Summary
Denne protokollen beskriver en metode for produksjon av tre forskjellige typer sfæroider på en måte som gjør dem egnet for screening og analyse av høyt innhold i stor skala. I tillegg presenteres eksempler som viser hvordan de kan analyseres ved sfæroid og individuelle cellenivåer.
Abstract
Høyinnholdsscreening (HCS) og høyinnholdsanalyse (HCA) er teknologier som gir forskere muligheten til å trekke ut store kvantitative fenotypiske målinger fra celler. Denne tilnærmingen har vist seg kraftig for å utdype vår forståelse av et bredt spekter av både grunnleggende og anvendte hendelser i cellebiologi. Til dags dato har flertallet av applikasjonene for denne teknologien stolt på bruk av celler dyrket i monolayers, selv om det i økende grad er realisert at slike modeller ikke rekapitulerer mange av interaksjonene og prosessene som forekommer i vev. Som sådan har det vært en fremvekst i utviklingen og bruken av 3-dimensjonale (3D) cellesamlinger, som sfæroider og organoider. Selv om disse 3D-modellene er spesielt kraftige i sammenheng med kreftbiologi og legemiddelleveringsstudier, gir deres produksjon og analyse på en reproduserbar måte egnet for HCS og HCA en rekke utfordringer. Protokollen som er beskrevet her beskriver en metode for generering av multicellulære tumorsfæroider (MCTS), og viser at den kan brukes på tre forskjellige cellelinjer på en måte som er kompatibel med HCS og HCA. Metoden letter produksjonen av flere hundre sfæroider per brønn, noe som gir den spesifikke fordelen at når de brukes i et screeningregime, kan data fås fra flere hundre strukturer per brønn, alt behandlet på en identisk måte. Eksempler er også gitt, som beskriver hvordan du behandler sfæroidene for høyoppløselig fluorescensavbildning og hvordan HCA kan trekke ut kvantitative egenskaper både på sfæroidnivå og fra individuelle celler i hver sfæroid. Denne protokollen kan lett brukes til å svare på et bredt spekter av viktige spørsmål i cellebiologi.
Introduction
Tradisjonelt har cellebaserte analyser blitt utført i monolayers som vokser på et solidt substrat, som effektivt kan betraktes som et todimensjonalt (2D) miljø. Imidlertid blir det stadig mer anerkjent at 2D-cellekulturmodeller mangler fysiologisk relevans i noen sammenhenger og ikke kan gjenskape mange av de komplekse interaksjonene som oppstår mellom celler1. Tredimensjonale (3D) cellekulturmetoder blir raskt populære blant forskere, og 3D-cellemodeller viser høyt potensial for bedre å etterligne de fysiologiske forholdene som celler i vevsmiljøet møter2. Det finnes flere forskjellige typer 3D-cellesamlinger som er ansatt, men de to vanligste typene er sfæroider og organoider. Sfæroider kan dyrkes fra mange forskjellige cellelinjer, og de kan vedta forskjellige former og størrelser avhengig av celletypen som brukes og deres samlingsmetode3. Videre kan sfæroider også refereres til som multicellulære tumorsfæroider (MCTS) når de vokser fra kreftcellelinjer, og disse modellene har funnet spesiell bruk for preklinisk in vitro-legemiddellevering og toksisitetsstudier4,5. Organoider, derimot, tar sikte på å bedre etterligne vev og organer i kroppen vår og kan vedta mer komplekse morfologiske ordninger. Produksjonen av organoider innebærer bruk av voksne stamceller eller pluripotente stamceller, som kan omprogrammeres til de aktuelle cellene for å ligne vevet eller orgelet av interesse. De brukes først og fremst til å undersøke utviklingen av organer og for å modellere sykdommer og vertspatogeninteraksjoner6.
Det finnes en rekke forskjellige metoder som brukes til å generere 3D-cellesamlinger. Stillasbaserte metoder gir et substrat eller støtte som celler enten kan feste eller vokse innenfor. Disse stillasene kan ha forskjellige former og kan være laget av en rekke forskjellige materialer. De vanligste er ekstracellulære matrisekomponenter (ECM) og hydrogeler, og de er designet for å ligne det naturlige ekstracellulære miljøet i celler og dermed lette fysiologiske interaksjoner4,7. ECM kjellermateriale er hentet fra Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom svulst og vist seg å inneholde en rik blanding av ECM-komponenter, inkludert laminin, type IV kollagen og perlecan8. Til tross for sin fordelaktige sammensetning er det imidlertid to hovedutfordringer med bruken, nemlig dens batch-til-batch-variasjon og at den har to forskjellige aggregerte tilstander under og over 10 °C8,9. Hydrogeler har derimot fordelen av å være fleksible med hensyn til komponenter og stivhet, og de kan tilpasses den spesifikke 3D-celleenheten ønsket7,10. Stillasbaserte metoder er avgjørende for organoid vekst, men er også mye brukt til sfæroider. Stillasfrie metoder, som fungerer ved å forhindre at celler festes til overflaten de vokser på, er vanligvis bare kompatible med sfæroidmontering. Eksempler er ultra-lave festeplater (ULA), med enten en flat bunn eller U-bunn, som tillater aggregering av cellene i sfæroider, eller bruk av kontinuerlig agitasjon av cellene i spinner / rotasjonsflasker10.
Bruken av 3D-cellesamlinger for å studere et bredt spekter av biologiske hendelser blir raskt stadig mer populært; Det er imidlertid viktig at metoden som er valgt for deres kultur er hensiktsmessig og kompatibel med planene for nedstrømsanalysen. For eksempel genererer bruken av ULA-plater sfæroider med høy konsistens; Denne metoden er imidlertid begrenset til produksjon av en enkelt sfæroid per brønn, og begrenser dermed gjennomstrømningen. Det er særlig hensyn som må tas når fluorescensavbildning av 3D-strukturen planlegges. Underlaget eller platen som enheten dyrkes på, må være optisk kompatibel, og det må tas hensyn til effekten av lysspredning forårsaket av stillaser som kan ha blitt brukt11. Dette spesielle problemet blir mer akutt etter hvert som den numeriske blenderåpningen til mikroskopet objektive linser øker.
Uten tvil er en av hovedårsakene til å velge å jobbe med en 3D-cellemodell å trekke ut volumetriske bildedata om ikke bare hele samlingen, men også de enkelte cellene i den. Spesielt MCTS-modeller begynner å vise seg å være svært kraftige for å utdype vår forståelse av hvordan terapeutiske behandlinger går fra utsiden til sentrale celler (som de trenger i en svulst)12, og derfor er det viktig å få kunnskap fra individuelle celler på forskjellige lag. Bildeteknologien som trekker ut kvantitativ informasjon fra enkeltceller kalles høyinnholdsanalyse (HCA) og er en kraftig tilnærming i sammenheng med screening13. Til dags dato har HCA nesten utelukkende blitt brukt på monolayerkulturer, men det er en økende erkjennelse av at denne tilnærmingen har makt til å bli brukt på 3D-kulturer, slik at et bredt spekter av cellulære funksjoner og prosesser kan studeres14. Det vil ha den klare fordelen at et stort antall 3D-samlinger kan analyseres, og potensielt gi data på cellenivå fra hver struktur. Utfordringer knyttet til avbildning av potensielt tykke cellesamlinger, så vel som de store datasettene som genereres, må imidlertid overvinnes.
I denne artikkelen presenteres en robust stillasbasert metode for storskala produksjon av MCTS i et 96-brønns format. Metoden letter produksjonen av flere hundre 3D-celleenheter i hver brønn. Eksempler er vist for tre forskjellige celletyper, som representerer solide tumormodeller i leveren, lungen og tykktarmen. Sfæroidene som dannes kan være av en rekke størrelser, og derfor brukes HCA til å velge strukturer av en bestemt størrelse og / eller morfologi. Denne funksjonen gir den ekstra fordelen at alle observerte fenotyper kan sammenlignes på tvers av sfæroider av forskjellige størrelser, men alle behandles på samme måte i samme brønn. Denne tilnærmingen er kompatibel med høyoppløselig bildebehandling, og gir viktig både kvantitative data på cellenivå og subcellulært nivå fra de samme cellesamlingene. Denne metoden for sfæroidproduksjon har den ekstra fordelen i forhold til metoder som genererer en enkelt sfæroid per brønn, at det store antallet sfæroider produsert i hver brønn potensielt gir tilstrekkelig biomasse til andre nedstrømsanalyser, for eksempel transkripsjon og proteomprofilering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellekultur
- Klargjøre medier
- Klargjør bestemte cellekulturmedier avhengig av typen cellelinje. Forsikre deg om at alle medier for cellevedlikehold inneholder 10% Foetal Bovine Serum (FBS).
MERK: Ulike cellelinjer bruker forskjellige medier. HT-29 kolonkarsinomceller (ATCC HTB-38) dyrkes i McCoys 5A + 10% FBS. HepG2 hepatocellulære karsinomceller (ATCC HB-8065) dyrkes i Minimum Essential Medium + 1% L-glutamin + 10% FBS. H358 bronkoalveolarkarsinomceller (ATCC CRL-5807) dyrkes i RPMI 1640 medium + 1% L-glutamin + 10% FBS. Alle medier som inneholder L-glutamin og FBS omtales som komplette medier. Når du plating celler for å vokse som sfæroider, er det nødvendig med et fenol rødfritt medium med 10% FBS for å unngå farging av ECM-kjellermaterialet, noe som igjen kan forårsake artefakter under bildebehandlingsprosessen.
- Klargjør bestemte cellekulturmedier avhengig av typen cellelinje. Forsikre deg om at alle medier for cellevedlikehold inneholder 10% Foetal Bovine Serum (FBS).
- Subkulturceller
- Når cellene er ca. 80 % sammenfallende, vask kort med 2 ml trypsin-EDTA (0,25 % (w/v) trypsin/0,53 mM EDTA). Aspirer trypsin-EDTA, tilsett 3 ml fersk trypsin-EDTA og inkuber i 3-5 min ved 37 °C.
- Når celler løsnes fra cellekulturretten, tilsett 7 ml ferskt komplett medium.
- Pipette 1 ml celleoppheng i en ny 10 cm cellekulturrett og tilsett 9 ml ferskt komplett medium for å gi en 1:10 fortynning av celler.
- Kultur cellene ved 37 °C i en fuktet inkubator med 5 % CO2.
- Subkultur cellene hver 3-5 dager, avhengig av cellelinjen.
2. Generering av sfæroider
- Frakk 96-brønns plater med ECM kjellermateriale
- Tine ECM kjellermateriale på is over natten.
- Fortynn ECM kjellermateriale i kaldt fenol rødfritt serumfritt medium ved hjelp av forhåndskjølte spisser holdt ved -20 °C.
MERK: Den endelige konsentrasjonen av ECM kjellermateriale avhenger av cellelinjen som brukes. For HT-29- og H358-celler, bruk 4 mg·ml-1 av ECM kjellermateriale. For HepG2-celler, bruk 4 mg·ml-1 av redusert vekstfaktor ECM kjellermateriale. - Pipette 15 μL av ECM kjellermateriale/mediumløsning i en 96-brønns bildeplate.
MERK: For storskala sfæroidproduksjon kan dette trinnet utføres med både en 8-kanals pipette og et 96-kanals pipetteringshode, så lenge spissene og reservoaret som inneholder ECM-kjellermaterialet er avkjølt. - Sentrifuger platen i 20 min ved 91 x g ved 4 °C.
- Inkuber platen i ikke mer enn 30 min ved 37 °C.
- Celler for subkultur og antall
- I løpet av plateinkubasjonsperioden inkuberer du cellene med trypsin-EDTA og bruker dem på nytt i et komplett medium som inneholder 10% FBS.
- Pipette 10 μL av cellefjæringen i et hemocytometer tellekammer. Tell antall celler i 4 kvadranter av kammeret.
- Beregn antall celler i celleopphenget ved å bestemme gjennomsnittlig antall celler i de 4 kvadrantene.
MERK: Celler kan også telles ved hjelp av automatiserte celletellingsenheter. - Sentrifuger cellene ved 135 x g i 4 min ved romtemperatur (RT).
- Når cellene er pelletert, aspirerer du supernatanten og resuspenderer cellene i et fenolrødt komplett medium for å oppnå en konsentrasjon på 1 x 106 celler per ml.
- Frøceller inn i ECM-kjellermaterialebelagte plater
- Fortynn cellene i et fenolrødt komplett medium.
MERK: Tettheten av celler sådd er avhengig av cellelinjen som brukes. For HT-29- og HepG2-celler blir 3 x 104 celler sådd per brønn; For H358-celler er 4 x 104 celler sådd per brønn. - Frø cellene i et totalt volum på 35 μL per brønn. Sørg for å legge dem fallvis i en sirkulær bevegelse.
MERK: For storskala sfæroidproduksjon kan dette trinnet utføres med en 8-kanals pipette, så lenge pipetteringssirkulære bevegelser kan oppnås. - Inkuber cellene i 1 time ved 37 °C i en fuktet inkubator med 5 % CO2.
- Forbered en løsning av ECM kjellermateriale i fenol rødfritt komplett medium, noe som resulterer i en endelig konsentrasjon på 2% ECM kjellermateriale i brønnen. For å oppnå dette, tilsett 1,2 μL ECM kjellermateriale til 23,8 μL fenol rødfritt komplett medium per brønn, noe som resulterer i et sluttvolum på 60 μL per brønn.
- Inkuber cellene ved 37 °C i en fuktet inkubator med 5 % CO2.
- Neste dag, erstatt mediet med 100 μL frisk fenol rødfritt komplett medium.
- Bytt ut mediet annenhver dag med 100 μL frisk fenol rødfritt komplett medium.
- Fortynn cellene i et fenolrødt komplett medium.
3. Immunfluorescence farging av sfæroider
MERK: Denne protokollen er tilpasset fra Nürnberg et al., 202015. Disse tilpasningene er først og fremst basert på det faktum at sfæroidene beskrevet i denne protokollen er mindre enn de som brukes i Nürnberg et al. work15 og som sådan letter kortere inkubasjonstider. For eksempel reduseres blokkeringstidene fra 2 timer til 1 time. I tillegg, da protokollen er designet for høygjennomstrømningsproduksjon av sfæroider, utføres alle behandlingstrinnene i brønnen der sfæroidene dyrkes, noe som betyr at overføring av individuelle sfæroider til rør ikke er nødvendig.
- Klargjør alle løsninger og buffere som kreves for festing og farging
- Forbered fosfatbufret saltvann (PBS) ved å tilsette 1 PBS-tablett per 200 ml vann. Autoklaver PBS.
- Forbered paraformaldehyd (PFA) ved å følge trinn 3.1.3-3.1.4.
- Bruk en oppvarmet rører til å varme opp 400 ml PBS til 60-70 °C i en avtrekkshette. Tilsett 15 g PFA under omrøring. Når PFA er oppløst, tilsett 50 μL 1 M CaCl2 og 50 μL 1 M MgCl2.
- Tilsett 100 ml PBS for å lage et endelig volum på 500 ml. Bruk NaOH til å likevekte PFA til pH 7.4. Filtrer PFA gjennom sterile vakuumfiltre (porestørrelse 0,22 μm), aliquot og oppbevar ved -20 °C.
- Forbered en 1 M glycin lagerløsning ved å tilsette 3,75 g glycin til 50 ml PBS. Oppbevars ved 4 °C.
- Forbered 5 ml permeabiliseringsbuffer ved å tilsette 100 μL Triton X-100, 1 ml dimetylsulfoksid (DMSO) og 1,5 ml 1 M glycin til 2,4 ml PBS. Oppbevars ved 4 °C i ikke mer enn 2 uker.
- Forbered 5 ml blokkeringsbuffer ved å legge til 100 μL Triton X-100, 0,5 ml DMSO og 0,05 g bovint serumalbumin (BSA) til 4,9 ml PBS. Aliquot blokkering bufferen i 1,5 ml rør og lagre ved -20 °C.
- Forbered 5 ml antistoffinkubasjonsbuffer ved å tilsette 10 μL polysorbat 20, 0,05 g BSA og 250 μL DMSO til 4,74 ml PBS. Aliquot antistoff inkubasjon buffer i 1,5 ml rør og lagre den ved -20 °C.
MERK: I protokollen som er beskrevet her, monteres sfæroider bare i de indre 60 brønnene på en 96-brønnsplate, selv om de kan tilberedes i alle de 96 brønnene på platen. Årsaken til at man bare forbereder sfæroider i de indre 60 brønnene, er at noen objektive objektive objektive objektiver med høy numerisk blenderåpning ikke er i stand til fysisk å kunne se hele brønnen av de ytre brønnene på grunn av "skjørtet" på noen platetyper. Ovennevnte volumer er tilstrekkelig for fremstilling av 60 brønner som inneholder sfæroider.
- Fest og permeabiliser sfæroidene
- Fjern forsiktig mediet fra sfæroidene, og sørg for at ECM kjellermaterialelaget ikke forstyrres.
- Vask sfæroidene to ganger med 70 μL PBS i 3 minutter hver gang.
- Fest sfæroidene med 70 μL 3% PFA i 1 time ved 37 °C.
- Vask sfæroidene to ganger med 70 μL PBS i 3 minutter hver gang.
- Slukk med 70 μL 0,5 M glycinoppløsning i 30 min ved 37 °C.
- Permeabiliser sfæroidene ved hjelp av 70 μL av permeabiliseringsbufferen i 30 minutter ved RT.
- Vask sfæroidene to ganger med 70 μL PBS i 3 minutter hver gang.
- Inkuber sfæroidene i 70 μL blokkeringsbuffer i 1 time ved 37 °C.
MERK: Når sfæroidene er fikset, kan alle etterfølgende behandlingstrinn utføres ved hjelp av en 8-kanals pipette, eller et 96-brønns pipetteringshode, hvis tilgjengelig. Dette øker hastigheten på sfæroidpreparatet før avbildning.
- Immunostain sfæroider som bruker primære og sekundære antistoffer
- Fortynn det primære antistoffet til en passende fortynning i antistoffinkubasjonsbufferen og tilsett 70 μL til hver brønn. Inkuber sfæroidene med det primære antistoffet over natten.
MERK: Fortynning avhenger av det spesifikke antistoffet som brukes. I eksemplet som er vist her, er lysosomer immunostert med mus anti-LAMP1 antistoffer ved hjelp av en fortynning på 1:500. - Neste dag, vask sfæroidene 5 ganger med 70 μL PBS i 3 minutter hver gang.
- Fortynn det sekundære antistoffet ved en fortynning på 1:500, fluorescerende konjugert falloidin ved 1:500, og Hoechst 33342 (fra en 1 mg ml-1 lager) ved 1:5000 i antistoffinkubasjonsbufferen og tilsett 70 μL til hver brønn. Inkuber over natten.
MERK: Antistofffortynning avhenger av det spesifikke antistoffet som brukes. Svært kryss adsorberte sekundære antistoffer som viser høy fotostabilitet og høy lysstyrke anbefales. - Neste dag, vask sfæroidene 5 ganger med 70 μL PBS i 3 minutter hver gang.
MERK: Plater kan lagres i opptil to uker på RT før avbildning, så lenge sfæroidene forblir dekket med PBS.
- Fortynn det primære antistoffet til en passende fortynning i antistoffinkubasjonsbufferen og tilsett 70 μL til hver brønn. Inkuber sfæroidene med det primære antistoffet over natten.
4. Bildeanskaffelse og analyse av sfæroider
- Bildeanskaffelse
- Sett inn 96-brønnsplaten som inneholder sfæroider, i et konfokalt screeningmikroskop med høyt innhold.
- Velg de aktuelle laserne for å begeistre fluoroforene som brukes.
- Skaff kanalene sekvensielt for å unngå kryssprat.
- Bilde sfæroidene ved hjelp av passende mål.
MERK: Bruk av mål for vannutsenkning anbefales hvis tilgjengelig. Et 20x/1.0 NA-målsetting kan for eksempel vise en hel brønn i ~77 synsfelt. Et 63x/1.15 NA-mål kan avbilde en hel brønn på ca. 826 synsfelt. - Bilde ~30-40 skiver, avhengig av dybden på sfæroidet, med hver skive tatt med et intervall på 1,5 μm fra den foregående.
- Bildeanalyse
- For morfologisk analyse av sfæroider, følg trinn 4.2.2-4.2.6.
- Segmenter sfæroidene basert på fluorescerende konjugert falloidinfarging.
- Segmenter kjernene basert på Hoechst 33342 farging.
- Segmenter cytoplasmaet til hver celle etter den gjenværende Hoechst 33342-flekken som er tilstede i cellecytoplasma.
- Beregn forskjellige morfologiske egenskaper til sfæroidene, inkludert volum, overflateareal, sfæriskhet og antall kjerner per sfæroid.
MERK: Denne informasjonen trekkes ut ved hjelp av forskjellige algoritmer som er innebygd i den valgte bildeanalyseprogramvaren. - Behandle bilder videre for å fjerne sfæroider som er mindre enn 75 000 μm3 og større enn 900 000 μm3.
MERK: Disse verdiene er forslag for å tillate fjerning av svært små cellesamlinger og store forsamlinger som kan ha oppstått som følge av sammensmelting av flere sfæroider. Sfæroider kan også kategoriseres i forskjellige størrelsesklasser på dette trinnet. - Hvis du vil analysere enkeltceller i sfæroider, følger du trinn 4.2.8-4.2.12.
- Segmenter sfæroidene basert på fluorescerende konjugert falloidinfarging.
- Segmenter kjernene basert på Hoechst 33342 farging.
- Segmenter cytoplasmaet til hver celle etter den gjenværende Hoechst 33342-flekken som er tilstede i cellecytoplasma.
- Segmenter lysosomene basert på sekundær antistofffarging.
- Beregn forskjellige morfologiske egenskaper til cellene i hver sfæroid, inkludert antall lysosomer per celle, cellevolum og celleoverflateområde.
MERK: Denne informasjonen trekkes ut ved hjelp av forskjellige algoritmer som er innebygd i den valgte bildeanalyseprogramvaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne protokollen er en robust metode for å produsere 3D-cellekultursamlinger i form av sfæroider, ved hjelp av forskjellige celletyper for å representere ulike tumorvev, detaljert. Denne metoden gjør det mulig å utføre hundrevis av sfæroider per brønn, noe som gjør det mulig å utføre cellebaserte analyser på en høyverdig måte (figur 1). Denne tilnærmingen har tidligere blitt brukt til å studere nanopartikkelopptak i HT-29 sfæroider16 og nanopartikkelindusert toksisitet i HepG2 sfæroider17. Metoden er avhengig av å produsere en tynn og jevn fordeling av stillasmateriale over brønnbunnen på en optisk kvalitetsplate. Celler blir sådd inn i hver brønn, og ytterligere stillasmateriale, ved lav konsentrasjon, tilsetts som et overlegg på cellene. Dette resulterer i en base som støtter jevn vekst av sfæroider, noe som betyr at flere hundre sfæroider kan dyrkes i hver brønn av en 96-brønns plate. Et mål for lav forstørrelse brukes til å generere et oversiktsbilde av hele populasjonen (figur 2). Underregioner i brønnen kan deretter velges og avbildes ved hjelp av et mål med høy oppløsning, og i hver posisjon anskaffes en komplett konfokal stakk. Dette gir nødvendig informasjon for etterfølgende volumetrisk analyse av hver sfæroid.
De enkelte sfæroidene kan deretter analyseres av HCA, og dermed gi informasjon om sfæroidenes morfologiske egenskaper. Vanligvis er det første trinnet å identifisere hver sfæroid som et enkelt objekt. For å gjøre dette velges en fluorescenskanal som sannsynligvis vil gi konsistent farging eller fordeling i hele sfæroidet. I eksemplet som er vist her, brukes signalet i den fluorescerende konjugede falloidinkanalen, da aktin finnes nær plasmamembranen i alle celler i de forskjellige sfæroidtypene (figur 2 og figur 3A). Som et resultat av at komplette konfokale stabler genereres, kan alle HCA-trinn utføres på en volumetrisk måte i stedet for på stykke for stykkebasis. Dette er viktig fordi det fjerner eventuelle skjevheter knyttet til analysen av et lite antall valgte plan. Denne volumetriske tilnærmingen brukes deretter på de andre kanalene i bildet. Kjernene ble oppdaget og segmentert basert på Hoechst 33342 farging, og den samme kanalen kan brukes til å oppdage cellecytoplasma, da det er gjenværende Hoechst 33342 tilstede på lave nivåer (figur 3B). Hvis nedstrømsanalyse av individuelle celler i sfinoiden er nødvendig, kan de andre kanalene (for eksempel lysosomer immunostert med anti-LAMP1 antistoffer) også behandles på en lignende måte. Den volumetriske tilnærmingen gjør at alle fluorescerende merkede strukturer kan visualiseres fra alle visninger (figur 3C).
Etter å ha identifisert sfæroidet som et tydelig objekt, kan ulike morfologiske målinger på sfæroidnivå gjøres. Disse målingene inkluderer beregning av antall kjerner per sfæroid (figur 4A), samt sfæriskhet (figur 4B), volum (figur 4C) og overflateareal (figur 4D) av sfæroidet. Avhengig av HCA-programvaren som brukes, kan andre morfologiske funksjoner som tverrsnittsområde, indre diskradius og indre sfæreradius også beregnes. I eksemplene som er vist her, ble sfæroider under 75 000 μm3 og over 900 000 μm3 kassert fra målingene, men disse parametrene kan settes av brukeren, avhengig av de ønskede sfæroidegenskapene for analyse. Regneark ble generert av bildeanalyseprogramvaren og importert til RStudio for analyse. Boxplot-grafer ble produsert for å vise de morfologiske egenskapene til de forskjellige typene sfæroider (figur 4). Disse boxplots avslører nivået av sfæroid heterogenitet i befolkningen, og derfor er det viktig å kvantifisere et stort antall sfæroider i ett eksperiment. Dette er en viktig fordel i forhold til metoder som genererer en enkelt sfæroid per brønn. De tre sfæroidtypene som vises her, viser et høyt nivå av likhet med hensyn til volum og overflateareal, selv om det er bemerkelsesverdig at sfæriskheten til HepG2-sfæroider er noe lavere enn for de andre typene som er vist her (figur 4B).
Imaging sfæroider med et høyoppløselig mål, for eksempel 63x vann nedsenking mål som brukes her, tillater subcellulær oppløsning av individuelle celler i sfæroidet å oppnås. De forskjellige organellene kan segmenteres avhengig av antistoffene som brukes. I eksemplet som er vist her, ble lysosomer identifisert basert på immunstaining ved hjelp av anti-LAMP1 antistoffer, etterfulgt av sekundær antistofftilsetning (figur 3C). Segmenteringen av hver organell i hver celle tillater deretter kvantifisering av måling på cellenivå. Det typiske volumet av hver celle i de tre sfæroidtypene (figur 5A), samt antall lysosomer per celle (figur 5B), vises. Behovet for slike subcellulære detaljer bestemmes av analysen der sfæroidene skal brukes.
Optimalisering av den første cellesåingstettheten ved starten av sfæroidgenerering er et kritisk skritt. Å legge til for mange celler tillater fortsatt sfæroiddannelse; Dette kan imidlertid føre til sammensmelting av sfæroider (figur 6). Dette fører til generering av uregelmessig formede forsamlinger, noe som igjen kan være svært problematisk for nedstrømsidentifikasjon av sfæroidene. Når sfæroider feilaktig identifiseres som distinkte strukturer, kan det også være problemer med analysen av de enkelte cellene. Som sådan er nøye optimalisering av hver cellelinje som brukes til sfæroidgenereringen, inkludert cellesåtettheten og lengden på veksttiden, kritiske parametere å etablere.
Figur 1: Skjematisk detaljering av protokollen som brukes til å generere sfæroider for HCS og HCA. 96-brønnsplater er belagt med et lag av ECM kjellermateriale, etterfulgt av såing av celler, som deretter initierer sfæroiddannelse. Medium erstattes neste dag og annenhver dag deretter. Som forberedelse til avbildning er sfæroider faste, permeabiliserte og immunosterte med spesifikke antistoffer. Sfæroider blir deretter avbildet ved hjelp av et konfokalt HCS-mikroskop. Grafikk opprettet med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Eksempelbilder av H358-, HepG2- og HT-29-sfæroider. Helautomatisk HCS konfokal avbildning av (A) H358, (B) HepG2 og (C) HT-29 sfæroider. Paneler viser en enkelt brønnoversikt, samt tre eksempel konfokale skiver og volumetrisk rekonstruksjon av en sfæroid fra hver cellelinje. Nuklei farget med Hoechst 33342 er vist i blått, aktin farget med fluorescerende konjugert falloidin i rødt, og lysosomer immunostert for LAMP1 i grønt. Bilder av brønnoversikten ble innhentet med et 20x vann nedsenkingsmål (NA 1.0). Bilder av individuelle sfæroider ble anskaffet med et 63x vann nedsenkingsmål (NA 1,15). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Eksempel på viktige trinn i bildeanalyse. (A) Hver sfæroid identifiseres først i volumetrisk modus ved påvisning av fluorescerende konjugert falloidinfarging. (B) Ved hjelp av denne informasjonen som maske segmenteres cytoplasmaet til hver celle av den gjenværende Hoechst 33342-flekken som er tilstede i cellecytoplasmaet. Kjernene er segmentert av Hoechst 33342-flekken. Lysosomene segmenteres ved hjelp av antistoffet (anti-LAMP1) immunstaining. Volumetriske visninger vises. (C) 3-plan utsikt over samme sfæroid. Eksemplet som vises er av en H358 celle sfæroid. Bilder ble anskaffet med et 63x vann nedsenkingsmål (NA 1.15) Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Eksempler på målinger på sfæroidnivå. Alle målinger ble gjort ved hjelp av en automatisert bildeanalyserørledning, og for tre typer sfæroider, nemlig H358, HepG2 og HT-29, avbildet med et 20x mål. Vist er (A) gjennomsnittlig antall kjerner per sfæroid, (B) sfæroid sfæriskhet, (C) sfæroidvolum og (D) sfæroid overflateareal. Alle boxplots viser medianverdien og kvartilene for hver sfæroidtype. Data er fra 3 replikeringsbrønner; totalt antall sfæroider analysert var 1259 (H358), 1522 (HepG2) og 1326 (HT-29). Bilder ble anskaffet med et 20x vann nedsenkingsmål (NA 1.0). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Eksempler på måling på cellenivå fra sfæroider. Alle målinger ble gjort ved hjelp av en automatisert bildeanalyserørledning, og for tre typer sfæroider, nemlig H358, HepG2 og HT-29, avbildet med et 63x mål. Vist er (A) volumer av individuelle celler, og (B) gjennomsnittlig antall lysosomer per celle. Totalt antall celler som ble analysert var 1410 (H358), 1625 (HepG2) og 1401 (HT-29), fra 20 sfæroider av hver cellelinje. Bilder ble anskaffet med et 63x vann nedsenkingsmål (NA 1.15) Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Eksempelbilder som viser effekter av over-plating av celler på sfæroiddannelse. Eksempelbilder vises for H358-, HepG2- og HT-29-sfæroider. Piler indikerer steder der sfæroider sannsynligvis har smeltet sammen. Bilder ble anskaffet med et 20x vann nedsenkingsmål (NA 1.0). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tilnærmingen beskrevet her beskriver en plattform for å generere flere hundre sfæroider per brønn på en måte som passer for HCS og HCA. Sammenlignet med andre populære metoder, for eksempel bruk av flatbunnede og rundbunnede ULA-plater, som tillater dannelse av bare en sfæroid per brønn18,19, gir denne metoden muligheten for at høyoppløselig informasjon kan trekkes ut fra et stort antall sfæroider i et screeningformat. Spesielt har denne metoden blitt demonstrert i 3 forskjellige cellelinjer, som representerer ulike tumortyper, og fremhever den brede egnetheten til å studere en rekke cellulære prosesser i forskjellige modeller. Selv om sfæroidene som genereres ved hjelp av denne metoden viser noe variasjon i størrelse og form, kan HCA enkelt klassifisere dem etter størrelse (eller andre parametere av interesse). Laboratoriet vårt har med hell brukt denne tilnærmingen til å studere nanopartikkelindusert toksisitet som en funksjon av sfæroid størrelse. Viktigst, alle de forskjellige størrelsesklassene av sfæroider kan studeres i samme brønn, noe som betyr at alle ble utsatt for identiske behandlinger, noe som gir svært robuste utganger fra en stor sfæroid befolkning17. Metodikken som er beskrevet her, kan enkelt tilpasses for bruk med andre celletyper som representerer forskjellige vev. I tillegg kan slike sfæroider brukes til å vurdere ulike biologiske prosesser14. Hvis sfæroidene genereres med celler som stabilt uttrykker fluorescerende merkede proteiner, er levende celleavbildning også mulig.
Et kritisk skritt i denne protokollen er produksjonen av ECM kjellermaterialelaget som cellene er belagt på. Når laget er for tykt, kan det danne en menisk20 som fremmer veksten av monolayers i midten av brønnen og sfæroider bare på de ytre felgene i brønnen. Derfor er det viktig at riktig konsentrasjon og volum av ECM kjellermaterialet er valgt for å tillate jevn sfæroiddannelse gjennom hele brønnen; Dette er alltid cellelinjeavhengig. Vær også oppmerksom på at overflødig ECM kjellermateriale kan forårsake problemer under immunoppfatningsprosessen, da det ikke er lett oppløst. Dette kan igjen føre til komplikasjoner under bildeanskaffelse når du bruker et HCS konfokalt mikroskopsystem. En annen vurdering er at forskjellige cellelinjer kan kreve forskjellige ECM-formuleringer. For eksempel krever HepG2 sfæroider ECM kjellermateriale med redusert konsentrasjon av vekstfaktorer, sammenlignet med det som brukes av H358 og HT-29 sfæroider. Metoden for cellebelegg er også viktig, da dette bestemmer hvordan cellene fordeles i brønnen. Når enten for mange celler er sådd eller når de er dårlig fordelt, kan dette føre til sfæroidfusjon (figur 6). En annen utfordring med å bruke ECM stillaser er at de må håndteres ved lave temperaturer (under 10 °C), noe som er spesielt problematisk ved bruk av automatisering for HCS. Dette problemet ble imidlertid nylig løst av Eismann og kolleger (2020), som brukte mikroarrayteknologi for å oppdage 0,2 μL dråper ECM kjellermateriale og celler i kammeret lysbilder. Dette var tilstrekkelig materiale for å lette veksten av små sfæroider21. Hvorvidt en slik tilnærming også vil fungere for å plating større mengder ECM kjellermateriale i brønner av multi-brønn plater gjenstår å demonstrere.
Et problem knyttet til analysen av 3D-cellemodeller ved hjelp av mikroskopi er evnen til å trekke ut informasjon fra de sentrale planene til disse samlingene. I denne forbindelse kan permeabilisering og antistofftilgang under immunoppfatningsprosessen være problematisk. Protokollen utgitt av Nürnberg og kolleger15 muliggjør imidlertid svært konsistent immunstaining av hele sfæroiden. Ved hjelp av små modifikasjoner på denne protokollen kan denne teknikken immunostain selv små subcellulære strukturer (for eksempel lysosomer), med høy grad av konsistens, uansett om cellene er sentrale eller perifere med hensyn til den generelle sfæroidstrukturen. Det er viktig at dette trinnet er nøye optimalisert når du bruker nye antistoffer.
Et annet kritisk skritt er det valgte bilderegimet. Det er viktig å forestille seg riktig antall z-skiver gjennom sfæroiden, da dette bestemmer datavolumet som må analyseres og lagres. Hvis du for eksempel ser for mye på et begrenset antall z-plan med for stort intervall, kan det føre til en underestimering av den totale sfæroidstørrelsen og -volumet. På den annen side kan det å fange for mange z-fly føre til dataanalyse og lagringsproblemer. Svært store datasett krever også mer intensiv beregningskraft for analysen, spesielt i volumetrisk modus. Det optimale prøvetakingsintervallet i z-planet er i stor grad diktert av egenskapene til objektivlinsen, men for eksemplene som er vist her, kreves ca. 40 konfikale skiver med et intervall på 1,5 μm for å lette avbildning gjennom hele dybden av sfæroidet.
Som nevnt, for å redusere skjevheter fra analyse av utvalgte plan, anbefales bruk av en volumetrisk basert bildeanalysetilnærming sterkt. Dette gjør at ikke bare sfæroidnivåinformasjon kan trekkes ut, men også cellenivådata fra hver enkelt sfæroid. Til syvende og sist må HCA-rørledningene utformes på en slik måte at de adresserer det spesifikke biologiske spørsmålet som stilles. Multiparametriske utganger gjør det mulig å beskrive komplekse fenotyper kvantitativt. Dette har vist seg å fungere for 3D-cellesamlinger ved hjelp av kommersiell HCA-programvare16,17, samt fritt tilgjengelig programvare som CellProfiler22,23. Volumetriske analysemetoder har potensial til å bli brukt på andre 3D-cellemodelltyper, for eksempel organoider og ex vivo pasientavledede utvisningsplanter (PDEer), som enda bedre replikerer in vivo-forhold. Nylig har en rørledning med høy gjennomstrømning for å produsere hjerneorganoider blitt beskrevet24. Dette innebærer å generere organoider i en 96-brønns plate og deretter avbilde dem ved hjelp av et screeningmikroskop med høyt innhold24. PDEer er svært fordelaktige ved at de viser den opprinnelige histologien fra svulsten, og gir dermed en cellemodell som rekapitulerer vivoforhold, inkludert funksjoner som tumormikromiljøet25. Disse modellene kan også i prinsippet immuniseres, avbildes og analyseres ved hjelp av tilnærmingen som er beskrevet her26,27.
Oppsummert beskriver denne protokollen en tilgjengelig og robust metode for storskala produksjon av sfæroider for HCS- og HCA-applikasjoner. Dens anvendbarhet vises med tre forskjellige cellelinjer, og produserer sfæroider som kan avbildes med høy oppløsning. Denne protokollen viser også at volumetrisk analyse kan gi kvantitativ informasjon om sfæroidpopulasjonen, så vel som på encellede og subcellulære nivåer, og dermed gjøre den nyttig for et bredt utvalg av analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at det ikke er konkurrerende interesser knyttet til dette arbeidet.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner støtten fra et forskningsstipend for infrastruktur fra Science Foundation Ireland (SFI) (16/RI/3745) til JCS. Arbeidet i UCD Cell Screening Laboratory støttes av UCD College of Science. ASC er finansiert av en irsk forskningsrådsregjering (IRC) i Irland Postgraduate Scholarship (GOIPG/2019/68). Forfatterne takker også alle medlemmer av laboratoriet for deres innspill og nyttige diskusjoner. Kunstverket i figur 1 ble generert i BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A6003 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10050070 | |
| CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid | Perkin Elmer | 6055302 | These plates have been renamed as Phenoplates |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated | Gibco | 10500064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | |
| L-Glutamine solution, 200 mM | Gibco | 25030024 | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | 14533 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 10647032 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL | Corning | 356237 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences |
| Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 356231 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning |
| McCoy's 5A medium | Gibco | 26600023 | |
| McCoy's 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red | Hyclone | 10358633 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090022 | |
| Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red | Gibco | 51200046 | |
| Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate) | Developmental Studies Hybridoma Bank | H4A3-a | |
| Neubauer counting chamber | Hirschmann | 8100203 | |
| Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
| Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software | Perkin Elmer | HCSHH14000000 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phalloidin Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A12380 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Polysorbate 20 | Sigma Aldrich | P5927 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61870010 | |
| RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red | Gibco | 11835063 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Stericup sterile vacuum filter units | Millipore | SCGVU05RE |
References
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
- Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. Three-dimensional liver models: state of the art and their application for hepatotoxicity evaluation. Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15, 378-386 (2005).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Foglietta, F., Canaparo, R., Muccioli, G., Terreno, E., Serpe, L. Methodological aspects and pharmacological applications of three-dimensional cancer cell cultures and organoids. Life Sciences. 254, 117784 (2020).
- Bardsley, K., Deegan, A. J., El Haj, A., Yang, Y. Current state-of-the-art 3D tissue models and their compatibility with live-cell imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 3-18 (2017).
- Darrigues, E., et al. Tracking gold nanorods' interaction with large 3D pancreatic-stromal tumor spheroids by multimodal imaging: Fluorescence, photoacoustic, and photothermal microscopies. Scientific Reports. 10 (1), 3362 (2020).
- Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C.
- Mysior, M. M., Simpson, J. C. Cell3: A new vision for study of the endomembrane system in mammalian cells. Bioscience Reports. , (2021).
- Nürnberg, E., et al. Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (20), (2020).
- Cutrona, M. B., Simpson, J. C. A High-throughput automated confocal microscopy platform for quantitative phenotyping of nanoparticle uptake and transport in spheroids. Small. 15 (37), 1902033 (2019).
- Kelly, S., Byrne, M. H., Quinn, S. J., Simpson, J. C. Multiparametric nanoparticle-induced toxicity readouts with single cell resolution in HepG2 multicellular tumour spheroids. Nanoscale. 13 (41), 17615-17628 (2021).
- Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures. Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), 402-414 (2015).
- Redondo-Castro, E., Cunningham, C. J., Miller, J., Cain, S. A., Allan, S. M., Pinteaux, E. Generation of human mesenchymal stem cell 3D spheroids using low-binding plates. Bio-protocol. 8 (16), (2018).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Eismann, B., et al. Automated 3D light-sheet screening with high spatiotemporal resolution reveals mitotic phenotypes. Journal of Cell Science. 133 (11), 245043 (2020).
- Alsehli, H., et al. An integrated pipeline for high-throughput screening and profiling of spheroids using simple live image analysis of frame to frame variations. Methods. 190, 33-43 (2021).
- Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 1-11 (2021).
- Renner, H., et al. A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids. eLife. 9, 52904 (2020).
- Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
- Collins, A., Miles, G. J., Wood, J., MacFarlane, M., Pritchard, C., Moss, E. Patient-derived explants, xenografts and organoids: 3-dimensional patient-relevant preclinical models in endometrial cancer. Gynecologic Oncology. 156 (1), 251-259 (2020).
- Miles, G. J., et al. Evaluating and comparing immunostaining and computational methods for spatial profiling of drug response in patient-derived explants. Laboratory Investigation. 101 (3), 396-407 (2021).
