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Biology

उच्च सामग्री स्क्रीनिंग और विश्लेषण अनुप्रयोगों के लिए गोलाकार के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक मजबूत विधि

Published: December 28, 2021 doi: 10.3791/63436
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cell Screening Laboratory, UCD School of Biology and Environmental Science, University College Dublin

Summary

यह प्रोटोकॉल तीन अलग-अलग प्रकार के गोलाकार के उत्पादन के लिए एक विधि का विवरण देता है जो उन्हें बड़े पैमाने पर उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग और विश्लेषण के लिए उपयुक्त बनाता है। इसके अलावा, उदाहरण प्रस्तुत किए गए हैं जो दिखाते हैं कि उन्हें गोलाकार और व्यक्तिगत सेल स्तरों पर कैसे विश्लेषण किया जा सकता है।

Abstract

उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग (एचसीएस) और उच्च-सामग्री विश्लेषण (एचसीए) ऐसी प्रौद्योगिकियां हैं जो शोधकर्ताओं को कोशिकाओं से बड़े पैमाने पर मात्रात्मक फेनोटाइपिक माप निकालने की क्षमता प्रदान करती हैं। यह दृष्टिकोण सेल जीव विज्ञान में मौलिक और लागू दोनों घटनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला की हमारी समझ को गहरा करने के लिए शक्तिशाली साबित हुआ है। आज तक, इस तकनीक के लिए अधिकांश अनुप्रयोगों ने मोनोलेयर्स में उगाई गई कोशिकाओं के उपयोग पर भरोसा किया है, हालांकि यह तेजी से महसूस किया जाता है कि इस तरह के मॉडल ऊतकों में होने वाली कई इंटरैक्शन और प्रक्रियाओं को दोहराते नहीं हैं। इस प्रकार, 3-आयामी (3 डी) सेल असेंबली के विकास और उपयोग में एक उद्भव हुआ है, जैसे कि गोलाकार और ऑर्गेनोइड्स। हालांकि ये 3 डी मॉडल कैंसर जीव विज्ञान और दवा वितरण अध्ययनों के संदर्भ में विशेष रूप से शक्तिशाली हैं, एचसीएस और एचसीए के लिए उपयुक्त पुनरुत्पादक तरीके से उनके उत्पादन और विश्लेषण कई चुनौतियां पेश करते हैं। यहां विस्तृत प्रोटोकॉल बहुकोशिकीय ट्यूमर गोलाकार (एमसीटीएस) की पीढ़ी के लिए एक विधि का वर्णन करता है, और यह दर्शाता है कि इसे तीन अलग-अलग सेल लाइनों पर इस तरह से लागू किया जा सकता है जो एचसीएस और एचसीए के साथ संगत है। यह विधि प्रति अच्छी तरह से कई सौ गोलाकार के उत्पादन की सुविधा प्रदान करती है, विशिष्ट लाभ प्रदान करती है कि जब स्क्रीनिंग शासन में उपयोग किया जाता है, तो डेटा को कई सौ संरचनाओं से प्राप्त किया जा सकता है, सभी को एक समान तरीके से इलाज किया जा सकता है। उदाहरण भी प्रदान किए जाते हैं, जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए गोलाकार को संसाधित करने के तरीके का विवरण देते हैं और एचसीए गोलाकार स्तर के साथ-साथ प्रत्येक गोलाकार के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं से मात्रात्मक विशेषताओं को कैसे निकाल सकता है। इस प्रोटोकॉल को सेल जीव विज्ञान में महत्वपूर्ण प्रश्नों की एक विस्तृत श्रृंखला का उत्तर देने के लिए आसानी से लागू किया जा सकता है।

Introduction

परंपरागत रूप से, सेल-आधारित assays एक ठोस सब्सट्रेट पर बढ़ रहे मोनोलेयर्स में प्रदर्शन किया गया है, जिसे प्रभावी ढंग से दो आयामी (2 डी) वातावरण के रूप में माना जा सकता है। हालांकि, यह तेजी से मान्यता प्राप्त हो रही है कि 2 डी सेल संस्कृति मॉडल में कुछ संदर्भों में शारीरिक प्रासंगिकता की कमी है और कोशिकाओं के बीच होने वाले कई जटिल इंटरैक्शन को दोहरा नहीं सकता है। तीन आयामी (3 डी) सेल संस्कृति विधियां शोधकर्ताओं के बीच तेजी से लोकप्रिय हो रही हैं, और 3 डी सेल मॉडल ऊतक वातावरण में कोशिकाओं द्वारा सामना की जाने वाली शारीरिक स्थितियों की बेहतर नकल करने के लिए उच्च क्षमता दिखाते हैं2। कई अलग-अलग प्रकार के 3 डी सेल असेंबली हैं जिन्हें नियोजित किया गया है, लेकिन दो सबसे आम प्रकार गोलाकार और ऑर्गेनोइड हैं। गोलाकार को कई अलग-अलग सेल लाइनों से उगाया जा सकता है, और वे उपयोग किए गए सेल प्रकार और असेंबली 3 की उनकी विधि के आधार पर विभिन्न आकारों और आकारों को अपना सकते हैं। इसके अलावा, गोलाकार को बहुकोशिकीय ट्यूमर गोलाकार (एमसीटीएस) के रूप में भी संदर्भित किया जा सकता है जब वे कैंसर सेल लाइनों से उगाए जाते हैं, और इन मॉडलों ने प्रीक्लिनिकल इन विट्रो ड्रग डिलीवरी और विषाक्तता अध्ययन 4,5 के लिए विशेष उपयोग पाया है। दूसरी ओर, ऑर्गेनोइड्स का उद्देश्य हमारे शरीर में ऊतकों और अंगों की बेहतर नकल करना है और अधिक जटिल रूपात्मक व्यवस्थाओं को अपना सकते हैं। ऑर्गेनोइड्स के उत्पादन में वयस्क स्टेम कोशिकाओं या प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं का उपयोग शामिल है, जिन्हें ऊतक या ब्याज के अंग के समान होने के लिए उपयुक्त कोशिकाओं में फिर से प्रोग्राम किया जा सकता है। वे मुख्य रूप से अंगों के विकास की जांच करने और रोगों और मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन को मॉडल करने के लिए उपयोग किए जाते हैं6।

3D सेल असेंबली उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाने वाली विभिन्न विधियों की एक श्रृंखला है। पाड़-आधारित विधियां एक सब्सट्रेट या समर्थन प्रदान करती हैं जिसके लिए कोशिकाएं या तो संलग्न या भीतर बढ़ सकती हैं। इन scaffolds विभिन्न आकार हो सकता है और विभिन्न सामग्री की एक किस्म से बनाया जा सकता है. सबसे आम बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स (ईसीएम) घटक और हाइड्रोजेल हैं, और उन्हें कोशिकाओं के प्राकृतिक बाह्य कोशिकीय वातावरण के समान होने के लिए डिज़ाइन किया गया है और इस प्रकार शारीरिक इंटरैक्शन की सुविधा प्रदान करता है4,7। ईसीएम तहखाने सामग्री Engelbreth-Holm-Swarm माउस सारकोमा ट्यूमर से निकाला गया है और लैमिनिन, प्रकार IV कोलेजन, और perlecan8 सहित ईसीएम घटकों का एक समृद्ध मिश्रण शामिल करने के लिए दिखाया गया है। हालांकि, इसकी लाभप्रद संरचना के बावजूद, इसके उपयोग के साथ दो मुख्य चुनौतियां हैं, अर्थात् इसकी बैच-टू-बैच परिवर्तनशीलता और इसमें 10 डिग्री सेल्सियस 8,9 से नीचे और ऊपर दो अलग-अलग कुल राज्य हैं। इसके विपरीत, हाइड्रोजेल को अपने घटकों और कठोरता के संबंध में लचीला होने का लाभ होता है, और उन्हें विशिष्ट 3 डी सेल असेंबली वांछित 7,10 के अनुरूप अनुकूलित किया जा सकता है। पाड़-आधारित तरीके ऑर्गेनोइड विकास के लिए आवश्यक हैं, लेकिन व्यापक रूप से गोलाकार के लिए भी उपयोग किए जाते हैं। पाड़-मुक्त तरीके, जो कोशिकाओं को उस सतह से जुड़ने से रोककर काम करते हैं जिस पर वे बढ़ रहे हैं, आमतौर पर केवल गोलाकार असेंबली के साथ संगत होते हैं। उदाहरणों में अल्ट्रा-लो अटैचमेंट (यूएलए) प्लेटें शामिल हैं, या तो एक फ्लैट बॉटम या यू-बॉटम के साथ, जो कोशिकाओं को गोलाकार में एकत्रीकरण की अनुमति देता है, या स्पिनर / रोटेशन फ्लास्क 10 में कोशिकाओं के निरंतर आंदोलन का उपयोग करता है।

जैविक घटनाओं की एक विस्तृत विविधता का अध्ययन करने के लिए 3 डी सेल असेंबली का उपयोग तेजी से लोकप्रियता प्राप्त कर रहा है; हालांकि, यह आवश्यक है कि उनकी संस्कृति के लिए चुनी गई विधि उनके डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए योजनाओं के साथ उपयुक्त और संगत हो। उदाहरण के लिए, यूएलए प्लेटों का उपयोग उच्च स्थिरता के गोलाकार उत्पन्न करता है; हालांकि, यह विधि प्रति अच्छी तरह से एक एकल गोलाकार के उत्पादन तक सीमित है, जिससे थ्रूपुट सीमित हो जाता है। विशेष रूप से विचार की आवश्यकता होती है जब 3 डी संरचना की प्रतिदीप्ति इमेजिंग की योजना बनाई जाती है। सब्सट्रेट या प्लेट जिस पर असेंबली उगाई जाती है, उसे ऑप्टिकल रूप से संगत होने की आवश्यकता होती है, और किसी भी मचान के कारण प्रकाश प्रकीर्णन के प्रभावों को कम करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए जिसका उपयोग किया जा सकता है11। यह विशेष समस्या अधिक तीव्र हो जाती है क्योंकि माइक्रोस्कोप उद्देश्य लेंस का संख्यात्मक एपर्चर बढ़ जाता है।

यकीनन 3 डी सेल मॉडल के साथ काम करने के लिए चयन करने के प्रमुख कारणों में से एक न केवल पूरे असेंबली के बारे में वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग डेटा निकालना है, बल्कि इसके भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं के बारे में भी है। एमसीटीएस मॉडल, विशेष रूप से, हमारी समझ को गहरा करने के लिए बहुत शक्तिशाली साबित होने लगे हैं कि कैसे चिकित्सीय बाहर से केंद्रीय कोशिकाओं में पारगमन करते हैं (जैसा कि उन्हें ट्यूमर में करने की आवश्यकता होगी)12, और इसलिए विभिन्न परतों पर व्यक्तिगत कोशिकाओं से ज्ञान प्राप्त करना आवश्यक है। इमेजिंग तकनीक जो व्यक्तिगत कोशिकाओं से मात्रात्मक जानकारी निकालती है, उसे उच्च-सामग्री विश्लेषण (एचसीए) कहा जाता है और स्क्रीनिंग 13 के संदर्भ में एक शक्तिशाली दृष्टिकोण है। आज तक, एचसीए को लगभग विशेष रूप से मोनोलेयर संस्कृतियों पर लागू किया गया है, लेकिन एक बढ़ती हुई प्राप्ति है कि इस दृष्टिकोण में 3 डी संस्कृतियों पर लागू होने की शक्ति है जो सेलुलर कार्यों और प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला को सक्षम करती है। इसका स्पष्ट लाभ होगा कि बड़ी संख्या में 3 डी असेंबली का विश्लेषण किया जा सकता है, संभावित रूप से प्रत्येक संरचना से सेल-स्तर का डेटा प्रदान किया जा सकता है। हालांकि, संभावित मोटी सेल असेंबली की इमेजिंग से जुड़ी चुनौतियों, साथ ही साथ उत्पन्न बड़े डेटा सेट को दूर करने की आवश्यकता है।

इस लेख में, 96-अच्छी तरह से प्रारूप में MCTS के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक मजबूत पाड़-आधारित विधि प्रस्तुत की गई है। विधि प्रत्येक कुएं में कई सौ 3 डी सेल असेंबली के उत्पादन की सुविधा प्रदान करती है। उदाहरण तीन अलग-अलग सेल प्रकारों के लिए दिखाए गए हैं, जो यकृत, फेफड़े और बृहदान्त्र के ठोस ट्यूमर मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं। गोलाकार जो बनते हैं, विभिन्न आकारों के हो सकते हैं, और इसलिए एचसीए का उपयोग किसी विशेष आकार और / या आकृति विज्ञान की संरचनाओं का चयन करने के लिए किया जाता है। यह सुविधा अतिरिक्त लाभ प्रदान करती है कि देखे गए किसी भी फेनोटाइप की तुलना विभिन्न आकारों के गोलाकार में की जा सकती है, लेकिन सभी को एक ही तरह से एक ही तरह से अच्छी तरह से इलाज किया जाता है। यह दृष्टिकोण उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के साथ संगत है, महत्वपूर्ण रूप से एक ही सेलुलर असेंबली से सेल-स्तर और उपकोशिकीय स्तर मात्रात्मक डेटा दोनों प्रदान करता है। गोलाकार उत्पादन की इस विधि में उन तरीकों पर अतिरिक्त लाभ है जो प्रति अच्छी तरह से एक एकल गोलाकार उत्पन्न करते हैं, कि प्रत्येक अच्छी तरह से उत्पादित गोलाकार की बड़ी संख्या संभावित रूप से अन्य डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए पर्याप्त बायोमास प्रदान करती है, जैसे कि ट्रांसक्रिप्टोम और प्रोटिओम प्रोफाइलिंग।

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Protocol

1. सेल संस्कृति

  1. मीडिया तैयार करें
    1. सेल लाइन के प्रकार के आधार पर विशिष्ट सेल संस्कृति मीडिया तैयार करें. सुनिश्चित करें कि सेल रखरखाव के लिए सभी मीडिया में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) शामिल है।
      नोट:: भिन्न कक्ष पंक्तियाँ भिन्न मीडिया का उपयोग करें। HT-29 बृहदान्त्र कार्सिनोमा कोशिकाओं (ATCC HTB-38) McCoys 5A + 10% FBS में उगाए जाते हैं। हेपजी 2 हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा कोशिकाएं (एटीसीसी एचबी -8065) न्यूनतम आवश्यक माध्यम + 1% एल-ग्लूटामाइन + 10% एफबीएस में उगाई जाती हैं। H358 ब्रोन्कोएल्वियोलर कार्सिनोमा कोशिकाओं (ATCC CRL-5807) को RPMI 1640 मध्यम + 1% L-glutamine + 10% FBS में उगाया जाता है। एल-ग्लूटामाइन और एफबीएस युक्त सभी मीडिया को पूर्ण मीडिया के रूप में जाना जाता है। जब कोशिकाओं को गोलाकार के रूप में बढ़ने के लिए चढ़ाना होता है, तो ईसीएम बेसमेंट सामग्री के रंग से बचने के लिए 10% एफबीएस के साथ एक फिनोल लाल-मुक्त माध्यम की आवश्यकता होती है, जो बदले में इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान कलाकृतियों का कारण बन सकता है।
  2. उपसंस्कृति कक्ष
    1. जब कोशिकाएं लगभग 80% confluent होती हैं, तो ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 2 मिलीलीटर (0.25% (डब्ल्यू / वी) ट्रिप्सिन / 0.53 एमएम ईडीटीए) के साथ संक्षेप में धोएं। ट्रिप्सिन-ईडीटीए को एस्पिरेट करें, ताजा ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 3 एमएल जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3-5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. जब कोशिकाओं को सेल संस्कृति पकवान से अलग कर दिया जाता है, तो ताजा पूर्ण माध्यम के 7 एमएल जोड़ें।
    3. पिपेट एक नए 10 सेमी सेल संस्कृति पकवान में सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर और कोशिकाओं के 1: 10 कमजोर पड़ने देने के लिए ताजा पूर्ण माध्यम के 9 एमएल जोड़ें।
    4. 5% CO2 के साथ एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को संस्कृति।
    5. सेल लाइन के आधार पर हर 3-5 दिनों में कोशिकाओं को उपसंस्कृति करें।

2. गोलाकार की पीढ़ी

  1. ईसीएम तहखाने सामग्री के साथ कोट 96-अच्छी तरह से प्लेटें
    1. रात भर बर्फ पर ईसीएम तहखाने सामग्री को पिघलाएं।
    2. -20 डिग्री सेल्सियस पर रखे गए पूर्व-ठंडा युक्तियों का उपयोग करके ठंडे फिनोल लाल-मुक्त सीरम-मुक्त सीरम-मुक्त माध्यम में ईसीएम बेसमेंट सामग्री को पतला करें।
      नोट:: ईसीएम तहखाने सामग्री की अंतिम एकाग्रता उपयोग की गई सेल लाइन पर निर्भर करती है। एचटी -29 और एच 358 कोशिकाओं के लिए, ईसीएम बेसमेंट सामग्री के 4 मिलीग्राम · एमएल -1 का उपयोग करें। HepG2 कोशिकाओं के लिए, कम विकास कारक ईसीएम तहखाने सामग्री के 4 mg · mL -1 का उपयोग करें।
    3. पिपेट 15 μL एक 96 अच्छी तरह से इमेजिंग प्लेट में ईसीएम तहखाने सामग्री / मध्यम समाधान के।
      नोट: बड़े पैमाने पर गोलाकार उत्पादन के लिए, इस चरण को 8-चैनल पिपेट और 96-चैनल पिपेटिंग हेड दोनों के साथ किया जा सकता है, जब तक कि ईसीएम बेसमेंट सामग्री वाले टिप्स और जलाशय को ठंडा किया जाता है।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 91 x g पर 20 मिनट के लिए प्लेट को सेंट्रीफ्यूज करें।
    5. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट से अधिक समय तक प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  2. उपसंस्कृति और गिनती कक्ष
    1. प्लेट इनक्यूबेशन अवधि के दौरान, ट्रिप्सिन-ईडीटीए के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें और उन्हें 10% एफबीएस युक्त एक पूर्ण माध्यम में फिर से निलंबित करें।
    2. एक हेमोसाइटोमीटर गिनती कक्ष में सेल निलंबन के पिपेट 10 μL. कक्ष के 4 चतुर्भुजों में कोशिकाओं की संख्या की गणना करें।
    3. 4 चतुर्थांशों के भीतर कोशिकाओं की औसत संख्या निर्धारित करके सेल निलंबन के भीतर कोशिकाओं की संख्या की गणना करें।
      नोट:: स्वचालित सेल-गिनती उपकरणों का उपयोग करके कक्षों को भी गिना जा सकता है.
    4. कमरे के तापमान (आरटी) पर 4 मिनट के लिए 135 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
    5. एक बार जब कोशिकाओं को गोली मार दी जाती है, तो supernatant aspirate और प्रति mL 1 x 106 कोशिकाओं की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए एक फिनोल लाल मुक्त पूर्ण माध्यम में कोशिकाओं resuspend।
  3. ईसीएम तहखाने सामग्री लेपित प्लेटों में बीज कोशिकाओं
    1. एक फिनोल लाल मुक्त पूर्ण माध्यम में कोशिकाओं को पतला करें।
      नोट:: सीडेड कोशिकाओं का घनत्व उपयोग की गई सेल लाइन पर निर्भर करता है। एचटी -29 और हेपजी 2 कोशिकाओं के लिए, 3 x 104 कोशिकाओं को प्रति अच्छी तरह से बीज दिया जाता है; H358 कोशिकाओं के लिए, 4 x 104 कोशिकाओं को प्रति अच्छी तरह से बीज दिया जाता है।
    2. कोशिकाओं को 35 μL प्रति अच्छी तरह से की कुल मात्रा में बीज. उन्हें एक परिपत्र गति में dropwise जोड़ने के लिए सुनिश्चित करें।
      नोट: बड़े पैमाने पर गोलाकार उत्पादन के लिए, इस चरण को 8-चैनल पिपेट के साथ किया जा सकता है, जब तक कि पिपेटिंग परिपत्र गति प्राप्त की जा सकती है।
    3. 5% CO2 के साथ एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    4. फिनोल लाल मुक्त पूर्ण माध्यम में ईसीएम तहखाने सामग्री का एक समाधान तैयार करें, जिसके परिणामस्वरूप कुएं में 2% ईसीएम बेसमेंट सामग्री की अंतिम एकाग्रता होती है। इसे प्राप्त करने के लिए, 23.8 μL फिनोल लाल मुक्त पूर्ण माध्यम प्रति अच्छी तरह से, जिसके परिणामस्वरूप प्रति अच्छी तरह से 60 μL की अंतिम मात्रा में जिसके परिणामस्वरूप ईसीएम तहखाने सामग्री का 1.2 μL जोड़ें।
    5. 5% CO2 के साथ एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    6. अगले दिन, ताजा फिनोल लाल मुक्त पूर्ण माध्यम के 100 μL के साथ माध्यम को बदलें।
    7. ताजा फिनोल लाल मुक्त पूर्ण माध्यम के 100 μL के साथ हर दूसरे दिन माध्यम की जगह.

3. गोलाकार के immunofluorescence धुंधला

नोट: यह प्रोटोकॉल Nürnberg et al., 202015 से अनुकूलित है। ये अनुकूलन मुख्य रूप से इस तथ्य पर आधारित हैं कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित गोलाकार Nürnberg et al. work15 में उपयोग किए जाने वाले लोगों की तुलना में छोटे हैं और, जैसे, छोटे इनक्यूबेशन समय की सुविधा प्रदान करते हैं। उदाहरण के लिए, ब्लॉकिंग समय 2 घंटे से 1 घंटे तक कम हो जाता है। इसके अलावा, जैसा कि प्रोटोकॉल को गोलाकार के उच्च-थ्रूपुट उत्पादन के लिए डिज़ाइन किया गया है, सभी प्रसंस्करण चरणों को उस कुएं में किया जाता है जिसमें गोलाकार सुसंस्कृत होते हैं, जिसका अर्थ है कि ट्यूबों में व्यक्तिगत गोलाकार के हस्तांतरण की आवश्यकता नहीं होती है।

  1. फिक्सिंग और धुंधला करने के लिए आवश्यक सभी समाधान और बफर तैयार करें
    1. फॉस्फेट बफ़र्ड सलाइन (पीबीएस) प्रति 200 मिलीलीटर पानी में 1 पीबीएस टैबलेट जोड़कर तैयार करें। पीबीएस को आटोक्लेव करें।
    2. 3.1.3-3.1.4 चरणों के बाद पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) तैयार करें।
    3. एक धुएं के हुड में 60-70 डिग्री सेल्सियस के लिए पीबीएस के 400 मिलीलीटर को गर्म करने के लिए एक गर्म हलचल का उपयोग करें। हिलाते समय पीएफए के 15 ग्राम जोड़ें। एक बार जब PFA भंग हो जाता है, तो 1 M CaCl2 के 50 μL और 1 M MgCl2 के 50 μL जोड़ें।
    4. 500 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा बनाने के लिए पीबीएस के 100 मिलीलीटर जोड़ें। PFA को pH 7.4 पर संतुलित करने के लिए NaOH का उपयोग करें। बाँझ वैक्यूम फिल्टर (ताकना आकार 0.22 μm), ऐलीकोट, और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर के माध्यम से पीएफए फ़िल्टर करें।
    5. पीबीएस के 50 मिलीलीटर में 3.75 ग्राम ग्लाइसिन जोड़कर 1 एम ग्लाइसिन स्टॉक समाधान तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    6. ट्राइटन एक्स -100 के 100 μL, डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (DMSO) के 1 mL और PBS के 2.4 mL में 1 M ग्लाइसिन के 1.5 mL जोड़कर permeabilization बफर के 5 mL तैयार करें। 2 सप्ताह से अधिक समय तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    7. ट्राइटन एक्स -100 के 100 μL, DMSO के 0.5 mL और गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (BSA) के 0.05 ग्राम को PBS के 4.9 mL में जोड़कर 5 mL ब्लॉकिंग बफर तैयार करें। 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में अवरुद्ध बफर को एलीकोट करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    8. पॉलीसोर्बेट 20 के 10 μL, BSA के 0.05 g, और DMSO के 250 μL को PBS के 4.74 mL में जोड़कर बफर के इनक्यूबेशन 5 mL एंटीबॉडी तैयार करें। 1.5 मिली ट्यूबों में बफर इनक्यूबेशन एंटीबॉडी को एलीकोट करें और इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: यहां वर्णित प्रोटोकॉल में, गोलाकार केवल 96-वेल प्लेट के आंतरिक 60 कुओं में इकट्ठे होते हैं, हालांकि उन्हें प्लेट के सभी 96 कुओं में तैयार किया जा सकता है। केवल आंतरिक 60 कुओं में गोलाकार तैयार करने का कारण यह है कि कुछ उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य लेंस कुछ प्लेट प्रकारों पर 'स्कर्ट' के कारण बाहरी कुओं के पूरे कुएं को शारीरिक रूप से छवि करने में सक्षम नहीं हैं। उपरोक्त खंड गोलाकार युक्त 60 कुओं की तैयारी के लिए पर्याप्त हैं।
  2. फिक्स और गोलाकार permeabilize
    1. ध्यान से गोलाकार से माध्यम को हटा दें, यह सुनिश्चित करते हुए कि ईसीएम तहखाने सामग्री परत परेशान नहीं है।
    2. हर बार 3 मिनट के लिए पीबीएस के 70 μL के साथ गोलाकार को दो बार धोएं।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 3% पीएफए के 70 μL के साथ गोलाकार को ठीक करें।
    4. हर बार 3 मिनट के लिए पीबीएस के 70 μL के साथ गोलाकार को दो बार धोएं।
    5. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 0.5 एम ग्लाइसिन समाधान के 70 μL के साथ बुझाएं।
    6. RT पर 30 मिनट के लिए permeabilization बफर के 70 μL का उपयोग कर गोलाकार permeabilize.
    7. हर बार 3 मिनट के लिए पीबीएस के 70 μL के साथ गोलाकार को दो बार धोएं।
    8. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए ब्लॉकिंग बफर के 70 μL में गोलाकार को इनक्यूबेट करें।
      नोट: एक बार गोलाकार तय किया गया है, सभी बाद के प्रसंस्करण चरणों को एक 8-चैनल पिपेट, या 96-अच्छी तरह से पिपेटिंग हेड का उपयोग करके किया जा सकता है, यदि उपलब्ध हो। यह इमेजिंग से पहले गोलाकार तैयारी की गति को बढ़ाता है।
  3. प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्युनोस्टेन गोलाकार
    1. प्राथमिक एंटीबॉडी को बफर के इनक्यूबेशन एंटीबॉडी में एक उपयुक्त कमजोर पड़ने के लिए पतला करें और प्रत्येक अच्छी तरह से 70 μL जोड़ें। रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ गोलाकार इनक्यूबेट करें।
      नोट: कमजोर पड़ने विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग किया पर निर्भर करता है। यहां दिखाए गए उदाहरण में, लाइसोसोम को माउस एंटी-लैम्प 1 एंटीबॉडी के साथ 1: 500 के कमजोर पड़ने का उपयोग करके इम्यूनोस्टेन किया जाता है।
    2. अगले दिन, हर बार 3 मिनट के लिए पीबीएस के 70 μL के साथ गोलाकार को 5 बार धोएं।
    3. 1: 500 के कमजोर पड़ने पर द्वितीयक एंटीबॉडी को पतला करें, 1: 500 पर फ्लोरोसेंटली-संयुग्मित फेलोइडिन, और Hoechst 33342 (1 मिलीग्राम एमएल -1 स्टॉक से) 1:5000 पर एंटीबॉडी इनक्यूबेशन बफर में और प्रत्येक अच्छी तरह से 70 μL जोड़ें। रात भर इनक्यूबेट करें।
      नोट: एंटीबॉडी कमजोर पड़ने विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग किया पर निर्भर करता है. अत्यधिक क्रॉस-अधिशोषित माध्यमिक एंटीबॉडी जो उच्च फोटोस्टेबिलिटी और उच्च चमक दिखाते हैं, की सिफारिश की जाती है।
    4. अगले दिन, हर बार 3 मिनट के लिए पीबीएस के 70 μL के साथ गोलाकार को 5 बार धोएं।
      नोट: प्लेटों को इमेजिंग से पहले आरटी में दो सप्ताह तक संग्रहीत किया जा सकता है, जब तक कि गोलाकार पीबीएस के साथ कवर रहते हैं।

4. छवि अधिग्रहण और गोलाकार का विश्लेषण

  1. छवि अधिग्रहण
    1. एक confocal उच्च सामग्री स्क्रीनिंग माइक्रोस्कोप में गोलाकार युक्त 96 अच्छी तरह से प्लेट डालें।
    2. उपयोग किए गए फ्लोरोफोर को उत्तेजित करने के लिए उपयुक्त लेजर का चयन करें।
    3. क्रॉस-टॉक से बचने के लिए चैनलों को क्रमिक रूप से प्राप्त करें।
    4. उचित उद्देश्यों का उपयोग करके गोलाकार छवि।
      नोट: यदि उपलब्ध हो तो जल विसर्जन उद्देश्यों का उपयोग अनुशंसित है। उदाहरण के लिए, एक 20x/1.0 NA उद्देश्य ~ 77 फ़ील्ड ्स ऑफ़ व्यू में एक संपूर्ण कुएं की छवि बना सकता है। एक 63x /1.15 एनए उद्देश्य दृश्य के लगभग 826 क्षेत्रों में एक पूरे कुएं की छवि बना सकता है।
    5. छवि ~ 30-40 स्लाइस, गोलाकार की गहराई के आधार पर, प्रत्येक स्लाइस के साथ पूर्ववर्ती एक से 1.5 μm के अंतराल पर लिया गया है।
  2. छवि विश्लेषण
    1. गोलाकार के रूपात्मक विश्लेषण के लिए, चरण 4.2.2-4.2.6 का पालन करें।
    2. फ्लोरोसेंट-संयुग्मित phalloidin धुंधला पर आधारित गोलाकार खंड.
    3. Hoechst 33342 धुंधला पर आधारित नाभिक खंड.
    4. प्रत्येक कोशिका के साइटोप्लाज्म को अवशिष्ट Hoechst 33342 दाग द्वारा विभाजित करें जो सेल साइटोप्लाज्म में मौजूद है।
    5. गोलाकार के विभिन्न रूपात्मक गुणों की गणना करें, जिसमें आयतन, सतह क्षेत्र, स्फेरिकिटी और प्रति गोलाकार नाभिक की संख्या शामिल है।
      नोट:: यह जानकारी विभिन्न एल्गोरिदम का उपयोग करके निकाली जाती है जो पसंद के छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में अंतर्निहित हैं।
    6. 75,000 μm3 से छोटे और 900,000 μm3 से बड़े गोलाकार को हटाने के लिए आगे की प्रक्रिया छवियों।
      नोट:: ये मान बहुत छोटे सेल असेंबली और बड़ी असेंबली जो एकाधिक गोलाकार के संलयन के परिणामस्वरूप उत्पन्न हो सकता है को हटाने की अनुमति देने के लिए सुझाव हैं। गोलाकार को इस चरण में विभिन्न आकार वर्गों में भी वर्गीकृत किया जा सकता है।
    7. गोलाकार के भीतर एकल कक्षों का विश्लेषण करने के लिए, चरण 4.2.8-4.2.12 का पालन करें।
    8. फ्लोरोसेंट-संयुग्मित phalloidin धुंधला पर आधारित गोलाकार खंड.
    9. Hoechst 33342 धुंधला पर आधारित नाभिक खंड.
    10. प्रत्येक कोशिका के साइटोप्लाज्म को अवशिष्ट Hoechst 33342 दाग द्वारा विभाजित करें जो सेल साइटोप्लाज्म में मौजूद है।
    11. द्वितीयक एंटीबॉडी धुंधला के आधार पर लाइसोसोम को विभाजित करें।
    12. प्रत्येक गोलाकार के भीतर कोशिकाओं के विभिन्न रूपात्मक गुणों की गणना करें, जिसमें प्रति सेल लाइसोसोम, सेल वॉल्यूम और सेल सतह क्षेत्र की संख्या शामिल है।
      नोट:: यह जानकारी विभिन्न एल्गोरिदम का उपयोग करके निकाली जाती है जो पसंद के छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में अंतर्निहित हैं।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल में, विभिन्न ट्यूमर ऊतकों का प्रतिनिधित्व करने के लिए विभिन्न सेल प्रकारों का उपयोग करके, गोलाकार के रूप में 3 डी सेल संस्कृति विधानसभाओं का उत्पादन करने के लिए एक मजबूत विधि, विस्तृत है। यह विधि प्रति अच्छी तरह से सैकड़ों गोलाकार की पीढ़ी के लिए अनुमति देती है, जो सेल-आधारित assays को उच्च-सामग्री तरीके से निष्पादित करने में सक्षम बनाती है (चित्रा 1)। इस दृष्टिकोण का उपयोग पहले एचटी -29 गोलाकार 16 और हेपजी 2 गोलाकार 17 में नैनोपार्टिकल-प्रेरित विषाक्तता में नैनोपार्टिकल अपटेक का अध्ययन करने के लिए किया गया है। विधि एक ऑप्टिकल गुणवत्ता प्लेट के अच्छी तरह से नीचे पाड़ सामग्री के एक पतली और यहां तक कि वितरण के उत्पादन पर निर्भर करती है। कोशिकाओं को प्रत्येक अच्छी तरह से बीज दिया जाता है, और आगे पाड़ सामग्री, कम एकाग्रता पर, कोशिकाओं पर एक ओवरले के रूप में जोड़ा जाता है। इसके परिणामस्वरूप एक आधार होता है जो गोलाकार के विकास का भी समर्थन करता है, जिसका अर्थ है कि 96-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में कई सौ गोलाकार को सुसंस्कृत किया जा सकता है। एक कम आवर्धन उद्देश्य का उपयोग पूरी आबादी की एक सिंहावलोकन छवि उत्पन्न करने के लिए किया जाता है (चित्रा 2)। अच्छी तरह से उप-क्षेत्रों को तब एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन उद्देश्य का उपयोग करके चुना और चित्रित किया जा सकता है, और प्रत्येक स्थिति में, एक पूर्ण कॉन्फोकल स्टैक का अधिग्रहण किया जाता है। यह प्रत्येक गोलाकार के बाद के वॉल्यूमेट्रिक विश्लेषण के लिए आवश्यक जानकारी प्रदान करता है।

व्यक्तिगत गोलाकार को तब एचसीए द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है, जिससे गोलाकार के रूपात्मक गुणों के बारे में जानकारी प्रदान की जा सकती है। आमतौर पर पहला कदम प्रत्येक गोलाकार को एक ही वस्तु के रूप में पहचानना है। ऐसा करने के लिए, एक प्रतिदीप्ति चैनल जो गोलाकार में लगातार धुंधला या वितरण देने की संभावना है, का चयन किया जाता है। यहां दिखाए गए उदाहरण में, फ्लोरोसेंटली-संयुग्मित फालोइडिन चैनल में सिग्नल का उपयोग किया जाता है, क्योंकि एक्टिन विभिन्न गोलाकार प्रकारों (चित्रा 2 और चित्रा 3 ए) में सभी कोशिकाओं में प्लाज्मा झिल्ली के करीब पाया जाता है। पूर्ण confocal स्टैक उत्पन्न किया जा रहा है के एक परिणाम के रूप में, सभी HCA चरणों को स्लाइस के आधार पर एक टुकड़ा पर बजाय एक वॉल्यूमेट्रिक तरीके से किया जा सकता है। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि यह चयनित विमानों की एक छोटी संख्या के विश्लेषण से जुड़े किसी भी पूर्वाग्रह को हटा देता है। यह वॉल्यूमेट्रिक दृष्टिकोण तब छवि में अन्य चैनलों पर लागू होता है। नाभिक का पता लगाया गया था और Hoechst 33342 धुंधला के आधार पर विभाजित किया गया था, और इस एक ही चैनल का उपयोग सेल साइटोप्लाज्म का पता लगाने के लिए किया जा सकता है, क्योंकि निम्न स्तर पर अवशिष्ट Hoechst 33342 मौजूद है (चित्रा 3 B)। यदि गोलाकार के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं के डाउनस्ट्रीम विश्लेषण की आवश्यकता होती है, तो अन्य चैनलों (उदाहरण के लिए, एंटी-लैम्प 1 एंटीबॉडी के साथ लाइसोसोम इम्युनोस्टेन्ड) को भी इसी तरह से संसाधित किया जा सकता है। वॉल्यूमेट्रिक दृष्टिकोण सभी फ्लोरोसेंटली-लेबल संरचनाओं को सभी दृश्यों (चित्रा 3 सी) से कल्पना करने की अनुमति देता है।

गोलाकार को एक अलग वस्तु के रूप में पहचानने के बाद, गोलाकार स्तर पर विभिन्न रूपात्मक माप किए जा सकते हैं। इन मापों में प्रति गोलाकार नाभिक की संख्या की गणना शामिल है (चित्रा 4 ए), साथ ही साथ गोलाकार के स्फेरिकिटी (चित्रा 4 बी), आयतन (चित्रा 4 सी), और सतह क्षेत्र (चित्रा 4 डी)। उपयोग किए गए एचसीए सॉफ़्टवेयर के आधार पर, अन्य रूपात्मक विशेषताओं जैसे कि क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र, आंतरिक डिस्क त्रिज्या और आंतरिक क्षेत्र त्रिज्या की भी गणना की जा सकती है। यहां दिखाए गए उदाहरणों में, 75,000 μm3 से नीचे और 900,000 μm3 से ऊपर के गोलाकार को माप से छोड़ दिया गया था, लेकिन इन मापदंडों को उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, विश्लेषण के लिए वांछित गोलाकार गुणों के आधार पर। स्प्रेडशीट छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न किए गए थे और विश्लेषण के लिए RStudio में आयात किए गए थे। बॉक्सप्लॉट ग्राफ़ का उत्पादन विभिन्न प्रकार के गोलाकार (चित्रा 4) के रूपात्मक गुणों को प्रदर्शित करने के लिए किया गया था। ये बॉक्सप्लॉट आबादी में गोलाकार विषमता के स्तर को प्रकट करते हैं, यही कारण है कि किसी भी एक प्रयोग में बड़ी संख्या में गोलाकार को मापना महत्वपूर्ण है। यह उन तरीकों पर एक महत्वपूर्ण लाभ है जो प्रति अच्छी तरह से एक एकल गोलाकार उत्पन्न करते हैं। यहां दिखाए गए तीन गोलाकार प्रकार उनकी मात्रा और सतह क्षेत्र के संबंध में समानता का एक उच्च स्तर दिखाते हैं, हालांकि यह उल्लेखनीय है कि हेपजी 2 गोलाकार की स्फेरिकिटी यहां दिखाए गए अन्य प्रकारों की तुलना में कुछ कम है (चित्रा 4 बी)।

एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन उद्देश्य के साथ इमेजिंग गोलाकार, जैसे कि यहां उपयोग किए जाने वाले 63x जल विसर्जन उद्देश्य, गोलाकार के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं के उपकोशिकीय संकल्प को प्राप्त करने की अनुमति देता है। विभिन्न ऑर्गेनेल को उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी के आधार पर विभाजित किया जा सकता है। यहां दिखाए गए उदाहरण में, लाइसोसोम की पहचान एंटी-लैम्प 1 एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्युनोस्टेनिंग के आधार पर की गई थी, इसके बाद माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ (चित्रा 3 सी)। प्रत्येक कोशिका के भीतर प्रत्येक ऑर्गेनेल का विभाजन तब सेल-स्तर के माप के परिमाणीकरण की अनुमति देता है। तीन गोलाकार प्रकारों (चित्रा 5A) में प्रत्येक सेल की विशिष्ट मात्रा, साथ ही साथ प्रति सेल लाइसोसोम की संख्या (चित्रा 5 B), दिखाई गई है। इस तरह के उपकोशिकीय विस्तार की आवश्यकता परख जिसमें गोलाकार का उपयोग किया जाएगा द्वारा निर्धारित किया जाता है।

गोलाकार पीढ़ी की शुरुआत में प्रारंभिक सेल सीडिंग घनत्व का अनुकूलन एक महत्वपूर्ण कदम है। बहुत अधिक कोशिकाओं को जोड़ना अभी भी गोलाकार गठन की अनुमति देता है; हालांकि, इसके परिणामस्वरूप गोलाकार (चित्रा 6) का संलयन हो सकता है। यह अनियमित रूप से आकार की विधानसभाओं की पीढ़ी की ओर जाता है, जो बदले में गोलाकार की डाउनस्ट्रीम पहचान के लिए अत्यधिक समस्याग्रस्त हो सकता है। जब गोलाकार को गलत तरीके से अलग-अलग संरचनाओं के रूप में पहचाना जाता है, तो व्यक्तिगत कोशिकाओं के विश्लेषण के साथ भी समस्याएं हो सकती हैं। इस प्रकार, गोलाकार पीढ़ी के लिए उपयोग की जाने वाली प्रत्येक सेल लाइन का सावधानीपूर्वक अनुकूलन, जिसमें सेल सीडिंग घनत्व और विकास के समय की लंबाई शामिल है, स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण पैरामीटर हैं।

Figure 1
चित्रा 1: एचसीएस और एचसीए के लिए गोलाकार उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल का विवरण देने वाली योजनाबद्ध। 96-वेल प्लेटों को ईसीएम बेसमेंट सामग्री की एक परत के साथ लेपित किया जाता है, जिसके बाद कोशिकाओं की सीडिंग होती है, जो तब गोलाकार गठन शुरू करती है। माध्यम को अगले दिन और उसके बाद हर दूसरे दिन बदल दिया जाता है। इमेजिंग की तैयारी में, गोलाकार को निश्चित, permeabilized, और विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ immunostained कर रहे हैं। गोलाकार को तब एक confocal HCS माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्रित किया जाता है। ग्राफ़िक BioRender.com के साथ बनाया गया. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: H358, HepG2, और HT-29 गोलाकार की उदाहरण छवियाँ। (ए) एच 358, (बी) हेपजी 2, और (सी) एचटी -29 गोलाकार की पूरी तरह से स्वचालित एचसीएस कॉन्फोकल इमेजिंग। पैनल एक एकल अच्छी तरह से अवलोकन दिखाते हैं, साथ ही साथ तीन उदाहरण कॉन्फोकल स्लाइस और प्रत्येक सेल लाइन से एक गोलाकार के वॉल्यूमेट्रिक पुनर्निर्माण। Hoechst 33342 के साथ दाग नाभिक नीले रंग में दिखाया गया है, लाल रंग में फ्लोरोसेंटली संयुग्मित phalloidin के साथ दाग एक्टिन, और हरे रंग में LAMP1 के लिए लाइसोसोम immunostaineds. अच्छी तरह से अवलोकन की छवियों को 20x जल विसर्जन उद्देश्य (एनए 1.0) के साथ अधिग्रहित किया गया था। व्यक्तिगत गोलाकार की छवियों को 63x जल विसर्जन उद्देश्य (एनए 1.15) के साथ अधिग्रहित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: छवि विश्लेषण में उदाहरण कुंजी कदम। (ए) प्रत्येक गोलाकार को पहली बार फ्लोरोसेंट-संयुग्मित फेलोइडिन स्टेनिंग का पता लगाकर वॉल्यूमेट्रिक मोड में पहचाना जाता है। (बी) मास्क के रूप में इस जानकारी का उपयोग करते हुए, प्रत्येक कोशिका के साइटोप्लाज्म को सेल साइटोप्लाज्म में मौजूद अवशिष्ट होचस्ट 33342 दाग द्वारा विभाजित किया जाता है। नाभिक Hoechst 33342 दाग द्वारा विभाजित कर रहे हैं। लाइसोसोम को एंटीबॉडी (एंटी-लैम्प 1) इम्युनोस्टेनिंग का उपयोग करके विभाजित किया जाता है। वॉल्यूमेट्रिक दृश्य दिखाए गए हैं। (सी) एक ही गोलाकार के 3-समतल दृश्य। दिखाया गया उदाहरण H358 सेल गोलाकार का है। छवियों को 63x जल विसर्जन उद्देश्य (एनए 1.15) के साथ अधिग्रहित किया गया था , कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: गोलाकार-स्तर माप के उदाहरण। सभी माप एक स्वचालित छवि विश्लेषण पाइपलाइन का उपयोग करके किए गए थे, और तीन प्रकार के गोलाकार के लिए, अर्थात् H358, HepG2 और HT-29, 20x उद्देश्य के साथ चित्रित किया गया था। दिखाया गया है (ए) प्रति गोलाकार नाभिक की औसत संख्या, (बी) गोलाकार स्फेरिकिटी, (सी) गोलाकार आयतन, और (डी) गोलाकार सतह क्षेत्र। सभी boxplots प्रत्येक गोलाकार प्रकार के लिए माध्य मान और चतुर्थक दिखाते हैं। डेटा 3 प्रतिकृति कुओं से हैं; विश्लेषण किए गए गोलाकार की कुल संख्या 1259 (H358), 1522 (HepG2), और 1326 (HT-29) थी। छवियों को 20x जल विसर्जन उद्देश्य (एनए 1.0) के साथ अधिग्रहित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: गोलाकार से सेल-स्तर माप के उदाहरण। सभी माप एक स्वचालित छवि विश्लेषण पाइपलाइन का उपयोग करके किए गए थे, और तीन प्रकार के गोलाकार के लिए, अर्थात् H358, HepG2, और HT-29, 63x उद्देश्य के साथ चित्रित किया गया था। दिखाया गया है (ए) अलग-अलग कोशिकाओं के वॉल्यूम, और (बी) प्रति सेल लाइसोसोम की औसत संख्या। विश्लेषण की गई कोशिकाओं की कुल संख्या 1410 (H358), 1625 (HepG2), और 1401 (HT-29), प्रत्येक सेल लाइन के 20 गोलाकार से थी। छवियों को 63x जल विसर्जन उद्देश्य (एनए 1.15) के साथ अधिग्रहित किया गया था , कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: उदाहरण छवियां गोलाकार गठन पर कोशिकाओं के ओवर-चढ़ाना के प्रभाव ों को दर्शाती हैं। उदाहरण छवियाँ H358, HepG2, और HT-29 गोलाकार के लिए दिखाए गए हैं। तीर उन स्थानों को इंगित करते हैं जहां गोलाकार संभवतः फ्यूज हो गए हैं। छवियों को 20x जल विसर्जन उद्देश्य (एनए 1.0) के साथ अधिग्रहित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां वर्णित दृष्टिकोण में एचसीएस और एचसीए के लिए उपयुक्त तरीके से कई सौ गोलाकार प्रति अच्छी तरह से उत्पन्न करने के लिए एक मंच का विवरण दिया गया है। अन्य लोकप्रिय तरीकों की तुलना में, जैसे कि फ्लैट-बॉटम वाले और राउंड-बॉटम वाले यूएलए प्लेटों का उपयोग, जो प्रति वेल 18,19 में केवल एक गोलाकार के गठन की अनुमति देता है, यह विधि उच्च-रिज़ॉल्यूशन की जानकारी के लिए एक स्क्रीनिंग प्रारूप में बड़ी संख्या में गोलाकार से निकाली जाने का अवसर प्रदान करती है। विशेष रूप से, इस विधि को 3 अलग-अलग सेल लाइनों में प्रदर्शित किया गया है, जो विभिन्न ट्यूमर प्रकारों का प्रतिनिधित्व करता है, विभिन्न मॉडलों में सेलुलर प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए इसकी व्यापक उपयुक्तता को उजागर करता है। यद्यपि इस विधि का उपयोग करके उत्पन्न गोलाकार आकार और आकार में कुछ परिवर्तनशीलता दिखाता है, एचसीए आसानी से उन्हें आकार (या ब्याज के किसी भी अन्य पैरामीटर) द्वारा वर्गीकृत कर सकता है। हमारी प्रयोगशाला ने गोलाकार आकार के एक समारोह के रूप में नैनोपार्टिकल-प्रेरित विषाक्तता का अध्ययन करने के लिए इस दृष्टिकोण का सफलतापूर्वक उपयोग किया है। महत्वपूर्ण रूप से, गोलाकार के सभी अलग-अलग आकार के वर्गों का एक ही अच्छी तरह से अध्ययन किया जा सकता है, जिसका अर्थ है कि सभी समान उपचारों के संपर्क में थे, जो एक बड़े गोलाकार आबादी 17 से अत्यधिक मजबूत आउटपुट देते थे। यहां वर्णित पद्धति को विभिन्न ऊतकों का प्रतिनिधित्व करने वाले अन्य सेल प्रकारों के साथ उपयोग के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, इस तरह के गोलाकार का उपयोग विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं का आकलन करने के लिए किया जा सकता है14। यदि गोलाकार कोशिकाओं के साथ उत्पन्न होते हैं, तो फ्लोरोसेंटली-टैग किए गए प्रोटीन को स्थिर रूप से व्यक्त करते हैं, तो लाइव सेल इमेजिंग भी संभव है।

इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम ईसीएम बेसमेंट सामग्री परत का उत्पादन है जिस पर कोशिकाओं को मढ़वाया जाता है। जब परत बहुत मोटी होती है, तो यह एक मेनिस्कस 20 बना सकती है जो कुएं के केंद्र में मोनोलेयर्स के विकास को बढ़ावा देती है और केवल कुएं के बाहरी रिम पर गोलाकार होती है। इसलिए, यह आवश्यक है कि ईसीएम तहखाने सामग्री की सही एकाग्रता और मात्रा को अच्छी तरह से समान गोलाकार गठन की अनुमति देने के लिए चुना जाता है; यह हमेशा सेल लाइन-निर्भर है। इसके अलावा ध्यान देने योग्य बात यह है कि अतिरिक्त ईसीएम तहखाने सामग्री इम्यूनोस्टेनिंग प्रक्रिया के दौरान मुद्दों का कारण बन सकती है, क्योंकि यह आसानी से भंग नहीं होती है। यह बदले में, एचसीएस कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सिस्टम का उपयोग करते समय छवि अधिग्रहण के दौरान जटिलताओं को जन्म दे सकता है। एक अन्य विचार यह है कि विभिन्न सेल लाइनों को विभिन्न ईसीएम योगों की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, हेपजी 2 गोलाकार को विकास कारकों की कम एकाग्रता के साथ ईसीएम बेसमेंट सामग्री की आवश्यकता होती है, जो एच 358 और एचटी -29 गोलाकार द्वारा उपयोग की जाती है। सेल चढ़ाना की विधि भी महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह निर्धारित करता है कि कोशिकाओं को कुएं में कैसे वितरित किया जाता है। जब या तो बहुत अधिक कोशिकाओं को सीड किया जाता है या जब वे खराब रूप से वितरित किए जाते हैं, तो इससे गोलाकार संलयन हो सकता है (चित्रा 6)। ईसीएम मचानों का उपयोग करने की एक अन्य चुनौती यह है कि उन्हें कम तापमान (10 डिग्री सेल्सियस से नीचे) पर संभाला जाना चाहिए, जो एचसीएस के लिए स्वचालन का उपयोग करते समय विशेष रूप से समस्याग्रस्त है। हालांकि, इस समस्या को हाल ही में ईसमैन और सहयोगियों (2020) द्वारा हल किया गया था, जिन्होंने ईसीएम बेसमेंट सामग्री और कोशिकाओं की 0.2 μL बूंदों को चैंबर स्लाइड में स्पॉट करने के लिए माइक्रोएरे तकनीक को नियोजित किया था। यह छोटे गोलाकार 21 के विकास को सुविधाजनक बनाने के लिए पर्याप्त सामग्री थी। क्या इस तरह का एक दृष्टिकोण बहु-अच्छी तरह से प्लेटों के कुओं में ईसीएम तहखाने सामग्री की बड़ी मात्रा को चढ़ाने के लिए भी काम करेगा, यह प्रदर्शित किया जाना बाकी है।

माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके 3 डी सेल मॉडल के विश्लेषण से जुड़ी एक समस्या इन असेंबली के केंद्रीय विमानों से जानकारी निकालने की क्षमता है। इस संबंध में, इम्यूनोस्टेनिंग प्रक्रिया के दौरान परमेबिलाइजेशन और एंटीबॉडी एक्सेस समस्याग्रस्त हो सकता है। हालांकि, Nürnberg और सहकर्मियों द्वारा प्रकाशित प्रोटोकॉल 15 पूरे गोलाकार के अत्यधिक सुसंगत immunostaining सक्षम बनाता है। इस प्रोटोकॉल में मामूली संशोधनों का उपयोग करते हुए, यह तकनीक छोटी उपकोशिकीय संरचनाओं (उदाहरण के लिए, लाइसोसोम) को भी इम्यूनोस्टेन कर सकती है, जिसमें उच्च स्तर की स्थिरता होती है, भले ही कोशिकाएं समग्र गोलाकार संरचना के संबंध में केंद्रीय या परिधीय हों या नहीं। यह महत्वपूर्ण है कि नए एंटीबॉडी का उपयोग करते समय इस चरण को सावधानीपूर्वक अनुकूलित किया जाए।

एक और महत्वपूर्ण कदम इमेजिंग शासन चुना गया है। गोलाकार के माध्यम से जेड-स्लाइस की उचित संख्या की इमेजिंग महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह डेटा की मात्रा निर्धारित करता है जिसे विश्लेषण और संग्रहीत करने की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, बहुत बड़े अंतराल पर z-विमानों की एक सीमित संख्या इमेजिंग के परिणामस्वरूप समग्र गोलाकार आकार और मात्रा को कम करके आंका जा सकता है। दूसरी ओर, बहुत सारे जेड-विमानों पर कब्जा करने के परिणामस्वरूप डेटा विश्लेषण और भंडारण समस्याएं हो सकती हैं। बहुत बड़े डेटासेट को उनके विश्लेषण के लिए अधिक गहन कम्प्यूटेशनल शक्ति की भी आवश्यकता होती है, विशेष रूप से वॉल्यूमेट्रिक मोड में। जेड-प्लेन में इष्टतम नमूना अंतराल काफी हद तक उद्देश्य लेंस की विशेषताओं द्वारा निर्धारित किया जाता है, लेकिन यहां दिखाए गए उदाहरणों के लिए, 1.5 μm के अंतराल पर 40 कॉन्फोकल स्लाइस की आवश्यकता होती है ताकि गोलाकार की पूरी गहराई के माध्यम से इमेजिंग की सुविधा हो सके।

जैसा कि उल्लेख किया गया है, चयनित विमानों के विश्लेषण से पूर्वाग्रह को कम करने के लिए, वॉल्यूमेट्रिक-आधारित छवि विश्लेषण दृष्टिकोण के उपयोग की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है। यह न केवल गोलाकार-स्तर की जानकारी निकालने की अनुमति देता है, बल्कि प्रत्येक व्यक्तिगत गोलाकार से सेल-स्तर के डेटा को भी अनुमति देता है। आखिरकार, एचसीए पाइपलाइनों को इस तरह से डिजाइन करने की आवश्यकता है कि वे पूछे जा रहे विशिष्ट जैविक प्रश्न को संबोधित करें। Multiparametric outputs जटिल फेनोटाइप्स को मात्रात्मक रूप से वर्णित करने में सक्षम बनाते हैं। यह वाणिज्यिक HCA software16,17 का उपयोग करके 3D सेल असेंबली के लिए काम करने के लिए प्रदर्शित किया गया है, साथ ही साथ CellProfiler22,23 जैसे स्वतंत्र रूप से सुलभ सॉफ़्टवेयर। वॉल्यूमेट्रिक विश्लेषण विधियों में अन्य 3 डी सेल मॉडल प्रकारों पर लागू होने की क्षमता होती है, जैसे ऑर्गेनोइड्स और एक्स वीवो रोगी-व्युत्पन्न स्पष्टीकरण (पीडीई), जो विवो स्थितियों में भी बेहतर दोहराते हैं। हाल ही में, मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स के उत्पादन के लिए एक उच्च-थ्रूपुट पाइपलाइन का वर्णन किया गया है24। इसमें 96-अच्छी तरह से प्लेट में ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करना और बाद में उन्हें उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग माइक्रोस्कोप 24 का उपयोग करके इमेजिंग करना शामिल है। पीडीई अत्यधिक लाभप्रद हैं कि वे ट्यूमर से मूल हिस्टोलॉजी का प्रदर्शन करते हैं, इस प्रकार एक सेल मॉडल प्रदान करते हैं जो विवो स्थितियों में पुनरावृत्ति करता है, जिसमें ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट 25 जैसी विशेषताएं शामिल हैं। इन मॉडलों को सिद्धांत रूप में, यहां वर्णित दृष्टिकोण का उपयोग करके immunostained, imaged, और विश्लेषण किया जा सकता है26,27।

संक्षेप में, यह प्रोटोकॉल एचसीएस और एचसीए अनुप्रयोगों के लिए गोलाकार के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक सुलभ और मजबूत विधि का वर्णन करता है। इसकी प्रयोज्यता को तीन अलग-अलग सेल लाइनों के साथ दिखाया गया है, जो गोलाकार का उत्पादन करता है जिसे उच्च रिज़ॉल्यूशन पर चित्रित किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल यह भी दर्शाता है कि वॉल्यूमेट्रिक विश्लेषण गोलाकार आबादी के बारे में मात्रात्मक जानकारी प्रदान कर सकता है, साथ ही साथ एकल-सेल और उपकोशिकीय स्तरों पर भी, जिससे यह विभिन्न प्रकार के assays के लिए उपयोगी हो जाता है।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि इस काम से जुड़े कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं हैं।

Acknowledgments

लेखकों ने विज्ञान फाउंडेशन आयरलैंड (एसएफआई) (16 / आरआई / 3745) से जेसीएस के लिए एक बुनियादी ढांचे के अनुसंधान अनुदान के समर्थन को स्वीकार किया। यूसीडी सेल स्क्रीनिंग प्रयोगशाला में काम यूसीडी कॉलेज ऑफ साइंस द्वारा समर्थित है। एएससी को आयरिश रिसर्च काउंसिल (आईआरसी) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है आयरलैंड स्नातकोत्तर छात्रवृत्ति (जीओआईपीजी / 2019 /68) की सरकार। लेखकों ने प्रयोगशाला के सभी सदस्यों को उनके इनपुट और उपयोगी चर्चाओं के लिए भी धन्यवाद दिया। चित्रा 1 में कलाकृति BioRender में उत्पन्न किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red Gibco 25300054
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A6003
Calcium chloride Fisher Scientific 10050070
CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid Perkin Elmer 6055302 These plates have been renamed as Phenoplates
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650
Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated Gibco 10500064
Glycine Fisher Scientific BP381-1
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11029
L-Glutamine solution, 200 mM Gibco 25030024
Hoechst 33342 Sigma Aldrich 14533
Magnesium chloride Fisher Scientific 10647032
Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL Corning 356237 This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences
Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel BD Biosciences 356231 This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning
McCoy's 5A medium Gibco 26600023
McCoy's 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red Hyclone 10358633
Minimum Essential Medium (MEM) Gibco 21090022
Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red Gibco 51200046
Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate) Developmental Studies Hybridoma Bank H4A3-a
Neubauer counting chamber Hirschmann 8100203
Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm ThermoFisher Scientific 150350
Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software Perkin Elmer HCSHH14000000
Paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich P6148
Phalloidin Alexa Fluor 568 Invitrogen A12380
Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets Sigma Aldrich P4417
Polysorbate 20 Sigma Aldrich P5927
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement Gibco 61870010
RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red Gibco 11835063
Triton X-100 Sigma Aldrich T9284
Stericup sterile vacuum filter units Millipore SCGVU05RE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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जीव विज्ञान अंक 178
उच्च सामग्री स्क्रीनिंग और विश्लेषण अनुप्रयोगों के लिए गोलाकार के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक मजबूत विधि
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Chalkley, A. S., Mysior, M. M.,… More

Chalkley, A. S., Mysior, M. M., Simpson, J. C. A Robust Method for the Large-Scale Production of Spheroids for High-Content Screening and Analysis Applications. J. Vis. Exp. (178), e63436, doi:10.3791/63436 (2021).

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