Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

細胞代謝を評価するための自己蛍光イメージング

Published: November 15, 2021 doi: 10.3791/63282
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University-College Station

Summary

このプロトコルは、内因性代謝補酵素、還元型ニコチンアミドアデニン(リン酸)ジヌクレオチド(NAD(P)H)、および酸化フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)の蛍光イメージングおよび分析について記載しています。NAD(P)HおよびFADの自己蛍光イメージングは、細胞代謝を評価するための標識フリーの非破壊的方法を提供します。

Abstract

細胞代謝は細胞がエネルギーを生成するプロセスであり、癌を含む多くの疾患は異常な代謝によって特徴付けられる。還元型ニコチンアミドアデニン(リン酸)ジヌクレオチド(NAD(P)H)および酸化型フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)は、代謝反応の補酵素である。NAD(P)HおよびFADは自己蛍光を示し、励起および発光波長によってスペクトル的に単離することができる。両方の補酵素、NAD(P)HおよびFADは、遊離またはタンパク質結合配置のいずれかで存在することができ、それぞれが異なる蛍光寿命(蛍光色素分子が励起状態にとどまる時間)を有する。蛍光寿命イメージング(FLIM)は、細胞代謝の標識のない分析のために、NAD(P)HおよびFADの蛍光強度および寿命の定量化を可能にする。蛍光強度と寿命顕微鏡は、適切な励起波長と発光波長を選択することで、NAD(P)HとFADのイメージングに最適化できます。シアン化物による代謝摂動は、細胞内の代謝変化を検出するための自己蛍光イメージングプロトコルを検証します。本稿では、細胞代謝を測定するためのNAD(P)HおよびFADの自己蛍光イメージング技術を実証する。

Introduction

代謝は、エネルギーを生産する細胞プロセスです。細胞代謝は、解糖系、酸化的リン酸化、およびグルタミン分解を含む複数の経路を包含する。健康な細胞は、これらの代謝経路を使用して、免疫細胞によるサイトカインの産生などの増殖および機能のためのエネルギーを生成する。代謝障害、癌、神経変性を含む多くの疾患は、細胞代謝の変化によって特徴付けられます1。例えば、一部のがん細胞型は、酸素の存在下でも解糖系の割合が上昇し、核酸、タンパク質、および脂質を合成するための分子を生成します2,3。ウォーバーグ効果として知られるこの現象は、乳がん、肺がん、膠芽腫など、多くのがんタイプの特徴です4。がんの進行に伴う細胞代謝の変化のため、細胞代謝は薬物応答の代理バイオマーカーとなり得る5,6。さらに、細胞の不均一性は個人において異なる薬物応答につながる可能性があるため、細胞レベルで薬物の有効性を理解することは極めて重要です7,8。

細胞代謝の変化を同定および定量化する技術は、がんおよび薬物応答の研究に不可欠です。化学分析およびタンパク質分析は、細胞または組織の代謝を評価するために使用されますが、単一細胞分解能および空間情報が不足しています。代謝プレートリーダーベースのアッセイは、経時的にサンプル中のpHおよび酸素消費量、およびその後の化学物質による代謝摂動を測定することができる。pHを使用して細胞外酸性化率(ECAR)を計算することができ、細胞の解糖系活性に関する洞察が得られます9。2-[フッ素-18]フルオロ-D-グルコース陽電子放射断層撮影法(FDG PET)および磁気共鳴分光法(MRS)を含む全身イメージング法は、代謝測定を通じて腫瘍の再発および薬物有効性を同定するために臨床的に使用される非侵襲的イメージングモダリティである10,11,12,13,14。

FDG-PETは、放射性標識グルコース類似体であるFDGの組織取り込みを画像化する。周囲の組織に対する腫瘍によるFDG-PETの取り込みの増加は、ウォーバーグ効果によるものである12,13。MRSは、13Cや31Pなどの代謝に使用される分子の一般的な核を画像化し、運動や食事などの刺激に応答して代謝がどのように変化するかについての動的情報を得ることができます14。FDG-PETおよびMRSは臨床的に使用することができるが、これらの技術は腫瘍内の不均一性を解決するための空間分解能を欠いている。同様に、酸素消費量の測定は、大量の細胞集団に対して行われます。自己蛍光イメージングは、これらの技術の空間分解能の障害を克服し、細胞代謝を定量化する非侵襲的な方法を提供します。

Figure 1
図1:一般的な代謝経路におけるNADHおよびFAD。 NADHおよびFADは、解糖系、クレブスサイクル、および電子輸送鎖に使用される補酵素である。これらの分子の自己蛍光イメージングは、細胞代謝に関する情報を提供する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

還元型ニコチンアミドアデニン(リン酸)ジヌクレオチド(NAD(P)H)および酸化型フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)は、解糖系、酸化的リン酸化系、グルタミン分解系などの代謝反応の補酵素です(図1)。NAD(P)HとFADはどちらも自己蛍光性であり、蛍光イメージングに内因性のコントラストを提供します1,15。NADPHはNADHと同様の蛍光特性を有する。このため、NAD(P)H は、NADH と NADPH2,16 の結合信号を表すためによく使用されます。

蛍光寿命イメージング(FLIM)は、蛍光寿命または蛍光色素分子が励起状態にある時間を定量化します。蛍光の寿命は蛍光色素分子の微小環境に反応し、細胞代謝に関する情報を提供します17。NAD(P)HおよびFADは、タンパク質結合または遊離立体配座のいずれかで細胞内に存在することができ、それぞれが異なる寿命を有する。遊離NAD(P)Hは、タンパク質結合NAD(P)Hよりも寿命が短い。逆に、遊離FADは束縛されたFADよりも寿命が長い18,19。寿命および寿命成分の重みは、蛍光寿命減衰データから式(1)20を通して定量化することができる。

I(t) = α 1e-t/τ1 + α 2e-t/τ2 + C (1)

式(1)は、時間の関数として規格化された蛍光強度を表す。この式のα 1とα 2は、それぞれ短寿命と長寿命(α 1+α 2=1)の比例成分を表し、τ1とτ2はそれぞれ短寿命と長寿命を表し、Cは背景光7,20を表します。振幅加重寿命は、ここではτmとして表され、式(2)を使用して計算されます。

τm= α 1τ1+ α 2τ2 (2)

平均寿命は、蛍光色素分子の強度減衰に対して「t」を平均することによって計算することができ、2指数関数的な減衰の場合、式(3)17,21で示されます。

τ*m= (α 1τ12+ α 2τ22)/ (α 1τ1+ α 2τ2) (3)

蛍光強度画像は、蛍光寿命減衰を積分することにより、寿命画像から計算することができる。自己蛍光イメージングは、生細胞の代謝を細胞内分解能で特徴付けるために使用できる非破壊的で標識のない方法です。光酸化還元比は、セルの化学的酸化還元状態の光学アナログ測定を提供し、NAD(P)HとFAD強度の比として計算されます。光学酸化還元比の計算式は標準化されていませんが22,23,24,25,ここではNAD(P)HとFADを合わせた強度に対するFADの強度と定義しています。この定義が使用されるのは、分母の強度の合計がメトリックを 0 ~ 1 の間で正規化し、シアン化物阻害の予想される結果が酸化還元比の減少であるためです。遊離NAD(P)HおよびFADの蛍光寿命は、pH、温度、酸素への近接性、浸透圧など、代謝溶媒微小環境の変化に関する洞察を提供します17。

