Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

הדמיית זרם אוטומטי להערכת חילוף החומרים התאי

Published: November 15, 2021 doi: 10.3791/63282
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University-College Station

Summary

פרוטוקול זה מתאר הדמיה וניתוח פלואורסצנטי של קואנזימים מטבוליים אנדוגני, אדנין ניקוטינאמיד מופחת (פוספט) dinucleotide (NAD(P)H), ו flavin adenine dinucleotide מחומצן (FAD). הדמיה אוטופלואורסצנטית של NAD(P)H ו-FAD מספקת שיטה נטולת תוויות ולא הרסנית להערכת חילוף החומרים התאי.

Abstract

חילוף החומרים התאי הוא התהליך שבו תאים מייצרים אנרגיה, ומחלות רבות, כולל סרטן, מאופיינות בחילוף חומרים חריג. ניקוטינאמיד אדנין מופחת (פוספט) דינוקלאוטיד (NAD(P)H) ופלובין אדנין דינוקלאוטיד מחומצן (FAD) הם קואנזימים של תגובות מטבוליות. NAD(P)H ו-FAD מציגים זרימה אוטומטית וניתן לבודד אותם באופן ספקטרלי על ידי אורכי גל של עירור ופליטה. שני הקואנזימים, NAD(P)H ו- FAD, יכולים להתקיים בתצורה חופשית או כרוכה בחלבון, שלכל אחד מהם פלואורסצנטיות ייחודית לכל החיים - הזמן שעבורו הפלואורופור נשאר במצב הנרגש. הדמיה לכל החיים של פלואורסצנטיות (FLIM) מאפשרת כימות של עוצמת הפלואורסצנטיות ואורך החיים של NAD(P)H ו- FAD לניתוח ללא תוויות של חילוף החומרים התאי. ניתן למטב את עוצמת הפלואורסצנטיות ואת המיקרוסקופים לכל החיים להדמיית NAD(P)H ו- FAD על-ידי בחירת אורכי הגל המתאימים של עירור ופליטה. הפרעות מטבוליות על ידי ציאניד לאמת פרוטוקולי הדמיה autofluorescence כדי לזהות שינויים מטבוליים בתוך תאים. מאמר זה ידגים את הטכניקה של הדמיית autofluorescence של NAD(P)H ו- FAD למדידת חילוף החומרים התאי.

Introduction

חילוף החומרים הוא התהליך התאי של ייצור אנרגיה. חילוף החומרים התאי מקיף מסלולים מרובים, כולל גליקוליזה, זרחן חמצוני, גלוטמינוליזיס. תאים בריאים משתמשים במסלולים מטבוליים אלה כדי לייצר אנרגיה להתפשטות ולתפקוד, כגון ייצור ציטוקינים על ידי תאי מערכת החיסון. מחלות רבות, כולל הפרעות מטבוליות, סרטן, ניוון עצבי, מאופיינים בחילוף חומרים תאי שונה1. לדוגמה, כמה סוגי תאים סרטניים יש שיעורים גבוהים של גליקוליזה, אפילו בנוכחות חמצן, כדי ליצור מולקולות לסינתזה של חומצות גרעין, חלבונים, שומנים, שומנים2,3. תופעה זו, המכונה אפקט ורבורג, היא סימן היכר של סוגי סרטן רבים, כולל סרטן השד, סרטן ריאות, ו glioblastomas4. בגלל השינויים של חילוף החומרים התאי הקשורים עם התקדמות הסרטן, חילוף החומרים התאי יכול להיות סמן ביולוגי פונדקאי לתגובה תרופתית 5,6. יתר על כן, הבנת יעילות התרופה ברמה התאית היא חיונית כמו הטרוגניות התא יכול להוביל לתגובות סמים שונות אצל אנשים7,8.

טכנולוגיות המזהות ומכמתות שינויים בחילוף החומרים התאי חיוניות למחקרים של סרטן ותגובה לתרופות. ניתוחים כימיים וחלבון משמשים להערכת חילוף החומרים של תאים או רקמות אך חסרים רזולוציה של תא יחיד ומידע מרחבי. בדיקות המבוססות על קורא לוחות מטבוליים יכולות למדוד את צריכת החומציות והחמצן במדגם לאורך זמן ואת ההפרעה המטבולית הבאה על ידי כימיקלים. ניתן להשתמש ב- pH כדי לחשב את קצב החמצה חוץ-תאית (ECAR), המספק תובנה על הפעילות הגליקוליטית של התאים9. שיטות הדמיה לכל הגוף, כולל טומוגרפיה של פליטת פלואורו-D-גלוקוז פוזיטרונים (FDG PET) וספקטרוסקופיית תהודה מגנטית (MRS), הן שיטות הדמיה לא פולשניות המשמשות קלינית לזיהוי הישנות גידולים ויעילות התרופה באמצעות מדידות מטבוליות10,11,12,13,14.14.

FDG-PET מצלם את ספיגת הרקמות של FDG, אנלוגי גלוקוז עם תווית רדיו. ספיגה מוגברת של FDG-PET על ידי גידולים ביחס לרקמה שמסביב נובעת אפקט ורבורג12,13. MRS מדמה גרעינים נפוצים של מולקולות המשמשות לחילוף חומרים, כגון 13C ו- 31P, ויכולה לקבל מידע דינמי על האופן שבו חילוף החומרים משתנה בתגובה לגירויים, כגון פעילות גופנית או אכילה14. למרות FDG-PET ו- MRS ניתן להשתמש קלינית, טכנולוגיות אלה חסרות את הפתרון המרחבי כדי לפתור הטרוגניות תוךטומורלית. כמו כן, מדידות צריכת חמצן נעשות על אוכלוסייה בתפזורת של תאים. הדמיית Autofluorescence מתגברת על מכשול הרזולוציה המרחבית של טכנולוגיות אלה ומספקת שיטה לא פולשנית לכימות חילוף החומרים התאי.

Figure 1
איור 1: NADH ו-FAD במסלולים מטבוליים נפוצים. NADH ו-FAD הם קואנזימים המשמשים בגליקוליזה, מחזור קרבס ושרשרת הובלת האלקטרונים. הדמיה Autofluorescence של מולקולות אלה מספק מידע על חילוף החומרים הסלולר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

ניקוטינאמיד אדנין מופחת (פוספט) דינוקלאוטיד (NAD(P)H) ופלובין אדנין דינוקלאוטיד מחומצן (FAD) הם קואנזימים של תגובות מטבוליות, כולל גליקוליזה, זרחן חמצוני וגלוטמינוליזיס (איור 1). הן NAD(P)H והן FAD הם autofluorescent ומספקים ניגודיות אנדוגנית להדמיית פלואורסצנטיות1,15. ל- NADPH תכונות פלואורסצנטיות דומות ל- NADH. מסיבה זו, NAD(P)H משמש לעתים קרובות כדי לייצג את האות המשולב של NADH ו NADPH2,16.

הדמיה לכל החיים פלואורסצנטיות (FLIM) מכמתת את חיי הפלואורסצנטיות או את הזמן שעבורו פלואורופור נמצא במצב הנרגש. תקופות חיים פלואורסצנטיות מגיבות למיקרו-סביבה של הפלואורופורים ומספקות מידע על חילוף החומרים התאי17. NAD(P)H ו-FAD יכולים להתקיים בתוך תאים בקונפורמציות הקשורות לחלבון או בחינם, שלכל אחד מהם יש חיים שונים. ל-NAD(P)H החינמי יש אורך חיים קצר יותר מ-NAD(P)H הקשור לחלבון; לעומת זאת, ל-FAD בחינם יש חיים ארוכים יותר מ-FAD18,19 מאוגד. ניתן לכמת את אורך החיים ואת משקולות הרכיבים לכל החיים מנתוני ריקבון לכל החיים של פלואורסצנטיות באמצעות Eq. (1)20:

I(t) = α 1e-t/τ1 + α 2e-t/τ2 + C (1)

Eq (1) מייצג את עוצמת הפלואורסצנטיות המנורמלת כפונקציה של זמן. α 1 ו-α 2 במשוואה זו מייצגים את הרכיבים היחסיים של אורך חיים קצר וארוך (α 1+ α 2=1), בהתאמה, τ1 ו- τ2 מייצגים את אורך החיים הקצר והארוך, בהתאמה, ו- C מהווה אור רקע7,20. אורך החיים המשוקלל של משרעת, המיוצג כאן כ- τm, מחושב באמצעות Eq. (2).

τm= α 1τ1+ α 2τ2 (2)

חיים ממוצעים יכולים להיות מחושבים על ידי ממוצע "t" על דעיכה אינטנסיבית של פלואורופור, אשר עבור ריקבון דו-מעריכי מוצג על ידי Eq. (3)17,21.

τ*m= (α 1τ12+ α 2τ22)/ (α 1τ1+ α 2τ2) (3)

ניתן לחשב תמונה בעוצמה פלואורסצנטית מהתמונה לכל החיים על-ידי שילוב הריקבון של חיי הפלואורסצנטיות. הדמיה אוטופלואורסצנטית היא שיטה לא הרסנית ונטולת תוויות שניתן להשתמש בה כדי לאפיין את חילוף החומרים של תאים חיים ברזולוציה תת-תאית. יחס redox אופטי מספק מדד אנלוגי אופטי של מצב redox כימי של התא ומחושב כיחס של עוצמות NAD(P)H ו- FAD. למרות שהנוסחה לחישוב יחס ה-redox האופטי אינה מתוקננת22,23,24,25, היא מוגדרת כאן כעוצמת ה-FAD על פני העוצמות המשולבות של NAD(P)H ו-FAD. הגדרה זו משמשת מכיוון שהעוצמה המסוכמת במכנה מנרמלת את המדד בין 0 ל-1, והתוצאה הצפויה של עיכוב הציאניד היא ירידה ביחס ה- redox. חיי הפלואורסצנטיות של NAD(P)H ו-FAD בחינם מספקים תובנה לגבי שינויים במיקרו-סביבה הממסית המטבולית, כולל pH, טמפרטורה, קרבה לחמצן ואוסמולאריות17.

שינויים באורך הפלואורסצנטיות של השברים הכרוכים של NAD(P)H ו- FAD יכולים להצביע על ניצול מסלול מטבולי וחילוף חומרים ספציפי למצע26. ניתן לפרש משקולות רכיבים לשינויים בשבר החופשי עד הכרוך של קואנזים18,19. בסך הכל, מדדים כמותיים אלה של אורך החיים של autofluorescence מאפשרים ניתוח של חילוף החומרים התאי, והדמיה autofluorescence שימש לזיהוי neoplasms מרקמות נורמליות27,28, המאפיינים תאי גזע29,30, הערכת תפקוד תאי מערכת החיסון31,32,33,34,35, מודד פעילות נוירולוגית36, 37,38, והבנת יעילות התרופה בסוגי סרטן כגון סרטן השד וסרטן הראש והצוואר21,39,40,41,42. הדמיית תצפרחת אוטומטית ברזולוציה גבוהה ניתן לשלב עם פילוח תמונה לניתוח תא יחיד וכימות של הטרוגניות תוך-אוכלוסיות43,44,44,45,45,46,47.

ניתן לצלם את NAD(P)H ו- FAD במיקרוסקופים פלואורסצנטיים של פוטון יחיד או רב-פוטון המוגדרים לעוצמה או להדמיה לכל החיים. עבור מיקרוסקופים של פוטון יחיד, NAD(P)H ו- FAD מתרגשים בדרך כלל באורכי גל של 375-405 ננומטר ו- 488 ננומטר, בהתאמה, בשל מקורות לייזר נפוצים באורכי גל אלה48. בהתרגשות פלואורסצנטית דו-פוטונית, NAD(P)H ו-FAD ירגשו באורכי גל של כ-700 עד 750 ננומטר ו-700 עד 900 ננומטר, בהתאמה, 15,49. לאחר הפלורופורים מתרגשים, NAD(P)H ו- FAD פולטים פוטונים באורכי גל בין ~ 410 ננומטר ל ~ 490 ננומטר ו ~ 510 ננומטר ~ 640 ננומטר, בהתאמה. אורכי הגל של פליטת NAD(P)H ו-FAD maxa הם כ-450 ננומטר ו-535 ננומטר, בהתאמה, בהתאמה.

בגלל אורכי הגל השונים של עירור ופליטה, הפלואורסצנטיות של שני הקואנזימים המטבוליים יכולה להיות מבודדת באופן ספקטרלי. הבנה של המאפיינים הספקטרליים של NAD(P)H ו- FAD נחוצה לתכנון ואופטימיזציה של פרוטוקולי הדמיה autofluorescence. ציאניד הוא מעכב עירוי מורכב של שרשרת הובלת אלקטרונים (ETC). ההשפעות של ציאניד על חילוף החומרים התאי ואת עוצמות autofluorescence ואת אורך החיים של NAD(P)H ו FAD בתוך תאים מאופיינים היטב27,40. לכן, ניסוי הפרעת ציאניד הוא אמצעי יעיל לאימות פרוטוקולי הדמיה NAD(P)H ו- FAD. ניסוי ציאניד מוצלח מספק ביטחון כי פרוטוקול הדמיה NAD(P)H ו- FAD יכול לשמש כדי להעריך את חילוף החומרים של קבוצות לא ידועות או הפרעות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ציפוי תאים להדמיה

  1. שאפו את המדיום מבקבוק T-75 בעל 80-90% של תאי MCF-7, שטפו את התאים ב-10 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית עם חוצץ פוספט (PBS), והוסיפו 2 מ"ל של 0.25% טריפסין (1x) כדי לנתק את התאים מתחתית הבקבוקון.
  2. דגירה הבקבוקון ב 37 °C (50 °F) במשך ~ 4 דקות. בדוק את התאים מתחת למיקרוסקופ כדי לאשר ניתוק.
  3. מיד להוסיף 8 מ"ל של מדיום תרבות כדי לבטל את הפעלת הטריפסין.
  4. לאסוף את התאים בצינור חרוטי (15 מ"ל או 50 מ"ל). לספור את התאים באמצעות hemocytometer.
  5. צנטריפוגה התאים 200 × גרם במשך 5 דקות.
  6. ברגע שצנטריפוגה, לשאוף את supernatant. Resuspend את גלולה של תאים ב 1 מ"ל של מדיום תרבות, וזרע 4 × 105 תאים על צלחת הדמיה 35 מ"מ זכוכית תחתונה (או מחזיק המדגם המתאים עבור המיקרוסקופ בשימוש).
  7. הוסף 2 מ"ל של מדיום תרבות לצלחת ההדמיה כדי לשמור על חילוף החומרים של התא.
  8. לדגור על התאים ב 37 °C (5° C) עם 5% CO2 עבור 24-48 שעות לפני הדמיה עבור התאים לדבוק ולהגיע לשלב הצמיחה הלוגריתמית.
    הערה: שלב הצמיחה נקבע על ידי ניסיון קודם עם תאים אלה ואושר עם גליון הנתונים של התא.

2. הדמיית FLIM רב-פוטונית של NAD(P)H ו-FAD

  1. הפעל את כל הרכיבים של מיקרוסקופ החיים פלואורסצנטיות פלואורסצנטיות רב-פוטוני, כולל המיקרוסקופ, מקור הלייזר והגלאים הנמצאים בשימוש.
  2. מיקום לדוגמה
    1. תדליק את המנורה של ברייטפילד. תוודא שהאור נכנס לעין. בחר מטרה, בדרך כלל 20x, 40x או 100x להדמיית תאים. החל 1 טיפה של אמצעי הטבילה המתאים על גבי המטרה [דלג אם משתמשים במטרת אוויר].
    2. הזז את המטרה למטה כדי למקם כראוי את המדגם מבלי לגעת במטרה. מניחים את צלחת הזכוכית התחתונה על מחזיק הדגימה על במת המיקרוסקופ. ודא שהדגימה מאובטחת ולא תזוז במהלך ההדמיה.
    3. מרכז את הדגימה עם המטרה באמצעות בקרת הבמה X-Y. ברגע שזה נעשה, להסתכל לתוך העין ולהזיז את המטרה למעלה כדי להתמקד בתאים.
    4. אם המיקרוסקופ נמצא בתוך מתחם, סגור את דלת תיבת האור. פתח את תוכנת רכישת התמונות, לחץ על הכרטיסיה הדמיה רב-פוטונית והגדר את הפרמטרים הבאים של הדמיה רב-פוטונית: גודל התמונה = 256 x 256 פיקסלים; זמן השתהות פיקסל = 4-25 μs; זמן רכישת תמונה כולל = ~ 60 s; רווח גלאי ממוטב לספירת פוטון יחיד = 85% (ספציפי למערכת הנמצאת בשימוש).
  3. הדמיה של פונקציית תגובת מכשירים (IRF) ותקן חיים פלואורסצנטי
    1. מניחים גבישי אוריאה על צלחת זכוכית תחתונה ומאבטחים את מכסה המנה עם סרט דבק או parafilm.
      הערה: גבישי אוריאה נשארים יציבים בטמפרטורת החדר במשך חודשים.
    2. דמיין את גבישי האוריאה.
      1. מניחים את צלחת האוריאה על במת המיקרוסקופ ומתמקדים בגביש אוריאה.
      2. הגדר את אורך הגל של לייזר העירור ל 900 ננומטר.
      3. השתמש במסנן פליטה הלוכד אורכי גל של 450 ננומטר.
      4. קבל תמונה לכל החיים פלואורסצנטיות של גביש אוריאה עם כוח לייזר במדגם <1 mW ולהשתמש הפרמטרים הדמיה המומלצים שהוזכרו בשלב 2.2.4.
    3. דמיינו את החרוזים הצהובים-ירוקים (YG) כסטנדרט לכל החיים של הפלואורסצנטיות.
      1. צור שקופית חרוזים YG על ידי דילול פתרון חרוז YG 1:1,000 במים סטריליים. מניחים נפח קטן (~ 30 μL) על מגלשה או צלחת זכוכית תחתונה. מכסים עם כיסוי ולאטום את הקצוות של כיסוי עם לק שקוף.
      2. מניחים את שקופית חרוז YG על במת המיקרוסקופ עם צד כיסוי של השקופית לכיוון המטרה.
      3. הגדר את אורך הגל של לייזר העירור ל- 890 ננומטר
      4. השתמש במסנן פליטה הלוכד אורכי גל של כ-500-600 ננומטר.
      5. קבל תמונה לכל החיים פלואורסצנטיות של חרוז YG באמצעות כוח לייזר בדגימה <1 mW ואת הפרמטרים התמונה המומלצים [שלב 2.2.4].
      6. בדוק את אורך החיים של החרוז באמצעות IRF של האוריאה. אם אורך החיים אינו ~ 2.1 ns, בדוק אם החרוז נמצא במגע עם חרוז אחר התורם למרווה פלואורסצנטית, פתרון החרוזים התייבש, החרוז אינו בפוקוס, IRF אינו מדויק, או שהמעבר בין IRF לריקבון פלואורסצנטי אינו ממוטב [ראה שלב 4.2.4].
        הערה: אורך החיים של ~ 2.1 ns יציב לאורך זמן.
  4. הדמיית NAD(P)H
    1. מניחים את צלחת הזכוכית התחתונה עם התאים על במת המיקרוסקופ ולהתמקד בתאים.
      הערה: מומלץ להציב את התאים בתא סביבתי כדי לשמור על רמות חום , לחות ופחמן דו חמצני במהלך רכישת תמונה, שכן פרמטרים אלה יכולים להשפיע על חילוף החומרים התאי.
    2. התאם את הרווח של הגלאי לערך האופטימלי עבור FLIM. בנוסף, שנה לזמן ההשתהות הרצוי - פרמטר המציין את הזמן שהלייזר מבלה בכל פיקסל של הדגימה.
      הערה: פרמטרים אלה צריכים להישאר זהים לאורך שארית ההליך. זאת כדי להבטיח עקביות בהגדרות תאורת לייזר וגלאי כדי להבטיח את תוקפן של המדידות מבוססות האינטנסיביות, התלויות בכוח לייזר, פרמטרי סריקה ורווח גלאי. יש רווח גלאי ממוטב להפעלת גלאים במצב ספירת פוטון יחיד; הערך הוא 85% עבור המערכת שאליה בוצעה הפניה.
    3. הגדר את הלייזר המולטיפוטוני ל-750 ננומטר. ודא כי בקרת הכוח עבור הלייזר מוגדרת באפס בתחילה, כך התאים לא ניזוקו עם פתיחת התריס על הלייזר.
      הערה: עירור ב 750 ננומטר מומלץ עבור NAD(P)H, אם כי יש לו ספיגה רחבה ב 700-750 ננומטר. עירור ב 890 ננומטר מומלץ עבור FAD, אם כי יש לו ספיגה רחבה ב 700-900 ננומטר.
    4. הגדר או בחר מסנן פליטה לאיסוף אורכי גל פליטה ב- ~ 400-500 ננומטר.
    5. התחל הדמיה באופן מיקוד או הצגה חיה כדי למטב את הגדרות התמונה.
      הערה: הלייזר פועל כעת. אין לפתוח את מארז המיקרוסקופ בשלב זה. ללבוש ציוד מגן אישי מתאים.
    6. לאט להגדיל את כוח הלייזר ~ 3-8 mW במדגם תוך הבטחת התאים נמצאים בפוקוס. לאחר ההתאמה, רשום את העוצמה המרבית שבה נעשה שימוש. השתמש בהגדרת צריכת חשמל זו עבור ההדמיה בקטעים אחרים של צלחת פטרי להדמיית NAD(P)H.
      הערה: חשוב למדוד את כוח הלייזר בדגימה או בחלון האיסוף ולא להסתמך על מתח התאים של pockels מכיוון שתאי הפוקלס אינם יציבים. לעתים קרובות כוח לייזר מנוטר במהלך הדמיה עם חלון איסוף במקום במדגם. באמצעות מד כוח שני במטרה, ניתן להשתמש בקשר בין הכוח בחלון האיסוף לבין הכוח במדגם כדי להעריך את הכוח המשוער במדגם ממדידות חלון האיסוף.
    7. אסוף תמונת NAD(P)H FLIM עם זמן שילוב תמונה של 60 שניות.
    8. ודא שלתמונה יש מספיק פוטונים (שיא של ~100 פוטונים לפיקסל ציטופלסמה) בתוך עקומת הריקבון של חיי הפלואורסצנטיות. אם מספר הפוטונים נמוך מדי, הגדל את עוצמת הלייזר או את משך הזמן של רכישת התמונה.
      הערה: מספר השיא המינימלי של פוטונים בתוך הריקבון המעריכי של הפלואורסצנטיות תלוי בפרמטרים של המערכת, כולל רזולוציית זמן, IRF ורעשי רקע.
  5. הדמיית FAD
    1. הגדר את הלייזר המולטי-פוטוני ל- 890 ננומטר והמתן עד שהוא יינעל במצב באורך הגל החדש. ודא כי בקרת הכוח עבור הלייזר מוגדרת באפס בתחילה, כך התאים לא ניזוקו עם פתיחת התריס על הלייזר.
      הערה: אל תזיז את הבמה או את המוקד האובייקטיבי בעת ביצוע שלב זה. שדה הראייה FAD (FOV) צריך להתאים ישירות ל- NAD(P)H FOV עבור תמונה זו.
    2. הגדר או בחר מסנן פליטה לאיסוף אורכי גל פליטה ב- ~ 500-600 ננומטר.
    3. התחל הדמיה באופן מיקוד או הצגה חיה כדי למטב את הגדרות התמונה.
      הערה: הלייזר פועל כעת. אין לפתוח את מארז המיקרוסקופ בשלב זה.
    4. הגדל באיטיות את עוצמת הלייזר ל- ~ 5-10 mW בדגימה ורשום את ההספק המרבי המשמש. השתמש בזה כהגדרת הכוח להדמיה בקטעים אחרים של צלחת פטרי להדמיית FAD.
    5. אסוף תמונת FAD FLIM עם זמן שילוב תמונה של 60 שניות.
    6. ודא שלתמונה יש מספיק פוטונים (שיא של ~100 פוטונים לפיקסל ציטופלסמה) בתוך עקומת הריקבון של חיי הפלואורסצנטיות. אם מספר הפוטונים נמוך מדי, הגדל את עוצמת הלייזר או את משך הזמן של רכישת התמונה.
      הערה: מספר השיא המינימלי של פוטונים בתוך הריקבון המעריכי של הפלואורסצנטיות תלוי בפרמטרים של המערכת, כולל רזולוציית זמן, IRF ורעשי רקע.
  6. חזור על שלבים 2.4-2.5 בארבעה עד חמישה FOVs נוספים. ודא שכל תמונה מרווחת במרחק של לפחות 2 FOVs מהמיקומים שצולמו.

3. הכנת ניסוי ציאניד

  1. ממיסים 130.24 מ"ג נתרן ציאניד ב-25 מ"ל של PBS כדי לייצר תמיסת נתרן ציאניד של 80 מ"מ (20x).
    הערה: ציאניד רעיל. ללבוש ציוד מגן אישי מתאים.
  2. שאפו 100 μL של מדיום תרבות מהמנה. החלף את זה עם 100 μL של פתרון נתרן ציאניד כדי לקבל ריכוז 4 מ"מ של ציאניד בצלחת.
  3. שים את התאים באינקובטור במשך 5 דקות כדי לאפשר לתאים להגיב עם פתרון ציאניד.
  4. חזור על שלבים 2.4-2.6 כדי לרכוש תמונות NAD(P)H ו- FAD של התאים לאחר חשיפה לציאניד.
    הערה: חשיפה ממושכת לציאניד תהרוג את התאים. תמונות לאחרcyanide נרכשות בתוך 30 דקות של תוספת ציאניד.

4. ניתוח תמונות FLIM

  1. פתח את תוכנת ניתוח החיים של FLIM.
    1. פתח את תמונת האוריאה כדי לרכוש את ה- IRF הנמדד.
    2. יבאו את תמונת האוריאה. בחר נקודה על התמונה של גביש אוריאה שישמש לניתוח תמונה. הגדל את ערך הסל המרחבי כדי לשלב נתוני FLIM מפיקסלים מרובים ל- 1 או יותר עבור שיא ריקבון > 100 פוטונים על-ידי שינוי המשתנה Bin הממוקם בממשק התוכנה הראשי.
    3. שמור את הנתונים כ- IRF.
      1. בתוכנה שאליה בוצעה הפניה, לחץ על התפריט הנפתח שכותרתו IRF, בחר העתק מנתוני ריקבון. לאחר מכן, לחץ על העתק ללוח לשימוש בניתוח התמונה של התמונה שצולמה במהלך הניסוי.
  2. ניתוח תמונה של תמונות בעלות חיים של NAD(P)H ו-FAD
    1. יבא את קובץ התמונה לתוכנת ניתוח אורך חיים של פלואורסצנטיות.
    2. שפר את התצוגה החזותית של התמונה כדי לראות את התאים והתאים התת-תאיים על-ידי שינוי העוצמה והניגודיות במידת הצורך.
      1. לחץ על התפריט הנפתח אפשרויות ובחר עוצמה. כאן, שנה את האינטנסיביות והניגודיות כרצונך ולחץ על אישור.
    3. יבא את ה- IRF מתמונת האוריאה.
      1. לחץ על התפריט הנפתח IRF ובחר הדבק מהלוח.
    4. הגדר פרמטרי ריקבון רב-תכליתי50.
      1. הגדר ערך סף להערכת ריקבון עבור פיקסלים של ציטופלסמה.
        הערה: כאן נעשה שימוש בערך של 50. הערך נבחר על-ידי השוואת ערכי שיא הפלואורסצנטיות של מספר פיקסלי רקע וגרעין מייצגים עם ערך השיא של מספר פיקסלים של ציטופלסמה. ערך בין פיקסלי הגרעין לפיקסלים של ציטופלסמה נבחר עבור הסף.
    5. ודא שהערך Shift מיישר את ה- IRF ביחס לקצה העולה של הפלואורסצנטיות. התאם את ההזזה במידת הצורך לערך הממזער את הערך Chi בריבוע.
    6. הגדל את הפח המרחבי כך שלפיקסלים של ציטופלסמה יהיו ערכי שיא פלואורסצנטיים ב- 100 או מעליהם.
      הערה: הגדלת הפח המרחבי תוביל לירידה ברזולוציה המרחבית.
    7. חשב משכי חיים של פלואורסצנטיות עבור כל הפיקסלים בתמונה.
      1. בתוכנית שאליה בוצעה הפניה, לחץ על התפריט הנפתח חשב | מטריצת ריקבון.
        הערה: הצלחה מסומנת בתמונה בצבע כוזב לאורך חיי הפלואורסצנטיות המשוקללים של משרעת.
    8. שמור את נתוני אורך החיים של הפלואורסצנטיות.
      1. לחץ על התפריט הנפתח קובץ | ייצוא. בחר את הפרמטרים הרצויים לניתוח ולחץ על אישור. שמור את התמונה.
      2. בחר בלחצן צבע מהתפריט הנפתח אפשרויות כדי להתאים את מדד אורך החיים של הפלואורסצנטיות המוצג, את תצורת הצבע ל - B-G-R, והגדר את ערכי המינימום והמקסימום של סרגל הצבע הספציפי כדי להתאים את קנה המידה הצבע של תמונת אורך החיים של הפלואורסצנטיות.

Figure 2
איור 2: IRF מדוד של גביש אוריאה. (א) תמונת עוצמה המתקבלת מהאוריאה. פיקסל מייצג נבחר כדי ליצור את עקומת הריקבון של IRF (B) לניתוח מאוחר יותר של תמונות אורך חיים פלואורסצנטיות של תאים. קיצור: IRF = פונקציית תגובת מכשיר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. פילוח תאים
    הערה: הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בתוכנת ניתוח תמונה51. תמונות MCF-7 נציג וקוד ניתוח נתונים מסופקים52.
    1. הורד את הקובץ MCF7_Segmentation_Final.cpproj52.
    2. יבא את צינור MCF7_Segmentation על-ידי לחיצה על | קבצים | ייבוא צינור מקובץ, בחר את הקובץ MCF7_Segmentation_Final.cpproj.
    3. לחץ על המודול תמונות והוסף את התמונות בעוצמה של NAD(P)H למפולח.
      הערה: התמונות חייבות להיות בתבנית .tif, .png או .jpg.
    4. לחצו על הלחצן 'נתח תמונות ' בפינה הימנית התחתונה.
      הערה: ייתכן שצינור יזדקק למיטוב עבור תמונות שנרכשו במערכות שונות. לפתרון בעיות, נסה את צעדי המשנה הבאים
      1. השתמש במצב הבדיקה לבדיקת פרמטרים שונים: לחץ על מצב בדיקת התחלה והפעל כל מודול על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה לצד שם המודול.
      2. לחץ על המודול הראשון של IdentifyPrimaryObjects והתאם את הקוטר הטיפוסי של אובייקטים, ביחידות פיקסלים (מינימום, מקסימום) כדי להתאים לקוטר התאים.
        הערה: עבור תאי MCF-7, נעשה שימוש ב- 10 ו- 40 פיקסלים עבור המינימום והמקסימום, בהתאמה.
      3. לחץ על מודול EnhanceOrSuppressFeatures והתאם את גודל התכונה כדי לשפר את הזיהוי של סוג התכונה שנבחר.
        הערה: גודל תכונה של 10 פיקסלים שימש עבור תאי MCF-7.
      4. לחץ על מודול EnhanceOrSuppressFeatures השני והתאם את טווח גדלי החורים כדי למטב את שיפור האזורים הגרעיניים.
        הערה: טווח של 5-20 שימש עבור תאי MCF-7.
      5. לחץ על המודול השני IdentifyPrimaryObjects והתאם את הפרמטרים (אסטרטגיית סף, שיטת סף, קנה מידה של החלקת סף ומקדם תיקון סף) כדי למטב את הזיהוי של גרעינים. לחץ על ? על ידי כל פרמטר כדי לזהות הגדרות אופטימליות ולהחיל על מודול IdentifySecondaryObjects .
      6. לחץ על מודול FilterObjects והתאם את צורת האזור. בחר פיקסל מינימלי ומקסימלי של צורת האזור לזיהוי.
        הערה: עבור תאי MCF-7, 100 ו- 500 שימשו עבור המקסימום והמינימום, בהתאמה. תהליך פילוח התאים על ידי זיהוי הגרעין וההתפשטות לגבולות התא מוסבר בפירוט על ידי וולש ו- Skala47.
    5. באמצעות מסכות הציטופלסמה של התא, ממוצע משתני הפלט של אורך החיים של פלואורסצנטיות עבור כל תא בתוך התמונה.

Figure 3
איור 3: זיהוי ופילוג של תאים בודדים. תמונת העוצמה של NAD(P)H של תאי MCF7 (A) המתקבלת על-ידי שילוב תמונת אורך חיים פלואורסצנטית. תאים צולמו באמצעות עירור 750 ננומטר ב 5 mW עבור 60 s. צירי x ו- y מייצגים את מיקום הפיקסלים של התמונה. (א) זוהו תאים בודדים. התאים היו רעולי פנים (B) כדי למנוע רעשי רקע מערכת הנתונים. לאחר מכן זוהה הגרעין (C) והוקרן על מסכת התא (D). לאחר מכן התאים סוננו (E) כדי להסיר אזורים עם מסיכה שאינם מתאימים לגודל של תאים טיפוסיים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

5. שיטה חלופית: הדמיית עוצמת פלואורסצנטיות

  1. הפעל את הציוד שישמש במהלך הניסוי.
    הערה: ניתן לרכוש תמונות בעוצמה פלואורסצנטית עם מיקרוסקופים פלואורסצנטיים רחבי טווח, מיקרוסקופים פלואורסצנטיים קונפוקליים או מיקרוסקופים רב-פוטוניים.
    1. ודא שלמיקרוסקופ שישמש יש מקור עירור מתאים עבור NAD(P)H (אורך גל פוטון יחיד ~ 370-405 ננומטר: אורך גל של שני פוטונים ~ 700-750 ננומטר) ו- FAD (אורך גל פוטון יחיד ~ 488 ננומטר, אורך גל של שני פוטונים ~ 890 ננומטר).
    2. ודא כי המיקרוסקופ יש מסנן לבידוד של פליטת NAD(P)H (~ 400-500 ננומטר).
      הערה: 4',6-Diamidino-2-פנילינדולה (DAPI) הגדרות לעתים קרובות לעבוד עבור NAD(P)H.
    3. ודא שלמיקרוסקופ יש מסנן לבידוד פליטת FAD (~500-600 ננומטר).
      הערה: הגדרות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) פועלות לעתים קרובות עבור FAD.
  2. הכינו את המיקרוסקופ.
    1. תדליק את המנורה של ברייטפילד. תוודא שהאור נכנס לעין. יש למרוח טיפה אחת של מדיום הטבילה המתאים על גבי המטרה המתאימה במידת הצורך.
    2. הזז את המטרה למטה כדי למקם כראוי את הדגימות ללא כל הפרעה. מניחים את צלחת הפטרי על הבמה כראוי. ודא שהדגימה מאובטחת ולא תזוז במהלך ההדמיה.
      הערה: מומלץ להציב את התאים בתא סביבתי כדי לשמור על רמות חום , לחות ופחמן דו חמצני במהלך רכישת תמונה, שכן פרמטרים אלה יכולים להשפיע על חילוף החומרים התאי.
    3. מרכז את הדגימה עם המטרה. ברגע שזה נעשה, להסתכל לתוך העין ולהזיז את המטרה עד התאים נראים בפוקוס.
  3. התחל הדמיית עוצמה.
    1. פתח את תוכנת ההדמיה והגדר את תצורת העירור והפליטה כדי ללכוד NAD(P)H על-ידי לחיצה על הכרטיסיה לכידה בתוכנת רכישת התמונה ומיצוב מסנן העירור והפליטה NAD(P)H בצריח המיקרוסקופ.
      הערה: מסנן עירור 357/44, דיכרואי 409 longpass ומסנן פליטה 447/60 שימשו להדמיית NAD(P)H.
    2. מטב את תאורת העירור ואת הפרמטרים גלאי. אם הלבנה היא בעיה, הפחיתו את עוצמת התאורה והגדילו את זמן שילוב התמונה.
      הערה: NAD(P)H הוא אות חלש; להיות מודעים להלבנה אם נעשה שימוש בכוח רב מדי.
    3. השג תמונת NAD(P)H של גודל התמונה הרצוי. ודא שהתמונה נשמרת.
    4. הגדר את תצורת העירור והפליטה כדי ללכוד FAD. מטב את תאורת העירור ואת הפרמטרים גלאי.
      הערה: מסנן עירור 458/64, דיקרויק 495 longpass ומסנן פליטה 550/88 שימשו להדמיית FAD.
    5. השג תמונת FAD. ודא שהתמונה נשמרת.
      הערה: פרמטרי רכישת תמונות NAD(P)H ו- FAD (עוצמת תאורה, גודל תמונה, רווח גלאי) צריכים להישאר זהים לאורך כל ניסוי ההדמיה.
    6. חזור על התהליך בחמישה מיקומים נוספים, במרווחים של לפחות 2 FOVs הרחק מהמיקומים המדומיאים.
  4. ניתוח נתונים של יחס redox ברמת התמונה
    1. פתחו את התמונות בעצימות NAD(P)H ו-FAD בתוכנית עיבוד תמונה.
    2. הגדר סף ב- NAD(P)H כדי לשמור על פיקסלים של ציטופלסמה ולהגדיר פיקסלים ברקע ובגרעין ל- 0.
    3. חשב את תמונת יחס ה- redox על-ידי הערכת המשוואה FAD/(NAD(P)H+FAD) בכל פיקסל באמצעות תמונת NAD(P)H בעלת הסף.
    4. חשב את הערך הממוצע של הפיקסלים שאינם 0 פיקסלים.
      הערה: שלבים אלה יכולים להתבצע בתוכנה לניתוח תמונות או מקודד ישירות באמצעות סקריפטים.
  5. ניתוח יחס redox ברמת התא
    1. בצע את השלבים 4.3.1-4.3.5 כדי לקבל תמונת מסיכה של התאים בתוך כל תמונת NAD(P)H.
    2. חשב את תמונת יחס ה- redox על-ידי הערכת המשוואה FAD/(NAD(P)H+FAD) בכל פיקסל.
    3. באמצעות מסיכת הציטופלסמה של התא, ממוצע יחס ה- Redox עבור כל הפיקסלים עבור כל תא בתמונה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

קו תאי סרטן השד האפיתל, MCF-7, היה תרבית ב- DMEM בתוספת סרום בקר עוברי 10% (FBS) ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין. להדמיית פלואורסצנטיות, התאים נזרעו בצפיפות של 4 × 105 תאים לכל צלחת הדמיה תחתית זכוכית 35 מ"מ 48 שעות לפני ההדמיה. התאים צולמו לפני ואחרי טיפול ציאניד באמצעות הפרוטוקולים שצוינו לעיל. מטרת ניסוי הציאניד היא לאשר בידוד ספקטרלי של פלואורסצנטיות NAD(P)H ו- FAD ולאמת את מערכת ההדמיה ופרוטוקול הניתוח לאיתור שינויים מטבוליים בתאים. תמונות משולבות של NAD(P)H ו- FAD פלואורסצנטיות צולמו בחמישה מיקומים שונים לפני ציאניד וחמישה מיקומים שונים לאחר הוספת ציאניד למדיום. פרמטרים של משך חיים פלואורסצנטי (יחס אורך חיים אופטי, NAD(P)H α 1, NAD(P)H τ1, NAD(P)H τ2, NAD(P)H τm, FAD τ1, FAD τ2, FAD α 1, FAD τ1, FAD τ2 ו- FAD τm) חושבו באמצעות ה- IRF הנמדד מאוריאה (איור 2) וממוצע לאורך הפיקסלים של הציטופלסמה של כל תא המשמש לפילוח (איור 3).

הדמיה לכל החיים של פלואורסצנטיות רב-פוטונית של NAD(P)H ו-FAD מאפשרת הדמיה של מורפולוגיה של תאים וחילוף חומרים (איור 4). הרזולוציה הגבוהה שהושגה עם מיקרוסקופיה רב-פוטונית מאפשרת זיהוי של תאים בודדים. NAD(P)H ו-FAD ממוקמים בעיקר במיטוכונדריה ובציטופלסמה, ואילו הגרעין, שחסר בו NAD(P)H ו-FAD מטבוליים, כהה בהשוואה ל-23,53. התמונות לכל החיים מספקות הדמיה של אורך החיים המשוקלל של NAD(P)H ו-FAD בכל התא וכתוצאה מחשיפה לציאניד (איור 4).

Figure 4
איור 4: תמונות באורך חיים של פלואורסצנטיות מייצגות של תאי MCF7 לפני ואחרי טיפול ציאניד. (A) תמונת חיים של פלואורסצנטיות משוקללת של NAD(P)H ו- (B) תמונת חיים של פלואורסצנטיות משוקללת של FAD לפני טיפול ציאניד. (A) תמונת חיים של פלואורסצנטיות משוקללת של NAD(P)H ו- (B) תמונת חיים של פלואורסצנטיות משוקללת של משרעת FAD לפני טיפול ציאניד. (C) NAD(P)H משוקלל פלורסצנטיות תמונה לכל החיים ו (D) FAD משרעת משוקלל פלואורסצנטיות תמונה לכל החיים לאחר טיפול ציאניד. אורך החיים של פלואורסצנטיות משוקלל משרעת (המצוין על ידי סרגל הצבעים) מודד את הזמן שבו פלואורופור, במקרים אלה NAD(P)H ו- FAD, נמצא במצב נרגש. NAD(P)H החיים פוחתת עם טיפול ציאניד, בעוד אורך החיים FAD עולה לאחר טיפול ציאניד. אות NADH צולם באמצעות עירור 750 ננומטר ב 5 mW עבור 60 s, ואת אות FAD היה בתמונה באמצעות עירור 890 ננומטר ב 7 mW עבור 60 s. תמונות שנרכשו עם מטרה של 40x טבילה במים, צמצם מספרי = 1.1. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

ציאניד מעכב עירוי מורכב של שרשרת הובלת האלקטרונים, אשר מעכב זרחן חמצוני2,15. לאחר חשיפה ציאניד ולפני מוות תאים, NAD(P)H מצטבר בתוך המיטוכונדריה, ו FAD פוחתת 1,15. בשל שינויים מוגדרים היטב אלה בעוצמה NAD(P)H ו- FAD עקב עיכוב ציאניד של חילוף החומרים, ההפרעה היא בדיקה סטנדרטית כדי לאמת הדמיה וניתוח autofluorescence פרוטוקולים וניתוח2,54. כצפוי, יחס ה-REDOX האופטי (FAD/(FAD+NAD(P)H)) של תאי MCF-7 ירד לאחר טיפול בציאניד (איור 5, p = 0.044, בדיקת t של וולש). יחס ה- Redox האופטי אינו נוסחה מתוקננת, אך כל נוסחאות האינטנסיביות הוכחו כשווה ערך ל-20. FAD/(NAD(P)H+FAD) נבחר כדי להגדיר את יחס ה- redox האופטי מכיוון שהסכום המשולב של NAD(P)H ו- FAD במכנה מספק ערך מנורמל בין 0 ל- 120,55. ההשפעה ההפוכה - עלייה ביחס redox אופטי -צפוי עבור הפרעות ציאניד עם יחסי redox אופטי מחושב עם NAD(P)H במונה.

Figure 5
איור 5: יחס redox אופטי של תאי MCF7 יורד עם טיפול ציאניד. לוחות התיבות מציגים את החציון ואת המחצבה הראשונה והשלישית המחושב מנתוני התא. הממוצע מיוצג על-ידי סמל הנקודה השחורה, והחציון מיוצג על-ידי הקו השחור שבתוך התיבה. נקודות הנתונים האפורות הכלולות בכל לוח תיבות מייצגות את הערך הממוצע של כל הפיקסלים של הציטופלסמה בכל תא. קבוצת הביקורת כללה 91 תאים מחמש תמונות שונות, וקבוצת הציאניד כללה 95 תאים מחמש תמונות שונות. p < 0.01, מבחן T של וולש. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

אורך החיים של תאי NAD(P)H (τm) של תאי MCF7 במשקל משרעת ירד עם חשיפה לציאניד (איור 6A, p < 2.2 × 10-16, בדיקת t של וולש). הן אורך החיים הקצר והארוך ירד עבור NAD(P)H (איור 6B,C) אך גדל עבור NAD(P)H α 1 (איור 6D). שינויים אלה במהלך חיי הפלואורסצנטיות של NAD(P)H, ירידה ב- τm, עלייה α 1, וירידה בערכים שפורסמו תואמים של τ2 ערכים שפורסמו של הפרעות ציאניד40,56. הירידה בחיי הפלואורסצנטיות המשוקללת של NAD(P)H עם חשיפה לציאניד מצביעה על מרווה מוגברת בתוך המיקרו-סביבה של NAD(P)H. עלייה α 1 מצביעה על NAD(P)H חופשי יותר, כצפוי מהעלייה של NAD(P)H בשל ההשפעות של ציאניד על חילוף החומרים התאי21.

Figure 6
איור 6: אורך החיים של פלואורסצנטיות NAD(P)H של תאי MCF7 לפני ואחרי טיפול ציאניד. לוחות התיבות בחלוניות A-D מציגים את החציון ואת המחצבה הראשונה והשלישית המחושב מנתוני רמת התא. הממוצע מיוצג על-ידי סמל הנקודה השחורה, והחציון מיוצג על-ידי הקו השחור שבתוך התיבה. נקודות הנתונים האפורות הכלולות בכל לוח תיבות מייצגות את הערך הממוצע של כל הפיקסלים של הציטופלסמה בתוך תא. קבוצת הביקורת כללה 91 תאים מחמש תמונות שונות, וקבוצת הציאניד כללה 95 תאים מחמש תמונות שונות. (A-D) מציגים את השינויים ב-NAD(P)H משוקלל חיים (τm), אורך חיים קצר של NAD(P)H (τ1), אורך חיים ארוך של NAD(P)H (τ2) ורכיב יחסי NAD(P)H של אורך החיים הקצר (α 1) עקב טיפול ציאניד. ערכי p חושבו באמצעות מבחן t של וולש. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

אורך החיים של תאי MCF7(τm) של משרעת גדל לאחר חשיפה לציאניד (איור 7A, p = 3.688 × 10-12, בדיקת t של וולש). אורך החיים הקצר והארוך גדל עבור ה-FAD (איור 7B,C) אך ירד עבור FAD α 1 (איור 7D). שינויים באורך החיים של הפלואורסצנטיות של FAD, עלייה ב- τm ו- τ2, וירידה α 1 עולים בקנה אחד עם נתוני אורך החיים של פלואורסצנטיות של FAD שפורסמו של ציאניד perturbation57. השינוי בערכי אורך החיים וב-α 1 מרמז על שינויים מטבוליים בתוך התאים, כולל כמות מוגברת של FAD21 בחינם.

Figure 7
איור 7: חיי הפלואורסצנטיות של FAD לפני ואחרי טיפול ציאניד. תיבות הקופסה ב- A-D מציגות את החציון, את המחצבה הראשונה והשלישית, ואת הממוצע המחושב מהנתונים ברמת התא. הממוצע מיוצג על-ידי סמל הנקודה השחורה, והחציון מיוצג על-ידי הקו השחור שבתוך התיבה. נקודות הנתונים האפורות הכלולות בכל לוח תיבות מייצגות את הערך הממוצע של כל הפיקסלים של הציטופלסמה בתוך תא. קבוצת הביקורת כללה 91 תאים מחמש תמונות שונות, וקבוצת הציאניד כללה 95 תאים מחמש תמונות שונות. (A-D) מציגים את השינויים בכל החיים המשוקללים של משרעת FAD (τm), אורך חיים קצר של FAD (τ1), אורך חיים ארוך של FAD (τ2) ומרכיב פרופורציונלי FAD של החיים הקצרים (α 1) מטיפול ציאניד. ערכי p חושבו באמצעות מבחן t של וולש. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עוצמת autofluorescence והדמיה לכל החיים היו בשימוש נרחב כדי להעריך את חילוף החומרים בתאים21,55. FLIM הוא ברזולוציה גבוהה ולכן פותר תאים בודדים, אשר חשוב עבור מחקרי סרטן כי הטרוגניות הסלולר תורם תוקפנות הגידול ועמידות לתרופות7,39,41,44,44,45,46,58. כמו כן, הדמיה autofluorescence של חילוף החומרים התאי שימושי להדמיית תאים חיסוניים כמו תפקוד תאי החיסון קשור חילוף החומרים התאי, ואוכלוסיות תאי החיסון הם לעתים קרובות הטרוגניים20,31. בדיקות ביוכימיות סטנדרטיות בדרך כלל להעריך תאים חיסוניים ברמת האוכלוסייה או דורשים תיוג תאי בעקבות חדירות תאים34,59,60. הדמיית Autofluorescence מתאימה גם לרזולוציה גבוהה במידות vivo ודינמיות של חילוף החומרים בשל האופי הלא הרסני של האור והיעדר תוויות כימיות או מקודדות גנטית36,37,37,38,41,41,48,55 . צעדים קריטיים להדמיית עוצמת הפלואורסצנטיות של NAD(P)H ו-FAD כוללים את בחירת אורכי הגל המתאימים לעירור ופליטה, אימות שהתאים אינם מכילים פלואורופורים סינתטיים או אנדוגניים נוספים שיתרמו פלואורסצנטיות חופפת, ושימוש בכוחות לייזר לא מזיקים.

הדמיית זרם אוטומטי של NAD(P)H ו-FAD ממלאת נישה ייחודית כטכנולוגיית הדמיה מטבולית כמותית נטולת תוויות, ברזולוציה גבוהה וכמותית. שיטות הדמיה אחרות, כגון FDG-PET ו- MRS, חילוף החומרים של רקמת התמונה אך חסרות רזולוציה ברמה התאית ולכן אינן יכולות להעריך הטרוגניות תאית. טכניקות ביוכימיות אחרות, כגון בדיקות צריכת חמצן, מדידות של מטבוליטים בתקשורת, או ניתוח חלבונים, דורשות ריאגנטים יקרים לשימוש חד-פעמי, משיגות מדידות מתאים מאוחדים ודורשות פרוטוקולים של הרס תאים, מניעת מחקרי קורסי זמן או ניתוח vivo 61,62.

בעוד הדמיה autofluorescence של NAD(P)H ו- FAD מספק תמונות ברזולוציה גבוהה באופן ללא תוויות ולא הרסני, כמה מגבלות של הדמיה autofluorescence יש לקחת בחשבון בעת תכנון ופרשנות ניסויים. FLIM דורש ציוד מיוחד ויקר שאינו זמין באופן נרחב. עירור FLIM דורש מקור עירור פעמו עם פולסים picosecond או femtosecond בקצב חזרה בין 40 ל 100 MHz עם כוח פלט > 50 mW63. בנוסף, רכישת התמונה איטית יחסית, עם טרייד-אוף בין מספר הפיקסלים או רזולוציית התמונה וזמן רכישת התמונה. הפרמטרים המומלצים בפרוטוקול זה של 256 x 256 פיקסלים וזמן אינטגרציה של 60 s מספקים תמונה ברזולוציה סבירה בטווח של כ-1.6 ק"מ. המשתמש יכול לבחור לדמיין אזורים קטנים יותר עם פחות פיקסלים או לבצע סריקות קו כדי לשפר את מהירות ההדמיה.

לחלופין, ניתן לרכוש תמונות עם פיקסלים גבוהים יותר עם זמני שילוב תמונה מוגברים. ניתוח הנתונים והפרשנות של תמונות חיים autofluorescence יכול להיות מאתגר כמו FLIM מספק מידע ביופיזי ספציפי על קואנזימים מטבוליים והסביבה המולקולרית שלהם ולא מסלולים מטבוליים ספציפיים. מיקרוסקופיה אופטית מוגבלת גם על ידי עומק חדירת האור ברקמה עקב פיזור אור וספיגה. במחקרים vivo ניתן לעשות, בעומקים של ~ 0.5 מ"מ עם מערכות הדמיה מולטיפוטוניות, של רקמות פני השטח או דרך חדרי החלון2,20,21,64,65.

בעוד NAD(P)H ו- FAD הם הפלורופורים האנדוגניים העיקריים בתאים מבודדים, מולקולות נוספות, כולל קולגן ואלסטין, יכולות לתרום אותות autofluorescence ברקמות. התמונות ברזולוציה גבוהה של מיקרוסקופיה רב-פוטונית מאפשרות הדמיה של תאים תאיים ונוצרליים לפילוח של פיקסלי NAD(P)H ו-FAD מהחלבונים החוץ-תאיים40. תאים מסוימים מכילים מולקולות אנדוגני עם פלואורסצנטיות חופפת, כגון ליפופוסין, רטינול, טריפטופן, מלנין66. לכן, תמונות autofluorescence של NAD(P)H ו- FAD עשוי להכיל תרומות רקע ממולקולות אנדוגניות אחרות.

כמו כן, בעוד NAD(P)H ו- FAD ניתן מולטיפלקס עם פלואורופורים אקסוגניים הפולטים באורכי גל מעל 600 ננומטר, תוויות אקסוגניות, כגון DAPI או חלבונים מקודדים גנטית כגון GFP, חופפים באופן ספקטרלי עם הדמיה autofluorescence. ניסוי ההפרעה ציאניד המתואר כאן מסייע לוודא שאורכי הגל של עירור ופליטה מבודדים את NAD(P)H ו- FAD במידה מספקת כדי ללכוד שינויים מטבוליים בתאים. ניתן להחיל סוגי תאים אחרים על פרוטוקול זה; עם זאת, המשתמש צריך לייעל פרמטרי הדמיה, כולל כוח לייזר וזמן שילוב תמונה עבור כל סוג תא, ולהתנסות כדי למנוע הלבנת פוטו. ניתן למזער את ההלבנה באמצעות צילום על-ידי ניטור קצב ספירת הפוטונים או עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת במהלך ההדמיה למשך הסריקה לכל החיים. עלייה או ירידה בעוצמת הפלואורסצנטיות מצביעה על כך שכוח הלייזר גבוה מדי. אם כוחות לייזר גורמים להלבנת פוטו, ניתן להפחית את העוצמה, ורכישת התמונה הכוללת גדלה כדי להשיג אוסף פוטונים מספיק לניתוח לכל החיים.

למרות שאורך החיים של הפלואורסצנטיות אינו תלוי בפרמטרים של הדמיה, כולל כוח לייזר ורווח גלאי, עוצמת הפלואורסצנטיות תלויה בפרמטרים אלה20. לכן, בעת ביצוע הדמיה autofluorescence כדי לכמת את יחס redox אופטי, זה קריטי להשתמש בפרמטרים הדמיה עקביים. הפרוטוקול ממליץ לרכוש 5-6 תמונות של FOVs שונים מכל קבוצת ניסוי. גודל מדגם זה מספק נתונים מספיקים הן ברמת התמונה והן ברמת התא כדי לפתור את ההבדלים הצפויים בפרמטרים של משך חיים פלואורסצנטי של תאי MCF7 זורמים עקב הפרעת ציאניד. המספר האופטימלי של תמונות שנרכשו לכל קבוצה תלוי בתכנון הניסיוני ובגודל האפקט. בעת מעבר בין תמונות NAD(P)H ו- FAD, מישור המוקד צריך להישאר זהה בכל מיקום לעקביות. למרות הדמיה לכל החיים בדרך כלל אין מספר רווי של פוטונים, תמונות אינטנסיביות שנרכשו עם מצלמות או צינורות photomultiplier יכול להיות רווי. יש להימנע מרווי פיקסלים כדי להבטיח שכל טווח העוצמות הפיזיולוגיות יילכד בתמונות.

בעת ניתוח תמונות אורך חיים של פלואורסצנטיות, ניתן להשתמש ב- IRF מדוד או ב- IRF מדומה. IRF מדומה מוערך מן upshoot של עקומת החיים הפלואורסצנטית; עם זאת, ה- IRF האמיתי המתקבל מהמערכת עשוי להיות רחב יותר בהתאם למערכת ובכך לגרום לערכי חיים מדויקים יותר. בעוד IRF בדרך כלל רק משתנה עם שינויי חומרה או תוכנה, מדידת IRF יומית היא תרגול טוב כדי להבטיח את מערכת חיי הפלואורסצנטיות פועלת כצפוי.

בסך הכל, הדמיה אוטופלואורסצנטית של NAD(P)H ו- FAD מספקת שיטה נטולת תוויות ולא הרסנית לדמות ולנתח את חילוף החומרים התאי ברמה של תא יחיד. שיטה זו מספקת גישה צעד אחר צעד כדי לאמת את ההדמיה של NAD(P)H ו- FAD באמצעות ציאניד כדי לגרום הפרעה מטבולית מאופיינת היטב בתאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

מקורות המימון כוללים את המכון למניעת סרטן ומחקר של טקסס (CPRIT RP200668) ואוניברסיטת טקסס A&M. איור 1 נוצר עם BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-deoxy-d-glucose (2-DG) Sigma AC111980000; AC111980010; AC111980050; AC111980250
Antibiotic Antimicrobial (pen-strep) Gibco 15240096
Cell Samples American Type Culture Collection N/A MCF-7 cancer line
CellProfiler Broad Institute N/A Image analysis software
Conical Tube VWR 89039-664 15 mL conical tube
DMEM ThermoFisher 11965092 Culture media
FAD dichroic mirror Semrock FF495-Di03-25x36 495 nm
FAD emission filter Semrock FF01-550/88-25 550/88 nm
FAD excitation filter Semrock FF01-458/64-25 458/64 nm
FBS ThermoFisher 16000036
Fluorescence Lifetime Microscope 3i N/A
Glass bottom dish MatTek Corp P35G-1.0-14-C
Multiphoton Laser Coherent N/A 2P Coherent Laser, Tunable 680 nm-1080 nm
NAD(P)H dichroic mirror Semrock FF409-Di03-25x36 409 nm
NAD(P)H emission filter Semrock FF02-447/60-25 447/60 nm
NAD(P)H excitation filter Semrock FF01-357/44-25 357/44 nm
PBS ThermoFisher 70011044
Potassium Cyanide Sigma-Aldrich 380970
SlideBooks 6 3i N/A Image acquisition software
SPCImage Becker & Hickl GmbH N/A Fluorescence lifetime analysis software
Stage Top Incubator okoLab N/A
Trypsin Biosciences 786-262
Urea Sigma-Aldrich U5128
YG beads Polysciences 19096-2 Yg microspheres (20.0 µm)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heikal, A. A. Intracellular coenzymes as natural biomarkers for metabolic activities and mitochondrial anomalies. Biomarkers in Medicine. 4 (2), 241-263 (2010).
  2. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Optical imaging using endogenous contrast to assess metabolic state. Annual Review of Biomedical Engineering. 14, 351-367 (2012).
  3. Zheng, J. Energy metabolism of cancer: Glycolysis versus oxidative phosphorylation (Review). Oncology Letters. 4 (6), 1151-1157 (2012).
  4. Potter, M., Newport, E., Morten, K. J. The Warburg effect: 80 years on. Biochemical Society Transactions. 44 (5), 1499-1505 (2016).
  5. Zhao, Y., Butler, E. B., Tan, M. Targeting cellular metabolism to improve cancer therapeutics. Cell Death and Disease. 4 (3), 532 (2013).
  6. Patel, S., Ahmed, S. Emerging field of metabolomics: Big promise for cancer biomarker identification and drug discovery. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 63-74 (2015).
  7. Walsh, A. J., Cook, R. S., Skala, M. C. Functional optical imaging of primary human tumor organoids: Development of a personalized drug screen. Journal of Nuclear Medicine. 58 (9), 1367-1372 (2017).
  8. Zaal, E. A., Berkers, C. R. The influence of metabolism on drug response in cancer. Frontiers in Oncology. 8, 500 (2018).
  9. Little, A. C., et al. High-content fluorescence imaging with the metabolic flux assay reveals insights into mitochondrial properties and functions. Communications Biology. 3 (1), 271 (2020).
  10. Wang, X., et al. Comparison of magnetic resonance spectroscopy and positron emission tomography in detection of tumor recurrence in posttreatment of glioma: A diagnostic meta-analysis. Asia-Pacific Journal of Clinical Oncology. 11 (2), 97-105 (2015).
  11. Nabi, H. A., Zubeldia, J. M. Clinical applications of 18F-FDG in oncology. Journal of Nuclear Medicine Technology. 30 (1), 3-9 (2002).
  12. Kostakoglu, L., Agress, H., Goldsmith, S. J. Clinical role of FDG PET in evaluation of cancer patients. Radiographics. 23 (2), 315-340 (2003).
  13. Hoh, C. K. Clinical use of FDG PET. Nuclear Medicine and Biology. 34 (7), 737-742 (2007).
  14. van de Weijer, T., Schrauwen-Hinderling, V. B. Application of magnetic resonance spectroscopy in metabolic research. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1865 (4), 741-748 (2019).
  15. Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and Flavoprotein. Biophysical Journal. 82, 2811-2825 (2002).
  16. Lagarto, J. L., et al. Characterization of NAD(P)H and FAD autofluorescence signatures in a Langendorff isolated-perfused rat heart model. Biomedical Optics Express. 9 (10), 4961-4978 (2018).
  17. Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. , Springer. Boston, MA. (2013).
  18. Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Johnson, M. L. Fluorescence lifetime imaging of free and protein-bound NADH. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 89 (4), 1271-1275 (1992).
  19. Nakashima, N., Yoshihara, K., Tanaka, F., Yagi, K. Picosecond fluorescence lifetime of the coenzyme of D-amino acid oxidase. Journal of Biological Chemistry. 255 (11), 5261-5263 (1980).
  20. Hu, L., Wang, N., Cardona, E., Walsh, A. J. Fluorescence intensity and lifetime redox ratios detect metabolic perturbations in T cells. Biomedical Optics Express. 11 (10), 5674-5688 (2020).
  21. Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. Journal of Biomedical Optics. 25 (7), 1-43 (2020).
  22. Liu, Z., et al. Mapping metabolic changes by noninvasive, multiparametric, high-resolution imaging using endogenous contrast. Science Advances. 4 (3), (2018).
  23. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Optical imaging using endogenous contrast to assess metabolic state. Annual Review of Biomedical Engineering. 14, 351-367 (2012).
  24. Varone, A., et al. Endogenous two-photon fluorescence imaging elucidates metabolic changes related to enhanced glycolysis and glutamine consumption in precancerous epithelial tissues. Cancer Research. 74 (11), 3067-3075 (2014).
  25. Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals. Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).
  26. Sharick, J. T., et al. Protein-bound NAD(P)H lifetime is sensitive to multiple fates of glucose carbon. Scientific Reports. 8 (1), 5456 (2018).
  27. Skala, M. C., et al. In vivo multiphoton microscopy of NADH and FAD redox states, fluorescence lifetimes, and cellular morphology in precancerous epithelia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19494-19499 (2007).
  28. Skala, M. C., et al. In vivo multiphoton fluorescence lifetime imaging of protein-bound and free nicotinamide adenine dinucleotide in normal and precancerous epithelia. Journal of Biomedical Optics. 12 (2), 024014 (2007).
  29. Uchugonova, A. A., König, K. Two-photon autofluorescence and second-harmonic imaging of adult stem cells. Journal of Biomedical Optics. 13 (5), 054068 (2008).
  30. Miranda-Lorenzo, I., et al. Intracellular autofluorescence: a biomarker for epithelial cancer stem cells. Nature Methods. 11 (11), 1161-1169 (2014).
  31. Walsh, A. J., et al. Classification of T-cell activation via autofluorescence lifetime imaging. Nature Biomedical Engineering. 5 (1), 77-88 (2021).
  32. Heaster, T. M., Humayun, M., Yu, J., Beebe, D. J., Skala, M. C. Autofluorescence imaging of 3D tumor-macrophage microscale cultures resolves spatial and temporal dynamics of macrophage metabolism. Cancer Research. 80 (23), 5408-5423 (2020).
  33. Pavillon, N., Hobro, A. J., Akira, S., Smith, N. I. Noninvasive detection of macrophage activation with single-cell resolution through machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (12), 2676-2685 (2018).
  34. Chang, C. H., et al. Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis. Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).
  35. Kaech, S. M., Cui, W. Transcriptional control of effector and memory CD8+ T cell differentiation. Nature Reviews. Immunology. 12 (11), 749-761 (2012).
  36. Gómez, C. A., Fu, B., Sakadžić, S., Yaseena, M. A. Cerebral metabolism in a mouse model of Alzheimer's disease characterized by two-photon fluorescence lifetime microscopy of intrinsic NADH. Neurophotonics. 5 (4), 045008 (2018).
  37. Yaseen, M. A., et al. In vivo imaging of cerebral energy metabolism with two-photon fluorescence lifetime microscopy of NADH. Biomedical Optics Express. 4 (2), 307-321 (2013).
  38. Bower, A. J., et al. High-speed label-free two-photon fluorescence microscopy of metabolic transients during neuronal activity. Applied Physics Letters. 118 (8), 081104 (2021).
  39. Walsh, A. J., et al. Quantitative optical imaging of primary tumor organoid metabolism predicts drug response in breast cancer. Cancer Research. 74 (18), 5184-5194 (2014).
  40. Walsh, A. J., et al. Optical metabolic imaging identifies glycolytic levels, subtypes, and early-treatment response in breast cancer. Cancer Research. 73 (20), 6164-6174 (2013).
  41. Chowdary, M. V. P., et al. Autofluorescence of breast tissues: Evaluation of discriminating algorithms for diagnosis of normal, benign, and malignant conditions. Photomedicine and Laser Surgery. 27 (2), 241-252 (2009).
  42. Demos, S. G., Bold, R., White, R. D., Ramsamooj, R. Investigation of near-infrared autofluorescence imaging for the detection of breast cancer. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 11 (4), 791-798 (2005).
  43. Heaster, T. M., Humayun, M., Yu, J., Beebe, D. J., Skala, M. C. Autofluorescence imaging of 3D tumor-macrophage microscale cultures resolves spatial and temporal dynamics of macrophage metabolism. Cancer Research. 80 (23), 5408-5423 (2020).
  44. Sharick, J. T., et al. Cellular metabolic heterogeneity in vivo is recapitulated in tumor organoids. Neoplasia. 21 (6), 615-626 (2019).
  45. Shah, A. T., Diggins, K. E., Walsh, A. J., Irish, J. M., Skala, M. C. In vivo autofluorescence imaging of tumor heterogeneity in response to treatment. Neoplasia. 17 (12), 862-870 (2015).
  46. Walsh, A. J., Skala, M. C. Optical metabolic imaging quantifies heterogeneous cell populations. Biomedical Optics Express. 6 (2), 559-573 (2015).
  47. Walsh, A. J., Skala, M. C. An automated image processing routine for segmentation of cell cytoplasms in high-resolution autofluorescence images. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XIV. , (2014).
  48. Skala, M., Ramanujam, N. Methods in Molecular Biology. 594, 155-162 (2010).
  49. Stringari, C., et al. Multicolor two-photon imaging of endogenous fluorophores in living tissues by wavelength mixing. Scientific Reports. 7, 3792 (2017).
  50. SPCImage 2.9: Data analysis software for fluorescence lifetime imaging microscopy. SPCImage. , Available from: https://biology.uiowa.edu/sites/biology.uiowa.edu/files/SPCIMAGE29.pdf (2007).
  51. CellProfiler. , Available from: https://cellprofiler.org/releases (2007).
  52. Autofluorescence Imaging. GitHub. , Available from: https://github.com/walshlab/Autofluorescence-Imaging (2021).
  53. Ramey, N. A., Park, C. Y., Gehlbach, P. L., Chuck, R. S. Imaging mitochondria in living corneal endothelial cells using autofluorescence microscopy. Photochemistry and Photobiology. 83 (6), 1325-1329 (2007).
  54. Walsh, A., Cook, R. S., Rexer, B., Arteaga, C. L., Skala, M. C. Optical imaging of metabolism in HER2 overexpressing breast cancer cells. Biomedical Optics Express. 3 (1), 75-85 (2012).
  55. Kolenc, O. I., Quinn, K. P. Evaluating cell metabolism through autofluorescence imaging of NAD(P)H and FAD. Antioxidants & Redox Signaling. 30, 875-889 (2019).
  56. Bird, D. K., et al. Metabolic mapping of MCF10A human breast cells via multiphoton fluorescence lifetime imaging of the coenzyme NADH. Cancer Research. 65, 8766-8773 (2005).
  57. Walsh, A. J., et al. Optical metabolic imaging identifies glycolytic levels, subtypes, and early-treatment response in breast cancer. Cancer Research. 73 (20), 6164-6174 (2013).
  58. Walsh, A. J., Castellanos, J. A., Nagathihalli, N. S., Merchant, N. B., Skala, M. C. Optical imaging of drug-induced metabolism changes in murine and human pancreatic cancer organoids reveals heterogeneous drug response. Pancreas. 45 (6), 863-869 (2016).
  59. Gubser, P. M., et al. Rapid effector function of memory CD8+ T cells requires an immediate-early glycolytic switch. Nature Immunology. 14 (10), 1064-1072 (2013).
  60. Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Review. Immunology. 18 (1), 35-45 (2018).
  61. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. O. Review: Quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. The Journals of Gerontology: Series A. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  62. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio-protocol. 8 (10), 2850 (2018).
  63. Becker, W. The bh TCSPC Handbook. , Available from: https://www.becker-hickl.com/wp-content/uploads/2021/10/SPC-handbook-9ed-05a.pdf (2021).
  64. Gadella, T. W. J. Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity. Mason, W. T. 34, Ch. 34 467-479 (1999).
  65. Miller, D. R., Jarrett, J. W., Hassan, A. M., Dunna, A. K. Deep tissue iImaging with multiphoton fluorescence microscopy. Current Opinion in Biomedical Engineering. 4, 32-39 (2017).
  66. Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence lifetime measurements and biological imaging. Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).

Tags

הנדסה ביולוגית בעיה 177 FLIM חילוף חומרים NAD(P)H FAD פלואורסצנטיות מיקרוסקופיה
הדמיית זרם אוטומטי להערכת חילוף החומרים התאי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Theodossiou, A., Hu, L., Wang, N.,… More

Theodossiou, A., Hu, L., Wang, N., Nguyen, U., Walsh, A. J. Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism. J. Vis. Exp. (177), e63282, doi:10.3791/63282 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter