Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Autofluorescensavbildning för att utvärdera cellulär metabolism

Published: November 15, 2021 doi: 10.3791/63282
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University-College Station

Summary

Detta protokoll beskriver fluorescensavbildning och analys av endogena metaboliska koenzymer, reducerad nikotinamidadenin (fosfat) dinukleotid (NAD (P) H) och oxiderad flavinadenindinukleotid (FAD). Autofluorescensavbildning av NAD(P)H och FAD ger en etikettfri, icke-destruktiv metod för att bedöma cellulär metabolism.

Abstract

Cellulär metabolism är den process genom vilken celler genererar energi, och många sjukdomar, inklusive cancer, kännetecknas av onormal metabolism. Reducerad nikotinamidadenin (fosfat) dinukleotid (NAD(P)H) och oxiderad flavinadenindinukleotid (FAD) är koenzymer av metaboliska reaktioner. NAD(P)H och FAD uppvisar autofluorescens och kan isoleras spektralt genom excitation och emissionsvåglängder. Båda koenzymerna, NAD(P)H och FAD, kan existera i antingen en fri eller proteinbunden konfiguration, som var och en har en distinkt fluorescenslivslängd - den tid för vilken fluoroforen förblir i det exciterade tillståndet. Fluorescens livstidsavbildning (FLIM) möjliggör kvantifiering av fluorescensintensiteten och livslängden för NAD(P)H och FAD för etikettfri analys av cellulär metabolism. Fluorescensintensitet och livstidsmikroskop kan optimeras för avbildning av NAD(P)H och FAD genom att välja lämpliga excitations- och emissionsvåglängder. Metaboliska störningar av cyanid verifierar autofluorescensavbildningsprotokoll för att upptäcka metaboliska förändringar i celler. Denna artikel kommer att demonstrera tekniken för autofluorescensavbildning av NAD (P) H och FAD för mätning av cellulär metabolism.

Introduction

Metabolism är den cellulära processen att producera energi. Cellulär metabolism omfattar flera vägar, inklusive glykolys, oxidativ fosforylering och glutaminolys. Friska celler använder dessa metaboliska vägar för att generera energi för spridning och funktion, såsom produktion av cytokiner av immunceller. Många sjukdomar, inklusive metaboliska störningar, cancer och neurodegeneration, kännetecknas av förändrad cellulär metabolism1. Till exempel har vissa cancercelltyper förhöjda glykolyshastigheter, även i närvaro av syre, för att generera molekyler för syntes av nukleinsyror, proteiner och lipider2,3. Detta fenomen, känt som Warburg-effekten, är ett kännetecken för många cancertyper, inklusive bröstcancer, lungcancer och glioblastom4. På grund av förändringarna i cellulär metabolism i samband med cancerprogression kan cellulär metabolism vara en surrogatbiomarkör för läkemedelssvar5,6. Dessutom är det avgörande att förstå läkemedelseffekten på cellulär nivå eftersom cellheterogenitet kan leda till olika läkemedelssvar hos individer7,8.

Teknik som identifierar och kvantifierar förändringar i cellulär metabolism är avgörande för studier av cancer och läkemedelsrespons. Kemiska analyser och proteinanalyser används för att utvärdera metabolismen av celler eller vävnader men saknar encellsupplösning och rumslig information. Metaboliska plattläsarbaserade analyser kan mäta pH och syreförbrukning i provet över tid och efterföljande metabolisk störning av kemikalier. PH kan användas för att beräkna den extracellulära försurningshastigheten (ECAR), vilket ger en inblick i cellernas glykolytiska aktivitet9. Helkroppsavbildningsmetoder, inklusive 2-[fluor-18] fluor-D-glukospositronemissionstomografi (FDG PET) och magnetisk resonansspektroskopi (MRS), är icke-invasiva bildmetoder som används kliniskt för att identifiera tumöråterfall och läkemedelseffekt genom metaboliska mätningar10,11,12,13,14.

FDG-PET avbildningar vävnadsupptaget av FDG, en radioaktivt märkt glukosanalog. Ökat upptag av FDG-PET av tumörer i förhållande till omgivande vävnad beror på Warburg-effekten12,13. MRS bilder vanliga kärnor av molekyler som används för metabolism, såsom 13C och 31P, och kan få dynamisk information om hur ämnesomsättningen förändras som svar på stimuli, såsom motion eller ätande14. Även om FDG-PET och MRS kan användas kliniskt, saknar dessa tekniker den rumsliga upplösningen för att lösa intratumoral heterogenitet. På samma sätt görs syreförbrukningsmätningar på en bulkpopulation av celler. Autofluorescensavbildning övervinner det rumsliga upplösningshinderet för dessa tekniker och ger en icke-invasiv metod för att kvantifiera cellulär metabolism.

Figure 1
Figur 1: NADH och FAD i vanliga metaboliska vägar. NADH och FAD är koenzymer som används i glykolys, Krebs-cykeln och elektrontransportkedjan. Autofluorescensavbildning av dessa molekyler ger information om cellulär metabolism. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Reducerad nikotinamidadenin (fosfat) dinukleotid (NAD(P)H) och oxiderad flavinadenindinukleotid (FAD) är koenzymer av metaboliska reaktioner, inklusive glykolys, oxidativ fosforylering och glutaminolys (figur 1). Både NAD(P)H och FAD är autofluorescerande och ger endogen kontrast för fluorescensavbildning1,15. NADPH har liknande fluorescerande egenskaper som NADH. På grund av detta används NAD(P)H ofta för att representera den kombinerade signalen för NADH och NADPH2,16.

Fluorescens livstidsavbildning (FLIM) kvantifierar fluorescensens livstid eller den tid för vilken en fluorofor är i exciterad tillstånd. Fluorescenslivslängder svarar mot fluoroforernas mikromiljö och ger information om cellulär metabolism17. NAD(P)H och FAD kan existera i celler i antingen proteinbundna eller fria konformationer, som var och en har en annan livstid. Fri NAD(P)H har en kortare livslängd än proteinbunden NAD(P)H; omvänt har fri FAD en längre livslängd än bunden FAD18,19. Komponenternas livslängd och livslängdsvikter kan kvantifieras från sönderfallsdata för fluorescenslivslängd genom ekv. (1)20:

I(t) = α 1e-t/τ1 + α 2e-t/τ2 + C (1)

Eq (1) representerar den normaliserade fluorescensintensiteten som en funktion av tiden. De α 1 och α 2 i denna ekvation representerar de proportionella komponenterna för korta respektive långa livstider (α 1+ α 2 = 1), τ1 respektive τ2 representerar de korta respektive långa livslängderna och C står för bakgrundsljus7,20. Den amplitudviktade livslängden, som här representeras som τm, beräknas med hjälp av ekv.

τm= α 1τ1+ α 2τ2 (2)

En genomsnittlig livslängd kan beräknas genom att medelvärdet "t" över fluoroforens intensitetsförfall, vilket för ett två-exponentiellt sönderfall visas av Eq. (3) 17,21.

τ*m= (α 1τ12+ α 2τ22)/ (α 1τ1+ α 2τ2) (3)

En fluorescensintensitetsbild kan beräknas från livstidsbilden genom att integrera fluorescenslivslängdsförfallet. Autofluorescensavbildning är en icke-destruktiv och etikettfri metod som kan användas för att karakterisera metabolismen av levande celler vid en subcellulär upplösning. Det optiska redoxförhållandet ger ett optiskt analogt mått på cellens kemiska redoxtillstånd och beräknas som förhållandet mellan NAD(P)H och FAD-intensiteter. Även om formeln för beräkning av det optiska redoxförhållandet inte är standardiserad22,23,24,25, definieras den här som INTENSITETEN AV FAD över de kombinerade intensiteterna av NAD(P)H och FAD. Denna definition används eftersom den summerade intensiteten i nämnaren normaliserar måttet mellan 0 och 1, och det förväntade resultatet av cyanidhämningen är en minskning av redoxförhållandet. Fluorescenslivslängderna för fri NAD(P)H och FAD ger insikt i förändringar i det metaboliska lösningsmedlets mikromiljö, inklusive pH, temperatur, närhet till syre och osmolaritet17.

Förändringar i fluorescenslivslängden för de bundna fraktionerna av NAD(P)H och FAD kan indikera metaboliskt vägutnyttjande och substratspecifik metabolism26. Komponentvikter kan tolkas för förändringar i den fria till den bundna fraktionen av koenzymerna18,19. Sammantaget möjliggör dessa kvantitativa autofluorescenslivstidsmått analys av cellulär metabolism, och autofluorescensavbildning har använts för att identifiera neoplasmer från normala vävnader27,28, karakterisera stamceller29,30, utvärdera immuncellsfunktionen31,32,33,34,35, mäta neurologisk aktivitet36, 37,38 och förståelse för läkemedelseffekt vid cancertyper som bröstcancer och huvud- och halscancer21,39,40,41,42. Högupplöst autofluorescensavbildning kan kombineras med bildsegmentering för encellsanalys och kvantifiering av intrapopulationens heterogenitet43,44,45,46,47.

NAD(P)H och FAD kan avbildas på enfoton- eller multifotonfluorescensmikroskop konfigurerade för intensitets- eller livstidsavbildning. För enfotonmikroskop exciteras NAD(P)H och FAD vanligtvis vid våglängder på 375-405 nm respektive 488 nm på grund av vanliga laserkällor vid dessa våglängder48. Vid excitation av tvåfotonfluorescens kommer NAD(P)H och FAD att excitera vid våglängder på cirka 700 till 750 nm respektive 700 till 900 nm15,49. När fluoroforerna är exciterade avger NAD(P)H och FAD fotoner vid våglängder mellan ~ 410 nm till ~ 490 nm respektive ~ 510 nm till ~ 640 nm15. NAD(P)H- och FAD-maximaemissionsvåglängderna är cirka 450 nm respektive 535 nm48.

På grund av deras olika excitations- och emissionsvåglängder kan fluorescensen hos de två metaboliska koenzymerna isoleras spektralt. En förståelse av de spektrala egenskaperna hos NAD(P)H och FAD är nödvändig för design och optimering av autofluorescensavbildningsprotokoll. Cyanid är en elektrontransportkedja (ETC) komplex IV-hämmare. Effekterna av cyanid på cellulär metabolism och autofluorescensintensiteterna och livslängderna för NAD(P)H och FAD i celler är väl karakteriserade27,40. Därför är ett cyaniduppstubbningsexperiment ett effektivt sätt att validera NAD(P)H- och FAD-bildprotokoll. Ett framgångsrikt cyanidexperiment ger förtroende för att NAD (P) H och FAD-bildprotokollet kan användas för att bedöma metabolismen av okända grupper eller störningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cellplätering för avbildning

  1. Aspirera mediet från en 80-90% sammanflytande T-75-kolv av MCF-7-celler, skölj cellerna med 10 ml steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och tillsätt 2 ml 0,25% trypsin (1x) för att lossa cellerna från kolvbotten.
  2. Inkubera kolven vid 37 °C i ~4 min. Kontrollera cellerna under mikroskopet för att bekräfta lossningen.
  3. Tillsätt omedelbart 8 ml odlingsmedium för att avaktivera trypsinet.
  4. Samla cellerna i ett koniskt rör (15 ml eller 50 ml). Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer.
  5. Centrifugera cellerna 200 × g i 5 min.
  6. När centrifugerad, aspirera supernatanten. Resuspendera cellpelleten i 1 ml odlingsmedium och frö 4 × 105 celler på en 35 mm glasbottenbildskål (eller lämplig provhållare för mikroskopet som används).
  7. Tillsätt 2 ml odlingsmedium till bildskålen för att upprätthålla cellmetabolismen.
  8. Inkubera cellerna vid 37 ° C med 5% CO2 i 24-48 timmar före avbildning för cellerna att fästa och nå den logaritmiska tillväxtfasen.
    OBS: Tillväxtfasen bestämdes av tidigare erfarenhet av dessa celler och bekräftades med celldatabladet.