NAD(P)HとFADの結合画分の蛍光寿命の変化は、代謝経路の利用と基質特異的代謝を示す可能性があります26。成分重量は、補酵素の遊離から結合画分への変化について解釈することができる18、19。全体として、これらの定量的自己蛍光寿命測定基準は、細胞代謝の分析を可能にし、自己蛍光イメージングは、正常組織からの新生物の同定27,28、幹細胞の特性評価29,30、免疫細胞機能の評価31,32,33,34,35、神経学的活性の測定36、 37、38、および乳癌および頭頸部癌などの癌タイプにおける薬物有効性を理解する21、39、40、41、42。高解像度の自己蛍光イメージングは、単一細胞分析および集団内不均一性の定量化のための画像セグメンテーションと組み合わせることができます43,44,45,46,47。

NAD(P)HおよびFADは、強度または寿命イメージング用に構成された単一光子または多光子蛍光顕微鏡でイメージングできます。単一光子顕微鏡の場合、NAD(P)HとFADは、これらの波長で共通のレーザー光源のために、それぞれ375-405nmと488nmの波長で励起されるのが一般的です48。2光子蛍光励起では、NAD(P)HとFADはそれぞれ約700~750nmと700~900nmの波長で励起します15,49。蛍光色素分子が励起されると、NAD(P)HおよびFADは、それぞれ~410 nm~~490 nmおよび~510 nm~~640 nmの波長で光子を放出します15。NAD(P)HおよびFADの最大発光波長は、それぞれ約450nmおよび535nmである48。

励起波長と発光波長が異なるため、2つの代謝補酵素の蛍光をスペクトル的に単離することができます。NAD(P)HおよびFADのスペクトル特性を理解することは、自己蛍光イメージングプロトコルの設計および最適化に必要です。シアン化物は電子輸送鎖(ETC)錯体IV阻害剤である。細胞代謝に対するシアン化物の影響、ならびに細胞内のNAD(P)HおよびFADの自己蛍光強度および寿命は、よく特徴付けられる27,40。したがって、シアン化物摂動実験は、NAD(P)HおよびFADイメージングプロトコルを検証するための有効な手段である。シアン化物実験が成功すれば、NAD(P)HおよびFADイメージングプロトコルを使用して未知のグループまたは摂動の代謝を評価できるという確信が得られます。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. イメージング用セルプレーティング

  1. MCF-7細胞の80〜90%コンフルエントT−75フラスコから培地を吸引し、10mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞をすすぎ、2mLの0.25%トリプシン(1x)を加えて細胞をフラスコ底部から剥離する。
  2. フラスコを37°Cで約4分間インキュベートする。顕微鏡で細胞を確認し、剥離を確認します。
  3. 直ちに8mLの培養液を加え、トリプシンを失活させた。
  4. 細胞を円錐形のチューブ(15mLまたは50mL)に集める。血球計数器を用いて細胞を計数する。
  5. 細胞200× g を5分間遠心分離する。
  6. 遠心分離したら、上清を吸引する。細胞のペレットを1mLの培養液に再懸濁し、4×105 個の細胞を35mmガラス底イメージングディッシュ(または使用されている顕微鏡用の適切なサンプルホルダー)上にシードする。
  7. 2mLの培養液をイメージングディッシュに加え、細胞代謝を維持する。
  8. 細胞を37°Cで5%CO2 で24〜48時間インキュベートしてから、細胞が接着して対数増殖期に達するようにイメージングします。
    注:増殖期は、これらの細胞に関する以前の経験によって決定され、細胞データシートで確認された。

2. NAD(P)HとFADの多光子FLIMイメージング

  1. 多光子蛍光寿命顕微鏡のすべてのコンポーネント(顕微鏡、レーザー光源、および使用されている検出器を含む)をオンにします。
  2. サンプルの配置
    1. 明視野ランプを点灯させます。光が接眼レンズに差し込まれていることを確認します。目的(通常は20倍、40倍、または100倍)を選択して細胞イメージングを行います。対物レンズの上に適切な浸漬媒体を1滴塗布します[対気目標を使用する場合はスキップします]。
    2. 対物レンズを下へ移動して、対物レンズに触れることなくサンプルを適切に配置します。ガラス底の皿を顕微鏡ステージ上のサンプルホルダーの上に置きます。試料が固定されており、イメージング中に動かないことを確認します。
    3. X-Yステージコントロールを使用して、試料を対物レンズで中央に配置します。これが完了したら、接眼レンズを覗き込み、目標を上に動かして細胞に焦点を合わせます。
    4. 顕微鏡が筐体内にある場合は、ライトボックスのドアを閉じます。画像取得ソフトウェアを開き、[多光子イメージング]タブをクリックし、次の 多光子イメージング パラメータを設定します:画像サイズ= 256 x 256ピクセル。ピクセル滞留時間 = 4-25 μs;総画像取得時間 = 〜60秒;単一光子カウント用に最適化された検出器ゲイン = 85% (使用されているシステムに固有)。
  3. 機器応答関数(IRF)と蛍光寿命標準のイメージング
    1. ガラス底の皿に尿素結晶を置き、皿の蓋をテープまたはパラフィルムで固定する。
      注:尿素結晶は室温で数ヶ月間安定しています。
    2. 尿素結晶をイメージしてください。
      1. 尿素皿を顕微鏡ステージに置き、尿素結晶に焦点を合わせます。
      2. 励起レーザーの波長を900nmに設定します。
      3. 450nmの波長をキャプチャする発光フィルターを使用してください。
      4. サンプル<1mWでレーザー出力で尿素結晶の蛍光寿命画像を取得し、ステップ2.2.4で述べた推奨イメージングパラメータを使用します。
    3. 黄緑色(YG)ビーズを蛍光寿命標準として画像化します。
      1. YGビーズ溶液を滅菌水で1:1,000に希釈してYGビーズスライドを作成する。少量(約30 μL)をスライドまたはガラス底の皿の上に置きます。カバースリップで覆い、カバースリップの端を透明なマニキュアで密封します。
      2. YGビーズスライドを顕微鏡ステージに置き、スライドのカバースリップ側を対物レンズの方に置きます。
      3. 励起レーザーの波長を890 nmに設定します。
      4. 〜500〜600nmの波長をキャプチャする発光フィルタを使用してください。
      5. サンプル<1mWでのレーザーパワーと推奨画像パラメータを用いてYGビーズの蛍光寿命画像を得る[ステップ2.2.4]。
      6. 尿素のIRFを使用してビーズの寿命を確認してください。寿命が〜2.1nsでない場合は、ビーズが蛍光消光に寄与する別のビーズと接触しているかどうか、ビーズ溶液が乾燥しているかどうか、ビーズの焦点が合っていないかどうか、IRFが正確でないかどうか、またはIRFと蛍光減衰の間のシフトが最適化されていないかどうかを確認します[ステップ4.2.4を参照]。
        注: ~2.1 ns の寿命は、時間の経過とともに安定しています。
  4. NAD(P)Hイメージング
    1. 細胞を入れたガラス底の皿を顕微鏡ステージに置き、細胞に焦点を合わせます。
      注:これらのパラメータは細胞代謝に影響を与える可能性があるため、画像取得中に熱、湿度、およびCO2 レベルを維持するために、細胞を環境チャンバに配置することをお勧めします。
    2. 検出器のゲインをFLIMの最適値に調整します。さらに、所望の滞留時間(試料の各ピクセルでレーザーが費やす時間を示すパラメータ)に変更します。
      メモ: これらのパラメータは、手順の残りの部分で同じままにする必要があります。これは、レーザー出力、スキャンパラメータ、検出器ゲインに依存する強度ベースの測定の有効性を保証するために、レーザー照明と検出器の設定の一貫性を確保するためです。単一光子計数モードで検出器を操作するための最適化された検出器ゲインがあります。この値は、参照されるシステムの 85% です。
    3. 多光子レーザーを750nmに設定します。レーザーのシャッターを開いたときにセルが損傷しないように、レーザーのパワーコントロールが最初にゼロに設定されていることを確認します。
      注: 750 nm での励起が NAD(P)H に推奨されますが、700 ~ 750 nm で広い吸収があります。FADには890 nmでの励起が推奨されますが、700-900 nmで広い吸収があります。
    4. 発光フィルターを設定または選択して、約400〜500nmの発光波長を収集します。
    5. ピント合わせまたはライブビュー方式でイメージングを開始し、画像設定を最適化します。
      メモ: レーザーは現在動作しています。この時点では、顕微鏡エンクロージャーを開けないでください。適切な個人用保護具を着用してください。
    6. レーザー出力をサンプルで約3〜8mWまでゆっくりと増やし、細胞に焦点が合っていることを確認します。調整が完了したら、最大使用電力を記録します。この電源設定は、NAD(P)Hイメージング用のペトリ皿の他のセグメントのイメージングに使用します。
      注:ポッケルセルは安定していないため、サンプルまたはピックオフウィンドウでレーザーパワーを測定し、ポッケルセル電圧に依存しないことが重要です。多くの場合、レーザー出力は、サンプルではなくピックオフウィンドウでイメージング中に監視されます。対物レンズで2番目のパワーメータを使用して、ピックオフウィンドウでのパワーとサンプルでのパワーの関係を使用して、ピックオフウィンドウの測定値からサンプルでのおおよそのパワーを推定できます。
    7. 画像統合時間が 60 秒の NAD(P)H FLIM 画像を収集します。
    8. 画像に蛍光寿命減衰曲線内に十分な光子(細胞質ピクセルに対して〜100光子のピーク)があることを確認してください。光子の数が少なすぎる場合は、レーザー出力または画像取得の時間を長くします。
      注:蛍光指数減衰内の光子の最小ピーク数は、時間分解能、IRF、およびバックグラウンドノイズなどのシステムパラメータに依存する。
  5. FADイメージング
    1. 多光子レーザーを890nmに設定し、新しい波長でモードロックするのを待ちます。レーザーのシャッターを開いたときにセルが損傷しないように、レーザーのパワーコントロールが最初にゼロに設定されていることを確認します。
      メモ: このステップを実行するときは、ステージまたは目標のフォーカスを移動しないでください。FAD 視野 (FOV) は、この画像の NAD(P)H FOV と直接一致する必要があります。
    2. 発光フィルターを設定または選択して、約500〜600nmの発光波長を収集します。
    3. ピント合わせまたはライブビュー方式でイメージングを開始し、画像設定を最適化します。
      メモ: レーザーは現在動作しています。この時点では、顕微鏡エンクロージャーを開けないでください。
    4. サンプルでレーザー出力を約5〜10mWまでゆっくりと増やし、使用された最大出力を記録します。これは、FADイメージング用のペトリ皿の他のセグメントのイメージングの電源設定として使用します。
    5. 画像統合時間が 60 秒の FAD FLIM 画像を収集します。
    6. 画像に蛍光寿命減衰曲線内に十分な光子(細胞質ピクセルに対して〜100光子のピーク)があることを確認してください。光子の数が少なすぎる場合は、レーザー出力または画像取得の時間を長くします。
      注:蛍光指数減衰内の光子の最小ピーク数は、時間分解能、IRF、およびバックグラウンドノイズなどのシステムパラメータに依存する。
  6. 手順 2.4 ~ 2.5 を 4 ~ 5 個の FOV で繰り返します。各イメージが、イメージされた場所から少なくとも 2 FOV 離れていることを確認します。

シアン化物実験準備

  1. 130.24mgのシアン化ナトリウムを25mLのPBSに溶解して、80mM(20x)シアン化ナトリウム溶液を作る。
    注:シアン化物は有毒です。適切な個人用保護具を着用してください。
  2. ディッシュから100μLの培養液を吸引する。これを100 μLのシアン化ナトリウム溶液と交換して、ディッシュ中のシアン化物の4 mM濃度を得た。
  3. 細胞をインキュベーターに5分間入れて、細胞がシアン化物溶液と反応することを可能にする。
  4. 手順2.4~2.6を繰り返して、シアン化物曝露後の細胞のNAD(P)HおよびFAD画像を取得します。
    注:シアン化物への長期暴露は細胞を殺すでしょう。シアン化物後画像は、シアン化物添加から30分以内に取得される。

4. FLIM画像解析

  1. FLIM 寿命解析ソフトウェアを開きます。
    1. 尿素画像を開き、測定されたIRFを取得します。
    2. 尿素イメージをインポートします。画像解析に使用する尿素結晶の画像上の点を選択します。メインソフトウェアインターフェイスにあるBin変数を変更して、減衰ピークが100光子の場合、複数のピクセルからのFLIMデータを1以上>積算するには、空間ビン値を大きくします。
    3. データを IRF として保存します。
      1. 参照先のソフトウェアで、「 IRF」というタイトルのドロップダウンメニューをクリックし、「 減衰データからコピー」を選択します。この後、[ クリップボードにコピー ]をクリックして、実験中に撮影した画像の画像解析に利用します。
  2. NAD(P)HおよびFAD寿命画像の画像解析
    1. 画像ファイルを蛍光寿命解析ソフトウェアにインポートします。
    2. 必要に応じて強度とコントラストを変更することで、細胞と細胞内コンパートメントを見るための画像視覚化を改善します。
      1. [オプション]ドロップダウンメニューをクリックし、[強度]を選択します。ここで、必要に応じて強度とコントラストを変更し、[OK]をクリックします。
    3. 尿素イメージから IRF をインポートします。
      1. [IRF] ドロップダウン メニューをクリックし、[クリップボードから貼り付け] を選択します。
    4. 多指数減衰パラメータ50を設定します。
      1. 細胞質ピクセルの減衰を評価するしきい値を設定します。
        注: ここでは、値 50 が使用されました。この値は、いくつかの代表的なバックグラウンドおよび核画素の蛍光ピーク値をいくつかの細胞質画素のピーク値と比較することによって選択した。核画素と細胞質画素との間の値を閾値として選択した。
    5. Shift 値が蛍光の立ち上がりエッジを基準にして IRF を揃えていることを確認します。必要に応じて、カイ 2 乗値を最小化する値にシフトを調整します。
    6. 細胞質ピクセルの蛍光ピーク値が 100 以上になるように空間ビンを増やします。
      注: 空間ビンを増やすと、空間分解能が低下します。
    7. 画像内のすべてのピクセルの蛍光寿命を計算します。
      1. 参照先のプログラムで、[ 計算] ドロップダウン メニュー |減衰マトリックス。
        注:成功は、振幅加重蛍光寿命に対して偽色の画像で示されます。
    8. 蛍光寿命データを保存します。
      1. [ ファイル ]ドロップダウンメニュー |エクスポート。解析に使用するパラメータを選択し、[ OK]をクリックします。画像を保存します。
      2. [オプション]ドロップダウンメニューから[色]ボタンを選択して、表示される蛍光寿命メトリックを調整し、カラー設定をB-G-Rに調整し、特定のカラーバーの最小値と最大値を設定して蛍光寿命画像のカラースケールを調整します。

