Summary
Este protocolo detalha um método para a produção de três tipos diferentes de esferoides de uma maneira que os torna adequados para triagem e análise de alto conteúdo em larga escala. Além disso, são apresentados exemplos mostrando como eles podem ser analisados nos níveis esferoide e células individuais.
Abstract
A triagem de alto teor de conteúdo (HCS) e a análise de alto teor de conteúdo (HCA) são tecnologias que fornecem aos pesquisadores a capacidade de extrair medições fenotípicas quantitativas em larga escala das células. Essa abordagem tem se mostrado poderosa para aprofundar nossa compreensão de uma ampla gama de eventos fundamentais e aplicados na biologia celular. Até o momento, a maioria das aplicações para essa tecnologia tem se apoiado no uso de células cultivadas em monocamadas, embora se realize cada vez mais que tais modelos não recapitulem muitas das interações e processos que ocorrem nos tecidos. Como tal, houve um surgimento no desenvolvimento e uso de conjuntos celulares tridimensionais (3D), como esferoides e organoides. Embora esses modelos 3D sejam particularmente poderosos no contexto de estudos de biologia do câncer e entrega de medicamentos, sua produção e análise de forma reprodutível adequada para o HCS e hca apresentam uma série de desafios. O protocolo aqui detalhado descreve um método para a geração de esferoides tumorais multicelulares (MCTS), e demonstra que ele pode ser aplicado a três linhas celulares diferentes de forma compatível com HCS e HCA. O método facilita a produção de várias centenas de esferoides por poço, proporcionando a vantagem específica de que, quando utilizados em um regime de triagem, os dados podem ser obtidos a partir de várias centenas de estruturas por poço, todas tratadas de forma idêntica. Também são fornecidos exemplos, que detalham como processar os esferoides para imagens de fluorescência de alta resolução e como o HCA pode extrair características quantitativas tanto no nível esferoide quanto em células individuais dentro de cada esferoide. Este protocolo poderia ser facilmente aplicado para responder a uma ampla gama de questões importantes na biologia celular.
Introduction
Tradicionalmente, ensaios baseados em células têm sido realizados em monocamadas crescendo em um substrato sólido, que efetivamente pode ser considerado como um ambiente bidimensional (2D). No entanto, está se tornando cada vez mais reconhecido que os modelos de cultura celular 2D carecem de relevância fisiológica em alguns contextos e não conseguem replicar muitas das interações complexas que ocorrem entre as células1. Os métodos de cultura celular tridimensional (3D) estão rapidamente se tornando populares entre os pesquisadores, e modelos de células 3D mostram alto potencial para imitar melhor as condições fisiológicas encontradas pelas células no ambiente tecidual2. Existem vários tipos diferentes de conjuntos de células 3D que foram empregados, mas os dois tipos mais comuns são esferoides e organoides. Esferoides podem ser cultivados a partir de muitas linhas celulares diferentes, e eles podem adotar várias formas e tamanhos, dependendo do tipo de célula usada e seu método de montagem3. Além disso, os esferoides também podem ser chamados de esferoides de tumores multicelulares (MCTS) quando são cultivados a partir de linhas de células cancerosas, e esses modelos têm encontrado uso especial para estudos pré-clínicos de entrega de medicamentos in vitro e toxicidade4,5. Os organoides, por outro lado, visam imitar melhor os tecidos e órgãos do nosso corpo e podem adotar arranjos morfológicos mais complexos. A produção de organoides envolve o uso de células-tronco adultas ou células-tronco pluripotentes, que podem ser reprogramadas nas células apropriadas para se assemelhar ao tecido ou órgão de interesse. Eles são usados principalmente para investigar o desenvolvimento de órgãos e para modelar doenças e interações hospedeiro-patógeno6.
Há uma gama de diferentes métodos usados para gerar conjuntos de células 3D. Os métodos baseados em andaimes fornecem um substrato ou suporte ao qual as células podem se conectar ou crescer dentro. Estes andaimes podem ter várias formas e podem ser feitos a partir de uma variedade de materiais diferentes. Os mais comuns são componentes e hidrogéis de matriz extracelular (ECM), e são projetados para se assemelhar ao ambiente extracelular natural das células e, assim, facilitar interações fisiológicas4,7. O material do porão ECM foi extraído do tumor de sarcoma do rato Engelbreth-Holm-Swarm e mostrado conter uma rica mistura de componentes ECM, incluindo laminina, colágeno tipo IV e perlecan8. No entanto, apesar de sua composição vantajosa, há dois desafios principais com seu uso, ou seja, sua variabilidade lote-a-lote e que possui dois estados agregados diferentes abaixo e acima de 10 °C8,9. Em contraste, os hidrogéis têm a vantagem de serem flexíveis em relação aos seus componentes e rigidez, e podem ser personalizados para se adequarem ao conjunto específico de células 3D desejado7,10. Métodos à base de andaimes são essenciais para o crescimento organoide, mas também são amplamente utilizados para esferoides. Métodos livres de andaimes, que funcionam impedindo que as células se conectem à superfície em que estão crescendo, geralmente são compatíveis apenas com o conjunto esferoide. Exemplos incluem placas de fixação ultra-baixa (ULA), com fundo plano ou fundo U, que permitem a agregação das células em esferoides, ou o uso de agitação contínua das células em frascos rotadores/rotatório10.
O uso de conjuntos de células 3D para estudar uma grande variedade de eventos biológicos está rapidamente ganhando popularidade; no entanto, é essencial que o método escolhido para sua cultura seja apropriado e compatível com os planos para sua análise a jusante. Por exemplo, o uso de placas ULA gera esferoides de alta consistência; no entanto, este método está restrito à produção de um único esferoide por bem, limitando assim o rendimento. Consideração especial é necessária quando a imagem de fluorescência da estrutura 3D é planejada. O substrato ou placa em que o conjunto é cultivado precisa ser opticamente compatível, e deve-se tomar cuidado para minimizar os efeitos da dispersão de luz causada por quaisquer andaimes que possam ter sido usados11. Este problema em particular torna-se mais agudo à medida que a abertura numérica das lentes objetivas do microscópio aumenta.
Sem dúvida, uma das principais razões para selecionar para trabalhar com um modelo de célula 3D é extrair dados de imagem volumosa sobre não apenas todo o conjunto, mas também as células individuais dentro dele. Os modelos MCTS, em particular, estão começando a se mostrar muito poderosos para aprofundar nossa compreensão de como a terapêutica transita de fora para as células centrais (como precisariam em um tumor)12, e assim ganhar conhecimento de células individuais em diferentes camadas é essencial. A tecnologia de imagem que extrai informações quantitativas de células individuais é denominada análise de alto conteúdo (HCA) e é uma abordagem poderosa no contexto da triagem13. Até o momento, o HCA tem sido aplicado quase exclusivamente às culturas de monocamadas, mas há uma percepção crescente de que essa abordagem tem o poder de ser aplicada às culturas 3D, permitindo que uma ampla gama de funções e processos celulares sejam estudados14. Teria a clara vantagem de que um grande número de conjuntos 3D poderia ser analisado, potencialmente fornecendo dados de nível celular de cada estrutura. No entanto, os desafios associados à imagem de conjuntos celulares potencialmente espessos, bem como os grandes conjuntos de dados gerados, precisam ser superados.
Neste artigo, é apresentado um método robusto baseado em andaimes para a produção em larga escala de MCTS em formato de 96 poços. O método facilita a produção de várias centenas de conjuntos de células 3D em cada poço. Exemplos são mostrados para três tipos diferentes de células, representando modelos de tumor sólidos do fígado, pulmão e cólon. Os esferoides que formam podem ser de uma variedade de tamanhos, e por isso o HCA é usado para selecionar estruturas de um determinado tamanho e/ou morfologia. Este recurso fornece a vantagem adicional de que quaisquer fenótipos observados podem ser comparados entre esferoides de diferentes tamanhos, mas todos tratados da mesma forma no mesmo poço. Esta abordagem é compatível com imagens de alta resolução, fornecendo, importantemente, dados quantitativos de nível celular e subcelular dos mesmos conjuntos celulares. Este método de produção de esferoides tem a vantagem adicional sobre métodos que geram um único esferoide por permérito, que o grande número de esferoides produzidos em cada poço potencialmente fornecem biomassa suficiente para outras análises a jusante, como transcriptome e profilto de proteome.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cultura celular
- Preparar mídia
- Prepare mídia específica de cultura celular, dependendo do tipo de linha celular. Certifique-se de que todas as mídias para manutenção celular contenham 10% de Soro Bovino Fetal (FBS).
NOTA: Diferentes linhas de celular usam diferentes mídias. As células de carcinoma de cólon HT-29 (ATCC HTB-38) são cultivadas em McCoys 5A + 10% FBS. As células hepatocelulares hepG2 (ATCC HB-8065) são cultivadas em Meio Essencial Mínimo + 1% L-glutamina + 10% FBS. As células de carcinoma broncoalveolar H358 (ATCC CRL-5807) são cultivadas em RPMI 1640 médio + 1% L-glutamina + 10% FBS. Todos os meios de comunicação contendo L-glutamina e FBS são referidos como mídia completa. Ao emplacamento de células para crescer como esferoides, um meio livre de fenol com 10% de FBS é necessário para evitar a coloração do material do porão ECM, que por sua vez pode causar artefatos durante o processo de imagem.
- Prepare mídia específica de cultura celular, dependendo do tipo de linha celular. Certifique-se de que todas as mídias para manutenção celular contenham 10% de Soro Bovino Fetal (FBS).
- Células de subcultura
- Quando as células estiverem aproximadamente 80% confluentes, lave brevemente com 2 mL de trypsin-EDTA (0,25% (w/v) trypsin/0,53 mM EDTA). Aspire o trypsin-EDTA, adicione 3 mL de trippsina-EDTA fresco e incubar por 3-5 min a 37 °C.
- Quando as células forem separadas do prato de cultura celular, adicione 7 mL de meio completo fresco.
- Pipeta 1 mL de suspensão celular em um novo prato de cultura celular de 10 cm e adicionar 9 mL de meio completo fresco para dar uma diluição de 1:10 de células.
- Cultume as células a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2.
- Subcultura as células a cada 3-5 dias, dependendo da linha celular.
2. Geração de esferoides
- Casaco 96-well placas com material de porão ECM
- Descongele o material do porão do ECM no gelo durante a noite.
- Diluir material do porão ECM em meio frio sem soro sem fenol usando pontas pré-refrigeradas mantidas a -20 °C.
NOTA: A concentração final do material do porão ECM depende da linha celular utilizada. Para células HT-29 e H358, utilize 4 mg·mL-1 de material de porão ECM. Para células HepG2, utilize 4 mg·mL-1 de material de porão do fator de crescimento reduzido ECM. - Pipeta 15 μL do material do porão ECM/solução média em uma placa de imagem de 96 poços.
NOTA: Para a produção de spheroid em larga escala, esta etapa pode ser realizada com uma pipeta de 8 canais e uma cabeça de pipetação de 96 canais, desde que as pontas e reservatórios contendo o material do porão ECM sejam refrigerados. - Centrifugar a placa por 20 min a 91 x g a 4 °C.
- Incubar a placa por não mais do que 30 min a 37 °C.
- Células de subcultura e contagem
- Durante o período de incubação da placa, incubar as células com trypsin-EDTA e resuspensá-las em um meio completo contendo 10% de FBS.
- Pipeta 10 μL da suspensão da célula em uma câmara de contagem de hemótmetros. Conte o número de células em 4 quadrantes da câmara.
- Calcule o número de células dentro da suspensão celular determinando o número médio de células dentro dos 4 quadrantes.
NOTA: As células também podem ser contadas usando dispositivos automatizados de contagem de células. - Centrifugar as células a 135 x g por 4 min em temperatura ambiente (RT).
- Uma vez que as células são pelotas, aspire o supernasal e resuspend as células em um meio completo livre de fenol para obter uma concentração de 1 x 106 células por mL.
- Células de sementes em placas revestidas de material do porão ECM
- Diluir as células em um meio completo livre de fenol.
NOTA: A densidade das células semeadas depende da linha celular utilizada. Para células HT-29 e HepG2, as células 3 x 104 são semeadas por poço; para células H358, 4 x 104 células são semeadas por poço. - Seme as células em um volume total de 35 μL por poço. Certifique-se de adicioná-los dropwise em um movimento circular.
NOTA: Para a produção de spheroid em larga escala, esta etapa pode ser realizada com uma pipeta de 8 canais, desde que o movimento circular de pipetação possa ser alcançado. - Incubar as células por 1h a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2.
- Prepare uma solução de material de porão ECM em meio completo sem fenol, o que resulta em uma concentração final de 2% de material de porão ECM no poço. Para isso, adicione 1,2 μL de material de porão ECM a 23,8 μL de meio completo sem fenol por poço, resultando em um volume final de 60 μL por poço.
- Incubar as células a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2.
- No dia seguinte, substitua o meio por 100 μL de meio completo sem fenol fresco.
- Substitua o meio a cada dois dias por 100 μL de meio completo fresco sem fenol.
- Diluir as células em um meio completo livre de fenol.
3. Mancha de imunofluorescência de esferoides
NOTA: Este protocolo é adaptado de Nürnberg et al., 202015. Essas adaptações baseiam-se principalmente no fato de que os esferoides descritos neste protocolo são menores do que os utilizados no Nürnberg et al. work15 e, como tal, facilitam tempos de incubação mais curtos. Por exemplo, os tempos de bloqueio são reduzidos de 2h para 1 h. Além disso, como o protocolo é projetado para a produção de alto rendimento de esferoides, todas as etapas de processamento são realizadas no poço em que os esferoides são cultivados, o que significa que a transferência de esferoides individuais em tubos não é necessária.
- Prepare todas as soluções e buffers necessários para fixação e coloração
- Prepare o Salino Tampão fosfato (PBS) adicionando 1 comprimido PBS por 200 mL de água. Autoclave o PBS.
- Prepare paraformaldeído (PFA) seguindo as etapas 3.1.3-3.1.4.
- Use um agitador aquecido para aquecer 400 mL de PBS a 60-70 °C em um capô de fumaça. Adicione 15 g de PFA enquanto mexe. Uma vez que o PFA tenha dissolvido, adicione 50 μL de 1 M CaCl2 e 50 μL de 1 M MgCl2.
- Adicione 100 mL de PBS para fazer um volume final de 500 mL. Use o NaOH para equilibrar o PFA ao pH 7.4. Filtre o PFA através de filtros de vácuo estéreis (tamanho de poros 0,22 μm), aliquot e armazenar a -20 °C.
- Prepare uma solução de estoque de 1 M de glycina adicionando 3,75 g de glicina a 50 mL de PBS. Armazenar a 4 °C.
- Prepare 5 mL de tampão de permeabilização adicionando 100 μL de Triton X-100, 1 mL de sulfoxida de dimetila (DMSO) e 1,5 mL de 1 M de glicacina a 2,4 mL de PBS. Guarde a 4 °C por não mais do que 2 semanas.
- Prepare 5 mL de tampão de bloqueio adicionando 100 μL de Triton X-100, 0,5 mL de DMSO e 0,05 g de albumina de soro bovino (BSA) a 4,9 mL de PBS. Aliquot o tampão de bloqueio em tubos de 1,5 mL e armazene a -20 °C.
- Prepare 5 mL de tampão de incubação de anticorpos adicionando 10 μL de polisorbato 20, 0,05 g de BSA e 250 μL de DMSO a 4,74 mL de PBS. Aliquot o tampão de incubação de anticorpos em tubos de 1,5 mL e armazene-o a -20 °C.
NOTA: No protocolo aqui descrito, os esferoides são montados apenas nos 60 poços internos de uma placa de 96 poços, embora possam ser preparados em todos os 96 poços da placa. A razão para apenas preparar esferoides nos 60 poços internos é que algumas lentes objetivas de alta abertura numérica não são capazes de ser fisicamente capaz de imaginar todo o poço dos poços externos devido à 'saia' em alguns tipos de placas. Os volumes acima são suficientes para a preparação de 60 poços contendo esferoides.
- Corrigir e permeabilize os esferoides
- Remova cuidadosamente o meio dos esferoides, garantindo que a camada de material do porão ECM não seja perturbada.
- Lave os esferoides duas vezes com 70 μL de PBS por 3 minutos cada vez.
- Fixar os esferoides com 70 μL de 3% PFA por 1h a 37 °C.
- Lave os esferoides duas vezes com 70 μL de PBS por 3 minutos cada vez.
- Sacie com 70 μL de solução de 0,5 M de glycina por 30 min a 37 °C.
- Permeabilize os esferoides usando 70 μL do tampão de permeabilização por 30 min no RT.
- Lave os esferoides duas vezes com 70 μL de PBS por 3 minutos cada vez.
- Incubar os esferoides em 70 μL de tampão de bloqueio por 1 h a 37 °C.
NOTA: Uma vez fixados os esferoides, todas as etapas subsequentes de processamento podem ser executadas usando uma pipeta de 8 canais ou uma cabeça de pipetação de 96 poços, se disponível. Isso aumenta a velocidade de preparação de esferoides antes da imagem.
- Esferoides imunossusuários usando anticorpos primários e secundários
- Diluir o anticorpo primário a uma diluição apropriada no tampão de incubação de anticorpos e adicionar 70 μL a cada poço. Incubar os esferoides com o anticorpo primário durante a noite.
NOTA: A diluição depende do anticorpo específico utilizado. No exemplo mostrado aqui, os lysosomos são imunossuídos com anticorpos anti-LAMP1 do rato usando uma diluição de 1:500. - No dia seguinte, lave os esferoides 5 vezes com 70 μL de PBS por 3 minutos cada vez.
- Diluir o anticorpo secundário a uma diluição de 1:500, falooidina fluorescentemente conjugada às 1:500, e Hoechst 33342 (de um estoque de 1 mg mL-1 ) a 1:5000 no tampão de incubação de anticorpos e adicionar 70 μL a cada poço. Incubar durante a noite.
NOTA: A diluição do anticorpo depende do anticorpo específico utilizado. Anticorpos secundários altamente transversais que mostram alta fotoe alto brilho são recomendados. - No dia seguinte, lave os esferoides 5 vezes com 70 μL de PBS por 3 minutos cada vez.
NOTA: As placas podem ser armazenadas por até duas semanas na RT antes da imagem, desde que os esferoides permaneçam cobertos com PBS.
- Diluir o anticorpo primário a uma diluição apropriada no tampão de incubação de anticorpos e adicionar 70 μL a cada poço. Incubar os esferoides com o anticorpo primário durante a noite.
4. Aquisição de imagens e análise de esferoides
- Aquisição de imagens
- Insira a placa de 96 poços contendo esferoides em um microscópio de triagem de alto teor de alta qualidade.
- Selecione os lasers apropriados para excitar os fluoroforos utilizados.
- Adquira os canais sequencialmente para evitar conversas cruzadas.
- Imagem dos esferoides usando objetivos apropriados.
NOTA: Recomenda-se o uso de objetivos de imersão em água, se disponível. Por exemplo, um objetivo 20x/1.0 NA pode imaginar um poço inteiro em ~77 campos de visão. Um objetivo 63x/1.15 NA pode visualizar um poço inteiro em aproximadamente 826 campos de visão. - Imagem ~30-40 fatias, dependendo da profundidade do esferoide, com cada fatia tirada em um intervalo de 1,5 μm do anterior.
- Análise de imagem
- Para análise morfológica de esferoides, siga os passos 4.2.2-4.2.6.
- Segmente os esferoides com base na coloração de faloideina fluorescentemente conjugada.
- Segmentar os núcleos com base na coloração hoechst 33342.
- Segmente o citoplasma de cada célula pela mancha residual hoechst 33342 que está presente no citoplasma celular.
- Calcule diferentes propriedades morfológicas dos esferoides, incluindo volume, área de superfície, esférica e o número de núcleos por esferoide.
NOTA: Essas informações são extraídas usando vários algoritmos que estão embutidos no software de análise de imagem de escolha. - Processe imagens ainda mais para remover esferoides menores que 75.000 μm3 e maiores que 900.000 μm3.
NOTA: Esses valores são sugestões para permitir a remoção de conjuntos de células muito pequenas e grandes conjuntos que podem ter surgido como resultado da fusão de múltiplos esferoides. Os spheroids também podem ser categorizados em diferentes classes de tamanho nesta etapa. - Para analisar células únicas dentro de esferoides, siga os passos 4.2.8-4.2.12.
- Segmente os esferoides com base na coloração de faloideina fluorescentemente conjugada.
- Segmentar os núcleos com base na coloração hoechst 33342.
- Segmente o citoplasma de cada célula pela mancha residual hoechst 33342 que está presente no citoplasma celular.
- Segmente os lysosomos com base na coloração de anticorpos secundários.
- Calcule diferentes propriedades morfológicas das células dentro de cada esferoide, incluindo o número de lysosos por célula, volume celular e área da superfície celular.
NOTA: Essas informações são extraídas usando vários algoritmos que estão embutidos no software de análise de imagem de escolha.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neste protocolo, um método robusto para produzir conjuntos de cultura celular 3D na forma de esferoides, usando diferentes tipos de células para representar vários tecidos tumorais, é detalhado. Este método permite a geração de centenas de esferoides por poço, o que permite que ensaios baseados em células sejam realizados de forma de alto conteúdo (Figura 1). Esta abordagem já foi usada para estudar a absorção de nanopartículas em esferoides HT-2916 e toxicidade induzida por nanopartículas em Spheroids HepG217. O método conta com a produção de um fino e até mesmo distribuição de material de andaime através do fundo do poço de uma placa de qualidade óptica. As células são semeadas em cada poço, e mais material de andaime, em baixa concentração, é adicionado como uma sobreposição nas células. Isso resulta em uma base que suporta até mesmo o crescimento de esferoides, o que significa que várias centenas de esferoides podem ser cultivados em cada poço de uma placa de 96 poços. Um objetivo de baixa ampliação é usado para gerar uma imagem geral de toda a população (Figura 2). Sub-regiões do poço podem então ser selecionadas e imagens usando um objetivo de alta resolução, e em cada posição, uma pilha confocal completa é adquirida. Isso fornece as informações necessárias para análise volumosa subsequente de cada esferoide.
Os esferoides individuais podem então ser analisados pelo HCA, fornecendo assim informações sobre as propriedades morfológicas dos esferoides. Normalmente, o primeiro passo é identificar cada esferoide como um único objeto. Para fazer isso, um canal de fluorescência que provavelmente dará coloração ou distribuição consistentes ao longo do esferoide é selecionado. No exemplo aqui mostrado, o sinal no canal de falooidina fluorescentemente conjugado é usado, pois a actina é encontrada perto da membrana plasmática em todas as células nos diferentes tipos de esferoides (Figura 2 e Figura 3A). Como resultado da geração completa de pilhas confocal, todas as etapas de HCA podem ser realizadas de forma volumosa e não em uma base fatiada. Isso é importante, pois remove qualquer viés associado à análise de um pequeno número de planos selecionados. Essa abordagem volutiva é então aplicada aos outros canais da imagem. Os núcleos foram detectados e segmentados com base na coloração hoechst 33342, e este mesmo canal pode ser usado para detectar o citoplasma celular, pois há hoechst residual 33342 presente em níveis baixos (Figura 3B). Se a análise a jusante de células individuais dentro do esferoide for necessária, os outros canais (por exemplo, lysososomes imunossumados com anticorpos anti-LAMP1) também podem ser processados de forma semelhante. A abordagem volumosa permite que todas as estruturas com rótulo fluorescente sejam visualizadas a partir de todas as vistas (Figura 3C).
Tendo identificado o esferoide como um objeto distinto, várias medidas morfológicas no nível esferoide podem ser feitas. Essas medidas incluem o cálculo do número de núcleos por spheroid (Figura 4A), bem como a esfericidade (Figura 4B), volume (Figura 4C) e área de superfície (Figura 4D) do esferoide. Dependendo do software HCA utilizado, outras características morfológicas, como área transversal, raio de disco interno e raio da esfera interna também podem ser calculadas. Nos exemplos aqui apresentados, esferoides abaixo de 75.000 μm3 e acima de 900.000 μm3 foram descartados das medições, mas esses parâmetros podem ser definidos pelo usuário, dependendo das propriedades esferidas desejadas para análise. As planilhas foram geradas pelo software de análise de imagens e importadas em RStudio para análise. Foram produzidos gráficos boxplot para exibir as propriedades morfológicas dos diferentes tipos de esferoides (Figura 4). Essas plataformas de caixa revelam o nível de heterogeneidade esferoide na população, razão pela qual é importante quantificar um grande número de esferoides em qualquer experimento. Esta é uma vantagem fundamental sobre métodos que geram um único esferoide por bem. Os três tipos de spheroid mostrados aqui mostram um alto nível de semelhança em relação ao seu volume e área de superfície, embora seja notável que a esferilidade dos esferoides HepG2 é um pouco menor do que a dos outros tipos mostrados aqui (Figura 4B).
Esferoides de imagem com um objetivo de alta resolução, como o objetivo de imersão em água 63x usado aqui, permite que a resolução subcelular de células individuais dentro do esferoide seja alcançada. As diferentes organelas podem ser segmentadas dependendo dos anticorpos utilizados. No exemplo aqui apresentado, os lysosomos foram identificados com base no imunostaining utilizando anticorpos anti-LAMP1, seguidos pela adição secundária de anticorpos (Figura 3C). A segmentação de cada organela dentro de cada célula permite, então, a quantificação das medidas de nível celular. O volume típico de cada célula nos três tipos de esferoides (Figura 5A), bem como o número de lysososomes por célula (Figura 5B), são mostrados. A necessidade de tal detalhe subcelular é determinada pelo ensaio no qual os esferoides serão usados.
Otimizar a densidade inicial de semeadura celular no início da geração esferoide é um passo crítico. Adicionar muitas células ainda permite a formação de esferoides; no entanto, isso pode resultar na fusão de esferoides (Figura 6). Isso leva à geração de conjuntos de forma irregular, que por sua vez podem ser altamente problemáticos para a identificação a jusante dos esferoides. Quando os esferoides são incorretamente identificados como estruturas distintas, também pode haver problemas com a análise das células individuais. Como tal, a otimização cuidadosa de cada linha celular usada para a geração de spheroid, incluindo a densidade de semeadura celular e o tempo de crescimento, são parâmetros críticos para estabelecer.
Figura 1: Detalhamento esquemático do protocolo utilizado para gerar esferoides para placas de HCS e HCA. 96-well são revestidos com uma camada de material de porão ECM, seguido pela semeadura de células, que então iniciam a formação esferoide. O médio é substituído no dia seguinte e a cada dois dias depois. Em preparação para imagens, os esferoides são fixos, permeabilizados e imunossuídos com anticorpos específicos. Os spheroids são então imagens usando um microscópio confocal HCS. Gráfico criado com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Exemplos de imagens de spheroids H358, HepG2 e HT-29. Imagens confocal hcs totalmente automatizadas de (A) H358, (B) HepG2 e (C) HT-29 spheroids. Os painéis mostram uma única visão geral do poço, bem como três fatias confocal de exemplo e a reconstrução volumosa de um esferoide de cada linha celular. Núcleos manchados com Hoechst 33342 são mostrados em azul, actin manchado com faloideina fluorescente conjugada em vermelho, e lisesosomes imunossuados para LAMP1 em verde. Imagens do poço foram adquiridas com um objetivo de imersão em água de 20x (NA 1.0). Imagens de esferoides individuais foram adquiridas com um objetivo de imersão em água de 63x (NA 1,15). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Exemplo de etapas-chave na análise de imagens. (A) Cada esferoide é identificado pela primeira vez no modo volumoso pela detecção da coloração de faloideina fluorescentemente conjugada. (B) Utilizando essas informações como máscara, o citoplasma de cada célula é segmentado pela mancha residual Hoechst 33342 que está presente no citoplasma celular. Os núcleos são segmentados pela mancha hoechst 33342. Os lysosomos são segmentados usando o anticorpo (anti-LAMP1) imunostaining. São mostradas vistas volumosas. (C) vistas de 3 aviões do mesmo esferoide. O exemplo mostrado é de um esferoide de células H358. As imagens foram adquiridas com um objetivo de imersão em água de 63x (NA 1.15) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Exemplos de medidas de nível esferoide. Todas as medições foram feitas por meio de um pipeline automatizado de análise de imagens, e para três tipos de esferoides, ou seja, H358, HepG2 e HT-29, com um objetivo de 20x. São mostrados (A) número médio de núcleos per spheroid, (B) esferilidade esferoide, (C) volume esferoide e (D) área de superfície esferoide. Todas as estações mostram o valor mediano e os quartis para cada tipo de esferoide. Os dados são de 3 poços de replicação; o número total de esferoides analisados foi de 1259 (H358), 1522 (HepG2) e 1326 (HT-29). As imagens foram adquiridas com um objetivo de imersão em água de 20x (NA 1.0). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Exemplos de medidas de nível celular a partir de esferoides. Todas as medições foram feitas por meio de um pipeline automatizado de análise de imagens, e para três tipos de esferoides, ou seja, H358, HepG2 e HT-29, com um objetivo de 63x. São mostrados volumes (A) de células individuais, e (B) números médios de lysosos por célula. O número total de células analisadas foi de 1410 (H358), 1625 (HepG2) e 1401 (HT-29), de 20 esferoides de cada linha celular. As imagens foram adquiridas com um objetivo de imersão em água de 63x (NA 1.15) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Exemplos de imagens que mostram efeitos do excesso de revestimento das células na formação esferoide. Exemplos de imagens são mostradas para spheroids H358, HepG2 e HT-29. Setas indicam lugares onde os esferoides provavelmente fundiram. As imagens foram adquiridas com um objetivo de imersão em água de 20x (NA 1.0). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A abordagem descrita aqui detalha uma plataforma para gerar várias centenas de esferoides por poço de uma maneira adequada para HCS e HCA. Em comparação com outros métodos populares, como o uso de placas ULA de fundo plano e de fundo redondo, que permitem a formação de apenas um poço esferoide por 18,19, este método oferece a oportunidade de informações de alta resolução serem extraídas de um grande número de esferoides em um formato de triagem. Notavelmente, este método tem sido demonstrado em 3 diferentes linhas celulares, representando vários tipos de tumores, destacando sua ampla adequação ao estudo de uma gama de processos celulares em diferentes modelos. Embora os esferoides gerados usando este método demonsquem alguma variabilidade em tamanho e forma, o HCA pode facilmente classificá-los por tamanho (ou quaisquer outros parâmetros de interesse). Nosso laboratório usou com sucesso essa abordagem para estudar toxicidade induzida por nanopartículas em função do tamanho de esferoides. É importante ressaltar que todas as diferentes classes de tamanhos de esferoides podem ser estudadas no mesmo poço, o que significa que todos foram expostos a tratamentos idênticos, dando saídas altamente robustas de uma grande população esferoide17. A metodologia descrita aqui poderia ser facilmente adaptada para uso com outros tipos de células representando diferentes tecidos. Além disso, tais esferoides poderiam ser usados para avaliar diferentes processos biológicos14. Se os esferoides forem gerados com células expressando proteínas fluorescentes marcadas, imagens de células vivas também são possíveis.
Um passo crítico neste protocolo é a produção da camada de material do porão ECM na qual as células são banhadas. Quando a camada é muito grossa, pode formar um menisco20 que promove o crescimento de monocamadas no centro do poço e esferoides apenas nas bordas externas do poço. Portanto, é essencial que a concentração e o volume corretos do material do porão ECM seja escolhido para permitir a formação uniforme de esferoides em todo o poço; isso é sempre dependente de linhas celulares. Também é importante ressaltar que o excesso de material de porão ECM pode causar problemas durante o processo de imunossuagem, pois não é facilmente dissolvido. Isso pode, por sua vez, levar a complicações durante a aquisição de imagens ao usar um sistema de microscópio confocal do HCS. Outra consideração é que diferentes linhas de células podem exigir diferentes formulações de ECM. Por exemplo, os spheróides HepG2 requerem material de porão ECM com uma concentração reduzida de fatores de crescimento, em comparação com o usado pelos esferoides H358 e HT-29. O método de revestimento celular também é importante, pois isso determina como as células são distribuídas no poço. Quando muitas células são semeadas ou quando estão mal distribuídas, isso pode levar à fusão esferoide (Figura 6). Outro desafio do uso de andaimes ECM é que eles precisam ser manuseados a baixas temperaturas (abaixo de 10 °C), o que é particularmente problemático ao usar a automação para HCS. No entanto, esse problema foi recentemente resolvido por Eismann e colegas (2020), que utilizaram a tecnologia de microarray para detectar gotículas de 0,2 μL de material de porão ECM e células em lâminas câmara. Este material foi suficiente para facilitar o crescimento de pequenos esferoides21. Resta saber se tal abordagem também funcionaria para emplacar volumes maiores de material do porão ECM em poços de placas multi-poços.
Um problema associado à análise de modelos de células 3D usando microscopia é a capacidade de extrair informações dos planos centrais desses conjuntos. Nesse sentido, a permeabilização e o acesso a anticorpos durante o processo de imunossuagem podem ser problemáticos. No entanto, o protocolo publicado por Nürnberg e seus colegas15 permite uma imunostenção altamente consistente de todo o esferoide. Utilizando pequenas modificações neste protocolo, essa técnica pode imunostar até mesmo pequenas estruturas subcelulares (por exemplo, lysosomos), com alto grau de consistência, independentemente de as células serem centrais ou periféricas em relação à estrutura esferoide global. É importante que esta etapa seja cuidadosamente otimizada ao usar novos anticorpos.
Outro passo crítico é o regime de imagem escolhido. A imagem do número apropriado de fatias z através do esferoide é importante, pois determina o volume de dados que precisa ser analisado e armazenado. Por exemplo, a imagem de um número limitado de z-planes em um intervalo muito grande pode resultar em uma subestimação do tamanho e volume spheroid global. Por outro lado, capturar muitos z-planes pode resultar em análise de dados e problemas de armazenamento. Conjuntos de dados muito grandes também requerem poder computacional mais intensivo para sua análise, particularmente no modo volumétrico. O intervalo de amostragem ideal no plano z é em grande parte ditado pelas características da lente objetiva, mas para os exemplos aqui mostrados, cerca de 40 fatias confocal são necessárias em um intervalo de 1,5 μm para facilitar a imagem através de toda a profundidade do esferoide.
Como mencionado, a fim de reduzir o viés da análise de planos selecionados, recomenda-se fortemente o uso de uma abordagem de análise de imagem baseada em volumetítrica. Isso permite que não apenas informações de nível esferoide sejam extraídas, mas também dados de nível celular de cada esferoide individual. Em última análise, os gasodutos do HCA precisam ser projetados de tal forma que eles abdoram a questão biológica específica que está sendo feita. As saídas multiparamétricas permitem que fenótipos complexos sejam descritos quantitativamente. Isso foi demonstrado para trabalhar em conjuntos de células 3D usando software hca comercial16,17, bem como softwares livremente acessíveis, como CellProfiler22,23. Os métodos de análise volumosa têm potencial para serem aplicados a outros tipos de modelos de células 3D, como organoides e ex-plantas derivadas do paciente (PDEs), que se replicam ainda melhor em condições in vivo. Recentemente, um oleoduto de alto rendimento para a produção de organoides cerebrais foi descrito24. Isso envolve a geração de organoides em uma placa de 96 poços e, posteriormente, imagens deles usando um microscópio de triagem de alto conteúdo24. Os PDEs são altamente vantajosos, pois exibem a histologia original do tumor, fornecendo assim um modelo celular que recapitula condições in vivo, incluindo características como o microambiente tumoral25. Esses modelos também podem, em princípio, ser imunossuídos, imagedos e analisados utilizando a abordagem aqui descrita26,27.
Em resumo, este protocolo descreve um método acessível e robusto para a produção em larga escala de esferoides para aplicações de HCS e HCA. Sua aplicabilidade é mostrada com três linhas celulares diferentes, produzindo esferoides que podem ser imagens em alta resolução. Este protocolo também demonstra que a análise volumosa pode fornecer informações quantitativas sobre a população esferoide, bem como nos níveis unicelular e subcelular, tornando-a útil para uma grande variedade de ensaios.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que não há interesses concorrentes associados a este trabalho.
Acknowledgments
Os autores reconhecem o apoio de uma bolsa de pesquisa de infraestrutura da Science Foundation Ireland (SFI) (16/RI/3745) à JCS. O trabalho no Laboratório de Triagem de Células da UCD é apoiado pela Faculdade de Ciências da UCD. A ASC é financiada por uma Bolsa de Pós-Graduação do Governo da Irlanda (GOIPG/2019/68) do Conselho de Pesquisa Irlandesa (IRC). Os autores também agradecem a todos os membros do laboratório por sua contribuição e discussões úteis. A obra de arte na Figura 1 foi gerada em BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A6003 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10050070 | |
| CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid | Perkin Elmer | 6055302 | These plates have been renamed as Phenoplates |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated | Gibco | 10500064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | |
| L-Glutamine solution, 200 mM | Gibco | 25030024 | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | 14533 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 10647032 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL | Corning | 356237 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences |
| Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 356231 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning |
| McCoy's 5A medium | Gibco | 26600023 | |
| McCoy's 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red | Hyclone | 10358633 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090022 | |
| Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red | Gibco | 51200046 | |
| Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate) | Developmental Studies Hybridoma Bank | H4A3-a | |
| Neubauer counting chamber | Hirschmann | 8100203 | |
| Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
| Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software | Perkin Elmer | HCSHH14000000 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phalloidin Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A12380 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Polysorbate 20 | Sigma Aldrich | P5927 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61870010 | |
| RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red | Gibco | 11835063 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Stericup sterile vacuum filter units | Millipore | SCGVU05RE |
References
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
- Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. Three-dimensional liver models: state of the art and their application for hepatotoxicity evaluation. Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15, 378-386 (2005).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Foglietta, F., Canaparo, R., Muccioli, G., Terreno, E., Serpe, L. Methodological aspects and pharmacological applications of three-dimensional cancer cell cultures and organoids. Life Sciences. 254, 117784 (2020).
- Bardsley, K., Deegan, A. J., El Haj, A., Yang, Y. Current state-of-the-art 3D tissue models and their compatibility with live-cell imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 3-18 (2017).
- Darrigues, E., et al. Tracking gold nanorods' interaction with large 3D pancreatic-stromal tumor spheroids by multimodal imaging: Fluorescence, photoacoustic, and photothermal microscopies. Scientific Reports. 10 (1), 3362 (2020).
- Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C.
- Mysior, M. M., Simpson, J. C. Cell3: A new vision for study of the endomembrane system in mammalian cells. Bioscience Reports. , (2021).
- Nürnberg, E., et al. Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (20), (2020).
- Cutrona, M. B., Simpson, J. C. A High-throughput automated confocal microscopy platform for quantitative phenotyping of nanoparticle uptake and transport in spheroids. Small. 15 (37), 1902033 (2019).
- Kelly, S., Byrne, M. H., Quinn, S. J., Simpson, J. C. Multiparametric nanoparticle-induced toxicity readouts with single cell resolution in HepG2 multicellular tumour spheroids. Nanoscale. 13 (41), 17615-17628 (2021).
- Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures. Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), 402-414 (2015).
- Redondo-Castro, E., Cunningham, C. J., Miller, J., Cain, S. A., Allan, S. M., Pinteaux, E. Generation of human mesenchymal stem cell 3D spheroids using low-binding plates. Bio-protocol. 8 (16), (2018).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Eismann, B., et al. Automated 3D light-sheet screening with high spatiotemporal resolution reveals mitotic phenotypes. Journal of Cell Science. 133 (11), 245043 (2020).
- Alsehli, H., et al. An integrated pipeline for high-throughput screening and profiling of spheroids using simple live image analysis of frame to frame variations. Methods. 190, 33-43 (2021).
- Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 1-11 (2021).
- Renner, H., et al. A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids. eLife. 9, 52904 (2020).
- Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
- Collins, A., Miles, G. J., Wood, J., MacFarlane, M., Pritchard, C., Moss, E. Patient-derived explants, xenografts and organoids: 3-dimensional patient-relevant preclinical models in endometrial cancer. Gynecologic Oncology. 156 (1), 251-259 (2020).
- Miles, G. J., et al. Evaluating and comparing immunostaining and computational methods for spatial profiling of drug response in patient-derived explants. Laboratory Investigation. 101 (3), 396-407 (2021).