2. Multifoton FLIM-avbildning av NAD(P)H och FAD

  1. Slå på alla komponenter i multifotonfluorescensens livstidsmikroskop, inklusive mikroskopet, laserkällan och detektorerna som används.
  2. Exempel på placering
    1. Slå på ljusfältslampan. Se till att ljuset går in i okularet. Välj ett mål, vanligtvis 20x, 40x eller 100x för cellavbildning. Applicera 1 droppe av lämpligt nedsänkningsmedium ovanpå målet [hoppa över om du använder ett luftmål].
    2. Flytta målet nedåt för att placera provet korrekt utan att röra vid målet. Placera glasskålen på provhållaren på mikroskopsteget. Se till att provet är säkert och inte kommer att röra sig under avbildningen.
    3. Centrera provet med målet med hjälp av X-Y-stegskontrollen. När detta är gjort, titta in i okularet och flytta målet upp för att fokusera på cellerna.
    4. Om mikroskopet är inom ett hölje, stäng ljusboxluckan. Öppna programvaran för bildförvärv, klicka på fliken Multiphoton Imaging och ställ in följande parametrar för multifotonavbildning: bildstorlek = 256 x 256 pixlar; pixel uppehållstid = 4-25 μs; total bildförvärvstid = ~ 60 s; optimerad detektorförstärkning för enfotonräkning = 85% (specifikt för det system som används).
  3. Avbildning av instrumentresponsfunktion (IRF) och fluorescerande livstidsstandard
    1. Placera ureakristaller på en glasbotten och säkra disklocket med tejp eller parafilm.
      OBS: Ureakristaller förblir stabila vid rumstemperatur i flera månader.
    2. Bild ureakristallerna.
      1. Placera ureaskålen på mikroskopstadiet och fokusera på en ureakristall.
      2. Ställ in excitationslaserns våglängd på 900 nm.
      3. Använd ett emissionsfilter som fångar upp 450 nm våglängder.
      4. Få en fluorescens livstidsbild av ureakristallen med lasereffekt vid provet <1 mW och använd de rekommenderade avbildningsparametrarna som nämns i steg 2.2.4.
    3. Föreställ dig de gulgröna (YG) pärlorna som en fluorescens livstidsstandard.
      1. Skapa en YG-pärlrutschbana genom att späda YG-pärllösningen 1:1 000 i sterilt vatten. Placera en liten volym (~ 30 μL) på en glid- eller glasbottenform. Täck med en täckglas och försegla kanterna på täckglaset med klart nagellack.
      2. Placera YG-pärlglaset på mikroskopsteget med täcksidan av bilden mot målet.
      3. Ställ in excitationslaserns våglängd på 890 nm
      4. Använd ett emissionsfilter som fångar upp ~500-600 nm våglängder.
      5. Få en fluorescenslivslängdsbild av YG-pärlan med hjälp av en lasereffekt vid provet <1 mW och de rekommenderade bildparametrarna [steg 2.2.4].
      6. Kontrollera pärlens livslängd med hjälp av ureas IRF. Om livslängden inte är ~ 2,1 ns, kontrollera om pärlan är i kontakt med en annan pärla som bidrar till fluorescenssläckning, pärllösningen har torkat, pärlan är ur fokus, IRF är inte korrekt eller skiftet mellan IRF och fluorescenssorfall är inte optimerat [se steg 4.2.4].
        OBS: Livslängden på ~ 2,1 ns är stabil över tiden.
  4. NAD(P)H-avbildning
    1. Placera glasskålen med cellerna på mikroskopstadiet och fokusera på cellerna.
      OBS: Det rekommenderas att cellerna placeras i en miljökammare för att bibehålla värme,fuktighet och CO2-nivåer under bildförvärv, eftersom dessa parametrar kan påverka cellulär metabolism.
    2. Justera detektorns förstärkning till det optimala värdet för FLIM. Byt dessutom till önskad uppehållstid - en parameter som anger den tid lasern spenderar vid varje pixel av provet.
      OBS: Dessa parametrar bör förbli DESAMMA under resten av proceduren. Detta för att säkerställa konsekvens i laserbelysning och detektorinställningar för att säkerställa giltigheten av de intensitetsbaserade mätningarna, som är beroende av lasereffekt, skanningsparametrar och detektorförstärkning. Det finns en optimerad detektorförstärkning för drift av detektorer i enfotonräkningsläge; värdet är 85% för det refererade systemet.
    3. Ställ in multifotonlasern på 750 nm. Se till att effektkontrollen för lasern är inställd på noll initialt så att cellerna inte skadas när slutaren på lasern öppnas.
      OBS: Excitation vid 750 nm rekommenderas för NAD(P)H, även om den har bred absorption vid 700-750 nm. Excitation vid 890 nm rekommenderas för FAD, även om den har bred absorption vid 700-900 nm.
    4. Ställ in eller välj ett emissionsfilter för att samla in emissionsvåglängder vid ~ 400-500 nm.
    5. Börja avbilda på ett fokuserande eller live-view-sätt för att optimera bildinställningarna.
      OBS: Lasern är nu i drift. Öppna inte mikroskophöljet vid denna tidpunkt. Använd lämplig personlig skyddsutrustning.
    6. Öka långsamt lasereffekten till ~ 3-8 mW vid provet samtidigt som cellerna är i fokus. När du har justerat registrerar du den maximala effekten som används. Använd den här effektinställningen för avbildning på andra segment av petriskålen för NAD(P)H-avbildning.
      OBS: Det är viktigt att mäta lasereffekten vid provet eller ett pick-off-fönster och inte förlita sig på pockels cellspänning eftersom pockelscellerna inte är stabila. Ofta övervakas laserkraften under avbildning med ett pick-off-fönster istället för vid provet. Med hjälp av en andra effektmätare vid målet kan förhållandet mellan effekten vid avhämtningsfönstret och effekten vid provet användas för att uppskatta den ungefärliga effekten vid provet från mätningarna av avhämtningsfönstret.
    7. Samla in en NAD(P)H FLIM-bild med en bildintegreringstid på 60 s.
    8. Kontrollera att bilden har tillräckligt med fotoner (topp på ~ 100 fotoner för en cytoplasmapixel) inom fluorescensens livstids sönderfallskurva. Om antalet fotoner är för lågt, öka lasereffekten eller varaktigheten av bildförvärvet.
      OBS: Det minsta toppantalet fotoner inom fluorescensen exponentiellt sönderfall är beroende av systemparametrar, inklusive tidsupplösning, IRF och bakgrundsbrus.
  5. FAD-avbildning
    1. Ställ in multifotonlasern på 890 nm och vänta tills den låses vid den nya våglängden. Se till att effektkontrollen för lasern är inställd på noll initialt så att cellerna inte skadas när slutaren på lasern öppnas.
      OBS: Flytta inte scenen eller objektivt fokus när du utför detta steg. FAD-synfältet (FOV) ska direkt matcha NAD(P)H FOV för den här bilden.
    2. Ställ in eller välj ett emissionsfilter för att samla in emissionsvåglängder vid ~ 500-600 nm.
    3. Börja avbilda på ett fokuserande eller live-view-sätt för att optimera bildinställningarna.
      OBS: Lasern är nu i drift. Öppna inte mikroskophöljet vid denna tidpunkt.
    4. Öka långsamt lasereffekten till ~ 5-10 mW vid provet och registrera den maximala effekten som används. Använd detta som effektinställning för avbildning på andra segment av petriskålen för FAD-avbildning.
    5. Samla in en FAD FLIM-bild med en bildintegreringstid på 60 s.
    6. Kontrollera att bilden har tillräckligt med fotoner (topp på ~ 100 fotoner för en cytoplasmapixel) inom fluorescensens livstids sönderfallskurva. Om antalet fotoner är för lågt, öka lasereffekten eller varaktigheten av bildförvärvet.
      OBS: Det minsta toppantalet fotoner inom fluorescensen exponentiellt sönderfall är beroende av systemparametrar, inklusive tidsupplösning, IRF och bakgrundsbrus.
  6. Upprepa steg 2.4–2.5 vid ytterligare fyra till fem FOV:er. Se till att varje bild är placerad minst 2 FOV:er bort från de avbildade platserna.

3. Beredning av cyanidexperiment

  1. Lös upp 130,24 mg natriumcyanid i 25 ml PBS för att göra en 80 mM (20x) natriumcyanidlösning.
    OBS: Cyanid är giftigt. Använd lämplig personlig skyddsutrustning.
  2. Aspirera 100 μL odlingsmedium från skålen. Ersätt detta med 100 μL natriumcyanidlösning för att erhålla en 4 mM koncentration av cyanid i skålen.
  3. Lägg cellerna i en inkubator i 5 minuter så att cellerna kan reagera med cyanidlösningen.
  4. Upprepa steg 2.4-2.6 för att få NAD(P)H- och FAD-bilder av cellerna efter cyanidexponering.
    OBS: Långvarig exponering för cyanid kommer att döda cellerna. Postcyanidbilder förvärvas inom 30 minuter efter cyanidtillsatsen.

4. FLIM-bildanalys

  1. Öppna programvaran FLIM för livstidsanalys.
    1. Öppna ureabilden för att hämta den uppmätta IRF.
    2. Importera ureabilden. Välj en punkt på bilden av ureakristallen som ska användas för bildanalys. Öka det rumsliga bin-värdet för att integrera FLIM-data från flera pixlar till 1 eller högre för en sönderfallstopp > 100 fotoner genom att ändra Bin-variabeln som finns i huvudprogramvarugränssnittet.
    3. Spara data som en IRF.
      1. I den refererade programvaran klickar du på rullgardinsmenyn med titeln IRF, väljer Kopiera från sönderfallsdata. Klicka sedan på Kopiera till Urklipp som ska användas i bildanalysen av bilden som tagits under experimentet.
  2. Bildanalys av NAD(P)H- och FAD-livstidsbilder
    1. Importera bildfilen till fluorescens livstidsanalysprogramvara.
    2. Förbättra bildvisualiseringen för att se cellerna och de subcellulära facken genom att ändra intensitet och kontrast om det behövs.
      1. Klicka på rullgardinsmenyn Alternativ och välj Intensitet. Här ändrar du intensiteten och kontrasten efter önskemål och klickar på Ok.
    3. Importera IRF från ureabilden.
      1. Klicka på rullgardinsmenyn IRF och välj Klistra in från Urklipp.
    4. Ange parametrar för multiexponentiellt förfall50.
      1. Ange ett tröskelvärde för att utvärdera sönderfall för cytoplasmapixlar.
        OBS: Här användes ett värde på 50. Värdet valdes genom att jämföra fluorescenstoppvärdena för flera representativa bakgrunds- och kärnpixlar med toppvärdet för flera cytoplasmapixlar. Ett värde mellan kärnpixlarna och cytoplasmapixlarna valdes för tröskelvärdet.
    5. Kontrollera att Shift-värdet justerar IRF i förhållande till fluorescensens stigande kant. Justera skiftet om det behövs till ett värde som minimerar Chi-kvadratvärdet.
    6. Öka den rumsliga behållaren så att cytoplasmapixlar har fluorescenstoppvärden vid eller över 100.
      OBS: Om du ökar den rumsliga papperskorgen leder det till minskad rumslig upplösning.
    7. Beräkna fluorescenslivslängder för alla pixlar i bilden.
      1. Klicka på rullgardinsmenyn Beräkna i det refererade programmet | Sönderfallsmatris.
        OBS: Framgång indikeras med en bild som är falskt färgad till den amplitudviktade fluorescenslivslängden.
    8. Spara fluorescenslivslängdsdata.
      1. Klicka på rullgardinsmenyn Arkiv | Exportera. Välj önskade parametrar för analys och klicka på Ok. Spara bilden.
      2. Välj knappen Färg i listrutan Alternativ för att justera det mått för fluorescenslivslängd som visas, färgkonfigurationen till B-G-R och ställ in de specifika minimi- och maximivärdena för färgfältet för att justera färgskalan för fluorescenslivslängdsbilden.

Figure 2
Figur 2: Uppmätt IRF för ureakristall. A) Intensitetsbild erhållen från urea. En representativ pixel valdes för att skapa IRF-sönderfallskurvan (B) för efterföljande analys av fluorescenslivslängdsbilder av celler. Förkortning: IRF = instrumentets svarsfunktion. Klicka här för att se en större version av denna figur.

  1. Cellsegmentering
    OBS: Protokollet som beskrivs här använder en bildanalysprogramvara51. Representativa MCF-7-bilder och dataanalyskod tillhandahålls52.
    1. Ladda ned filen MCF7_Segmentation_Final.cpproj52.
    2. Importera MCF7_Segmentation Pipeline genom att klicka på Arkiv | Importera | Pipeline från fil, välj filen MCF7_Segmentation_Final.cpproj.
    3. Klicka på modulen Bilder och lägg till de NAD(P)H-intensitetsbilder som ska segmenteras.
      OBS: Bilderna måste vara i.tif- .png eller .jpg format.
    4. Tryck på knappen Analysera bilder längst ned till vänster.
      OBS: Pipeline kan behöva optimeras för bilder som förvärvats på olika system. För felsökning kan du prova följande delsteg
      1. Använd testläget för att testa olika parametrar: Klicka på Starta testläge och kör varje modul genom att klicka på uppspelningsknappen bredvid modulnamnet.
      2. Klicka på den första modulen IdentifyPrimaryObjects och justera objektens typiska diameter i pixelenheter (Min, Max) så att de matchar cellernas diameter.
        OBS: För MCF-7-celler användes 10 och 40 pixlar för minimum respektive maximum.
      3. Klicka på modulen EnhanceOrSuppressFeatures och justera funktionsstorleken för att förbättra identifieringen av den valda funktionstypen.
        OBS: En funktionsstorlek på 10 pixlar användes för MCF-7-celler.
      4. Klicka på den andra EnhanceOrSuppressFeatures-modulen och justera intervallet för hålstorlekar för att optimera förbättringen av kärnregionerna.
        OBS: Ett intervall på 5-20 användes för MCF-7-celler.
      5. Klicka på den andra modulen IdentifyPrimaryObjects och justera parametrarna (Tröskelstrategi, Tröskelmetod, Tröskelutjämningsskala och Tröskelkorrigeringsfaktor) för att optimera identifieringen av kärnor. Klicka på parametern ? by each för att identifiera optimala inställningar och tillämpa på modulen IdentifySecondaryObjects .
      6. Klicka på modulen FilterObjects och justera områdesformen. Välj en lägsta och högsta pixel för den områdesform som ska identifieras.
        OBS: För MCF-7-cellerna användes 100 och 500 för maximalt respektive minimum. Processen för cellsegmentering genom att identifiera kärnan och förökningen till cellgränserna förklaras i detalj av Walsh och Skala47.
    5. Med hjälp av cellcytoplasmamaskerna, genomsnittliga fluorescenslivslängdsutmatningsvariablerna för varje cell i bilden.

Figure 3
Figur 3: Identifiering och segmentering av enskilda celler. NAD(P)H-intensitetsbilden av MCF7-celler (A) erhållen genom att integrera en fluorescenslivslängdsbild. Cellerna avbildades med 750 nm excitation vid 5 mW i 60 s. Axlarna x och y representerar bildens pixelplats. (A) Enskilda celler identifierades. Cellerna maskerades (B) för att eliminera eventuellt bakgrundsbrus från datauppsättningen. Kärnan identifierades sedan (C) och projicerades på cellmasken (D). Cellerna filtrerades sedan (E) för att ta bort maskerade områden som inte passar storleken på typiska celler. Skala bar = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

5. Alternativ metod: Fluorescensintensitetsavbildning

  1. Slå på utrustningen som ska användas under experimentet.
    OBS: Fluorescensintensitetsbilder kan förvärvas med bredfältsfluorescensmikroskop, konfokalfluorescensmikroskop eller multifotonmikroskop.
    1. Se till att mikroskopet som ska användas har en lämplig excitationskälla för NAD (P) H (enkelfotonvåglängd ~ 370-405 nm: tvåfotonvåglängd ~ 700-750 nm) och FAD (enkelfotonvåglängd ~ 488 nm, tvåfotonvåglängd ~ 890 nm).
    2. Se till att mikroskopet har ett filter för isolering av NAD(P)H-utsläpp (~400-500 nm).
      OBS: 4',6-Diamidino-2-fenylindol (DAPI) inställningar fungerar ofta för NAD (P) H.
    3. Se till att mikroskopet har ett filter för isolering av FAD-utsläpp (~ 500-600 nm).
      OBS: Inställningar för grönt fluorescerande protein (GFP) fungerar ofta för FAD.
  2. Förbered mikroskopet.
    1. Slå på ljusfältslampan. Se till att ljuset går in i okularet. Applicera 1 droppe av lämpligt nedsänkningsmedium ovanpå motsvarande mål om det behövs.
    2. Flytta ner målet för att placera proverna korrekt utan störningar. Placera petriskålen på scenen ordentligt. Se till att provet är säkert och inte kommer att röra sig under avbildningen.
      OBS: Det rekommenderas att cellerna placeras i en miljökammare för att bibehålla värme,fuktighet och CO2-nivåer under bildförvärv, eftersom dessa parametrar kan påverka cellulär metabolism.
    3. Centrera provet med målet. När detta är gjort, titta in i okularet och flytta målet tills cellerna verkar vara i fokus.
  3. Börja intensitetsavbildning.
    1. Öppna bildbehandlingsprogramvaran och ställ in excitations- och emissionskonfigurationen för att fånga NAD(P)H genom att klicka på fliken Capture i programvaran för bildförvärv och placera NAD(P)H-excitations- och emissionsfiltret i mikroskoptornet.
      OBS: Ett 357/44 excitationsfilter, 409 longpass dikroic och 447/60 emissionsfilter användes för NAD (P) H-avbildning.
    2. Optimera excitationsbelysningen och detektorparametrarna. Om blekning är ett problem, minska belysningsintensiteten och öka bildintegrationstiden.
      OBS: NAD(P)H är en svag signal; var medveten om blekning om för mycket ström används.
    3. Skaffa en NAD(P)H-bild med önskad bildstorlek. Se till att bilden är sparad.
    4. Ställ in excitations- och utsläppskonfigurationen för att fånga FAD. Optimera excitationsbelysningen och detektorparametrarna.
      OBS: Ett 458/64 excitationsfilter, 495 longpass dikroic och 550/88 emissionsfilter användes för FAD-avbildning.
    5. Skaffa en FAD-avbildning. Se till att bilden är sparad.
      OBS: NAD(P)H- och FAD-bildinsamlingsparametrar (belysningsintensitet, bildstorlek, detektorförstärkning) bör förbli desamma under hela bildexperimentet.
    6. Upprepa processen på ytterligare fem platser, åtskilda minst 2 FOV bort från de avbildade platserna.
  4. Dataanalys av redoxförhållande på bildnivå
    1. Öppna NAD(P)H- och FAD-intensitetsbilderna i ett bildbehandlingsprogram.
    2. Ställ in ett tröskelvärde på NAD(P)H för att behålla cytoplasmapixlar och ställ in bakgrunds- och kärnpixlar till 0.
    3. Beräkna redoxförhållandebilden genom att utvärdera ekvationen FAD/(NAD(P)H+FAD) vid varje pixel med hjälp av den tröskelvärderade NAD(P)H-bilden.
    4. Beräkna medelvärdet för icke-0 pixlarna.
      OBS: Dessa steg kan utföras i bildanalysprogramvara eller kodas direkt med skript.
  5. Redoxförhållandeanalys på cellnivå
    1. Följ steg 4.3.1-4.3.5 för att få en maskbild av cellerna i varje NAD(P)H-bild.
    2. Beräkna redoxförhållandebilden genom att utvärdera ekvationen FAD / (NAD (P) H + FAD) vid varje pixel.
    3. Använd cellcytoplasmamasken, genomsnittligt redoxförhållande för alla pixlar för varje cell i bilden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Epitelcancercellinjen, MCF-7, odlades i DMEM kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin. För fluorescensavbildning såddes cellerna med en densitet av 4 × 105 celler per 35 mm glasbottenavbildningsskål 48 timmar före avbildning. Cellerna avbildades före och efter cyanidbehandling med hjälp av de protokoll som anges ovan. Målet med cyanidexperimentet är att bekräfta spektral isolering av NAD(P)H och FAD-fluorescens och validera bildsystemet och analysprotokollet för att detektera metaboliska förändringar i celler. Parade NAD(P)H- och FAD-fluorescenslivslängdsbilder togs på fem olika platser före cyanid och fem olika platser efter tillsats av cyanid till mediet. Fluorescenslivslängdsparametrar (optiskt redoxförhållande, NAD(P)H α 1, NAD(P)H τ1, NAD(P)H τ2, NAD(P)H τm, FAD τ1, FAD τ2, FAD α 1, FAD τ1, FAD τ2 och FAD τm) beräknades med hjälp av den uppmätta IRF från urea (figur 2) och i genomsnitt över pixlarna i cytoplasman för varje cell som används för segmentering (figur 3).

Multifoton fluorescens livstidsavbildning av NAD (P) H och FAD möjliggör visualisering av cellmorfologi och metabolism (Figur 4). Den höga upplösningen som uppnås med multifotonmikroskopi möjliggör identifiering av enskilda celler. NAD(P)H och FAD finns främst i mitokondrierna och cytoplasman, medan kärnan, som saknar metabolisk NAD(P)H och FAD, är mörk i jämförelse23,53. Livstidsbilderna ger visualisering av de amplitudviktade livslängderna för NAD(P)H och FAD i hela cellen och som ett resultat av cyanidexponering (figur 4).

Figure 4
Figur 4: Representativa fluorescenslivstidsbilder av MCF7-celler före och efter cyanidbehandling. (A) NAD(P)H amplitudviktad fluorescenslivstidsbild och (B) FAD-amplitudviktad fluorescenslivstidsbild före cyanidbehandling. (C) NAD(P)H amplitudviktad fluorescenslivslängdsbild och (D) FAD-amplitudviktad fluorescenslivslängdsbild efter cyanidbehandling. Den amplitudviktade fluorescenslivslängden (indikeras av färgfältet) mäter den tid för vilken en fluorofor, i dessa fall NAD (P) H och FAD, är i ett upphetsat tillstånd. NAD(P)H-livslängden minskar vid cyanidbehandling, medan FAD-livslängden ökar efter cyanidbehandling. NADH-signalen avbildades med 750 nm excitation vid 5 mW i 60 s, och FAD-signalen avbildades med 890 nm excitation vid 7 mW i 60 s. Bilder som förvärvats med ett 40x vattennedsänkningsmål, numerisk bländare = 1,1. Skala bar = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Cyanid hämmar komplex IV i elektrontransportkedjan, vilket hämmar oxidativ fosforylering2,15. Efter cyanidexponering och före celldöd ackumuleras NAD(P)H i mitokondrierna och FAD minskar1,15. På grund av dessa väldefinierade förändringar i NAD(P)H- och FAD-intensitet på grund av cyanidhämning av ämnesomsättningen är störningen ett standardtest för att verifiera autofluorescensavbildnings- och analysprotokoll2,54. Som förväntat minskade det optiska redoxförhållandet (FAD/(FAD+NAD(P)H)) för MCF-7-celler efter cyanidbehandling (figur 5, p = 0,044, Welchs t-test). Det optiska redoxförhållandet är inte en standardiserad formel, men alla intensitetsformler har visat sig vara ekvivalenta20. FAD/(NAD(P)H+FAD) valdes för att definiera det optiska redoxförhållandet eftersom den sammanlagda summan av NAD(P)H och FAD i nämnaren ger ett normaliserat värde mellan 0 och 120,55. Den motsatta effekten - en ökning av det optiska redoxförhållandet - förväntas för cyanidstörningar med optiska redoxförhållanden beräknade med NAD (P) H i täljaren.

Figure 5
Figur 5: Optiskt redoxförhållande mellan MCF7-celler minskar med cyanidbehandling. Boxdiagram visar medianen och den första och tredje kvartilen beräknad från celldata. Medelvärdet representeras av den svarta pricksymbolen, och medianen representeras av den svarta linjen inuti rutan. De grå datapunkterna som läggs över på varje boxplot representerar medelvärdet för alla cytoplasmapixlar i varje cell. Kontrollgruppen bestod av 91 celler från fem olika bilder, och cyanidgruppen bestod av 95 celler från fem olika bilder. p < 0,01, Welchs t-test. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Den amplitudviktade NAD(P)H-livslängden (τm) för MCF7-celler minskade med cyanidexponering (figur 6A, p < 2,2 × 10-16, Welchs t-test). Både den korta och långa livslängden minskade för NAD(P)H (figur 6B,C) men ökade för NAD(P)H α 1 (figur 6D). Dessa förändringar i NAD(P)H fluorescenslivslängd, minskning av τm, ökning av α 1 och minskning av τ2 matchade publicerade värden för cyanidstörningar40,56. Minskningen av NAD(P)H-amplitudviktad fluorescenslivslängd vid cyanidexponering indikerar ökad släckning i mikromiljön av NAD(P)H. En ökning av α 1 indikerar mer fri NAD(P)H, vilket förväntas av ökningen av NAD(P)H på grund av cyanids effekter på cellulär metabolism21.

Figure 6
Figur 6: NAD(P)H fluorescenslivslängd för MCF7-celler före och efter cyanidbehandling. Boxplotterna i panelerna A-D visar medianen och den första och tredje kvartilen beräknad från data på cellnivå. Medelvärdet representeras av den svarta pricksymbolen, och medianen representeras av den svarta linjen inuti rutan. De grå datapunkterna som läggs över på varje boxplot representerar medelvärdet för alla cytoplasmapixlar i en cell. Kontrollgruppen bestod av 91 celler från fem olika bilder, och cyanidgruppen bestod av 95 celler från fem olika bilder. (A-D) uppvisar förändringar i NAD(P)H amplitudviktad livslängd (τm), NAD(P)H kort livslängd (τ1), NAD(P)H lång livslängd (τ2) och NAD(P)H-proportionell komponent under den korta livslängden (α 1) på grund av cyanidbehandling. p-värdena beräknades med Welchs t-test. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Den amplitudvägda FAD-livslängden (τm) för MCF7-celler ökade efter cyanidexponering (figur 7A, p = 3.688 × 10-12, Welchs t-test). Både den korta och långa livslängden ökade för FAD (figur 7B,C) men minskade för FAD α 1 (figur 7D). Förändringar i FAD-fluorescensens livslängd, en ökning av τm och τ2 och en minskning av α 1 överensstämmer med publicerade FAD-fluorescenslivstidsdata för cyanidförståelse57. Förändringen i livstidsvärden och α 1 tyder på metaboliska förändringar i cellerna, inklusive en ökad mängd fri FAD21.

Figure 7
Figur 7: FAD-fluorescenslivslängd före och efter cyanidbehandling. Boxdiagram i A-D visar medianen, den första och tredje kvartilen och medelvärdet beräknat från data på cellnivå. Medelvärdet representeras av den svarta pricksymbolen, och medianen representeras av den svarta linjen inuti rutan. De grå datapunkterna som läggs över på varje boxplot representerar medelvärdet för alla cytoplasmapixlar i en cell. Kontrollgruppen bestod av 91 celler från fem olika bilder, och cyanidgruppen bestod av 95 celler från fem olika bilder. (A-D) uppvisar förändringar i FAD-amplitudviktad livslängd (τm), FAD kort livslängd (τ1), FAD lång livslängd (τ2) och FAD-proportionell komponent av den korta livslängden (α 1) från cyanidbehandling. p-värdena beräknades med Welchs t-test. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Autofluorescensintensitet och livstidsavbildning har använts i stor utsträckning för att bedöma metabolism i celler21,55. FLIM är högupplöst och löser därför enskilda celler, vilket är viktigt för cancerstudier eftersom cellulär heterogenitet bidrar till tumöraggression och läkemedelsresistens7,39,41,44,45,46,58. På samma sätt är autofluorescensavbildning av cellulär metabolism användbar för avbildning av immunceller eftersom immuncellfunktionen är kopplad till cellulär metabolism och immuncellpopulationer ofta är heterogena20,31. Standard biokemiska analyser utvärderar vanligtvis immunceller på populationsnivå eller kräver intracellulär märkning efter cellpermeabilisering34,59,60. Autofluorescensavbildning är också väl lämpad för högupplösta in vivo- och dynamiska mätningar av ämnesomsättningen på grund av ljusets icke-destruktiva natur och brist på kemiska eller genetiskt kodade etiketter36,37,38,41,48,55 . Kritiska steg för avbildning av NAD(P)H och FAD fluorescensintensitet och livslängd inkluderar val av lämpliga våglängder för excitation och emission, verifiering av att cellerna inte innehåller syntetiska eller ytterligare endogena fluoroforer som kommer att bidra till överlappande fluorescens och användning av icke-ökande laserkrafter.

Autofluorescensavbildning av NAD (P) H och FAD fyller en unik nisch som en etikettfri, högupplöst, kvantitativ metabolisk bildteknik. Andra avbildningsmetoder, såsom FDG-PET och MRS, bildvävnadsmetabolism men saknar cellulär nivåupplösning och kan därför inte utvärdera cellulär heterogenitet. Andra biokemiska tekniker, såsom syreförbrukningsanalyser, mätningar av metaboliter i mediet eller proteinanalys, kräver dyra engångsreagenser, erhåller mätningar från poolade celler och kräver cellförstörande protokoll, vilket förhindrar tidsstudier eller in vivo-analys61,62.

Medan autofluorescensavbildning av NAD(P)H och FAD ger högupplösta bilder på ett etikettfritt och icke-destruktivt sätt, måste vissa begränsningar av autofluorescensavbildning beaktas vid utformning och tolkning av experiment. FLIM kräver specialiserad och dyr utrustning som inte är allmänt tillgänglig. FLIM-excitationen kräver en pulserad excitationskälla med pikosekund- eller femtosekundpulser vid en repetitionshastighet mellan 40 och 100 MHz med uteffekt > 50 mW63. Dessutom är bildförvärvet relativt långsamt, med en avvägning mellan antalet pixlar eller bildupplösning och bildförvärvstiden. Parametrarna som rekommenderas i detta protokoll på 256 x 256 pixlar och 60 s integrationstid ger en bild med rimlig upplösning inom cirka 1 mi. Användaren kan välja att avbilda mindre områden med färre pixlar eller utföra linjeskanningar för att förbättra bildhastigheten.

Alternativt kan bilder med högre pixlar förvärvas med ökade bildintegrationstider. Dataanalysen och tolkningen av autofluorescenslivstidsbilder kan vara utmanande eftersom FLIM ger specifik biofysisk information om de metaboliska koenzymerna och deras molekylära miljö snarare än specifika metaboliska vägar. Optisk mikroskopi begränsas också av djupet av ljuspenetration i vävnad på grund av ljusspridning och absorption. In vivo-studier kan göras, på djup av ~ 0,5 mm med multifotonavbildningssystem, av ytvävnader eller genom fönsterkammare2,20,21,64,65.

Medan NAD (P) H och FAD är de primära endogena fluoroforerna i isolerade celler, kan ytterligare molekyler, inklusive kollagen och elastin, bidra med autofluorescenssignaler i vävnader. De högupplösta bilderna av multifotonmikroskopi möjliggör visualisering av cellulära och icke-cellulära fack för segmentering av NAD(P)H- och FAD-pixlar från de extracellulära proteinerna40. Vissa celler innehåller endogena molekyler med överlappande fluorescens, såsom lipofuscin, retinol, tryptofan och melanin66. Därför kan autofluorescensbilder av NAD(P)H och FAD innehålla bakgrundsbidrag från andra endogena molekyler.

På samma sätt, medan NAD (P) H och FAD kan multiplexeras med exogena fluoroforer som avger vid våglängder över 600 nm, överlappar exogena etiketter, såsom DAPI eller genetiskt kodade proteiner såsom GFP, spektralt med autofluorescensavbildning. Cyanid störningsexperimentet som beskrivs här hjälper till att verifiera att excitations- och emissionsvåglängderna isolerar NAD (P) H och FAD tillräckligt för att fånga metaboliska förändringar i celler. Andra celltyper kan tillämpas på detta protokoll; Användaren bör dock optimera bildparametrar, inklusive lasereffekt och bildintegrationstid för varje celltyp, och experimentera för att förhindra fotoblekning. Fotoblekning kan minimeras genom att övervaka fotonantalshastigheten eller den genomsnittliga fluorescensintensiteten under avbildningen under hela livstidsskanningen. En ökning eller minskning av fluorescensintensiteten indikerar att lasereffekten är för hög. Om laserkrafter inducerar fotoblekning kan effekten minskas och den totala bildförvärvet ökas för att uppnå tillräcklig fotonsamling för livstidsanalys.

Även om fluorescenslivslängderna är oberoende av avbildningsparametrar, inklusive lasereffekt och detektorförstärkning, är fluorescensintensiteten beroende av dessa parametrar20. Därför är det viktigt att använda konsekventa bildparametrar när man utför autofluorescensavbildning för att kvantifiera det optiska redoxförhållandet. Protokollet rekommenderar att 5-6 bilder av olika FOV förvärvas från varje experimentell grupp. Denna provstorlek ger tillräckliga data på både bild- och cellnivå för att lösa de förväntade skillnaderna i fluorescenslivslängdsparametrar för konfluenta MCF7-celler på grund av cyanid störningen. Det optimala antalet bilder som förvärvas per grupp beror på den experimentella designen och effektstorleken. När du växlar mellan NAD(P)H- och FAD-bilder bör fokusplanet förbli detsamma på varje plats för konsekvens. Även om livstidsavbildning vanligtvis inte har ett mättande antal fotoner, kan intensitetsbilder som förvärvas med kameror eller fotomultiplikerarrör mättas. Pixelmättnad bör undvikas för att säkerställa att hela utbudet av fysiologiska intensiteter fångas i bilderna.

Vid analys av fluorescenslivstidsbilder kan antingen en uppmätt IRF eller en simulerad IRF användas. Den simulerade IRF uppskattas utifrån uppskjutningen av den fluorescerande livstidskurvan; Den verkliga IRF som erhålls från systemet kan dock vara bredare beroende på systemet och därmed resultera i mer exakta livstidsvärden. Medan IRF vanligtvis bara ändras med hårdvaru- eller programvaruändringar, är en daglig IRF-mätning en bra praxis för att säkerställa att fluorescenslivstidssystemet fungerar som förväntat.

Sammantaget ger autofluorescensavbildning av NAD (P) H och FAD en etikettfri, icke-destruktiv metod för att avbilda och analysera cellulär metabolism på encellsnivå. Denna metod ger en steg-för-steg-metod för att validera avbildningen av NAD (P) H och FAD med cyanid för att inducera en välkarakteriserad metabolisk störning i celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Finansieringskällor inkluderar Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP200668) och Texas A & M University. Figur 1 skapades med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-deoxy-d-glucose (2-DG) Sigma AC111980000; AC111980010; AC111980050; AC111980250
Antibiotic Antimicrobial (pen-strep) Gibco 15240096
Cell Samples American Type Culture Collection N/A MCF-7 cancer line
CellProfiler Broad Institute N/A Image analysis software
Conical Tube VWR 89039-664 15 mL conical tube
DMEM ThermoFisher 11965092 Culture media
FAD dichroic mirror Semrock FF495-Di03-25x36 495 nm
FAD emission filter Semrock FF01-550/88-25 550/88 nm
FAD excitation filter Semrock FF01-458/64-25 458/64 nm
FBS ThermoFisher 16000036
Fluorescence Lifetime Microscope 3i N/A
Glass bottom dish MatTek Corp P35G-1.0-14-C
Multiphoton Laser Coherent N/A 2P Coherent Laser, Tunable 680 nm-1080 nm
NAD(P)H dichroic mirror Semrock FF409-Di03-25x36 409 nm
NAD(P)H emission filter Semrock FF02-447/60-25 447/60 nm
NAD(P)H excitation filter Semrock FF01-357/44-25 357/44 nm
PBS ThermoFisher 70011044
Potassium Cyanide Sigma-Aldrich 380970
SlideBooks 6 3i N/A Image acquisition software
SPCImage Becker & Hickl GmbH N/A Fluorescence lifetime analysis software
Stage Top Incubator okoLab N/A
Trypsin Biosciences 786-262
Urea Sigma-Aldrich U5128
YG beads Polysciences 19096-2 Yg microspheres (20.0 µm)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heikal, A. A. Intracellular coenzymes as natural biomarkers for metabolic activities and mitochondrial anomalies. Biomarkers in Medicine. 4 (2), 241-263 (2010).
  2. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Optical imaging using endogenous contrast to assess metabolic state. Annual Review of Biomedical Engineering. 14, 351-367 (2012).
  3. Zheng, J. Energy metabolism of cancer: Glycolysis versus oxidative phosphorylation (Review). Oncology Letters. 4 (6), 1151-1157 (2012).
  4. Potter, M., Newport, E., Morten, K. J. The Warburg effect: 80 years on. Biochemical Society Transactions. 44 (5), 1499-1505 (2016).
  5. Zhao, Y., Butler, E. B., Tan, M. Targeting cellular metabolism to improve cancer therapeutics. Cell Death and Disease. 4 (3), 532 (2013).
  6. Patel, S., Ahmed, S. Emerging field of metabolomics: Big promise for cancer biomarker identification and drug discovery. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 63-74 (2015).
  7. Walsh, A. J., Cook, R. S., Skala, M. C. Functional optical imaging of primary human tumor organoids: Development of a personalized drug screen. Journal of Nuclear Medicine. 58 (9), 1367-1372 (2017).
  8. Zaal, E. A., Berkers, C. R. The influence of metabolism on drug response in cancer. Frontiers in Oncology. 8, 500 (2018).
  9. Little, A. C., et al. High-content fluorescence imaging with the metabolic flux assay reveals insights into mitochondrial properties and functions. Communications Biology. 3 (1), 271 (2020).
  10. Wang, X., et al. Comparison of magnetic resonance spectroscopy and positron emission tomography in detection of tumor recurrence in posttreatment of glioma: A diagnostic meta-analysis. Asia-Pacific Journal of Clinical Oncology. 11 (2), 97-105 (2015).
  11. Nabi, H. A., Zubeldia, J. M. Clinical applications of 18F-FDG in oncology. Journal of Nuclear Medicine Technology. 30 (1), 3-9 (2002).
  12. Kostakoglu, L., Agress, H., Goldsmith, S. J. Clinical role of FDG PET in evaluation of cancer patients. Radiographics. 23 (2), 315-340 (2003).
  13. Hoh, C. K. Clinical use of FDG PET. Nuclear Medicine and Biology. 34 (7), 737-742 (2007).
  14. van de Weijer, T., Schrauwen-Hinderling, V. B. Application of magnetic resonance spectroscopy in metabolic research. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1865 (4), 741-748 (2019).
  15. Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and Flavoprotein. Biophysical Journal. 82, 2811-2825 (2002).
  16. Lagarto, J. L., et al. Characterization of NAD(P)H and FAD autofluorescence signatures in a Langendorff isolated-perfused rat heart model. Biomedical Optics Express. 9 (10), 4961-4978 (2018).
  17. Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. , Springer. Boston, MA. (2013).
  18. Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Johnson, M. L. Fluorescence lifetime imaging of free and protein-bound NADH. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 89 (4), 1271-1275 (1992).
  19. Nakashima, N., Yoshihara, K., Tanaka, F., Yagi, K. Picosecond fluorescence lifetime of the coenzyme of D-amino acid oxidase. Journal of Biological Chemistry. 255 (11), 5261-5263 (1980).
  20. Hu, L., Wang, N., Cardona, E., Walsh, A. J. Fluorescence intensity and lifetime redox ratios detect metabolic perturbations in T cells. Biomedical Optics Express. 11 (10), 5674-5688 (2020).
  21. Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. Journal of Biomedical Optics. 25 (7), 1-43 (2020).
  22. Liu, Z., et al. Mapping metabolic changes by noninvasive, multiparametric, high-resolution imaging using endogenous contrast. Science Advances. 4 (3), (2018).
  23. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Optical imaging using endogenous contrast to assess metabolic state. Annual Review of Biomedical Engineering. 14, 351-367 (2012).
  24. Varone, A., et al. Endogenous two-photon fluorescence imaging elucidates metabolic changes related to enhanced glycolysis and glutamine consumption in precancerous epithelial tissues. Cancer Research. 74 (11), 3067-3075 (2014).
  25. Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals. Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).
  26. Sharick, J. T., et al. Protein-bound NAD(P)H lifetime is sensitive to multiple fates of glucose carbon. Scientific Reports. 8 (1), 5456 (2018).
  27. Skala, M. C., et al. In vivo multiphoton microscopy of NADH and FAD redox states, fluorescence lifetimes, and cellular morphology in precancerous epithelia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19494-19499 (2007).
  28. Skala, M. C., et al. In vivo multiphoton fluorescence lifetime imaging of protein-bound and free nicotinamide adenine dinucleotide in normal and precancerous epithelia. Journal of Biomedical Optics. 12 (2), 024014 (2007).
  29. Uchugonova, A. A., König, K. Two-photon autofluorescence and second-harmonic imaging of adult stem cells. Journal of Biomedical Optics. 13 (5), 054068 (2008).
  30. Miranda-Lorenzo, I., et al. Intracellular autofluorescence: a biomarker for epithelial cancer stem cells. Nature Methods. 11 (11), 1161-1169 (2014).
  31. Walsh, A. J., et al. Classification of T-cell activation via autofluorescence lifetime imaging. Nature Biomedical Engineering. 5 (1), 77-88 (2021).
  32. Heaster, T. M., Humayun, M., Yu, J., Beebe, D. J., Skala, M. C. Autofluorescence imaging of 3D tumor-macrophage microscale cultures resolves spatial and temporal dynamics of macrophage metabolism. Cancer Research. 80 (23), 5408-5423 (2020).
  33. Pavillon, N., Hobro, A. J., Akira, S., Smith, N. I. Noninvasive detection of macrophage activation with single-cell resolution through machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (12), 2676-2685 (2018).
  34. Chang, C. H., et al. Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis. Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).
  35. Kaech, S. M., Cui, W. Transcriptional control of effector and memory CD8+ T cell differentiation. Nature Reviews. Immunology. 12 (11), 749-761 (2012).
  36. Gómez, C. A., Fu, B., Sakadžić, S., Yaseena, M. A. Cerebral metabolism in a mouse model of Alzheimer's disease characterized by two-photon fluorescence lifetime microscopy of intrinsic NADH. Neurophotonics. 5 (4), 045008 (2018).
  37. Yaseen, M. A., et al. In vivo imaging of cerebral energy metabolism with two-photon fluorescence lifetime microscopy of NADH. Biomedical Optics Express. 4 (2), 307-321 (2013).
  38. Bower, A. J., et al. High-speed label-free two-photon fluorescence microscopy of metabolic transients during neuronal activity. Applied Physics Letters. 118 (8), 081104 (2021).
  39. Walsh, A. J., et al. Quantitative optical imaging of primary tumor organoid metabolism predicts drug response in breast cancer. Cancer Research. 74 (18), 5184-5194 (2014).
  40. Walsh, A. J., et al. Optical metabolic imaging identifies glycolytic levels, subtypes, and early-treatment response in breast cancer. Cancer Research. 73 (20), 6164-6174 (2013).
  41. Chowdary, M. V. P., et al. Autofluorescence of breast tissues: Evaluation of discriminating algorithms for diagnosis of normal, benign, and malignant conditions. Photomedicine and Laser Surgery. 27 (2), 241-252 (2009).
  42. Demos, S. G., Bold, R., White, R. D., Ramsamooj, R. Investigation of near-infrared autofluorescence imaging for the detection of breast cancer. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 11 (4), 791-798 (2005).
  43. Heaster, T. M., Humayun, M., Yu, J., Beebe, D. J., Skala, M. C. Autofluorescence imaging of 3D tumor-macrophage microscale cultures resolves spatial and temporal dynamics of macrophage metabolism. Cancer Research. 80 (23), 5408-5423 (2020).
  44. Sharick, J. T., et al. Cellular metabolic heterogeneity in vivo is recapitulated in tumor organoids. Neoplasia. 21 (6), 615-626 (2019).
  45. Shah, A. T., Diggins, K. E., Walsh, A. J., Irish, J. M., Skala, M. C. In vivo autofluorescence imaging of tumor heterogeneity in response to treatment. Neoplasia. 17 (12), 862-870 (2015).
  46. Walsh, A. J., Skala, M. C. Optical metabolic imaging quantifies heterogeneous cell populations. Biomedical Optics Express. 6 (2), 559-573 (2015).
  47. Walsh, A. J., Skala, M. C. An automated image processing routine for segmentation of cell cytoplasms in high-resolution autofluorescence images. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XIV. , (2014).
  48. Skala, M., Ramanujam, N. Methods in Molecular Biology. 594, 155-162 (2010).
  49. Stringari, C., et al. Multicolor two-photon imaging of endogenous fluorophores in living tissues by wavelength mixing. Scientific Reports. 7, 3792 (2017).
  50. SPCImage 2.9: Data analysis software for fluorescence lifetime imaging microscopy. SPCImage. , Available from: https://biology.uiowa.edu/sites/biology.uiowa.edu/files/SPCIMAGE29.pdf (2007).
  51. CellProfiler. , Available from: https://cellprofiler.org/releases (2007).
  52. Autofluorescence Imaging. GitHub. , Available from: https://github.com/walshlab/Autofluorescence-Imaging (2021).
  53. Ramey, N. A., Park, C. Y., Gehlbach, P. L., Chuck, R. S. Imaging mitochondria in living corneal endothelial cells using autofluorescence microscopy. Photochemistry and Photobiology. 83 (6), 1325-1329 (2007).
  54. Walsh, A., Cook, R. S., Rexer, B., Arteaga, C. L., Skala, M. C. Optical imaging of metabolism in HER2 overexpressing breast cancer cells. Biomedical Optics Express. 3 (1), 75-85 (2012).
  55. Kolenc, O. I., Quinn, K. P. Evaluating cell metabolism through autofluorescence imaging of NAD(P)H and FAD. Antioxidants & Redox Signaling. 30, 875-889 (2019).
  56. Bird, D. K., et al. Metabolic mapping of MCF10A human breast cells via multiphoton fluorescence lifetime imaging of the coenzyme NADH. Cancer Research. 65, 8766-8773 (2005).
  57. Walsh, A. J., et al. Optical metabolic imaging identifies glycolytic levels, subtypes, and early-treatment response in breast cancer. Cancer Research. 73 (20), 6164-6174 (2013).
  58. Walsh, A. J., Castellanos, J. A., Nagathihalli, N. S., Merchant, N. B., Skala, M. C. Optical imaging of drug-induced metabolism changes in murine and human pancreatic cancer organoids reveals heterogeneous drug response. Pancreas. 45 (6), 863-869 (2016).
  59. Gubser, P. M., et al. Rapid effector function of memory CD8+ T cells requires an immediate-early glycolytic switch. Nature Immunology. 14 (10), 1064-1072 (2013).
  60. Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Review. Immunology. 18 (1), 35-45 (2018).
  61. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. O. Review: Quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. The Journals of Gerontology: Series A. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  62. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio-protocol. 8 (10), 2850 (2018).
  63. Becker, W. The bh TCSPC Handbook. , Available from: https://www.becker-hickl.com/wp-content/uploads/2021/10/SPC-handbook-9ed-05a.pdf (2021).
  64. Gadella, T. W. J. Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity. Mason, W. T. 34, Ch. 34 467-479 (1999).
  65. Miller, D. R., Jarrett, J. W., Hassan, A. M., Dunna, A. K. Deep tissue iImaging with multiphoton fluorescence microscopy. Current Opinion in Biomedical Engineering. 4, 32-39 (2017).
  66. Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence lifetime measurements and biological imaging. Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).

Tags

Bioengineering utgåva 177 FLIM metabolism NAD(P)H FAD fluorescens mikroskopi
Autofluorescensavbildning för att utvärdera cellulär metabolism
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Theodossiou, A., Hu, L., Wang, N.,… More

Theodossiou, A., Hu, L., Wang, N., Nguyen, U., Walsh, A. J. Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism. J. Vis. Exp. (177), e63282, doi:10.3791/63282 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter