Summary
Этот протокол детализирует метод производства трех различных типов сфероидов таким образом, чтобы сделать их пригодными для крупномасштабного скрининга и анализа с высоким содержанием. Кроме того, представлены примеры, показывающие, как их можно анализировать на сфероидном и индивидуальном клеточном уровнях.
Abstract
Скрининг с высоким содержанием (HCS) и анализ высокого содержания (HCA) - это технологии, которые предоставляют исследователям возможность извлекать крупномасштабные количественные фенотипические измерения из клеток. Этот подход оказался мощным для углубления нашего понимания широкого спектра как фундаментальных, так и прикладных событий в клеточной биологии. На сегодняшний день большинство приложений для этой технологии полагаются на использование клеток, выращенных в монослоях, хотя все чаще осознается, что такие модели не повторяют многие взаимодействия и процессы, которые происходят в тканях. Таким образом, произошло появление в разработке и использовании 3-мерных (3D) клеточных сборок, таких как сфероиды и органоиды. Хотя эти 3D-модели особенно эффективны в контексте биологии рака и исследований доставки лекарств, их производство и анализ воспроизводимым способом, подходящим для HCS и HCA, представляют собой ряд проблем. Протокол, подробно описанный здесь, описывает метод генерации многоклеточных сфероидов опухоли (MCTS) и демонстрирует, что он может быть применен к трем различным клеточным линиям способом, совместимым с HCS и HCA. Метод облегчает добычу нескольких сотен сфероидов на скважину, обеспечивая конкретное преимущество в том, что при использовании в режиме скрининга данные могут быть получены из нескольких сотен структур на скважину, все обработаны одинаковым образом. Также приведены примеры, в которых подробно описывается, как обрабатывать сфероиды для флуоресцентной визуализации с высоким разрешением и как HCA может извлекать количественные признаки как на уровне сфероида, так и из отдельных клеток внутри каждого сфероида. Этот протокол может быть легко применен для ответа на широкий круг важных вопросов в клеточной биологии.
Introduction
Традиционно клеточные анализы проводились в монослоях, растущих на твердой подложке, которую фактически можно рассматривать как двумерную (2D) среду. Тем не менее, все чаще признается, что 2D-модели клеточных культур не имеют физиологической значимости в некоторых контекстах и не могут воспроизвести многие сложные взаимодействия, которые происходят между клетками1. Трехмерные (3D) методы культивирования клеток быстро становятся популярными среди исследователей, а 3D-модели клеток показывают высокий потенциал для лучшего подражания физиологическим условиям, с которыми сталкиваются клетки в тканевой среде2. Существует несколько различных типов 3D-клеточных сборок, которые были использованы, но двумя наиболее распространенными типами являются сфероиды и органоиды. Сфероиды могут быть выращены из множества различных клеточных линий, и они могут принимать различные формы и размеры в зависимости от используемого типа клеток и их метода сборки3. Кроме того, сфероиды также могут называться многоклеточными сфероидами опухолей (MCTS), когда они выращиваются из линий раковых клеток, и эти модели нашли особое применение для доклинической доставки лекарств in vitro и исследований токсичности4,5. Органоиды, с другой стороны, стремятся лучше имитировать ткани и органы в нашем теле и могут принимать более сложные морфологические структуры. Производство органоидов включает в себя использование взрослых стволовых клеток или плюрипотентных стволовых клеток, которые могут быть перепрограммированы в соответствующие клетки, чтобы напоминать ткань или орган, представляющий интерес. Они в основном используются для исследования развития органов и моделирования заболеваний и взаимодействий хозяина и патогена6.
Существует ряд различных методов, используемых для создания 3D-сборок ячеек. Методы на основе каркаса обеспечивают субстрат или опору, к которой клетки могут либо прикрепляться, либо расти внутри. Эти леса могут иметь различные формы и могут быть изготовлены из множества различных материалов. Наиболее распространенными являются компоненты внеклеточного матрикса (ECM) и гидрогели, и они предназначены для того, чтобы напоминать естественную внеклеточную среду клеток и тем самым облегчать физиологические взаимодействия4,7. Материал фундамента ECM был извлечен из опухоли саркомы мыши Engelbreth-Holm-Swarm и, как было показано, содержит богатую смесь компонентов ECM, включая ламинин, коллаген IV типа и перлекан8. Однако, несмотря на его выгодный состав, есть две основные проблемы с его использованием, а именно его изменчивость от партии к партии и то, что он имеет два различных агрегатных состояния ниже и выше 10 ° C8,9. Напротив, гидрогели имеют преимущество в том, что они гибкие по отношению к их компонентам и жесткости, и они могут быть настроены в соответствии с конкретной желаемой сборкой 3D-ячеек7,10. Методы на основе каркаса необходимы для роста органоидов, но также широко используются для сфероидов. Методы без каркаса, которые работают, предотвращая прикрепление клеток к поверхности, на которой они растут, обычно совместимы только со сфероидной сборкой. Примеры включают пластины со сверхнизким прикреплением (ULA) с плоским дном или U-образным дном, которые позволяют агрегировать ячейки в сфероиды, или использование непрерывного перемешивания ячеек в колбах спиннера/вращения10.
Использование 3D клеточных сборок для изучения широкого спектра биологических событий стремительно набирает популярность; однако важно, чтобы метод, выбранный для их культуры, был подходящим и совместимым с планами их последующего анализа. Например, использование пластин ULA генерирует сфероиды высокой консистенции; однако этот метод ограничен добычей одного сфероида на скважину, тем самым ограничивая пропускную способность. Особое внимание необходимо учитывать при планировании флуоресцентной визуализации 3D-структуры. Подложка или пластина, на которой выращивается сборка, должна быть оптически совместимой, и необходимо соблюдать осторожность, чтобы свести к минимуму последствия рассеяния света, вызванного любыми каркасами, которые могли быть использованы11. Эта конкретная проблема становится все более острой по мере увеличения числовой диафрагмы объективов микроскопа.
Возможно, одной из основных причин выбора работы с 3D-моделью клеток является извлечение объемных данных визуализации не только обо всей сборке, но и об отдельных клетках в ней. Модели MCTS, в частности, начинают оказываться очень мощными для углубления нашего понимания того, как терапевтические средства передаются извне в центральные клетки (как это необходимо в опухоли)12, и поэтому получение знаний от отдельных клеток в разных слоях имеет важное значение. Технология визуализации, которая извлекает количественную информацию из отдельных клеток, называется анализом высокого содержания (HCA) и является мощным подходом в контексте скрининга13. На сегодняшний день HCA почти исключительно применяется к однослойным культурам, но растет понимание того, что этот подход может быть применен к 3D-культурам, позволяющим изучать широкий спектр клеточных функций и процессов14. Это будет иметь явное преимущество в том, что большое количество 3D-сборок может быть проанализировано, потенциально предоставляя данные на уровне ячеек из каждой структуры. Однако необходимо преодолеть проблемы, связанные с визуализацией потенциально толстых клеточных сборок, а также больших наборов данных.
В данной статье представлен надежный каркасный метод крупномасштабной добычи MCTS в формате 96 скважин. Метод облегчает производство нескольких сотен 3D-клеточных сборок в каждой скважине. Примеры показаны для трех различных типов клеток, представляющих солидные опухолевые модели печени, легких и толстой кишки. Сфероиды, которые образуются, могут быть различных размеров, и поэтому HCA используется для выбора структур определенного размера и / или морфологии. Эта особенность обеспечивает дополнительное преимущество, что любые наблюдаемые фенотипы могут быть сопоставлены между сфероидами разных размеров, но все они обрабатываются одинаково в одной и той же колодце. Этот подход совместим с визуализацией с высоким разрешением, что важно, обеспечивая количественные данные как на клеточном, так и на субклеточном уровне из одних и тех же клеточных сборок. Этот метод производства сфероидов имеет дополнительное преимущество перед методами, которые генерируют один сфероид на скважину, что большое количество сфероидов, полученных в каждой скважине, потенциально обеспечивает достаточную биомассу для других последующих анализов, таких как транскриптом и протеомное профилирование.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Клеточная культура
- Подготовка носителей
- Подготовьте конкретную среду клеточной культуры в зависимости от типа клеточной линии. Убедитесь, что все среды для поддержания клеток содержат 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS).
ПРИМЕЧАНИЕ: Разные клеточные линии используют разные носители. Клетки рака толстой кишки HT-29 (ATCC HTB-38) выращиваются в McCoys 5A + 10% FBS. Клетки гепатоцеллюлярной карциномы HepG2 (ATCC HB-8065) выращиваются в минимально необходимой среде + 1% L-глутамина + 10% FBS. Клетки бронхоальвеолярной карциномы H358 (ATCC CRL-5807) выращивают в среде RPMI 1640 + 1% L-глутамина + 10% FBS. Все среды, содержащие L-глютамин и FBS, называются полными средами. При окрашивании клеток для роста в виде сфероидов требуется фенольная среда без красного цвета с 10% FBS, чтобы избежать окрашивания материала фундамента ECM, что, в свою очередь, может вызвать артефакты во время процесса визуализации.
- Подготовьте конкретную среду клеточной культуры в зависимости от типа клеточной линии. Убедитесь, что все среды для поддержания клеток содержат 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS).
- Субкультурные клетки
- Когда клетки составляют приблизительно 80% слива, кратковременно промыть 2 мл трипсина-ЭДТА (0,25% (мас./об.) трипсина/0,53 мМ ЭДТА). Аспирировать трипсин-ЭДТА, добавить 3 мл свежего трипсина-ЭДТА и инкубировать в течение 3-5 мин при 37 °С.
- Когда клетки отделяются от чашки для культивирования клеток, добавляют 7 мл свежей полной среды.
- Пипетка 1 мл клеточной суспензии в новую чашку для культивирования клеток 10 см и добавление 9 мл свежей полной среды для получения разведения клеток 1:10.
- Культивируйте клетки при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2.
- Субкультура клеток каждые 3-5 дней, в зависимости от клеточной линии.
2. Генерация сфероидов
- Покрытие плит из 96 скважин материалом фундамента ECM
- Оттаивание материала подвала ECM на льду в течение ночи.
- Разбавляйте материал фундамента ECM в холодной фенольной среде, не содержащей красных сывороток, используя предварительно охлажденные наконечники, выдержанные при -20 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация материала фундамента ECM зависит от используемой клеточной линии. Для клеток HT-29 и H358 используйте 4 мг·мл-1 из материала фундамента ECM. Для клеток HepG2 используют 4 мг·мл-1 из материала основания ECM с пониженным фактором роста. - Пипетка 15 мкл раствора фундамента/среды ECM в 96-луночную визуализирующую пластину.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для крупномасштабного производства сфероидов этот этап может быть выполнен как с 8-канальной пипеткой, так и с 96-канальной пипеткой, при условии, что наконечники и резервуар, содержащие материал фундамента ECM, охлаждены. - Центрифугировать пластину в течение 20 мин при 91 х г при 4 °C.
- Инкубировать пластину не дольше 30 мин при 37 °C.
- Субкультура и подсчет клеток
- Во время инкубационного периода пластинок инкубируют клетки с трипсином-ЭДТА и повторно суспендируют их в полной среде, содержащей 10% FBS.
- Пипетка 10 мкл клеточной суспензии в счетную камеру гемоцитометра. Подсчитайте количество ячеек в 4 квадрантах камеры.
- Рассчитайте количество ячеек в суспензии ячейки, определив среднее число ячеек в 4 квадрантах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки также могут быть подсчитаны с помощью автоматизированных устройств подсчета ячеек. - Центрифугирование ячеек при 135 х г в течение 4 мин при комнатной температуре (RT).
- После того, как клетки гранулированы, аспирируйте супернатант и повторно суспендируйте клетки в фенольной полной среде без красного цвета, чтобы получить концентрацию 1 х 106 клеток на мл.
- Семенные ячейки в пластины с покрытием материала фундамента ECM
- Разбавьте клетки в фенольной полной среде, свободной от красного цвета.
ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность засеянных клеток зависит от используемой клеточной линии. Для клеток HT-29 и HepG2 на лунку засевается 3 х 104 клетки; для клеток H358 засевают 4 x 104 клетки на лунку. - Засейте клетки в общем объеме 35 мкл на лунку. Убедитесь, что вы добавляете их по каплям круговыми движениями.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для крупномасштабного производства сфероидов этот этап может быть выполнен с помощью 8-канальной пипетки, если может быть достигнуто круговое движение пипетки. - Инкубируют клетки в течение 1 ч при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2.
- Готовят раствор материала фундамента ECM в фенольной полной среде без красного цвета, в результате чего получается конечная концентрация 2% материала основания ECM в скважине. Для достижения этой цели добавьте 1,2 мкл материала фундамента ECM к 23,8 мкл фенольной полной среды без красного цвета на скважину, в результате чего конечный объем составит 60 мкл на скважину.
- Инкубировать клетки при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2.
- На следующий день замените среду 100 мкл свежей фенольной полной среды без красного цвета.
- Заменяйте среду каждый второй день 100 мкл свежей фенольной полной среды без красного цвета.
- Разбавьте клетки в фенольной полной среде, свободной от красного цвета.
3. Иммунофлуоресцентное окрашивание сфероидов
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол адаптирован из Nürnberg et al., 202015. Эти адаптации в первую очередь основаны на том факте, что сфероиды, описанные в этом протоколе, меньше, чем те, которые используются в работе Nürnberg et al.15, и, как таковые, способствуют сокращению времени инкубации. Например, время блокировки сокращается с 2 ч до 1 ч. Кроме того, поскольку протокол предназначен для высокопроизводительного производства сфероидов, все этапы обработки осуществляются в скважине, в которой культивируются сфероиды, а это означает, что перенос отдельных сфероидов в трубки не требуется.
- Подготовьте все растворы и буферы, необходимые для фиксации и окрашивания
- Приготовьте фосфатный буферизованный физиологический раствор (PBS), добавив 1 таблетку PBS на 200 мл воды. Автоклав PBS.
- Приготовьте параформальдегид (PFA), следуя шагам 3.1.3-3.1.4.
- Используйте нагретую мешалку для нагрева 400 мл PBS до 60-70 °C в вытяжном шкафу. Добавьте 15 г PFA при перемешивании. Как только PFA растворится, добавьте 50 мкл 1 M CaCl2 и 50 мкл 1 M MgCl2.
- Добавьте 100 мл PBS, чтобы получить окончательный объем 500 мл. Используйте NaOH для уравновешивания PFA до pH 7,4. Фильтруйте PFA через стерильные вакуумные фильтры (размер пор 0,22 мкм), аликвоту и храните при -20 °C.
- Приготовьте 1 М раствора глицина, добавив 3,75 г г глицина к 50 мл PBS. Хранить при температуре 4 °C.
- Готовят 5 мл буфера пермеабилизации, добавляя 100 мкл тритона Х-100, 1 мл диметилсульфоксида (ДМСО) и 1,5 мл 1 Мглицина к 2,4 мл PBS. Хранить при температуре 4 °C не более 2 недель.
- Готовят 5 мл блокирующего буфера, добавляя 100 мкл Triton X-100, 0,5 мл DMSO и 0,05 г бычьего сывороточного альбумина (BSA) к 4,9 мл PBS. Аликвотируют блокирующий буфер в трубки по 1,5 мл и хранят при -20 °C.
- Готовят 5 мл инкубационного буфера антител, добавляя 10 мкл полисорбата 20, 0,05 г BSA и 250 мкл DMSO к 4,74 мл PBS. Аликвотирует инкубационный буфер антител в пробирки объемом 1,5 мл и хранит его при -20 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: В протоколе, описанном здесь, сфероиды собираются только во внутренних 60 скважинах плиты из 96 скважин, хотя они могут быть приготовлены во всех 96 скважинах плиты. Причина подготовки сфероидов только во внутренних 60 скважинах заключается в том, что некоторые объективы с высокой числовой апертурой физически не способны физически отображать весь колодец наружных скважин из-за «юбки» на некоторых типах пластин. Вышеуказанных объемов достаточно для подготовки 60 скважин, содержащих сфероиды.
- Фиксация и пермеабилизация сфероидов
- Осторожно удалите среду из сфероидов, следя за тем, чтобы слой материала фундамента ECM не был нарушен.
- Дважды промывайте сфероиды 70 мкл PBS в течение 3 мин каждый раз.
- Зафиксируйте сфероиды с 70 мкл 3% PFA в течение 1 ч при 37 °C.
- Дважды промывайте сфероиды 70 мкл PBS в течение 3 мин каждый раз.
- Закалка 70 мкл 0,5 М раствора глицина в течение 30 мин при 37 °С.
- Пермеабилизируйте сфероиды, используя 70 мкл буфера пермеабилизации в течение 30 мин при РТ.
- Дважды промывайте сфероиды 70 мкл PBS в течение 3 мин каждый раз.
- Инкубируют сфероиды в 70 мкл блокирующего буфера в течение 1 ч при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как сфероиды были зафиксированы, все последующие этапы обработки могут быть выполнены с использованием 8-канальной пипетки или 96-луночной пипеточной головки, если таковая имеется. Это увеличивает скорость приготовления сфероидов перед визуализацией.
- Иммуностерины сфероидов с использованием первичных и вторичных антител
- Развести первичное антитело до соответствующего разведения в инкубационном буфере антител и добавить 70 мкл в каждую лунку. Инкубируют сфероиды с первичным антителом в течение ночи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разведение зависит от специфического используемого антитела. В примере, показанном здесь, лизосомы иммуно загрязнены мышиными антителами против LAMP1 с использованием разведения 1:500. - На следующий день промывайте сфероиды 5 раз 70 мкл PBS в течение 3 минут каждый раз.
- Разводят вторичное антитело в разведении 1:500, флуоресцентно-конъюгированный фаллоидин в 1:500 и Hoechst 33342 (из запаса 1 мг мл-1 ) в 1:5000 в буфер инкубации антител и добавляют 70 мкл в каждую лунку. Инкубировать на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разведение антител зависит от специфического используемого антитела. Рекомендуется сильно перекрестно адсорбированные вторичные антитела, которые показывают высокую фотостабильность и высокую яркость. - На следующий день промывайте сфероиды 5 раз 70 мкл PBS в течение 3 минут каждый раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины могут храниться до двух недель в RT до получения изображения, пока сфероиды остаются покрытыми PBS.
- Развести первичное антитело до соответствующего разведения в инкубационном буфере антител и добавить 70 мкл в каждую лунку. Инкубируют сфероиды с первичным антителом в течение ночи.
4. Получение изображений и анализ сфероидов
- Получение изображений
- Вставьте 96-луночную пластину, содержащую сфероиды, в конфокальный скрининговый микроскоп с высоким содержанием.
- Выберите подходящие лазеры для возбуждения используемых флуорофоров.
- Приобретайте каналы последовательно, чтобы избежать перекрестных помех.
- Изобразите сфероиды, используя соответствующие цели.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать цели погружения в воду, если таковые имеются. Например, объектив 20x/1.0 NA может отображать всю скважину в ~77 полях зрения. Объектив 63x/1.15 NA может отображать всю скважину примерно в 826 полях зрения. - Изображение ~30-40 срезов, в зависимости от глубины сфероида, причем каждый срез взят с интервалом 1,5 мкм от предыдущего.
- Анализ изображений
- Для морфологического анализа сфероидов выполните шаги 4.2.2-4.2.6.
- Сегментация сфероидов на основе флуоресцентно-конъюгированного окрашивания фаллоидином.
- Сегментация ядер на основе окрашивания Hoechst 33342.
- Сегментация цитоплазмы каждой клетки остаточным пятном Hoechst 33342, которое присутствует в цитоплазме клетки.
- Рассчитайте различные морфологические свойства сфероидов, включая объем, площадь поверхности, сферичность и количество ядер на сфероид.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта информация извлекается с использованием различных алгоритмов, встроенных в программное обеспечение для анализа изображений по выбору. - Дальнейшая обработка изображений для удаления сфероидов размером менее 75 000 мкм3 и размером более 900 000 мкм3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти значения являются предложениями, позволяющими удалять очень маленькие ячейки и большие сборки, которые могли возникнуть в результате слияния нескольких сфероидов. Сфероиды также могут быть классифицированы в классы различных размеров на этом этапе. - Чтобы проанализировать отдельные клетки в сфероидах, выполните шаги 4.2.8-4.2.12.
- Сегментация сфероидов на основе флуоресцентно-конъюгированного окрашивания фаллоидином.
- Сегментация ядер на основе окрашивания Hoechst 33342.
- Сегментация цитоплазмы каждой клетки остаточным пятном Hoechst 33342, которое присутствует в цитоплазме клетки.
- Сегментация лизосом на основе вторичного окрашивания антителом.
- Рассчитайте различные морфологические свойства клеток внутри каждого сфероида, включая количество лизосом на клетку, объем клетки и площадь поверхности клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта информация извлекается с использованием различных алгоритмов, встроенных в программное обеспечение для анализа изображений по выбору.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом протоколе подробно описан надежный метод получения 3D-сборок клеточных культур в виде сфероидов, использующих различные типы клеток для представления различных опухолевых тканей. Этот метод позволяет генерировать сотни сфероидов на скважину, что позволяет проводить клеточные анализы с высоким содержанием (рисунок 1). Этот подход ранее использовался для изучения поглощения наночастиц в сфероидах HT-2916 и токсичности, вызванной наночастицами, в сфероидах HepG217. Метод основан на получении тонкого и равномерного распределения материала каркаса по дну скважины оптической качественной пластины. Клетки засеваются в каждую лунку, и далее материал каркаса, при низкой концентрации, добавляется в качестве наложения на клетки. Это приводит к основанию, которое поддерживает даже рост сфероидов, а это означает, что несколько сотен сфероидов могут быть культивированы в каждой скважине плиты из 96 лунок. Цель с низким увеличением используется для создания обзорного изображения всей популяции (рисунок 2). Затем подрайоны скважины могут быть выбраны и отображены с использованием объектива с высоким разрешением, и в каждом положении получается полный конфокальный стек. Это дает необходимую информацию для последующего объемного анализа каждого сфероида.
Затем отдельные сфероиды могут быть проанализированы HCA, тем самым предоставляя информацию о морфологических свойствах сфероидов. Обычно первым шагом является идентификация каждого сфероида как одного объекта. Для этого выбирается флуоресцентный канал, который, вероятно, даст последовательное окрашивание или распределение по всему сфероиду. В примере, показанном здесь, используется сигнал в флуоресцентно-конъюгированном фаллоидиновом канале, так как актин находится близко к плазматической мембране во всех клетках различных сфероидных типов (Фиг.2 и Фиг.3А). В результате создания полных конфокальных стеков все этапы HCA могут быть выполнены объемным образом, а не на основе среза за срезом. Это важно, так как устраняет любую предвзятость, связанную с анализом небольшого количества выбранных плоскостей. Этот объемный подход затем применяется к другим каналам изображения. Ядра были обнаружены и сегментированы на основе окрашивания Hoechst 33342, и этот же канал может быть использован для обнаружения цитоплазмы клетки, поскольку остаточный Hoechst 33342 присутствует на низких уровнях (рисунок 3B). Если необходим последующий анализ отдельных клеток внутри сфероида, другие каналы (например, лизосомы, иммуноокрашенные антителами против LAMP1) также могут быть обработаны аналогичным образом. Объемный подход позволяет визуализировать все флуоресцентно меченые структуры со всех видов (рисунок 3C).
Идентифицировав сфероид как отдельный объект, можно произвести различные морфологические измерения на уровне сфероида. Эти измерения включают в себя расчет количества ядер на сфероид (рисунок 4A), а также сферичности (рисунок 4B), объема (рисунок 4C) и площади поверхности (рисунок 4D) сфероида. В зависимости от используемого программного обеспечения HCA также могут быть рассчитаны другие морфологические особенности, такие как площадь поперечного сечения, радиус внутреннего диска и радиус внутренней сферы. В примерах, показанных здесь, сфероиды ниже 75 000 мкм3 и выше 900 000 мкм3 были исключены из измерений, но эти параметры могут быть установлены пользователем в зависимости от желаемых свойств сфероида для анализа. Электронные таблицы были сгенерированы программным обеспечением для анализа изображений и импортированы в RStudio для анализа. Графики Boxplot были созданы для отображения морфологических свойств различных типов сфероидов (рисунок 4). Эти коробчатые графики показывают уровень сфероидной гетерогенности в популяции, поэтому важно количественно оценить большое количество сфероидов в любом эксперименте. Это ключевое преимущество перед методами, которые генерируют один сфероид на скважину. Три типа сфероидов, показанные здесь, показывают высокий уровень сходства в отношении их объема и площади поверхности, хотя примечательно, что сферичность сфероидов HepG2 несколько ниже, чем у других типов, показанных здесь (рисунок 4B).
Визуализация сфероидов с целью высокого разрешения, такая как 63-кратный объектив погружения в воду, используемая здесь, позволяет достичь субклеточного разрешения отдельных клеток внутри сфероида. Различные органеллы могут быть сегментированы в зависимости от используемых антител. В примере, показанном здесь, лизосомы были идентифицированы на основе иммуноокрашивания с использованием антител против LAMP1 с последующим добавлением вторичных антител (рисунок 3C). Сегментация каждой органеллы в каждой клетке позволяет количественно оценить измерения на клеточном уровне. Показан типичный объем каждой клетки в трех сфероидных типах (рисунок 5А), а также количество лизосом на клетку (рисунок 5В). Потребность в такой субклеточной детали определяется анализом, в котором будут использоваться сфероиды.
Оптимизация начальной плотности посева клеток в начале генерации сфероидов является критическим шагом. Добавление слишком большого количества клеток по-прежнему позволяет образование сфероидов; однако это может привести к слиянию сфероидов (рисунок 6). Это приводит к генерации сборок неправильной формы, что, в свою очередь, может быть весьма проблематичным для последующей идентификации сфероидов. Когда сфероиды неправильно идентифицируются как отдельные структуры, также могут возникнуть проблемы с анализом отдельных клеток. Таким образом, тщательная оптимизация каждой клеточной линии, используемой для генерации сфероидов, включая плотность посева клеток и продолжительность времени роста, являются критическими параметрами для установления.
Рисунок 1: Схема с подробным описанием протокола, используемого для генерации сфероидов для HCS и HCA. 96-луночные пластины покрыты слоем материала фундамента ECM с последующим посевом клеток, которые затем инициируют образование сфероидов. Среда заменяется на следующий день и каждый второй день после этого. При подготовке к визуализации сфероиды фиксируются, пермеабилизируются и иммуноокрашиваются специфическими антителами. Сфероиды затем визуализируются с помощью конфокального микроскопа HCS. Графика, созданная с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Примеры изображений сфероидов H358, HepG2 и HT-29. Полностью автоматизированная конфокальная визуализация HCS сфероидов (A) H358, (B) HepG2 и (C) HT-29. Панели показывают обзор одной скважины, а также три примера конфокальных срезов и объемную реконструкцию одного сфероида из каждой клеточной линии. Ядра, окрашенные Hoechst 33342, показаны синим цветом, актин окрашен флуоресцентно-конъюгированным фаллоидином красного цвета, а лизосомы иммуноокрашены для LAMP1 зеленым цветом. Изображения обзора скважины были получены с помощью 20-кратного объектива погружения в воду (NA 1.0). Изображения отдельных сфероидов были получены с помощью объектива погружения в воду 63x (NA 1.15). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Пример ключевых шагов в анализе изображений. (A) Каждый сфероид сначала идентифицируется в объемном режиме путем обнаружения флуоресцентно-конъюгированного окрашивания фаллоидином. (B) Используя эту информацию в качестве маски, цитоплазма каждой клетки сегментируется остаточным пятном Hoechst 33342, которое присутствует в цитоплазме клетки. Ядра сегментированы пятном Hoechst 33342. Лизосомы сегментируются с использованием антител (анти-LAMP1) иммуноокрашивания. Показаны объемные виды. (C) 3-плоские виды одного и того же сфероида. Показанный пример представляет собой сфероид ячейки H358. Изображения были получены с 63-кратным объективом погружения в воду (NA 1.15) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Примеры измерений на уровне сфероидов. Все измерения производились с использованием автоматизированного конвейера анализа изображений, а для трех типов сфероидов, а именно H358, HepG2 и HT-29, сфотографированных с 20-кратным объективом. Показаны (A) среднее число ядер на сфероид, (B) сфероидная сферичность, (C) объем сфероида и (D) площадь сфероидной поверхности. Все квадратные графики показывают медианное значение и квартили для каждого типа сфероидов. Данные взяты из 3 реплицированных скважин; общее количество проанализированных сфероидов составило 1259 (H358), 1522 (HepG2) и 1326 (HT-29). Изображения были получены с помощью 20-кратного объектива погружения в воду (NA 1.0). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Примеры измерений на клеточном уровне из сфероидов. Все измерения были сделаны с использованием автоматизированного конвейера анализа изображений, а для трех типов сфероидов, а именно H358, HepG2 и HT-29, изображенных с объективом 63x. Показаны (A) объемы отдельных клеток и (B) среднее количество лизосом на клетку. Общее количество проанализированных клеток составило 1410 (H358), 1625 (HepG2) и 1401 (HT-29) из 20 сфероидов каждой клеточной линии. Изображения были получены с 63-кратным объективом погружения в воду (NA 1.15) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Пример изображений, показывающих эффекты чрезмерного покрытия клеток на образование сфероидов. Примеры изображений показаны для сфероидов H358, HepG2 и HT-29. Стрелки указывают места, где сфероиды, вероятно, слились. Изображения были получены с помощью 20-кратного объектива погружения в воду (NA 1.0). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный здесь подход детализирует платформу для генерации нескольких сотен сфероидов на скважину способом, подходящим для HCS и HCA. По сравнению с другими популярными методами, такими как использование плоскодонных и круглодонных пластин ULA, которые позволяют образовывать только один сфероид на скважину18,19, этот метод дает возможность извлекать информацию высокого разрешения из большого количества сфероидов в формате скрининга. Примечательно, что этот метод был продемонстрирован в 3 различных клеточных линиях, представляющих различные типы опухолей, подчеркивая его широкую пригодность для изучения ряда клеточных процессов в разных моделях. Хотя сфероиды, полученные с помощью этого метода, показывают некоторую изменчивость в размерах и форме, HCA может легко классифицировать их по размеру (или любым другим параметрам, представляющим интерес). Наша лаборатория успешно использовала этот подход для изучения токсичности, вызванной наночастицами, в зависимости от размера сфероида. Важно отметить, что все различные по размеру классы сфероидов могут быть изучены в одном и том же колодце, а это означает, что все они подвергались одинаковому лечению, что давало очень надежные результаты из большой популяции сфероидов17. Методология, описанная здесь, может быть легко адаптирована для использования с другими типами клеток, представляющими различные ткани. Кроме того, такие сфероиды могут быть использованы для оценки различных биологических процессов14. Если сфероиды генерируются клетками, стабильно экспрессирующими флуоресцентно помеченные белки, также возможна визуализация живых клеток.
Одним из важнейших этапов этого протокола является производство слоя материала фундамента ECM, на котором покрыты ячейки. Когда слой слишком толстый, он может образовывать мениск20 , который способствует росту монослоев в центре лунки и сфероидов только на внешних краях колодца. Поэтому важно, чтобы правильная концентрация и объем материала фундамента ECM были выбраны таким образом, чтобы обеспечить равномерное образование сфероидов по всей скважине; это всегда зависит от клеточной линии. Также следует отметить, что избыток материала фундамента ECM может вызвать проблемы во время процесса иммуноокрашения, так как он не легко растворяется. Это, в свою очередь, может привести к осложнениям при получении изображения при использовании системы конфокального микроскопа HCS. Еще одно соображение заключается в том, что для разных клеточных линий могут потребоваться разные составы ECM. Например, сфероиды HepG2 требуют материала фундамента ECM с пониженной концентрацией факторов роста по сравнению с тем, который используется сфероидами H358 и HT-29. Метод клеточного покрытия также важен, так как он определяет, как клетки распределяются в лунке. Когда засеяно слишком много клеток или когда они плохо распределены, это может привести к слиянию сфероидов (рисунок 6). Еще одна проблема использования каркасов ECM заключается в том, что они должны обрабатываться при низких температурах (ниже 10 ° C), что особенно проблематично при использовании автоматизации для HCS. Однако эта проблема была недавно решена Эйсманом и его коллегами (2020), которые использовали технологию микрочипов для обнаружения капель 0,2 мкл подвального материала ECM и клеток в камерные слайды. Этого материала было достаточно, чтобы облегчить рост мелких сфероидов21. Будет ли такой подход также работать для покрытия больших объемов материала фундамента ECM в скважины из многоскважинных плит, еще предстоит продемонстрировать.
Одной из проблем, связанных с анализом 3D-моделей клеток с помощью микроскопии, является возможность извлечения информации из центральных плоскостей этих сборок. В связи с этим пермеабилизация и доступ антител во время процесса иммуноокрашения могут быть проблематичными. Тем не менее, протокол, опубликованный Нюрнбергом и его коллегами15 , обеспечивает очень последовательное иммуноразрашивание всего сфероида. Используя небольшие модификации этого протокола, этот метод может иммунонапятить даже небольшие субклеточные структуры (например, лизосомы) с высокой степенью консистенции, независимо от того, являются ли клетки центральными или периферическими по отношению к общей сфероидной структуре. Важно, чтобы этот шаг был тщательно оптимизирован при использовании новых антител.
Другим важным шагом является выбранный режим визуализации. Визуализация соответствующего количества z-срезов через сфероид важна, так как это определяет объем данных, которые необходимо проанализировать и сохранить. Например, визуализация ограниченного числа z-плоскостей со слишком большим интервалом может привести к недооценке общего размера и объема сфероида. С другой стороны, захват слишком большого количества z-плоскостей может привести к проблемам анализа и хранения данных. Очень большие наборы данных также требуют более интенсивной вычислительной мощности для их анализа, особенно в объемном режиме. Оптимальный интервал выборки в z-плоскости в значительной степени продиктован характеристиками объектива, но для примеров, показанных здесь, требуется около 40 конфокальных срезов с интервалом 1,5 мкм для облегчения визуализации через всю глубину сфероида.
Как уже упоминалось, для уменьшения смещения при анализе выбранных плоскостей настоятельно рекомендуется использовать подход к анализу изображений на основе объема. Это позволяет извлекать не только информацию на уровне сфероидов, но и данные на клеточном уровне из каждого отдельного сфероида. В конечном счете, трубопроводы HCA должны быть спроектированы таким образом, чтобы они отвечали на конкретный задаваемый биологический вопрос. Многопараметрические выходы позволяют количественно описать сложные фенотипы. Было продемонстрировано, что это работает для сборок 3D-ячеек с использованием коммерческого программного обеспечения HCA16,17, а также свободно доступного программного обеспечения, такого как CellProfiler22,23. Методы объемного анализа могут быть применены к другим типам моделей 3D-клеток, таким как органоиды и экспланты ex vivo, полученные от пациента (PDE), которые еще лучше реплицируют условия in vivo. Недавно был описан высокопроизводительный конвейер для производства органоидов головного мозга24. Это включает в себя генерацию органоидов в 96-луночной пластине и последующую визуализацию их с использованием скринингового микроскопа с высоким содержанием24. ФДЭ очень выгодны в том смысле, что они демонстрируют оригинальную гистологию опухоли, тем самым обеспечивая клеточную модель, которая рекапитулирует условия in vivo, включая такие особенности, как микроокружение опухоли25. Эти модели также, в принципе, могут быть иммуноокрашены, изображены и проанализированы с использованием подхода, описанного здесь26,27.
Таким образом, этот протокол описывает доступный и надежный метод крупномасштабного производства сфероидов для приложений HCS и HCA. Его применимость показана с тремя различными клеточными линиями, производя сфероиды, которые могут быть изображены с высоким разрешением. Этот протокол также демонстрирует, что объемный анализ может предоставить количественную информацию о популяции сфероидов, а также на одноклеточном и субклеточном уровнях, тем самым делая его полезным для широкого спектра анализов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что с этой работой нет конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Авторы признают поддержку гранта на инфраструктурные исследования от Научного фонда Ирландии (SFI) (16/RI/3745) JCS. Работа в лаборатории скрининга клеток UCD поддерживается Научным колледжем UCD. ASC финансируется Стипендией для аспирантов правительства Ирландии Ирландского исследовательского совета (IRC) (GOIPG/2019/68). Авторы также благодарят всех членов лаборатории за их вклад и полезные обсуждения. Иллюстрация на рисунке 1 была сгенерирована в BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A6003 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10050070 | |
| CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid | Perkin Elmer | 6055302 | These plates have been renamed as Phenoplates |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated | Gibco | 10500064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | |
| L-Glutamine solution, 200 mM | Gibco | 25030024 | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | 14533 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 10647032 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL | Corning | 356237 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences |
| Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 356231 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning |
| McCoy's 5A medium | Gibco | 26600023 | |
| McCoy's 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red | Hyclone | 10358633 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090022 | |
| Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red | Gibco | 51200046 | |
| Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate) | Developmental Studies Hybridoma Bank | H4A3-a | |
| Neubauer counting chamber | Hirschmann | 8100203 | |
| Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
| Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software | Perkin Elmer | HCSHH14000000 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phalloidin Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A12380 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Polysorbate 20 | Sigma Aldrich | P5927 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61870010 | |
| RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red | Gibco | 11835063 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Stericup sterile vacuum filter units | Millipore | SCGVU05RE |
References
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
- Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. Three-dimensional liver models: state of the art and their application for hepatotoxicity evaluation. Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15, 378-386 (2005).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Foglietta, F., Canaparo, R., Muccioli, G., Terreno, E., Serpe, L. Methodological aspects and pharmacological applications of three-dimensional cancer cell cultures and organoids. Life Sciences. 254, 117784 (2020).
- Bardsley, K., Deegan, A. J., El Haj, A., Yang, Y. Current state-of-the-art 3D tissue models and their compatibility with live-cell imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 3-18 (2017).
- Darrigues, E., et al. Tracking gold nanorods' interaction with large 3D pancreatic-stromal tumor spheroids by multimodal imaging: Fluorescence, photoacoustic, and photothermal microscopies. Scientific Reports. 10 (1), 3362 (2020).
- Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C.
- Mysior, M. M., Simpson, J. C. Cell3: A new vision for study of the endomembrane system in mammalian cells. Bioscience Reports. , (2021).
- Nürnberg, E., et al. Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (20), (2020).
- Cutrona, M. B., Simpson, J. C. A High-throughput automated confocal microscopy platform for quantitative phenotyping of nanoparticle uptake and transport in spheroids. Small. 15 (37), 1902033 (2019).
- Kelly, S., Byrne, M. H., Quinn, S. J., Simpson, J. C. Multiparametric nanoparticle-induced toxicity readouts with single cell resolution in HepG2 multicellular tumour spheroids. Nanoscale. 13 (41), 17615-17628 (2021).
- Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures. Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), 402-414 (2015).
- Redondo-Castro, E., Cunningham, C. J., Miller, J., Cain, S. A., Allan, S. M., Pinteaux, E. Generation of human mesenchymal stem cell 3D spheroids using low-binding plates. Bio-protocol. 8 (16), (2018).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Eismann, B., et al. Automated 3D light-sheet screening with high spatiotemporal resolution reveals mitotic phenotypes. Journal of Cell Science. 133 (11), 245043 (2020).
- Alsehli, H., et al. An integrated pipeline for high-throughput screening and profiling of spheroids using simple live image analysis of frame to frame variations. Methods. 190, 33-43 (2021).
- Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 1-11 (2021).
- Renner, H., et al. A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids. eLife. 9, 52904 (2020).
- Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
- Collins, A., Miles, G. J., Wood, J., MacFarlane, M., Pritchard, C., Moss, E. Patient-derived explants, xenografts and organoids: 3-dimensional patient-relevant preclinical models in endometrial cancer. Gynecologic Oncology. 156 (1), 251-259 (2020).
- Miles, G. J., et al. Evaluating and comparing immunostaining and computational methods for spatial profiling of drug response in patient-derived explants. Laboratory Investigation. 101 (3), 396-407 (2021).