Figure 2
図2:尿素結晶のIRFを測定した。 (a)尿素から得られた強度画像。細胞の蛍光寿命画像のその後の分析のために、IRF減衰曲線(B)を作成するために代表ピクセルを選択した。省略形: IRF = 計測器応答関数。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

  1. セルのセグメンテーション
    メモ: ここで説明するプロトコルは、画像解析ソフトウェア51を使用します。代表的なMCF-7画像とデータ解析コードを提供します52。
    1. MCF7_Segmentation_Final.cpproj ファイル52 をダウンロードします。
    2. MCF7_Segmentationパイプラインをインポートするには、[ファイル|]をクリックします。 インポート|ファイル からパイプラインを選択し、 ファイルMCF7_Segmentation_Final.cpprojを選択します。
    3. 画像モジュールをクリックし、セグメント化する NAD(P)H 強度 画像 を追加します。
      メモ: 画像は.tif形式、.png形式、または.jpg形式である必要があります。
    4. 左下の [画像の分析 ]ボタンを押します。
      メモ: パイプラインでは、異なるシステムで取得した画像の最適化が必要な場合があります。トラブルシューティングを行うには、次のサブステップを試してください。
      1. さまざまなパラメータをテストするために テスト モードを使用する:「 テストモードの開始 」をクリックし、モジュール名の横にある 再生 ボタンをクリックして各モジュールを実行します。
      2. 最初の IdentifyPrimaryObjects モジュールをクリックし、セルの直径と一致するように、 オブジェクトの典型的な直径をピクセル単位 (最小、最大) で 調整します。
        注: MCF-7 セルでは、最小値と最大値にそれぞれ 10 ピクセルと 40 ピクセルが使用されました。
      3. [EnhanceOrSuppressFeatures] モジュールをクリックし、[フィーチャ サイズ] を調整して、選択したフィーチャ タイプの識別性を向上させます。
        注: MCF-7 セルには 10 ピクセルのフィーチャ サイズが使用されました。
      4. 2 番目の エンハンスまたはサプレッションフィーチャー モジュールをクリックし、「 穴のサイズの範囲」 を調整して、核領域の強化を最適化します。
        注:MCF-7セルには5〜20の範囲が使用されました。
      5. 2 番目の IdentifyPrimaryObjects モジュールをクリックし、パラメーター (しきい値戦略、しきい値 調整方法、しきい値 平滑化スケール、および しきい値補正係数) を調整して、核の識別を最適化します。各パラメータの横にある ? をクリックして最適な設定を特定し、 IdentifySecondaryObjects モジュールに適用します。
      6. FilterObjects モジュールをクリックし、領域の形状を調整します。識別する領域形状の最小ピクセルと最大ピクセルを選択します。
        注: MCF-7 セルでは、それぞれ最大値と最小値に 100 と 500 を使用しました。核を同定し、細胞境界への伝播を行うことによる細胞セグメンテーションの過程は、WalshおよびSkala47によって詳細に説明される。
    5. 細胞質マスクを使用して、画像内の各細胞の蛍光寿命出力変数を平均化する。

Figure 3
図3:個々の細胞の同定とセグメンテーション。 蛍光寿命画像を積分したMCF7細胞(A)のNAD(P)H強度画像。細胞を、5mWで750nm励起を用いて60秒間画像化した。x 軸と y 軸は、イメージのピクセル位置を表します。(a)個々の細胞を同定した。細胞をマスクし(B)、データセットからバックグラウンドノイズを除去した。その後、核が同定され(C)、セルマスク(D)に投影された。次いで、細胞を濾過(E)して、典型的な細胞のサイズに適合しないマスクされた領域を除去した。スケール バー = 50 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

5.代替方法:蛍光強度イメージング

  1. 実験中に使用する機器の電源を入れます。
    注:蛍光強度画像は、広視野蛍光顕微鏡、共焦点蛍光顕微鏡、または多光子顕微鏡で取得できます。
    1. 使用する顕微鏡に、NAD(P)H (単一光子波長~370~405 nm: 2 光子波長~700~750 nm) および FAD (単一光子波長~488 nm、2 光子波長~890 nm) の適切な励起源があることを確認します。
    2. 顕微鏡にNAD(P)H発光(〜400〜500nm)を分離するためのフィルターがあることを確認してください。
      注:4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)設定は、NAD(P)Hに対してしばしば機能します。
    3. 顕微鏡にFAD発光(〜500〜600nm)を分離するためのフィルターがあることを確認します。
      注:緑色蛍光タンパク質(GFP)の設定は、多くの場合、FADに対して機能します。
  2. 顕微鏡を準備する。
    1. 明視野ランプを点灯させます。光が接眼レンズに差し込まれていることを確認します。必要に応じて、対応する対物レンズの上に適切な浸漬媒体を1滴塗布します。
    2. 対物レンズを下へ動かして、干渉することなくサンプルを適切に配置します。ペトリ皿をステージ上に正しく置きます。試料が固定されており、イメージング中に動かないことを確認します。
      注:これらのパラメータは細胞代謝に影響を与える可能性があるため、画像取得中に熱、湿度、およびCO2 レベルを維持するために、細胞を環境チャンバに配置することをお勧めします。
    3. 試料を目標の中央に配置します。これが完了したら、接眼レンズを覗き込み、セルに焦点が合っているように見えるまで対物レンズを動かします。
  3. 強度イメージングを開始します。
    1. イメージングソフトウェアを開き、画像取得ソフトウェアのキャプチャタブをクリックし、顕微鏡タレットにNAD(P)H励起および発光フィルタを配置して、励起および発光構成を設定してNAD(P)Hを キャプチャ します。
      注:NAD(P)Hイメージングには、357/44励起フィルタ、409ロングパスダイクロイック、および447/60発光フィルタが使用されました。
    2. 励起照明と検出器のパラメータを最適化します。漂白が問題になる場合は、照明強度を下げ、画像統合時間を長くします。
      注: NAD(P)H は弱い信号です。あまりにも多くの電力が使用されている場合は、漂白に注意してください。
    3. 目的の画像サイズのNAD(P)H画像を取得します。イメージが保存されていることを確認します。
    4. FADをキャプチャするように励起および発光構成を設定します。励起照明と検出器のパラメータを最適化します。
      注:FADイメージングには、458/64励起フィルタ、495ロングパスダイクロイック、および550/88発光フィルタが使用されました。
    5. FAD イメージを取得します。イメージが保存されていることを確認します。
      注:NAD(P)HおよびFAD画像取得パラメータ(照明強度、画像サイズ、検出器ゲイン)は、イメージング実験を通して 同じ ままである必要があります。
    6. イメージされた場所から少なくとも 2 つの FOV を離して、さらに 5 つの場所でこのプロセスを繰り返します。
  4. 画像レベルの酸化還元比データ解析
    1. 画像処理プログラムでNAD(P)HおよびFAD強度画像を開きます。
    2. NAD(P)H にしきい値を設定して細胞質ピクセルを保持し、背景ピクセルと核ピクセルを 0 に設定します。
    3. 閾値化されたNAD(P)H画像を使用して、各ピクセルでFAD/(NAD(P)H + FADの式を評価して、酸化還元比画像を計算します。
    4. 0 以外のピクセルの平均値を計算します。
      メモ: これらの手順は、画像解析ソフトウェアで実行することも、スクリプトで直接コーディングすることもできます。
  5. 細胞レベルの酸化還元比分析
    1. 手順 4.3.1 ~ 4.3.5 に従って、各 NAD(P)H 画像内のセルのマスク画像を取得します。
    2. 各ピクセルで式FAD/(NAD(P)H + FAD)を評価して、酸化還元比画像を計算します。
    3. 細胞質マスクを使用して、画像内の各細胞のすべてのピクセルの酸化還元率を平均化する。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

上皮乳癌細胞株MCF-7を、10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したDMEM中で培養した。蛍光画像化のために、細胞を、画像化の48時間前に35mmガラス底画像化皿当たり4×105細胞の密度で播種した。細胞をシアン化物処理の前後に、上記のプロトコールを用いて画像化した。シアン化物実験の目的は、NAD(P)HおよびFAD蛍光のスペクトル分離を確認し、細胞の代謝変化を検出するためのイメージングシステムおよび分析プロトコルを検証することです。ペアのNAD(P)HおよびFAD蛍光寿命画像を、シアン化物前の5つの異なる場所およびシアン化物を媒体に添加した後の5つの異なる場所で撮影した。蛍光寿命パラメータ(光学酸化還元比、NAD(P)H α 1、NAD(P)Hτ1、NAD(P)Hτ2、NAD(P)Hτm、FAD τ1、FAD τ2、FAD α 1、FAD τ1、FAD τ2、およびFAD τm)は、尿素から測定されたIRFを使用して計算され(図2)、セグメンテーションに使用した各細胞の細胞質のピクセルにわたって平均化されました(図3)。

NAD(P)HおよびFADの多光子蛍光寿命イメージングにより、細胞形態および代謝の可視化が可能になります(図4)。多光子顕微鏡で達成された高解像度は、単一細胞の同定を可能にする。NAD(P)HとFADは主にミトコンドリアと細胞質に位置し、代謝性NAD(P)HとFADを欠いている核は対照的に暗い23,53。寿命画像は、細胞全体およびシアン化物曝露の結果としてのNAD(P)HおよびFADの振幅加重寿命の視覚化を提供します(図4)。

Figure 4
図4:シアン化物処理前後のMCF7細胞の代表的な蛍光寿命画像 。 (A)NAD(P)H振幅強調蛍光寿命画像および(B)シアン化物処理前のFAD振幅強調蛍光寿命画像。(C)NAD(P)H振幅強調蛍光寿命像及び(D)シアン化物処理後のFAD振幅強調蛍光寿命像。振幅加重蛍光寿命(カラーバーで示す)は、蛍光色素分子(この場合はNAD(P)HおよびFAD)が励起状態にある時間を測定します。NAD(P)Hの寿命はシアン化物処理で減少しますが、シアン化物処理後にFADの寿命は長くなります。NADHシグナルは5mWで750nm励起で60秒間、FADシグナルは7mWで890nm励起で60秒間イメージングしました。40倍の水浸対物レンズで取得した画像、開口数= 1.1。スケール バー = 50 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

シアン化物は電子輸送鎖の錯体IVを阻害し、酸化的リン酸化を阻害する2,15。シアン化物曝露後、細胞死の前に、NAD(P)Hはミトコンドリア内に蓄積し、FADは減少する1,15。シアン化物代謝阻害によるNAD(P)HおよびFAD強度のこれらの明確に定義された変化のために、摂動は自己蛍光イメージングおよび分析プロトコルを検証するための標準的な試験である2,54。予想通り、MCF-7細胞の光学酸化還元比(FAD/(FAD+NAD(P)H))はシアン化物処理後に減少した(図5、p = 0.044、ウェルチのT検定)。光学酸化還元比は標準化された式ではないが、それでも全ての強度式は等価であることが示されている20。FAD/(NAD(P)H+FAD)は、分母のNAD(P)H と FAD の合計が 0 ~ 120,55 の正規化された値を提供するため、光学酸化還元比を定義するために選択されました。反対の効果である光学酸化還元比の増加は、分子内のNAD(P)Hで計算された光学酸化還元比を有するシアン化物摂動に対して予想される。

Figure 5
図5:MCF7細胞の光学酸化還元率はシアン化物処理で減少する。 箱ひげ図は、中央値と、セルデータから計算された第1四分位数と第3四分位数を示します。平均は黒い点記号で表され、中央値はボックス内の黒い線で表されます。各箱ひげ図に重ねられた灰色のデータポイントは、各セル内のすべての細胞質ピクセルの平均値を表します。対照群は5つの異なる画像からの91個の細胞で構成され、シアン化物群は5つの異なる画像からの95個の細胞から構成された。p < 0.01、ウェルチの t 検定。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

MCF7細胞の振幅加重NAD(P)H寿命(τm)はシアン化物曝露とともに減少した(図6A、p<2.2×10-16、ウェルチのt検定)。短寿命と長寿命の両方がNAD(P)H では減少しましたが(図6B,C)、NAD(P)H α 1では増加しました(図6D)。NAD(P)H蛍光寿命のこれらの変化、τmの減少、α 1の増加、およびτ2の減少は、シアン化物摂動の公表された値と一致した40,56。シアン化物曝露によるNAD(P)H振幅加重蛍光寿命の減少は、NAD(P)Hの微小環境内での消光の増加を示す。α 1の増加は、細胞代謝に対するシアン化物の影響によるNAD(P)Hの増加から予想されるように、より多くの遊離NAD(P)Hを示す21。

Figure 6
図6:シアン化物処理前後のMCF7細胞のNAD(P)H蛍光寿命パネルA-Dの箱ひげ図は、中央値と、細胞レベルのデータから計算された第1四分位数と第3四分位数を示しています。平均は黒い点記号で表され、中央値はボックス内の黒い線で表されます。各箱ひげ図に重ねられた灰色のデータポイントは、細胞内のすべての細胞質ピクセルの平均値を表します。対照群は5つの異なる画像からの91個の細胞で構成され、シアン化物群は5つの異なる画像からの95個の細胞から構成された。(A-D)は、シアン化物処理によるNAD(P)H振幅加重寿命(τm)、NAD(P)H短寿命(τ1)、NAD(P)H長寿命(τ2)、およびNAD(P)H比例成分の短寿命(α 1)の変化を示す。p値はウェルチのt検定を用いて計算した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

MCF7細胞の振幅加重FAD寿命(τm)はシアン化物曝露後に増加した(図7A, p = 3.688 × 10-12, Welch's t検定)。短寿命と長寿命の両方がFADで増加しましたが(図7B,C)、FAD α 1では減少しました(図7D)。FAD蛍光寿命の変化、τmおよびτ2の増加、およびα 1の減少は、シアン化物摂動の公表されたFAD蛍光寿命データと一致している57。生涯値およびα 1の変化は、遊離FAD21の増加量を含む細胞内の代謝変化を示唆している。

Figure 7
図7:シアン化物処理前後のFAD蛍光寿命 A-Dの箱ひげ図は、中央値、第1四分位数、第3四分位数、および細胞レベルのデータから計算された平均を示します。平均は黒い点記号で表され、中央値はボックス内の黒い線で表されます。各箱ひげ図に重ねられた灰色のデータポイントは、細胞内のすべての細胞質ピクセルの平均値を表します。対照群は5つの異なる画像からの91個の細胞で構成され、シアン化物群は5つの異なる画像からの95個の細胞から構成された。(A-D)シアン化物処理によるFAD振幅加重寿命(τm)、FAD短寿命(τ1)、FAD長寿命(τ2)、および短寿命(α 1)のFAD比例成分の変化を示す。p値はウェルチのt検定を用いて計算した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

自己蛍光強度および寿命イメージングは、細胞における代謝を評価するために広く使用されている21,55。FLIMは高分解能であり、したがって単一細胞を解決し、細胞の不均一性が腫瘍の攻撃性および薬剤耐性に寄与するため、癌研究にとって重要である7,39,41,44,45,46,58。同様に、細胞代謝の自己蛍光イメージングは、免疫細胞機能が細胞代謝に関連しているため、免疫細胞のイメージングに有用であり、免疫細胞集団はしばしば不均一である20,31。標準的な生化学的アッセイは、典型的には、免疫細胞を集団レベルで評価するか、または細胞透過処理後の細胞内標識を必要とする34、59、60。自己蛍光イメージングは、光の非破壊的性質および化学的または遺伝的にコードされた標識の欠如による代謝の高解像度のin vivoおよび動的測定にも適しています36,37,38,41,48,55.NAD(P)HおよびFAD蛍光強度および寿命をイメージングするための重要なステップには、励起および放出に適した波長の選択、細胞に重なり合う蛍光に寄与する合成または追加の内因性蛍光色素を含まないことの検証、および無損傷レーザー出力の使用が含まれる。

NAD(P)HおよびFADの自己蛍光イメージングは、ラベルフリー、高解像度、定量的代謝イメージング技術として独自のニッチを埋めます。FDG-PETやMRSなどの他の画像化方法は、組織代謝を画像化するが、細胞レベルの分解能を欠いているため、細胞の不均一性を評価することができない。酸素消費アッセイ、培地中の代謝産物の測定、タンパク質分析などの他の生化学的手法は、高価な使い捨て試薬を必要とし、プールされた細胞から測定値を取得し、細胞破壊プロトコルを必要とし、タイムコース研究またはインビボ分析を妨げる61,62。

NAD(P)HおよびFADの自己蛍光イメージングは、ラベルフリーで非破壊的な方法で高解像度画像を提供しますが、実験を設計および解釈する際には、自己蛍光イメージングのいくつかの制限を考慮する必要があります。FLIMには、広く利用できない特殊な高価な機器が必要です。FLIM励起には、40~100MHzの繰り返しレートでピコ秒またはフェムト秒パルスのパルス励起源が必要で、出力電力は50mW63>必要です。さらに、画像取得は比較的遅く、ピクセル数または画像解像度と画像取得時間の間にトレードオフがあります。このプロトコルで推奨されているパラメータは、256 x 256 ピクセルと 60 秒の統合時間で、約 1 マイル以内の妥当な解像度の画像を提供します。ユーザーは、より少ないピクセルで小さな領域を画像化するか、ラインスキャンを実行してイメージング速度を向上させるかを選択できます。

あるいは、より高いピクセルの画像は、画像積分時間を長くして取得することができる。FLIMは特定の代謝経路ではなく、代謝補酵素とその分子環境に関する特定の生物物理学的情報を提供するため、自己蛍光の寿命画像のデータ分析と解釈は困難な場合があります。光学顕微鏡はまた、光散乱および吸収による組織内の光浸透の深さによって制限される。インビボ研究は、多光子イメージングシステムを用いて〜0.5mmの深さで、表面組織の、または窓チャンバーを通して2,20,21,64,65行うことができる。

NAD(P)HおよびFADは単離された細胞における主要な内因性蛍光色素であるが、コラーゲンおよびエラスチンを含む追加の分子は、組織における自己蛍光シグナルに寄与する可能性がある。多光子顕微鏡の高解像度画像は、細胞外タンパク質からのNAD(P)HおよびFADピクセルのセグメンテーションのための細胞および非細胞区画の視覚化を可能にする40。一部の細胞は、リポフスシン、レチノール、トリプトファン、メラニン66などの蛍光が重なり合う内因性分子を含む。したがって、NAD(P)HおよびFADの自己蛍光画像には、他の内因性分子からのバックグラウンド寄与が含まれている可能性がある。

同様に、NAD(P)HおよびFADは、600nmを超える波長で発光する外因性蛍光団と多重化することができるが、DAPIなどの外因性標識またはGFPなどの遺伝的にコードされたタンパク質は、スペクトル的に自己蛍光イメージングと重複する。ここで説明するシアン化物摂動実験は、励起波長と発光波長がNAD(P)HとFADを十分に分離して細胞内の代謝変化を捉えることを確認するのに役立ちます。他の細胞型をこのプロトコルに適用することができる。ただし、ユーザーは、各細胞タイプのレーザー出力や画像統合時間などのイメージングパラメータを最適化し、フォトブリーチングを防止するための実験を行う必要があります。フォトブリーチングは、ライフタイムスキャンの期間中、イメージング中の光子カウント率または平均蛍光強度を監視することによって最小限に抑えることができる。蛍光強度の増減は、レーザー出力が高すぎることを示す。レーザーパワーがフォトブリーチングを誘発する場合、パワーを低減し、全画像取得を増加させて、生涯分析のための十分な光子収集を達成することができる。

蛍光寿命は、レーザーパワーおよび検出器ゲインを含む画像化パラメータとは無関係であるが、蛍光強度はこれらのパラメータに依存する20。したがって、光学酸化還元比を定量化するために自家蛍光イメージングを実施する場合、一貫したイメージングパラメータを使用することが極めて重要である。このプロトコルは、各実験グループから異なるFOVの5〜6枚の画像を取得することを推奨しています。このサンプルサイズは、シアン化物摂動によるコンフルエントMCF7細胞の蛍光寿命パラメータの予想される差を解消するために、画像レベルと細胞レベルの両方で十分なデータを提供します。グループごとに取得される最適な画像数は、実験計画と効果サイズによって異なります。NAD(P)H 画像と FAD 画像を切り替える場合、一貫性を保つために、焦点面は各位置で同じままである必要があります。寿命イメージングは通常、飽和した数の光子を持っていませんが、カメラまたは光電子増倍管で取得した強度画像は飽和させることができます。ピクセルの彩度は、生理学的強度の全範囲が画像にキャプチャされることを保証するために避けるべきである。

蛍光寿命画像を解析する場合、測定されたIRFまたはシミュレートされたIRFのいずれかを使用することができる。シミュレートされたIRFは、蛍光寿命曲線のアップシュートから推定されます。ただし、システムによっては、システムから取得される実際の IRF が広くなる可能性があるため、より正確な有効期間値が得られます。IRFは通常、ハードウェアまたはソフトウェアの変更によってのみ変化しますが、蛍光寿命システムが期待どおりに機能していることを確認するには、毎日のIRF測定が良い方法です。

全体として、NAD(P)HおよびFADの自己蛍光イメージングは、単一細胞レベルで細胞代謝を画像化および分析するための標識フリーの非破壊的方法を提供する。この方法は、細胞内で十分に特徴付けられた代謝摂動を誘導するためにシアン化物を使用してNAD(P)HおよびFADのイメージングを検証するための段階的なアプローチを提供する。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

著者らは、開示する利益相反はありません。

Acknowledgments

資金源には、Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP200668) とTexas A&M Universityが含まれる。 図 1 は、BioRender.com を使用して作成されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-deoxy-d-glucose (2-DG) Sigma AC111980000; AC111980010; AC111980050; AC111980250
Antibiotic Antimicrobial (pen-strep) Gibco 15240096
Cell Samples American Type Culture Collection N/A MCF-7 cancer line
CellProfiler Broad Institute N/A Image analysis software
Conical Tube VWR 89039-664 15 mL conical tube
DMEM ThermoFisher 11965092 Culture media
FAD dichroic mirror Semrock FF495-Di03-25x36 495 nm
FAD emission filter Semrock FF01-550/88-25 550/88 nm
FAD excitation filter Semrock FF01-458/64-25 458/64 nm
FBS ThermoFisher 16000036
Fluorescence Lifetime Microscope 3i N/A
Glass bottom dish MatTek Corp P35G-1.0-14-C
Multiphoton Laser Coherent N/A 2P Coherent Laser, Tunable 680 nm-1080 nm
NAD(P)H dichroic mirror Semrock FF409-Di03-25x36 409 nm
NAD(P)H emission filter Semrock FF02-447/60-25 447/60 nm
NAD(P)H excitation filter Semrock FF01-357/44-25 357/44 nm
PBS ThermoFisher 70011044
Potassium Cyanide Sigma-Aldrich 380970
SlideBooks 6 3i N/A Image acquisition software
SPCImage Becker & Hickl GmbH N/A Fluorescence lifetime analysis software
Stage Top Incubator okoLab N/A
Trypsin Biosciences 786-262
Urea Sigma-Aldrich U5128
YG beads Polysciences 19096-2 Yg microspheres (20.0 µm)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heikal, A. A. Intracellular coenzymes as natural biomarkers for metabolic activities and mitochondrial anomalies. Biomarkers in Medicine. 4 (2), 241-263 (2010).
  2. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Optical imaging using endogenous contrast to assess metabolic state. Annual Review of Biomedical Engineering. 14, 351-367 (2012).
  3. Zheng, J. Energy metabolism of cancer: Glycolysis versus oxidative phosphorylation (Review). Oncology Letters. 4 (6), 1151-1157 (2012).
  4. Potter, M., Newport, E., Morten, K. J. The Warburg effect: 80 years on. Biochemical Society Transactions. 44 (5), 1499-1505 (2016).
  5. Zhao, Y., Butler, E. B., Tan, M. Targeting cellular metabolism to improve cancer therapeutics. Cell Death and Disease. 4 (3), 532 (2013).
  6. Patel, S., Ahmed, S. Emerging field of metabolomics: Big promise for cancer biomarker identification and drug discovery. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 63-74 (2015).
  7. Walsh, A. J., Cook, R. S., Skala, M. C. Functional optical imaging of primary human tumor organoids: Development of a personalized drug screen. Journal of Nuclear Medicine. 58 (9), 1367-1372 (2017).
  8. Zaal, E. A., Berkers, C. R. The influence of metabolism on drug response in cancer. Frontiers in Oncology. 8, 500 (2018).
  9. Little, A. C., et al. High-content fluorescence imaging with the metabolic flux assay reveals insights into mitochondrial properties and functions. Communications Biology. 3 (1), 271 (2020).
  10. Wang, X., et al. Comparison of magnetic resonance spectroscopy and positron emission tomography in detection of tumor recurrence in posttreatment of glioma: A diagnostic meta-analysis. Asia-Pacific Journal of Clinical Oncology. 11 (2), 97-105 (2015).
  11. Nabi, H. A., Zubeldia, J. M. Clinical applications of 18F-FDG in oncology. Journal of Nuclear Medicine Technology. 30 (1), 3-9 (2002).
  12. Kostakoglu, L., Agress, H., Goldsmith, S. J. Clinical role of FDG PET in evaluation of cancer patients. Radiographics. 23 (2), 315-340 (2003).
  13. Hoh, C. K. Clinical use of FDG PET. Nuclear Medicine and Biology. 34 (7), 737-742 (2007).
  14. van de Weijer, T., Schrauwen-Hinderling, V. B. Application of magnetic resonance spectroscopy in metabolic research. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1865 (4), 741-748 (2019).
  15. Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and Flavoprotein. Biophysical Journal. 82, 2811-2825 (2002).
  16. Lagarto, J. L., et al. Characterization of NAD(P)H and FAD autofluorescence signatures in a Langendorff isolated-perfused rat heart model. Biomedical Optics Express. 9 (10), 4961-4978 (2018).
  17. Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. , Springer. Boston, MA. (2013).
  18. Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Johnson, M. L. Fluorescence lifetime imaging of free and protein-bound NADH. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 89 (4), 1271-1275 (1992).
  19. Nakashima, N., Yoshihara, K., Tanaka, F., Yagi, K. Picosecond fluorescence lifetime of the coenzyme of D-amino acid oxidase. Journal of Biological Chemistry. 255 (11), 5261-5263 (1980).
  20. Hu, L., Wang, N., Cardona, E., Walsh, A. J. Fluorescence intensity and lifetime redox ratios detect metabolic perturbations in T cells. Biomedical Optics Express. 11 (10), 5674-5688 (2020).
  21. Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. Journal of Biomedical Optics. 25 (7), 1-43 (2020).
  22. Liu, Z., et al. Mapping metabolic changes by noninvasive, multiparametric, high-resolution imaging using endogenous contrast. Science Advances. 4 (3), (2018).
  23. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Optical imaging using endogenous contrast to assess metabolic state. Annual Review of Biomedical Engineering. 14, 351-367 (2012).
  24. Varone, A., et al. Endogenous two-photon fluorescence imaging elucidates metabolic changes related to enhanced glycolysis and glutamine consumption in precancerous epithelial tissues. Cancer Research. 74 (11), 3067-3075 (2014).
  25. Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals. Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).
  26. Sharick, J. T., et al. Protein-bound NAD(P)H lifetime is sensitive to multiple fates of glucose carbon. Scientific Reports. 8 (1), 5456 (2018).
  27. Skala, M. C., et al. In vivo multiphoton microscopy of NADH and FAD redox states, fluorescence lifetimes, and cellular morphology in precancerous epithelia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19494-19499 (2007).
  28. Skala, M. C., et al. In vivo multiphoton fluorescence lifetime imaging of protein-bound and free nicotinamide adenine dinucleotide in normal and precancerous epithelia. Journal of Biomedical Optics. 12 (2), 024014 (2007).
  29. Uchugonova, A. A., König, K. Two-photon autofluorescence and second-harmonic imaging of adult stem cells. Journal of Biomedical Optics. 13 (5), 054068 (2008).
  30. Miranda-Lorenzo, I., et al. Intracellular autofluorescence: a biomarker for epithelial cancer stem cells. Nature Methods. 11 (11), 1161-1169 (2014).
  31. Walsh, A. J., et al. Classification of T-cell activation via autofluorescence lifetime imaging. Nature Biomedical Engineering. 5 (1), 77-88 (2021).
  32. Heaster, T. M., Humayun, M., Yu, J., Beebe, D. J., Skala, M. C. Autofluorescence imaging of 3D tumor-macrophage microscale cultures resolves spatial and temporal dynamics of macrophage metabolism. Cancer Research. 80 (23), 5408-5423 (2020).
  33. Pavillon, N., Hobro, A. J., Akira, S., Smith, N. I. Noninvasive detection of macrophage activation with single-cell resolution through machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (12), 2676-2685 (2018).
  34. Chang, C. H., et al. Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis. Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).
  35. Kaech, S. M., Cui, W. Transcriptional control of effector and memory CD8+ T cell differentiation. Nature Reviews. Immunology. 12 (11), 749-761 (2012).
  36. Gómez, C. A., Fu, B., Sakadžić, S., Yaseena, M. A. Cerebral metabolism in a mouse model of Alzheimer's disease characterized by two-photon fluorescence lifetime microscopy of intrinsic NADH. Neurophotonics. 5 (4), 045008 (2018).
  37. Yaseen, M. A., et al. In vivo imaging of cerebral energy metabolism with two-photon fluorescence lifetime microscopy of NADH. Biomedical Optics Express. 4 (2), 307-321 (2013).
  38. Bower, A. J., et al. High-speed label-free two-photon fluorescence microscopy of metabolic transients during neuronal activity. Applied Physics Letters. 118 (8), 081104 (2021).
  39. Walsh, A. J., et al. Quantitative optical imaging of primary tumor organoid metabolism predicts drug response in breast cancer. Cancer Research. 74 (18), 5184-5194 (2014).
  40. Walsh, A. J., et al. Optical metabolic imaging identifies glycolytic levels, subtypes, and early-treatment response in breast cancer. Cancer Research. 73 (20), 6164-6174 (2013).
  41. Chowdary, M. V. P., et al. Autofluorescence of breast tissues: Evaluation of discriminating algorithms for diagnosis of normal, benign, and malignant conditions. Photomedicine and Laser Surgery. 27 (2), 241-252 (2009).
  42. Demos, S. G., Bold, R., White, R. D., Ramsamooj, R. Investigation of near-infrared autofluorescence imaging for the detection of breast cancer. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 11 (4), 791-798 (2005).
  43. Heaster, T. M., Humayun, M., Yu, J., Beebe, D. J., Skala, M. C. Autofluorescence imaging of 3D tumor-macrophage microscale cultures resolves spatial and temporal dynamics of macrophage metabolism. Cancer Research. 80 (23), 5408-5423 (2020).
  44. Sharick, J. T., et al. Cellular metabolic heterogeneity in vivo is recapitulated in tumor organoids. Neoplasia. 21 (6), 615-626 (2019).
  45. Shah, A. T., Diggins, K. E., Walsh, A. J., Irish, J. M., Skala, M. C. In vivo autofluorescence imaging of tumor heterogeneity in response to treatment. Neoplasia. 17 (12), 862-870 (2015).
  46. Walsh, A. J., Skala, M. C. Optical metabolic imaging quantifies heterogeneous cell populations. Biomedical Optics Express. 6 (2), 559-573 (2015).
  47. Walsh, A. J., Skala, M. C. An automated image processing routine for segmentation of cell cytoplasms in high-resolution autofluorescence images. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XIV. , (2014).
  48. Skala, M., Ramanujam, N. Methods in Molecular Biology. 594, 155-162 (2010).
  49. Stringari, C., et al. Multicolor two-photon imaging of endogenous fluorophores in living tissues by wavelength mixing. Scientific Reports. 7, 3792 (2017).
  50. SPCImage 2.9: Data analysis software for fluorescence lifetime imaging microscopy. SPCImage. , Available from: https://biology.uiowa.edu/sites/biology.uiowa.edu/files/SPCIMAGE29.pdf (2007).
  51. CellProfiler. , Available from: https://cellprofiler.org/releases (2007).
  52. Autofluorescence Imaging. GitHub. , Available from: https://github.com/walshlab/Autofluorescence-Imaging (2021).
  53. Ramey, N. A., Park, C. Y., Gehlbach, P. L., Chuck, R. S. Imaging mitochondria in living corneal endothelial cells using autofluorescence microscopy. Photochemistry and Photobiology. 83 (6), 1325-1329 (2007).
  54. Walsh, A., Cook, R. S., Rexer, B., Arteaga, C. L., Skala, M. C. Optical imaging of metabolism in HER2 overexpressing breast cancer cells. Biomedical Optics Express. 3 (1), 75-85 (2012).
  55. Kolenc, O. I., Quinn, K. P. Evaluating cell metabolism through autofluorescence imaging of NAD(P)H and FAD. Antioxidants & Redox Signaling. 30, 875-889 (2019).
  56. Bird, D. K., et al. Metabolic mapping of MCF10A human breast cells via multiphoton fluorescence lifetime imaging of the coenzyme NADH. Cancer Research. 65, 8766-8773 (2005).
  57. Walsh, A. J., et al. Optical metabolic imaging identifies glycolytic levels, subtypes, and early-treatment response in breast cancer. Cancer Research. 73 (20), 6164-6174 (2013).
  58. Walsh, A. J., Castellanos, J. A., Nagathihalli, N. S., Merchant, N. B., Skala, M. C. Optical imaging of drug-induced metabolism changes in murine and human pancreatic cancer organoids reveals heterogeneous drug response. Pancreas. 45 (6), 863-869 (2016).
  59. Gubser, P. M., et al. Rapid effector function of memory CD8+ T cells requires an immediate-early glycolytic switch. Nature Immunology. 14 (10), 1064-1072 (2013).
  60. Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Review. Immunology. 18 (1), 35-45 (2018).
  61. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. O. Review: Quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. The Journals of Gerontology: Series A. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  62. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio-protocol. 8 (10), 2850 (2018).
  63. Becker, W. The bh TCSPC Handbook. , Available from: https://www.becker-hickl.com/wp-content/uploads/2021/10/SPC-handbook-9ed-05a.pdf (2021).
  64. Gadella, T. W. J. Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity. Mason, W. T. 34, Ch. 34 467-479 (1999).
  65. Miller, D. R., Jarrett, J. W., Hassan, A. M., Dunna, A. K. Deep tissue iImaging with multiphoton fluorescence microscopy. Current Opinion in Biomedical Engineering. 4, 32-39 (2017).
  66. Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence lifetime measurements and biological imaging. Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).

Tags

バイオエンジニアリング 第177号 FLIM 代謝 NAD(P)H FAD 蛍光 顕微鏡
細胞代謝を評価するための自己蛍光イメージング
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Theodossiou, A., Hu, L., Wang, N.,… More

Theodossiou, A., Hu, L., Wang, N., Nguyen, U., Walsh, A. J. Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism. J. Vis. Exp. (177), e63282, doi:10.3791/63282 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter