方法文章

一种用于高内涵筛选与分析应用的类球体大规模生产的稳健方法

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DOI：

10.3791/63436

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2021年12月28日

 ,  , 
1Cell Screening Laboratory, UCD School of Biology and Environmental Science, University College Dublin

本文内容

摘要

本方案详细介绍了生成三种不同类型球状体的方法，这些球状体适用于大规模高内涵筛选与分析。此外，还提供了示例，展示如何在球状体水平和单个细胞水平对其进行分析。

摘要

高内涵筛选（HCS）和高内涵分析（HCA）是能够使研究人员从细胞中获取大规模定量表型测量数据的技术。该方法已被证明在加深理解细胞生物学中众多基础性和应用性事件方面具有强大能力。迄今为止，该技术的大多数应用依赖于单层培养的细胞，尽管人们日益认识到此类模型无法重现组织中发生的许多相互作用和过程。因此，三维（3D）细胞聚集体（如类球体和类器官）的开发与使用正在兴起。尽管这些3D模型在癌症生物学和药物递送研究中特别有效，但以适用于HCS和HCA的可重复方式对其进行制备和分析仍面临诸多挑战。本文详细描述了一种多细胞肿瘤类球体（MCTS）的生成方法，并证明该方法可兼容地应用于三种不同的细胞系。该方法可在每个孔中生成数百个类球体，其独特优势在于：在筛选实验中，每个孔可获得来自数百个结构的数据，且所有结构均接受完全相同的处理。本文还提供了示例，详细说明如何对类球体进行高分辨率荧光成像处理，以及HCA如何在类球体整体水平和每个类球体内的单个细胞水平上提取定量特征。该方案可轻松应用于解答细胞生物学中广泛的重要科学问题。

引言

传统上，基于细胞的实验是在固体基质上生长的单层细胞中进行的，这种环境可有效地被视为二维（2D）环境。然而，人们日益认识到，在某些情况下，2D细胞培养模型缺乏生理相关性，无法复制细胞间发生的许多复杂相互作用1。三维（3D）细胞培养技术正迅速受到研究人员的青睐，3D细胞模型在更好地模拟细胞在组织环境中所经历的生理条件方面展现出巨大潜力2。目前已采用多种不同类型的3D细胞结构，其中最常见的两种是球状体（spheroids）和类器官（organoids）。球状体可由多种不同的细胞系培养而成，其形状和大小因所用细胞类型及组装方法的不同而有所差异3。此外，当球状体由癌细胞系培养而成时，也可称为多细胞肿瘤球体（MCTS），这类模型在临床前体外（in vitro）药物递送和毒性研究中具有特殊应用价值4,5。类器官则旨在更真实地模拟人体内的组织和器官，能够形成更为复杂的形态结构。类器官的制备依赖于成体干细胞或诱导多能干细胞，这些干细胞可被重编程为特定类型的细胞，以模拟目标组织或器官。类器官主要用于研究器官发育过程，以及疾病建模和宿主-病原体相互作用的研究6。

目前有多种不同的方法用于生成三维细胞聚集体。基于支架的方法可为细胞提供附着或在其内部生长的基质或支撑结构。这些支架可以具有多种形状，并由多种不同材料制成。最常见的是细胞外基质（ECM）组分和水凝胶，它们被设计成模拟细胞的天然细胞外环境，从而促进生理性的相互作用4,7。ECM基底材料是从Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤肿瘤中提取的，已被证实含有丰富的ECM组分混合物，包括层粘连蛋白、IV型胶原和perlecan8。然而，尽管其组成具有优势，但该材料在使用中存在两个主要挑战：一是批次间的变异性，二是其在10 °C以下和以上存在两种不同的聚集状态8,9。相比之下，水凝胶的优势在于其组分和刚度具有可调性，可根据所需的特定三维细胞聚集体进行定制7,10。基于支架的方法对类器官的生长至关重要，但也广泛应用于球状体的构建。无支架方法通过阻止细胞附着于其生长表面来实现，通常仅适用于球状体的组装。例如超低吸附（ULA）培养板（可为平底或U型底），可促使细胞聚集形成球状体；或通过在旋转摇瓶中持续搅动细胞以促进其聚集10。

利用三维细胞聚集体研究多种生物学事件的方法正迅速获得广泛关注；然而，选择适合且与后续分析方案兼容的培养方法至关重要。例如，超低吸附（ULA）培养板可生成高度均一的球状体，但该方法受限于每个孔只能形成一个球状体，从而限制了通量。当计划对三维结构进行荧光成像时，需特别注意。细胞聚集体所生长的基质或培养板必须具备良好的光学兼容性，并应尽量减少因使用支架材料而引起的光散射影响11。随着显微镜物镜数值孔径的增加，这一问题将变得更加突出。

选择使用三维细胞模型的主要原因之一，可能是为了获取不仅关于整个细胞聚集体、还包括其中单个细胞的体积成像数据。尤其是多细胞球体（MCTS）模型，正逐渐证明其在深入理解治疗药物如何从外部渗透至中心细胞（正如在肿瘤中所需的过程）方面具有强大潜力12，因此获取不同层次单个细胞的信息至关重要。能够从单个细胞中提取定量信息的成像技术被称为高内涵分析（HCA），在筛选研究中是一种强有力的手段13。迄今为止，HCA 几乎仅应用于单层细胞培养，但人们日益认识到，该技术同样具备应用于三维培养体系的潜力，从而可研究广泛的细胞功能与过程14。其明显优势在于，可对大量三维聚集体进行分析，有望获得来自每个结构内部各个位置的单细胞水平数据。然而，针对可能较厚的细胞聚集体进行成像所面临的技术挑战，以及由此产生的大规模数据集，仍需加以克服。

本文介绍了一种基于支架的稳健方法，可在96孔板中大规模生产多细胞球（MCTS）。该方法可在每个孔中生成数百个三维细胞聚集体。文中以三种不同细胞类型为例，分别代表肝、肺和结肠的实体瘤模型。所形成的球状体具有多种尺寸，因此采用高内涵分析（HCA）来筛选特定尺寸和/或形态的结构。这一特点提供了额外优势：可在同一孔内以相同方式处理不同大小的球状体，并对所观察到的表型进行跨尺寸比较。该方法适用于高分辨率成像，重要的是可从同一细胞聚集体中同时获得细胞水平和亚细胞水平的定量数据。与每孔生成单个球状体的方法相比，该球状体生产方法的另一优势在于，每个孔中产生的大量球状体可能提供足够的生物量，用于转录组和蛋白质组分析等后续研究。

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方案

1. 细胞培养

  1. 准备培养基
    1. 根据细胞系的类型准备特定的细胞培养基。确保所有用于细胞维持的培养基均含有10%胎牛血清（FBS）。
      注意：不同细胞系使用不同的培养基。HT-29结肠癌细胞（ATCC HTB-38）在McCoys 5A培养基中培养，含10% FBS。HepG2肝细胞癌细胞（ATCC HB-8065）在最低必需培养基（Minimum Essential Medium）中培养，含1% L-谷氨酰胺和10% FBS。H358支气管肺泡癌细胞（ATCC CRL-5807）在RPMI 1640培养基中培养，含1% L-谷氨酰胺和10% FBS。所有含有L-谷氨酰胺和FBS的培养基均称为完全培养基。当接种细胞以形成球状体时，需使用不含酚红的培养基并添加10% FBS，以避免对细胞外基质（ECM）基底材料产生染色，从而防止成像过程中出现伪影。
  2. 传代培养细胞
    1. 当细胞融合度约为80%时，用2 mL胰蛋白酶-EDTA（0.25% (w/v) 胰蛋白酶/0.53 mM EDTA）短暂洗涤。吸除胰蛋白酶-EDTA溶液，加入3 mL新鲜胰蛋白酶-EDTA溶液，并在37 °C下孵育3–5分钟。
    2. 当细胞从培养皿表面脱落时，加入7 mL新鲜完全培养基。
    3. 将1 mL细胞悬液转移至新的10 cm细胞培养皿中，并加入9 mL新鲜完全培养基，使细胞稀释比例为1:10。
    4. 将细胞在37 °C、含5% CO2的湿润化培养箱中培养。
    5. 根据细胞系的不同，每3–5天进行一次传代培养。

2. 类球体的生成

  1. 用细胞外基质（ECM）基底膜材料包被96孔板
    1. 将细胞外基质（ECM）基底膜材料置于冰上过夜解冻。
    2. 使用预冷至-20 °C的低温枪头，将细胞外基质（ECM）基底膜材料用不含酚红且无血清的培养基稀释。
      注意：细胞外基质（ECM）基底膜材料的终浓度取决于所使用的细胞系。对于HT-29和H358细胞，使用浓度为4 mg·mL-1的细胞外基质（ECM）基底膜材料；对于HepG2细胞，使用浓度为4 mg·mL-1的低生长因子型细胞外基质（ECM）基底膜材料。
    3. 将15 µL细胞外基质（ECM）基底膜材料/培养基混合液加入96孔成像板中。
      注意：在大规模类球体生产中，只要枪头和盛装细胞外基质（ECM）基底膜材料的储液槽保持低温，可使用8通道移液器或96通道移液头完成此步骤。
    4. 在4 °C条件下，以91 ×g离心20分钟。
    5. 在37 °C条件下孵育，时间不超过30分钟。
  2. 传代并计数细胞
    1. 在板子孵育期间，用胰蛋白酶-EDTA处理细胞，并将其重悬于含10%胎牛血清（FBS）的完全培养基中。
    2. 取10 µL细胞悬液加入血细胞计数板的计数室中，计数计数室四个象限内的细胞数量。
    3. 通过计算四个象限内细胞数的平均值，确定细胞悬液中的细胞总数。
      注意：也可使用自动细胞计数仪进行细胞计数。
    4. 在室温（RT）下以135 ×g离心4分钟。
    5. 待细胞沉淀后，吸除上清液，并将细胞重悬于不含酚红的完全培养基中，调整细胞浓度至每毫升1 × 106个细胞。
  3. 将细胞接种至包被有细胞外基质（ECM）基底膜材料的孔板中
    1. 用不含酚红的完全培养基稀释细胞。
      注意：接种的细胞密度取决于所使用的细胞系。HT-29和HepG2细胞每孔接种3 × 104个细胞；H358细胞每孔接种4 × 104个细胞。
    2. 每孔加入总体积为35 µL的细胞悬液，确保以滴加方式沿孔壁呈环形加入。
      ​注意：在大规模类球体生产中，只要能够实现环形移液操作，可使用8通道移液器完成此步骤。
    3. 将细胞置于含5% CO2的湿润化培养箱中，在37 °C条件下孵育1小时。
    4. 配制细胞外基质（ECM）基底膜材料的溶液：将每孔1.2 µL的细胞外基质（ECM）基底膜材料加入23.8 µL不含酚红的完全培养基中，使孔内细胞外基质（ECM）基底膜材料的终浓度为2%，终体积为60 µL。
    5. 将细胞置于含5% CO2的湿润化培养箱中，在37 °C条件下继续孵育。
    6. 次日，更换为100 µL新鲜的不含酚红的完全培养基。
    7. 此后每隔两天更换一次培养基，每次加入100 µL新鲜的不含酚红的完全培养基。

3. 类球体的免疫荧光染色

注意：本方案改编自 Nürnberg 等人，202015。这些改编主要基于本方案中所述的类球体比 Nürnberg 等人研究中使用的类球体更小15，因此可缩短孵育时间。例如，封闭时间从 2 h 缩短至 1 h。此外，由于本方案旨在高通量生成类球体，所有处理步骤均在类球体培养的孔内进行，无需将单个类球体转移至离心管中。

  1. 准备固定和染色所需的所有溶液和缓冲液
    1. 通过将1片PBS片剂加入200 mL水中来配制磷酸盐缓冲盐水（PBS）。对PBS进行高压灭菌。
    2. 按照步骤3.1.3–3.1.4配制多聚甲醛（PFA）。
    3. 在通风橱中使用加热搅拌器将400 mL PBS加热至60–70 °C，边搅拌边加入15 g PFA。待PFA完全溶解后，加入50 µL 1 M CaCl2和50 µL 1 M MgCl2。
    4. 加入100 mL PBS，使最终体积为500 mL。用NaOH将PFA调节至pH 7.4。通过无菌真空滤器（孔径0.22 µm）过滤PFA，分装后于-20 °C保存。
    5. 通过将3.75 g甘氨酸加入50 mL PBS中配制1 M甘氨酸储备液。于4 °C保存。
    6. 通过将100 µL Triton X-100、1 mL二甲基亚砜（DMSO）和1.5 mL 1 M甘氨酸加入2.4 mL PBS中，配制5 mL透化缓冲液。于4 °C保存，保存时间不超过2周。
    7. 通过将100 µL Triton X-100、0.5 mL DMSO和0.05 g牛血清白蛋白（BSA）加入4.9 mL PBS中，配制5 mL封闭缓冲液。将封闭缓冲液分装至1.5 mL离心管中，于-20 °C保存。
    8. 通过将10 µL吐温20（polysorbate 20）、0.05 g BSA和250 µL DMSO加入4.74 mL PBS中，配制5 mL抗体孵育缓冲液。将抗体孵育缓冲液分装至1.5 mL离心管中，于-20 °C保存。
      注意：在本方案中，类球体仅在96孔板的内层60个孔中构建，尽管也可在全部96个孔中制备。仅在内层60个孔中制备类球体的原因是，某些高数值孔径物镜由于某些板型的“裙边”结构，无法物理上完整成像外周孔。上述体积足以用于制备60个含类球体的孔。
  2. 固定并透化类球体
    1. 小心移除类球体中的培养基，确保不扰动ECM基质层。
    2. 用70 µL PBS洗涤类球体两次，每次3分钟。
    3. 用70 µL 3% PFA在37 °C固定类球体1小时。
    4. 用70 µL PBS洗涤类球体两次，每次3分钟。
    5. 用70 µL 0.5 M甘氨酸溶液在37 °C淬灭30分钟。
    6. 用70 µL透化缓冲液在室温下透化类球体30分钟。
    7. 用70 µL PBS洗涤类球体两次，每次3分钟。
    8. 将类球体在70 µL封闭缓冲液中于37 °C孵育1小时。
      注意：类球体固定后，所有后续处理步骤可使用8通道移液器或96孔移液头（如有）进行，以提高成像前类球体制备的速度。
  3. 使用一抗和二抗对类球体进行免疫染色
    1. 将一抗用抗体孵育缓冲液稀释至适当浓度，每孔加入70 µL。将类球体与一抗在4 °C孵育过夜。
      注意：稀释比例取决于所使用的一抗。在本示例中，溶酶体使用小鼠抗LAMP1抗体以1:500稀释进行免疫染色。
    2. 次日，用70 µL PBS洗涤类球体5次，每次3分钟。
    3. 将二抗以1:500稀释，荧光标记的鬼笔环肽（phalloidin）以1:500稀释，Hoechst 33342（来自1 mg mL-1储备液）以1:5000稀释于抗体孵育缓冲液中，每孔加入70 µL。孵育过夜。
      注意：抗体稀释比例取决于所使用的具体抗体。推荐使用高度交叉吸附、光稳定性高且荧光强度高的二抗。
    4. 次日，用70 µL PBS洗涤类球体5次，每次3分钟。
      ​注意：只要类球体始终被PBS覆盖，板可在室温下保存长达两周后再进行成像。

4. 类球体的图像采集与分析

  1. 图像采集
    1. 将含有类球体的96孔板插入共聚焦高内涵筛选显微镜中。
    2. 选择适当的激光器以激发所用的荧光染料。
    3. 依次采集各通道图像，以避免串扰。
    4. 使用合适的物镜对类球体进行成像。
      注意：如有条件，建议使用水浸物镜。例如，20x/1.0 NA 物镜可在约77个视野内成像整个孔；63x/1.15 NA 物镜可在约826个视野内成像整个孔。
    5. 根据类球体的深度，采集约30–40个层面，每个层面间隔1.5 µm。
  2. 图像分析
    1. 如需对类球体进行形态学分析，请执行步骤4.2.2–4.2.6。
    2. 基于荧光标记的鬼笔环肽染色对类球体进行分割。
    3. 基于Hoechst 33342染色对细胞核进行分割。
    4. 利用存在于细胞质中的残余Hoechst 33342染料对每个细胞的细胞质进行分割。
    5. 计算类球体的不同形态学参数，包括体积、表面积、球形度以及每个类球体中的细胞核数量。
      注意：该信息通过所选图像分析软件内置的各种算法提取。
    6. 进一步处理图像，剔除体积小于75,000 µm3 或大于900,000 µm3 的类球体。
      注意：这些数值建议用于去除非常小的细胞聚集体，以及可能由多个类球体融合形成的大聚集体。在此步骤中也可将类球体划分为不同的尺寸类别。
    7. 如需分析类球体内的单个细胞，请执行步骤4.2.8–4.2.12。
    8. 基于荧光标记的鬼笔环肽染色对类球体进行分割。
    9. 基于Hoechst 33342染色对细胞核进行分割。
    10. 利用存在于细胞质中的残余Hoechst 33342染料对每个细胞的细胞质进行分割。
    11. 基于二抗染色对溶酶体进行分割。
    12. 计算每个类球体内细胞的不同形态学参数，包括每个细胞的溶酶体数量、细胞体积和细胞表面积。
      注意：该信息通过所选图像分析软件内置的各种算法提取。

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结果

本方案详细描述了一种利用不同细胞类型构建三维细胞培养球体（spheroid）以模拟多种肿瘤组织的稳健方法。该方法可在每个孔中生成数百个球体，从而实现以高内涵方式开展基于细胞的检测（图1）。此前，该方法已被用于研究纳米颗粒在HT-29球体中的摄取16以及纳米颗粒对HepG2球体的毒性作用17。该方法的关键在于将支架材料均匀且薄层地分布在光学质量培养板的孔底。将细胞接种至各孔后，再在细胞上覆盖一层低浓度的支架材料。由此形成的基底可支持球体均匀生长，使得在96孔板的每个孔中均可培养出数百个球体。使用低倍物镜可获取整个细胞群体的概览图像（图2）。随后可选择孔内特定区域，利用高分辨率物镜进行成像，并在每个位置采集完整的共聚焦图像层叠（confocal stack）。这些数据为后续对每个球体进行体积分析提供了必要信息。

随后可利用高内涵分析（HCA）对各个类球体进行分析，从而获得有...

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讨论

本文所述方法提供了一个平台，可在单个孔中生成数百个类球体，适用于高内涵筛选（HCS）和高内涵分析（HCA）。与其他常用方法（如使用平底或圆底超低吸附（ULA）培养板，这些方法通常每孔仅能形成一个类球体18,19）相比，该方法能够在筛选模式下从大量类球体中获取高分辨率信息。值得注意的是，该方法已在3种不同的细胞系中得到验证，代表了多种肿瘤类型，表明其在不同模型中研究多种细胞过程的广泛适用性。尽管使用该方法生成的类球体在大小和形状上存在一定异质性，但高内涵分析可轻松按尺寸（或其他感兴趣参数）对其进行分类。本实验室已成功应用该方法研究纳米颗粒诱导的毒性与类球体尺寸之间的关系。重要的是，所有不同尺寸类别的类球体均可在同一孔中进行研究，意味着它们经历了完全相同的处理条件，从而从大量类球体群体中获得高度稳健的实验结果17。本文描述的方法可轻松适配于代表不同组织类型的其他细胞类型。此外，此类类球体还可用于评估多种生物学过程14。若类球体由稳...

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披露

作者声明本研究不存在任何利益冲突。

致谢

作者感谢爱尔兰科学基金会（Science Foundation Ireland，SFI）（项目编号：16/RI/3745）向 JCS 提供的基础设施研究资助。都柏林大学（UCD）细胞筛选实验室的工作得到了 UCD 理学院的支持。ASC 获得了爱尔兰研究理事会（Irish Research Council，IRC）政府爱尔兰研究生奖学金（GOIPG/2019/68）的资助。作者还感谢实验室所有成员的贡献和有益的讨论。图1中的插图由 BioRender 生成。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.05% 胰蛋白酶-EDTA (1x)，含酚红Gibco25300054
牛血清白蛋白 (BSA)Sigma AldrichA6003
氯化钙Fisher Scientific10050070
CellCarrier-96 Ultra 微孔板，组织培养处理，黑色，96 孔带盖Perkin Elmer6055302这些孔板已更名为 Phenoplates
二甲基亚砜 (DMSO)Sigma AldrichD2650
胎牛血清 (FBS)，经鉴定合格，欧盟批准，南美来源，热灭活Gibco10500064
甘氨酸Fisher ScientificBP381-1
山羊抗小鼠 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 标记InvitrogenA-11029
L-谷氨酰胺溶液，200 mMGibco25030024
Hoechst 33342Sigma Aldrich14533
氯化镁Fisher Scientific10647032
Matrigel 基底膜基质，无酚红，无LDEV，10 mLCorning356237该 Matrigel 配方在 BD Biosciences 也可使用相同目录号获得
生长因子减少型 MatrigelBD Biosciences356231该 Matrigel 配方在 Corning 也可使用相同目录号获得
McCoy's 5A 培养基Gibco26600023
McCoy's 5A 培养基，含 L-谷氨酰胺和碳酸氢钠，无酚红Hyclone10358633
最低必需培养基 (MEM)Gibco21090022
最低必需培养基 (MEM)，不含谷氨酰胺，不含酚红Gibco51200046
小鼠单克隆抗 LAMP1 抗体（浓缩液）Developmental Studies Hybridoma BankH4A3-a
Neubauer 血细胞计数板Hirschmann8100203
Nunclon 组织培养皿带盖，聚苯乙烯材质，92 mm × 17 mmThermoFisher Scientific150350
Opera Phenix 高内涵筛选系统及 Harmony 高内涵分析软件Perkin ElmerHCSHH14000000
多聚甲醛 (PFA)Sigma AldrichP6148
鬼笔环肽 Alexa Fluor 568 标记InvitrogenA12380
磷酸盐缓冲液 (PBS) 片剂Sigma AldrichP4417
聚山梨酯 20Sigma AldrichP5927
RPMI 1640 培养基，含 GlutaMAX 补充物Gibco61870010
RPMI 1640 培养基，不含谷氨酰胺，不含酚红Gibco11835063
Triton X-100Sigma AldrichT9284
Stericup 无菌真空滤器装置MilliporeSCGVU05RE

参考文献

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