Summary
הפרוטוקול מתאר שיטה שלב אחר שלב לטיהור חלבונים הנמצאים בכל מקום מתאי יונקים באמצעות חלבון מדכא הגידול p53 כדוגמה. חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום טוהרו מתאים בתנאים מחמירים של אי-דנטורציה ודנאטורציה.
Abstract
Ubiquitination הוא סוג של שינוי posttranslational המסדיר לא רק את היציבות אלא גם את לוקליזציה ותפקוד של חלבון המצע. תהליך ה-ubiquitination מתרחש באופן תוך-תאי באאוקריוטים ומווסת כמעט את כל התהליכים הביולוגיים הבסיסיים של התאים. טיהור של חלבונים ubiquitinated מסייע לחקור את התפקיד של ubiquitination בשליטה על תפקוד של חלבונים המצע. כאן, הליך שלב אחר שלב לטיהור חלבונים ubiquitinated בתאי יונקים מתואר עם חלבון מדכא הגידול p53 כדוגמה. חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום טוהרו בתנאים מחמירים של אי-דנטורינג ודנאטורציה. סה"כ חלבון p53 המתויג כ-Flag טוהר באמצעות אגרוז מצומד נגד נוגדנים של פלאג בתנאים של אי-דנטורציה. לחלופין, סך כל החלבון התאי המתויג כיוביקוויטין טוהר באמצעות שרף טעון ניקל בתנאי דנטורציה. חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום באלואטים זוהו בהצלחה עם נוגדנים ספציפיים. באמצעות הליך זה, ניתן לטהר ביעילות את הצורות הנמצאות בכל מקום של חלבון נתון מתאי יונקים, ובכך להקל על מחקרים על התפקידים של יוביקוויטינציה בוויסות תפקוד החלבון.
Introduction
אוביקוויטין הוא חלבון משומר אבולוציונית של 76 חומצות אמינו 1,2,3. אוביקוויטין קושר באופן קוולנטי שאריות ליזין על חלבוני מטרה באמצעות מפלים המערבים אנזימים מפעילים (E1), מצומדים (E2) וליגאז (E3). יוביקוויטין מופעל תחילה על ידי האנזים E1 ולאחר מכן מועבר לאנזימים המצומדים E2. לאחר מכן, ליגאזות יוביקוויטין E3 מתקשרות הן עם אנזימי E2 טעונים ביוביקוויטין והן עם חלבוני סובסטרט ומתווכות את היווצרותו של קשר איזופפטידי בין מסוף C של יוביקוויטין לבין שאריות ליזין במצע 1,2,3,4,5. יוביקוויטינציה כרוכה בחיבור של יוביקוויטין מואטי לשאריות ליזין על חלבוני המצע או לעצמה, מה שמוביל למונוביקוויטינציה של חלבונים או לפוליוביקוויטינציה. תהליך זה של ubiquitination מתרחש באופן תוך-תאי באאוקריוטים ומסדיר מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים. יוביקוויטינציה גורמת לפירוק חלבוני הסובסטרט באמצעות מערכת יוביקוויטין-פרוטאזומים 1,2,3,4,5. בנוסף, יוביקוויטינציה מווסתת לוקליזציה של חלבונים תת-תאיים, היווצרות קומפלקס חלבונים וסחר בחלבונים בתאים 3,5. ניתן להסיר יוביקוויטין מואטי הקשור לחלבוני סובסטרט על ידי דה-אוביקוויטין אנזימים (DUBs)6,7. יש לציין כי הדרכים השונות שבהן שרשראות יוביקוויטין מורכבות מספקות מספר עצום של אמצעים לוויסות תהליכים ביולוגיים שונים 1,5. התפקידים המדויקים של יוביקוויטינציה בוויסות תפקוד חלבון המצע עדיין אינם מובנים במלואם עד כה. הטיהור של חלבונים ubiquitinated תורם להבהרת ההשפעות של חלבון ubiquitination על מגוון רחב של תהליכים תאיים.
החלבון p53 הוא אחד החלבונים מדכאי הגידול החשובים ביותר והוא מציג מוטציות גנטיות או השבתה כמעט בכל סוגי הסרטן האנושיים 8,9,10,11. היציבות והפעילות של P53 מווסתות בעדינות in vivo על-ידי שינויים פוסט-טרנסלציוניים, כולל יוביקוויטינציה, זרחון, אצטילציה ומתילציה12,13. לחלבון p53 יש זמן מחצית חיים קצר הנע בין 6 דקות ל-40 דקות בתאים שונים, מה שנובע בעיקר מהפוליוביקוויטינציה שלו ומפירוק פרוטאזומלי10,12 לאחר מכן. עכבר כפול דקה 2 (Mdm2) הוא ליגאז יוביקוויטין E3 של p53 הנקשר ל-N-terminus של p53 כדי לעכב את פעילות השעתוק שלו12,14,15. Mdm2 מקדם את הפוליוביקוויטינציה והפירוק הפרוטיאזומלי של p53 כדי לשלוט ביציבותו וגורם למונוביקוויטינציה של p53 כדי להקל על ייצוא הגרעין שלה12,14,15,16. כאן, יוביקוויטינציה p53 בתיווך Mdm2 משמשת כדוגמה להצגת שיטה לטיהור חלבונים יוביקוויטין מתאי יונקים בפירוט. ניתן לזהות את הרגולטורים המשפיעים על מצב האוביקוויטינציה של חלבוני המטרה באמצעות בדיקת יוביקוויטינציה in vivo זו כאשר הם מתבטאים יתר על המידה או מופלים/נדפקים בתאי יונקים. בנוסף, חלבונים המכילים יוביקוויטין יכולים לשמש כמצעים לבדיקת דאוביקוויטינציה במבחנה. ניתן לבצע בדיקת תפוקה גבוהה כדי לזהות DUBs ספציפיים עבור חלבוני מטרה על ידי דגירה של מצעים ubiquitinated עם DUBs בודדים. חלבונים הנמצאים בכל מקום עשויים לשמש כפיגום לגיוס חלבוני איתות במורד הזרם בתאים. קומפלקס חלבוני מטרה הנמצאים בכל מקום יכול להיות מטוהר על ידי מיצוי חיסוני רציף בתנאי טיהור מקומיים ולזהות על ידי ספקטרומטריית מסה. ניתן להשתמש בפרוטוקול הנוכחי באופן נרחב כדי לחקור את החלבונים התאיים המווסתים על ידי יוביקוויטינציה.
מספר שיטות הוקמו כדי לטהר חלבונים ubiquitinated, הכוללות שימוש ביוביקוויטין המתויג על ידי זיקה, נוגדני יוביקוויטין, חלבונים קושרי יוביקוויטין, ותחומים מבודדים הקושרים יוביקוויטין (UBDs)17. כאן, אנו מספקים פרוטוקול המשתמש ביוביקוויטין המתויג כמתווך לטיהור חלבונים הנמצאים בתאים של יונקים. השימוש ביוביקוויטין המתויג של פולי-היס מציע יתרונות על פני השיטות האחרות. חלבונים הנמצאים בכל מקום מטוהרים בנוכחות דנטורנטים חזקים, מה שמפחית קשירה לא ספציפית לשרף טעון ניקל על ידי ליניאריזציה של חלבונים תאיים ושיבוש אינטראקציות חלבון-חלבון. לעומת זאת, השימוש בנוגדנים ליוביקוויטין, חלבונים קושרי יוביקוויטין ו-UBDs מבודדים כמתווכים אינו יכול להוציא ביעילות שותפים קושרים מחלבון המטרה מכיוון שיש לבצע טיהור בתנאים פחות מחמירים. יתר על כן, טיהור עשוי גם להוביל לקשירה מוגברת של חלבונים שאינם קשורים באמצעות מתווכים אלה. בנוסף, קיימת נטייה מחייבת לסוגי קישור שונים של יוביקוויטין, כמו גם מונו ופולי-יוביקוויטינציה על ידי חלבונים קושרי יוביקוויטין או UBDs17 מבודדים. השימוש באוביקוויטין המתויג על-ידי פולי-היס תורם להורדת כל החלבונים הנמצאים בכל התאים הנמצאים בכל מקום. לחלופין, השימוש באגרוז מצומד נגד פלאג או אנטי-HA זמין מסחרית ומקל על חיסונית חלבוני מטרה מתויגים של דגל או HA בקנה מידה גדול בתנאים שאינם מתויגים. שלב טיהור שני, לדוגמה, על ידי שרף טעון ניקל המכוון ליוביקוויטין מתויג פולי-היס, יכול לשמש לרכישת חלבוני מטרה ubiquitinated עם טוהר גבוה לניסויים במורד הזרם. יש לציין כי אסטרטגיית טיהור תיוג אפיטופים יכולה להיות מותאמת כאשר לא ניתן לרכוש נוגדן מסוים לחלבוני מטרה חיסוניים יעילים. לבסוף, טיהור של חלבונים ubiquitinated בתאי יונקים, בהשוואה לטיהור במבחנה, שומר על מצב הקישור של יוביקוויטין של חלבוני מטרה בתנאים פיזיולוגיים יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: תאי H1299 סופקו בחביבות על ידי בנק תאי הגזע, האקדמיה הסינית למדעים והוכחו כשליליים לזיהום מיקופלסמה.
1. תרבית תאים
- עבור התרבית הראשונית, יש למקם 1 x 106 תאים של קו תאי אדנוקרצינומה בריאה אנושית, H1299 בצלחת פטרי בגודל 10 ס"מ עם 10-12 מ"ל של RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), תוסף גלוטמין 1%, 1% נתרן פירובט ואנטיביוטיקה (100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין). שמור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% CO2. פצלו את התאים כל 2-3 ימים, תלוי מתי הם מגיעים למפגש של 80%-90%.
- יום אחד לפני ההעברה, הכינו 6-9 x 10 6 תאים לשלוש צלחות פטרי וצלחת 2-3 x 106 תאים בצלחת פטרי אחת בגודל 10 ס"מ המכילה 10-12 מ"ל בינוני כדי להשיג מפגש של 70%-90% במהלך ההעברה.
הערה: תאי HEK293T יכולים לשמש גם לטיהור חלבונים המכילים יוביקוויטין בשל יעילות ההעברה הגבוהה שלהם ורמת ביטוי החלבון.
2. טרנספקציה פלסמידית
- הוסף 1.5 מ"ל של מדיום סרום מופחת בשלושה צינורות צנטריפוגה של 15 מ"ל.
- הוסיפו דנ"א פלסמיד מוכן להעברה לכל צינור כדי לבצע דילולים באופן הבא. צינור 1: 1 מיקרוגרם של פלסמיד דגל-p53, 12 מיקרוגרם של וקטור ריק; צינור 2: 1 מיקרוגרם של פלסמיד פלאג-p53, 3 מיקרוגרם של פלסמיד His-HA-Ub (HH-Ub), ו-9 מיקרוגרם של וקטור ריק; צינור 3: 1 מיקרוגרם של פלסמיד פלאג-p53, 3 מיקרוגרם של פלסמיד HH-Ub, ו-9 מיקרוגרם של פלסמיד Mdm2. הוסף סך של 0.2 מיקרוגרם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) פלסמיד לכל צינור כדי לפקח על יעילות הטרנספקציה.
הערה: יש לבצע ניסוי פיילוט כדי לקבוע את הכמויות האופטימליות של פלסמידים הדרושים להשגת ביטוי יעיל של חלבון מטרה בתאים. - הוסף 78 μL של ריאגנט טרנספקציה ליפוזום ל-4.5 מ"ל של מדיום סרום מופחת בצינור צנטריפוגה אחר כדי לדלל ליפוזומים. מערבבים היטב על ידי הבהוב הצינור ומאפשרים לעמוד במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- הוסף 1.5 מ"ל של תמיסת הליפוזום המדוללת לכל צינור משלב 2.2 המכיל 1.5 מ"ל של תמיסת ה- DNA המדוללת. ערבבו היטב וצלבו את הפלסמידים עם הליפוזומים למשך 20 דקות לפחות ב-RT. השתמשו בדנ"א פלסמיד: יחס ליפוזום של 1:2 (מיקרוגרם:μL) עבור כל טרנספקציה.
- השליכו את המדיום המקורי מצלחות הפטרי והוסיפו 9 מ"ל של מדיום סרום מופחת לכל מנה. מוסיפים 3 מ"ל מתערובת הליפוזום-DNA לכל מנה ומערבבים את התמיסה על ידי ניעור עדין של הצלחת קדימה ואחורה פי 3, ואז שמאלה וימינה פי 3 לפיזור שווה של התערובת בצלחת.
- תרבית את התאים באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. מחליפים את המדיום לאחר 4-6 שעות וממשיכים לתרבת את התאים במשך 24-36 שעות.
3. איסוף תאים
- לאחר 24-36 שעות, לטפל בתאים עם MG132 בריכוז סופי של 10 μM במשך 4-6 שעות.
הערה: MG132 הוא אלדהיד פפטידי החוסם ביעילות את הפעילות הפרוטאוליטית של קומפלקס פרוטאזום 26S. ניתן להגדיל את כמויות החלבונים המכילים שרשראות פוליוביקוויטין המקושרות לליזין-48 (K48) לאחר טיפול בתאים ב-MG132 או במעכבי פרוטאזומים אחרים. - יש להשליך את המדיום, לשטוף את התאים פי 2 (תוך הקפדה שלא לשטוף את התאים) בתמיסת מלח זרחתית קרה כקרח (PBS), ולשאוף את התאים עם פיפטים סרולוגיים.
- הוסף 1 מ"ל של PBS לצלחת, להסיר את התאים על ידי גירוד עם מגרד נקי, ולהעביר את ההשעיה התא לתוך צינורות microcentrifuge. צנטריפוגה ב 700 x גרם במשך 5 דקות כדי לאסוף כדורי תא.
4. טיהור של חלבונים ubiquitinated בתנאים nondenaturing
- יש להכין את חיץ התסיסה של פלאג (50 mM Tris-HCl (pH 7.9), 137 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM אתילן דיאמין חומצה טטראצטית (EDTA), 1% טריטון X-100, 0.2% סרקוזי ו-10% גליצרול) בתוספת טרייה של קוקטייל מעכב פרוטאז לפני השימוש.
- הוסיפו 800 μL של חיץ Flag lysis קר כקרח לתאים בכל צינור, ערבבו את התאים באמצעות מתנד מערבולת או אקדח פיפטה, ולאחר מכן דגרו את התערובת על סיבוב בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- נושא התערובת ל 5-10 פולסים קצרים של אולטרה סאונד. בצע את האולטרה-סאונד על הקרח בתדר סוניקציה של 20 קילו-הרץ ומשרעת של 80% כאשר כל פעימה נמשכת שנייה אחת. דגירה של התערובת על מסובב ב-40 סיבובים לדקה (סל"ד) ב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- צנטריפוגה דגימות אולטרה סאונד ב 8,000 x גרם במשך 20-30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. העבירו את הסופר-נטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש.
- Aliquot 80 μL (1/10) של תמצית התא ולערבב עם 20 μL של 5x נתרן דודציל סולפט (SDS) טעינה חיץ. מרתיחים את הדגימות בטמפרטורה של 98°C למשך 5 דקות, מצננים על קרח למשך 2 דקות ומאחסנים בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש. השתמש בדגימות אלה כקבוצת הקלט כדי לנטר את ביטוי החלבון.
- יש להוסיף 30 μL של חרוזי נוגדנים מצומדים נגד דגל M2 (Flag/M2) לתמציות התאים הנותרות ולדגור על סיבוב בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לפחות או למשך הלילה.
- צנטריפוגה ב 1,500 x גרם במשך 2 דקות ב 4 מעלות צלזיוס כדי לאסוף את החרוזים. הוסיפו 1 מ"ל של חיץ ליסיס פלאג קר כקרח לחרוזים וערבבו על ידי היפוך הצינור מספר פעמים.
- צנטריפוגה ב 1,500 x גרם במשך 2 דקות ב 4 מעלות צלזיוס כדי לאסוף את החרוזים. חזור על שלב 4.7 במשך 4-6 פעמים.
- הוסיפו 40 μL של פפטידי דגל בריכוז סופי של 200 ng/μL לחרוזים ודגרו על סיבוב בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים כדי לחמוק מהחלבונים הקשורים.
- צנטריפוגה ב 1,500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. העבירו את הסופר-נטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש.
- מוסיפים 10 μL של מאגר טעינה 5x SDS, מרתיחים את התערובת בטמפרטורה של 98°C למשך 5 דקות, מצננים על קרח למשך 2 דקות ומאחסנים בטמפרטורה של -20°C להכתמה מערבית. לחלופין, אחסנו את ה-eluate משלב 4.10 ישירות בטמפרטורה של -80°C לניסויים אחרים במורד הזרם.
הערה: ניתן להגדיל את כמות החלבונים המטוהרים המכילים יוביקוויטין על-ידי הגדלת מספר התאים וכמויות הפלסמידים שעברו טרנספקציה. ניתן להתאים אסטרטגיית תיוג אפיטופים כדי לטהר קומפלקסים תאיים הנקשרים במיוחד ל-p53 המצוי בכל מקום בתנאי טיהור מקומיים. על-ידי ביטוי משותף של Flag-p53, mdm2 ו-HA-ubiquitin, קומפלקס החלבונים p53 המצוי בכל מקום עשוי להיות משוקע על ידי אגרוז מצומד של דגל רציף ונוגדנים HA מתאי יונקים. כדי לשמור על שותפים קושרים של חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום, יש להשתמש במאגר התזה BC100 המחמיר פחות (20 mM Tris-HCl (pH 7.9), 100 mM NaCl, 10% גליצרול, 0.2 mM EDTA, 0.2% Triton X-100 ומעכב פרוטאז 1x) במהלך תהליך הטיהור. הפלט מפפטיד HA נתון לספקטרומטריית מסות כדי לזהות את כל השותפים הנקשרים באופן ספציפי ל-p53 המצוי בכל מקום.
5. טיהור של חלבונים ubiquitinated בתנאים denaturing
- הוסיפו 1 מ"ל של PBS קר כקרח לכדורי התא שהתקבלו בשלב 3.3 וערבבו באופן שווה. Aliquot 100 μL (נפח 1/10) של מתלה התא לתוך צינור microcentrifuge כמו דגימת קלט.
- צנטריפוגה ב 700 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס כדי לאסוף את כדורי התא. הוסף 80 μL של מאגר Flag lysis לדגימת הקלט, ערבב את התאים באמצעות מתנד מערבולת או אקדח פיפטה, ותלה את התאים על הקרח במשך שעה אחת.
- צנטריפוגה ב 8,000 x גרם במשך 20-30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. Aliquot 80 μL של supernatant לתוך צינור microcentrifuge חדש.
- יש להוסיף 20 μL של מאגר טעינה 5x SDS לסופרנטנט, להרתיח בטמפרטורה של 98°C למשך 5-10 דקות, לקרר על קרח למשך 2 דקות ולאחסן בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.
- צנטריפוגה את 900 μL הנותרים של מתלה התא ב 700 x g במשך 5 דקות ב 4 °C כדי לאסוף את גלולת התא. הוסף 1 מ"ל של מאגר יוביקוויטין 1 (מאגר UB 1; 6 M guanidine-HCI, 0.1 M Na 2 HPO 4, 6.8 mM NaH 2 PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8.0), ו-0.2% Triton X-100, בתוספת טרייה של 10 mM β-מרקפטואתנול ו-5 mM imidazole) לכדורי התא וערבב מספר פעמים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה כדי לפזר את התאים באופן שווה.
הערה: ריכוז האימידזול עשוי להשתנות בין 5 mM ל-20 mM כדי להפחית את קשירת החלבון הלא ספציפי על השרף הטעון ניקל. חיץ יוביקוויטין מכיל גואנידין הידרוכלוריד, אשר משבית הן ליגאזות והן DUBs. β-מרקפטואתנול הוא נוזל צלול וחסר צבע עם ריח חזק ולא נעים הדומה לביצים רקובות. תמיסה בריכוז גבוה תגרום נזק חמור לקרום הרירי, לדרכי הנשימה העליונות, לעור ולעיניים. יש ללבוש כפפות ומשקפי מגן ולפעול במכסה המנוע. - נושא התא lysates ל 10-20 סיבובים של אולטרה סאונד עד הפתרון הוא כבר לא צמיג. בצע את האולטרה-סאונד על הקרח בתדר סוניקציה של 20 קילו-הרץ ומשרעת של 80% כאשר כל פעימה נמשכת שנייה אחת. צנטריפוגה ב 8,000 x גרם במשך 20-30 דקות ב RT ולהעביר את supernatant לצינור microcentrifuge חדש.
- הוסיפו 30 μL של שרף טעון ניקל לסופרנטנט ודגרו על מסובב שנקבע ב-15 סל"ד למשך 4 שעות או לילה ב-RT. צנטריפוגה ב-1,500 x גרם למשך 2 דקות ב-RT כדי לאסוף את החרוזים.
- הוסיפו 1 מ"ל של מאגר UB 1, דגרו עם סיבוב בשייקר למשך 10 דקות ב-RT, וצנטריפוגה ב-1,500 x גרם למשך 2 דקות ב-RT כדי לאסוף את החרוזים.
- הוסיפו 1 מ"ל של מאגר יוביקוויטין 2 (מאגר UB 2; 8 M אוריאה, 0.1 M Na 2 HPO 4, 6.8 mM NaH 2 PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8.0) ו-0.2% Triton X-100) לחרוזים, דגרו עם סיבוב בשייקר למשך 10 דקות ב-RT, וצנטריפוגה ב-1,500 x g למשך2דקות כדי לאסוף את החרוזים. חזור על כך פעם נוספת.
- לחרוזים, הוסיפו 1 מ"ל של PBS, דגרו עם סיבוב בשייקר במשך 10 דקות ב-RT, וצנטריפוגה ב-1,500 x גרם למשך 2 דקות ב-RT כדי לאסוף את החרוזים. חזור על כך פעם נוספת.
- חלבונים הקשורים לאלוטה על ידי דגירה של החרוזים עם 40 μL של אימידזול בריכוז סופי של 0.5 M למשך שעה אחת ב-RT. צנטריפוגה בגודל 1,500 x g למשך 2 דקות ב-RT.
- מעבירים את הסופרנטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי, מוסיפים 10 μL של מאגר טעינה 5x SDS, מרתיחים ב-98°C למשך 5 דקות, מצננים על קרח למשך 2 דקות ומאחסנים בטמפרטורה של -20°C להכתמה מערבית. לחלופין, אחסנו את ה-eluate הלא מעובד בטמפרטורה של -80°C לניסויים אחרים במורד הזרם.
6. זיהוי של חלבונים מטוהרים בכל מקום על ידי כתם מערבי
- פתור את הדגימות משלבים 4.11 ו- 5.12 על ידי נתרן דודציל סולפט פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE), ולאחר מכן העבר אותן לממברנה ניטרוצלולוז על ידי כתם מערבי כדי לזהות חלבוני מטרה באמצעות הנוגדנים המתאימים כמתואר18.
- בקצרה, דגירה על הממברנה על ידי טבילה ב-20 מ"ל של תמיסה חוסמת המכילה אבקת חלב 5% דפט בחיץ TBST (15 mM Tris-HCI; pH = 7.6, 4.6 mM Tris-base, 150 mM NaCI, תוספת טרייה עם 0.1% Tween-20 לפני השימוש) ב-RT למשך שעה אחת. לאחר מכן, לדגור את הממברנה עם נוגדנים ראשוניים ב RT במשך 2 שעות או לילה ב 4 מעלות צלזיוס. השתמש בנוגדנים הבאים עבור כל קבוצה. כל הנוגדנים הראשוניים שימשו בדילול של 1:1000.
- זהה חלבון p53 כולל, כולל p53 ubiquitinated, עם נוגדן חד-שבטי נגד p53 לאחר מיצוי חיסוני עם חרוזי אגרוז Flag/M2.
- זהה חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום עם נוגדן נגד HA או נוגדן נגד יוביקוויטין לאחר מיצוי חיסוני עם חרוזי אגרוז Flag/M2.
- זהה חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום עם נוגדן חד-שבטי אנטי-p53 לאחר משיכת שרף טעון ניקל.
- זהה את סך כל החלבון המצוי בכל מקום עם נוגדן אנטי-HA או נוגדן נגד יוביקוויטין לאחר משיכת שרף טעון ניקל.
- לדגום את הממברנה עם נוגדנים משניים מצומדים של חזרת פרוקסידאז (HRP) ב-RT למשך שעה אחת לאחר שטיפה 3x עם חיץ TBST במשך 5 דקות כל אחד. כל הנוגדנים המשניים שימשו בדילול של 1:3000. לאחר מכן, לשטוף את הממברנה עם חיץ TBST 3x במשך 5 דקות כל אחד עם תסיסה עדינה.
- הפעל את מערכת ההדמיה chemiluminescence כדי לזהות אותות מכתם מערבי. הכן את פתרון המצע עבור תוכנית המענה ההומניטרי על-ידי ערבוב פתרונות A ו- B ביחס של 1:1.
- מניחים את קרום הניטרוצלולוז בקמרה אובסקורה עם הפנים כלפי מעלה ומצפים את תמיסת המצע באופן שווה על הממברנה באמצעות אקדח פיפטינג. בחר את הליך החשיפה האוטומטי כדי ללכוד אותות כימילומינסנטיים וכוונן ידנית את זמן החשיפה עד להשגת אות אידיאלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הדיאגרמה הסכמטית מציגה את חלבוני האוביקוויטין המתויגים בדגל (HH-Ub) (איור 1A). ההליכים המשמשים לטיהור חלבונים הנמצאים בכל מקום מסוכמים באיור 1B. ניתן לקשור יוביקוויטין מתויג של Poly-His לחלבונים ממוקדים בתאי יונקים. חלבונים הנמצאים בכל מקום יכולים להיות מטוהרים באמצעות חרוזי Flag/M2 בתנאים של אי-דנטורציה או על-ידי כרומטוגרפיה של זיקת יוני מתכת משותקים (IMAC) בתנאי דנטורציה (איור 1B). סך כל חלבון p53, כולל p53 ubiquitinated, היה חיסוני עם חרוזי Flag/M2 מתאי H1299 בתנאים שאינם דנטורציה. האות מחלבון p53 המצוי בכל מקום, המופיע כלהקה מרוחה ממשקל מולקולרי נמוך לגבוה, עלה במידה ניכרת כאשר Mdm2 התבטא באופן אקטופי בתאים אלה, מה שמרמז על כך שחלבון p53 המצוי בכל מקום טוהר ביעילות מתאים (איור 2). לאחר מכן, התאים הושכבו בתנאי דנטורציה, וסך כל החלבון התאי המצוי בכל מקום נמשך מטה באמצעות שרף טעון ניקל. סך כל החלבון התאי זוהה על ידי כתם מערבי באמצעות נוגדן חד שבטי אנטי-HA וחלבון p53 ubiquitinated זוהה באמצעות נוגדן חד שבטי נגד p53. התוצאות הראו כי רמת החלבון הכוללת המכילה של יוביקוויטין לא השתנתה, אך רמת החלבון p53 בכל מקום עלתה באופן דרמטי לאחר ש-Mdm2 התבטא יתר על המידה בתאים אלה. התוצאות האלה הצביעו על כך שסך כל חלבוני האוביקוויטין המכילים p53 יוביקוויטין נמשכו ביעילות מליזטים של תאים בתנאי דנטורציה (איור 3).
איור 1: סיכום של ההליכים המשמשים לטיהור חלבונים הנמצאים בשימוש בכל מקום. (A) דיאגרמה סכמטית של חלבוני יוביקוויטין מתויגים בדגל (Flag-p53) ו-His/HA המתויגים פעמיים (HH-Ub). (B) חלבונים הנמצאים בכל מקום ניתנים לטיהור באמצעות חרוזי Flag/M2 בתנאי אי-דנטורציה ועל-ידי IMAC בתנאי דנטורציה. קיצורים: שלו/HA = פוליהיסטידין/המגלוטינין; Ub = יוביקוויטין; חרוזי דגל/M2 = חרוזים מצומדים נגד דגל M2; IMAC = כרומטוגרפיית זיקה של יוני מתכת משותקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: חלבוני p53 שעברו יוביקוויטין טוהרו בתנאים של אי-הכחשה. פלסמיד הביטוי Flag-p53 הועתק לבדו, עם HH-Ub, או עם Mdm2 ו-HH-Ub לתוך תאי H1299. סך כל חלבוני p53 וצורות ubiquitinated היו חיסונית על ידי חרוזי פלאג/M2 מתמציות תאים. האלואט היה נתון לכתמים מערביים עם נוגדנים חד-שבטיים נגד p53 (A) ואנטי-HA (B). (C) תמציות התאים הגולמיים (קלט) היו נתונות לכתמים מערביים עם נוגדנים חד-שבטיים נגד p53 ונגד Mdm2. GFP שימש כבקרת הטעינה. קיצורים: HH-Ub = יוביקוויטין מתויג כפול שלו/HA; HA = המגלוטינין; חרוזי דגל/M2 = חרוזים מצומדים נגד דגל M2; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: חלבוני p53 שעברו שימוש בכל מקום טוהרו בתנאי דנטורציה. פלסמיד הביטוי Flag-p53 הועתק לבדו, עם HH-Ub, או עם Mdm2 ו-HH-Ub לתוך תאי H1299. סך כל החלבונים הנמצאים בכל מקום בתאים נמשכו למטה עם שרף טעון ניקל, ולאחר מכן היו נתונים לכתמים מערביים עם נוגדנים חד-שבטיים נגד p53 ואנטי-HA. (A) חלבון p53 המצוי בכל מקום זוהה באמצעות נוגדן נגד p53. (B) סך כל החלבון המצוי בכל מקום זוהה באמצעות נוגדן אנטי-HA. (C) תמציות התאים הגולמיים (קלט) היו נתונות לכתמים מערביים עם נוגדנים חד-שבטיים נגד p53 ונגד Mdm2. GFP שימש כבקרת הטעינה. קיצורים: HH-Ub = יוביקוויטין מתויג כפול שלו/HA; HA = המגלוטינין; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יוביקוויטינציה ממלאת תפקיד קריטי כמעט בכל התהליכים התאיים הפיזיולוגיים והפתולוגיים2. בשנים האחרונות חלה התקדמות רבה בהבנת התפקיד המולקולרי של יוביקוויטין במסלולי איתות וכיצד שינויים במערכת האוביקוויטין מובילים למחלות אנושיות שונות2. הטיהור של חלבונים המכילים יוביקוויטין תורם לתובנה לגבי התפקידים המדויקים של יוביקוויטינציה בתהליכים אלה. ניתן לטהר את התערובות של חלבונים מצומדים ליוביקוויטין מתאים בתנאי אי-דנטורציה ודנאטורציה. ניתן להשתמש ב-IMAC באמצעות שרפים של ניקל כדי לטהר חלבונים מתויגים של Poly-His בתנאי דנטורציה. המטרה של טיהור חלבונים המכילים יוביקוויטין בתנאי דנטורציה היא להשליך את שותפי האינטראקציה מחלבוני המטרה. כל הרכיבים התאיים הנקשרים לחלבוני המטרה יימחקו מהאלוציה בתנאי דנטורציה. לעומת זאת, חלק מהחלבונים התאיים הנקשרים לחלבוני מטרה עשויים להישמר ב-elution בתנאים מקומיים, מה שעלול להפריע לניסויים במורד הזרם. חלבונים ubiquitinated ניתן לטהר גם בנוכחות denaturants חזק, אשר מקטין מאוד חלבון לא ספציפי נקשר שרפים ניקל. לעומת זאת, ניתן לטהר את סך חלבוני המטרה, כולל צורותיהם הנמצאות בכל מקום, על ידי אסטרטגיות תיוג אפיטופיות באמצעות חרוזי אגרוז מצומדים לנוגדנים בתנאים שאינם משתנים. חלבונים טוהרו בתנאים פחות מחמירים מכיוון שבתהליך זה נעשה שימוש בטיהור זיקה בתיווך נוגדנים. חלבוני המטרה וצורותיהם המצוידות בכל מקום זוהו באמצעות נוגדנים ספציפיים לחלבון או ליוביקוויטין. חלבונים המתויגים HA ו- Myc יכולים להיות מטוהרים בנוחות באמצעות אותו הליך עם חרוזי אגרוז מצומדים לנוגדנים. יש לציין כי קל יותר לזהות חלבונים עם שרשראות מונוביקוויטין בודדות או מרובות מאשר חלבונים עם שרשראות פוליוביקוויטין עם נוגדנים ספציפיים לחלבון. לעומת זאת, חלבונים עם שרשראות פוליוביקוויטין יכולים להיות מזוהים בקלות רבה יותר על ידי נוגדנים ספציפיים ליוביקוויטין.
כדי לטהר ביעילות חלבונים הנמצאים בכל מקום, רמת הביטוי של חלבוני המטרה צריכה להיות גבוהה בתאי יונקים. ניתן להשתמש בווקטורים של ביטוי עם מקדמי CMV חזקים כדי להשיג רמות גבוהות של ביטוי חלבונים בתאים. בנוסף, יוביקוויטין ליגאז E3 ויוביקוויטין יכולים לבוא לידי ביטוי משותף עם חלבוני המטרה. הוא יוסיף יוביקוויטין מואטי בצורה יעילה יותר לחלבונים. הפעילות של פרוטאזום 26S יכולה להיחסם על ידי מעכב מולקולות קטנות על מנת לצבור חלבונים ubiquitinated בתאים. כדי לגרום לחלבונים הנמצאים בכל מקום להיקשר ביעילות לשרף, יש לנטרל את תמציות התאים לזמן קצר כדי לשבש את קומפלקס הדנ"א כדי להפוך את התמיסה ללא צמיגה. כדי להקטין את הכריכה הלא ספציפית, יש להוסיף ריכוז נמוך של אימידזול למאגר התזה בתנאי דנטורציה. חלבונים ubiquitinated עם משקל מולקולרי גבוה מאוד קל יותר לקשור עם שרף לאחר הליך denaturing ו refolding. על מנת להגדיל את היעילות של elution, לנסות להשתמש בריכוז גבוה יותר של imidazole. אם היעילות של אלוטיון עדיין הייתה נמוכה ביותר, נסו לחדד את החלבונים הנמצאים בכל מקום על ידי הרתחה ישירה במאגר הטעינה של SDS Laemmli. רוב החלבונים הנמצאים בכל מקום וקשורים לשרף יכולים להיות מחוברים במאגר דנטורינג חזק זה. כדי להשיג טוהר גבוה יותר של חלבונים הנמצאים בכל מקום, ניתן להתאים טיהור זיקה דו-שלבי. לאחר מיצוי חיסוני של Flag/M2 בתנאים שאינם מתכלים, ניתן להשתמש בטיהור שלב שני על ידי שרף טעון ניקל כדי למשוך למטה חלבון ubiquitinated המתויג שלו ולהיפטר ממצעים שאינם ubiquitinated. לעומת זאת, לאחר משיכת שרף טעון ניקל בתנאי דנטורציה, ניתן להתאים שלב טיהור זיקה שני כדי לזרז את חלבוני המטרה באמצעות אסטרטגיית תיוג האפיטופים על ידי חרוזי אגרוז מצומדים נגד פלאג או נוגדנים נגד HA.
השתמשנו באימונובלוטינג רגיש יותר במקום צביעת כסף או צביעת קומאסי כדי לזהות חלבונים הנמצאים בכל מקום, מכיוון שביצענו מחקר זה בקנה מידה קטן של טיהור. למעשה, למרות שחלק מהחלבונים התאיים נמצאים בקלות בכל מקום בתאים, רק חלק קטן מהחלבונים יכול להיות קשור עם יוביקוויטין מואיטי. כדי לזהות בהצלחה חלבונים אלה על ידי צביעת כסף או צביעת Coomassie, יש לבצע היקף גדול של טיהור. כדי להגדיל את הטוהר של חלבונים ubiquitinated, צעד שני טיהור זיקה צריך להיעשות גם. לא ביצענו את הניסויים האלה מאחר שחלבונים הנמצאים בכל מקום, המטוהרים באמצעות פרוטוקול זה, עונים לחלוטין על הדרישה של ניתוחים במורד הזרם. לדוגמה, כדי לזהות DUBs ספציפיים עבור חלבון מטרה המווסת על ידי יוביקוויטינציה, עלינו לטהר כמות גדולה של חלבוני מטרה הנמצאים בכל מקום. חלבונים אלה יכולים להיות דגירה עם DUBs בודדים מטוהרים מתאי יונקים במאגר deubiquitination. על ידי בדיקת תפוקה גבוהה במבחנה , אנו יכולים לזהות DUBs ספציפיים לחלבון מטרה בתאי יונקים.
ישנן מספר מגבלות של הטכניקה. חלבוני יוביקוויטין מהווים חלק קטן מאוד מחלבוני המטרה, קשה לטהר כמות גדולה של חלבוני מטרה ubiquitinated. נסו להגדיל את ביטוי החלבון בתאים על מנת להשיג יעילות טיהור גבוהה. חלופה אחרת היא לבצע תגובת יוביקוויטינציה במבחנה כדי לרכוש יותר חלבונים ubiquitinated. חלק מהחלבונים קשים לביטוי גבוה בתאי היונקים, מה שמציב מגבלה נוספת על טיהור כמויות גבוהות יותר של חלבונים הנמצאים בכל מקום. לבסוף, הפרוטוקול הנוכחי מוגבל לטיהור חלבונים מתויגים המתבטאים יתר על המידה באמצעות דנ"א פלסמיד. רמות הביטוי של חלבוני המטרה גבוהות מאלה של חלבוני המטרה האנדוגניים. כדי להעריך את מצב האוביקוויטינציה האנדוגנית של חלבון מטרה, החלבונים עם צורותיהם הנמצאות בכל מקום יכולים להיות חיסוניים ישירות על ידי נוגדנים ספציפיים לחלבון מטרה מתאים. ניתן להשתמש בנוגדנים נגד יוביקוויטין כדי לקבוע את מצב האוביקוויטינציה של חלבון המטרה. עם זאת, בנסיבות מסוימות, רמת הביטוי הנמוכה יותר, רמת האוביקוויטינציה הנמוכה יותר של חלבון המטרה, או היעילות החיסונית הנמוכה יותר של נוגדנים ספציפיים עשויים להגביל את זיהוי מצב האוביקוויטינציה של חלבוני המטרה האנדוגניים מתאי יונקים. הפרוטוקול הנוכחי עשוי לספק מערכת ניסיונית במקום זאת.
החלבון מדכא הגידול p53 ממלא תפקיד קריטי במניעת טרנספורמציה ממאירה של תאים נורמליים 8,9,10,11. היציבות של p53 מווסתת באופן הדוק על-ידי פירוק בתיווך יוביקוויטינציה בתאים. Mdm2 פועל כיוביקוויטין ליגאז E3 כדי לקדם p53 מונו ופוליוביקוויטינציה באופן תלוי מינון16. כאן, חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום טוהרו בתנאים של דנטורציה ואי-דנטורציה בתאי יונקים בנוכחות ביטוי יתר של Mdm2. חלבוני ה-p53 החד-יוביקוויטים זוהו באופן מועדף עם נוגדנים חד-שבטיים נגד p53, בעוד שהצורות הפוליוביקוויטינציה זוהו בקלות עם נוגדנים ספציפיים לאוביקוויטין. ניתן להגדיל ביעילות את רמות הצורות הפוליוביקוויטינות על ידי העלאת הביטוי של Mdm2 בתאים. מאמר זה מספק מערכת ניסויית אידיאלית להכנת חלבונים ubiquitinated על מנת להבהיר את התפקיד של ubiquitination בוויסות תפקוד החלבון. ניתן להשתמש בחלבונים הנמצאים ב-Ubiquitinated כדי לזהות DUBs ספציפיים עבור חלבון מטרה ולחשוף את התפקידים של סוגים שונים של שרשראות יוביקוויטין, לדוגמה, השרשראות המקושרות K48 ו-K63, באיתות. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור את התפקידים של יוביקוויטינציה באינטראקציה בין חלבון לחלבון ובהיווצרות קומפלקס חלבונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81972624) לד.ל.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-mercaptoethanol | Sangon Biotech | M6250 | |
| Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) | GE healthcare | NA931 | Secondary antibdoy |
| Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) | GE healthcare | NA935 | Secondary antibdoy |
| Anti-Flag M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | FLAG/M2 beads |
| Anti-GFP monocolonal antibody | Santa cruz | sc-9996 | Primary antibody |
| Anti-HA High Affinity | Roche | 11867423001 | Primary antibody |
| Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14) | Santa cruz | sc-965 | Primary antibody |
| Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1) | Santa cruz | sc-126 | Primary antibody |
| EDTA | Sigma-Alddich | E5134 | solvent |
| Fetal Bovine Serum | VivaCell | C04001-500 | FBS |
| FLAG Peptide | Sigma-Alddich | F3290 | Prepare elution buffer |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | supplement |
| Guanidine-HCI | Sangon Biotech | A100287-0500 | solvent |
| H1299 | Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences | ||
| Image Lab | Bio-rad | software | |
| Immidazole | Sangon Biotech | A500529-0100 | solvent |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| Lipofectamine 2000 reagents | Invitrogen | 11668019 | Transfection reagent |
| MG132 | MedChemExpress | HY-13259 | Proteasome inhibitor |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | solvent |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | solvent |
| NaF | Sigma-Alddich | 201154 | solvent |
| NaH2PO4 | Sangon Biotech | A501726-0500 | solvent |
| Ni-NTA Agarose | QIAGEN | 30230 | nickel-charged resin |
| Nitrocellulose Blotting membrane | GE healthcare | 10600002 | 0.45 µm pore size |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Transfection medium |
| PBS | Corning | 21-040-cv | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sangon Biotech | E607011-0100 | antibiotic |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| RPMI 1640 | Biological Industries | 01-100-1ACS | medium |
| Sarkosyl | Sigma-Alddich | L5777 | solvent |
| SDS Loading Buffer | Beyotime | P0015L | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | supplement |
| Tris-base | Sangon Biotech | A501492-0005 | solvent |
| Tris-HCI | Sangon Biotech | A610103-0250 | solvent |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A110694-0500 | reagent |
| Tween-20 | Sangon Biotech | A100777-0500 | supplement |
| Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System | Bio-rad | ChemiDoc XRS+ | |
| Urea | Sangon Biotech | A510907-0500 | solvent |
References
- Kwon, Y. T., Ciechanover, A. The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy. Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
- Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
- Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. J. Ubiquitin-binding domains - from structures to functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 659-671 (2009).
- Oh, E., Akopian, D., Rape, M.
- Clague, M. J., Urbe, S., Komander, D. Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).
- Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).
- Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J.
- Boutelle, A. M., Attardi, L. D. p53 and Tumor suppression: It takes a network. Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).
- Levine, A. J. p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery. Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).
- Vousden, K. H., Prives, C. Blinded by the light: The growing complexity of p53. Cell. 137 (3), 413-431 (2009).
- Brooks, C. L., Gu, W. p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond. Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).
- Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian. Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).
- Dobbelstein, M., Levine, A. J.
- Kulikov, R., et al. Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).
- Li, M., et al. Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2. Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).
- Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. Methods for the purification of ubiquitinated proteins. Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).
- Green, M., Sambrook, J. Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition). 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. 28 (2012).
