פרוטוקול זה מתאר הדמיה וניתוח פלואורסצנטי של קואנזימים מטבוליים אנדוגני, אדנין ניקוטינאמיד מופחת (פוספט) dinucleotide (NAD(P)H), ו flavin adenine dinucleotide מחומצן (FAD). הדמיה אוטופלואורסצנטית של NAD(P)H ו-FAD מספקת שיטה נטולת תוויות ולא הרסנית להערכת חילוף החומרים התאי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
חילוף החומרים התאי הוא התהליך שבו תאים מייצרים אנרגיה, ומחלות רבות, כולל סרטן, מאופיינות בחילוף חומרים חריג. ניקוטינאמיד אדנין מופחת (פוספט) דינוקלאוטיד (NAD(P)H) ופלובין אדנין דינוקלאוטיד מחומצן (FAD) הם קואנזימים של תגובות מטבוליות. NAD(P)H ו-FAD מציגים זרימה אוטומטית וניתן לבודד אותם באופן ספקטרלי על ידי אורכי גל של עירור ופליטה. שני הקואנזימים, NAD(P)H ו- FAD, יכולים להתקיים בתצורה חופשית או כרוכה בחלבון, שלכל אחד מהם פלואורסצנטיות ייחודית לכל החיים - הזמן שעבורו הפלואורופור נשאר במצב הנרגש. הדמיה לכל החיים של פלואורסצנטיות (FLIM) מאפשרת כימות של עוצמת הפלואורסצנטיות ואורך החיים של NAD(P)H ו- FAD לניתוח ללא תוויות של חילוף החומרים התאי. ניתן למטב את עוצמת הפלואורסצנטיות ואת המיקרוסקופים לכל החיים להדמיית NAD(P)H ו- FAD על-ידי בחירת אורכי הגל המתאימים של עירור ופליטה. הפרעות מטבוליות על ידי ציאניד לאמת פרוטוקולי הדמיה autofluorescence כדי לזהות שינויים מטבוליים בתוך תאים. מאמר זה ידגים את הטכניקה של הדמיית autofluorescence של NAD(P)H ו- FAD למדידת חילוף החומרים התאי.
מבוא
חילוף החומרים הוא התהליך התאי של ייצור אנרגיה. חילוף החומרים התאי מקיף מסלולים מרובים, כולל גליקוליזה, זרחן חמצוני, גלוטמינוליזיס. תאים בריאים משתמשים במסלולים מטבוליים אלה כדי לייצר אנרגיה להתפשטות ולתפקוד, כגון ייצור ציטוקינים על ידי תאי מערכת החיסון. מחלות רבות, כולל הפרעות מטבוליות, סרטן, ניוון עצבי, מאופיינים בחילוף חומרים תאי שונה1. לדוגמה, כמה סוגי תאים סרטניים יש שיעורים גבוהים של גליקוליזה, אפילו בנוכחות חמצן, כדי ליצור מולקולות לסינתזה של חומצות גרעין, חלבונים, שומנים, שומנים2,3. תופעה זו, המכונה אפקט ורבורג, היא סימן היכר של סוגי סרטן רבים, כולל סרטן השד, סרטן ריאות, ו gliobl....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. ציפוי תאים להדמיה
- שאפו את המדיום מבקבוק T-75 בעל 80-90% של תאי MCF-7, שטפו את התאים ב-10 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית עם חוצץ פוספט (PBS), והוסיפו 2 מ"ל של 0.25% טריפסין (1x) כדי לנתק את התאים מתחתית הבקבוקון.
- דגירה הבקבוקון ב 37 °C (50 °F) במשך ~ 4 דקות. בדוק את התאים מתחת למיקרוסקופ כדי לאשר ניתוק.
- מיד להוסיף 8 מ"ל של מדיום תרבות כדי לבטל את הפעלת הטריפסין.
- לאסוף את התאים בצינור חרוטי (15 מ"ל או 50 מ"ל). לספור את התאים באמצעות hemocytometer.
- צנטריפוגה התאים 200 × גרם במשך 5 דקות.
- ברגע שצנטריפוגה, לשאוף את supernatant. Resuspend את גלולה של תאים ב 1 מ"ל של מדיום תרבות, וזרע 4 × ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
קו תאי סרטן השד האפיתל, MCF-7, היה תרבית ב- DMEM בתוספת סרום בקר עוברי 10% (FBS) ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין. להדמיית פלואורסצנטיות, התאים נזרעו בצפיפות של 4 × 105 תאים לכל צלחת הדמיה תחתית זכוכית 35 מ"מ 48 שעות לפני ההדמיה. התאים צולמו לפני ואחרי טיפול ציאניד באמצעות הפרוטוקולים שצוינו לעיל. מטרת ניסוי הציאניד היא לאשר בידוד ספקטרלי של פלואורסצנטיות NAD(P)H ו- FAD ולאמת את מערכת ההדמיה ופרוטוקול הניתוח לאיתור שינויים מטבוליים בתאים. תמונות משולבות של NAD(P)H ו- FAD פלואורסצנטיות צולמו בחמישה מיקומים שונים לפני .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
עוצמת autofluorescence והדמיה לכל החיים היו בשימוש נרחב כדי להעריך את חילוף החומרים בתאים21,55. FLIM הוא ברזולוציה גבוהה ולכן פותר תאים בודדים, אשר חשוב עבור מחקרי סרטן כי הטרוגניות הסלולר תורם תוקפנות הגידול ועמידות לתרופות7,39,41,44,44,45,46,58.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
תודות
מקורות המימון כוללים את המכון למניעת סרטן ומחקר של טקסס (CPRIT RP200668) ואוניברסיטת טקסס A&M. איור 1 נוצר עם BioRender.com.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 2-דאוקסי-די-גלוקוז (2-DG) | סיגמא | AC111980000; AC111980010; AC111980050; | |
| AC111980250 אנטיביוטיקה אנטי מיקרוביאלית (עט-סטרפטוקוק) | Gibco | 15240096 | |
| דגימות תאים | אוסף תרבית מסוג אמריקאי | N/A | MCF-7 קו סרטן |
| CellProfiler | Broad Institute | N/A | תוכנה לניתוח תמונות |
| צינור חרוטי | VWR | 89039-664 | צינור חרוטי 15 מ"ל |
| DMEM | ThermoFisher | 11965092 | תרבות |
| מדיה FAD מראה דיכרואית | Semrock | FF495-Di03-25x36 | 495 ננומטר |
| מסנן פליטת FAD | Semrock | FF01-550/88-25 | 550/88 ננומטר |
| מסנן עירור FAD | Semrock | FF01-458/64-25 | 458/64 ננומטר |
| FBS | ThermoFisher | 16000036 | |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי לכל החיים | 3i | N/A | |
| צלחת תחתית זכוכית | MatTek Corp | P35G-1.0-14-C | |
| לייזר מולטיפוטון | קוהרנטי | N/A | 2P לייזר קוהרנטי, מתכוונן 680 ננומטר-1080 ננומטר |
| NAD(P)H מראה דיכרואית | Semrock | FF409-Di03-25x36 | 409 ננומטר |
| NAD(P)H מסנן פליטה | Semrock | FF02-447/60-25 | 447/60 ננומטר |
| NAD(P)H מסנן עירור | Semrock | FF01-357/44-25 | 357/44 ננומטר |
| PBS | ThermoFisher | 70011044 | |
| אשלגן ציאניד | סיגמא-אולדריץ' | 380970 | |
| SlideBooks 6 | 3i | N/A | תוכנה לרכישת תמונות |
| SPCImage | Becker & Hickl GmbH | N/A | תוכנת ניתוח אורך חיים פלואורסצנטי שלב |
| עליון חממה | okoLab | N/A | |
| Trypsin | Biosciences | 786-262 | |
| אוריאה | סיגמא-אולדריץ' | U5128 | |
| YG חרוזים | Polysciences | 19096-2 | Yg מיקרוספירות (20.0 ומיקרו; מ) |
מקורות
- Heikal, A. A. Intracellular coenzymes as natural biomarkers for metabolic activities and mitochondrial anomalies. Biomarkers in Medicine. 4 (2), 241-263 (2010).
- Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Optical imaging using en....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
