Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Oprensning af allestedsnærværende p53-proteiner fra pattedyrceller

Published: March 21, 2022 doi: 10.3791/63602
Automatic Translation
1, 1, 1
1Center for Translational Medicine, The Affiliated Zhangjiagang Hospital of Soochow University

Summary

Protokollen beskriver en trinvis metode til at rense allestedsnærværende proteiner fra pattedyrceller ved hjælp af p53 tumorundertrykkende protein som et eksempel. Ubiquitinerede p53-proteiner blev oprenset fra celler under strenge ikke-denaturerende og denaturerende betingelser.

Abstract

Ubiquitination er en type posttranslationel modifikation, der ikke kun regulerer stabiliteten, men også lokaliseringen og funktionen af et substratprotein. Ubiquitinationsprocessen forekommer intracellulært i eukaryoter og regulerer næsten alle grundlæggende cellulære biologiske processer. Oprensning af allestedsnærværende proteiner hjælper undersøgelsen af ubiquitinationens rolle i at kontrollere funktionen af substratproteiner. Her beskrives en trinvis procedure til oprensning af allestedsnærværende proteiner i pattedyrceller med p53 tumorundertrykkende protein som et eksempel. Ubiquitinerede p53-proteiner blev oprenset under strenge ikke-denaturerende og denaturerende betingelser. Total cellulær Flag-mærket p53-protein blev oprenset med anti-Flag antistofkonjugeret agarose under ikke-denaturerende forhold. Alternativt blev det samlede cellulære his-mærkede ubiquitinerede protein oprenset ved anvendelse af nikkelladet harpiks under denatureringsbetingelser. Ubiquitinerede p53-proteiner i eluaterne blev med succes påvist med specifikke antistoffer. Ved hjælp af denne procedure kan de allestedsnærværende former for et givet protein effektivt oprenses fra pattedyrceller, hvilket letter undersøgelser af ubiquitinationens roller i reguleringen af proteinfunktionen.

Introduction

Ubiquitin er et evolutionært konserveret protein af 76 aminosyrer 1,2,3. Ubiquitin binder kovalent lysinrester på målproteiner gennem kaskader, der involverer aktiverende (E1), konjugerende (E2) og ligase (E3) enzymer. Ubiquitin aktiveres først af E1-enzymet og overføres derefter til E2-konjugerende enzymer. Derefter interagerer E3 ubiquitin-ligaser med både ubiquitinbelastede E2-enzymer og substratproteiner og medierer dannelsen af en isopeptidbinding mellem C-terminalen af ubiquitin og en lysinrest i substratet 1,2,3,4,5. Ubiquitination involverer fastgørelse af ubiquitindele til lysinrester på substratproteiner eller til sig selv, hvilket fører til proteinmonoubiquitination eller polyubiquitination. Denne ubiquitinationsproces forekommer intracellulært i eukaryoter og regulerer en lang række biologiske processer. Ubiquitination resulterer i nedbrydning af substratproteiner via ubiquitin-proteasomsystemet 1,2,3,4,5. Derudover modulerer ubiquitination protein subcellulær lokalisering, proteinkompleksdannelse og proteinhandel i celler 3,5. Ubiquitindele, der er ligeret med substratproteiner, kan fjernes ved hjælp af deubiquitinerende enzymer (DUB'er)6,7. Især giver de forskellige måder, hvorpå ubiquitinkæder samles, et utal af midler til at regulere forskellige biologiske processer 1,5. De nøjagtige roller af ubiquitination i regulering af substratproteinfunktion forbliver ufuldstændigt forstået indtil nu. Oprensningen af ubiquitinerede proteiner bidrager til belysningen af virkningerne af protein ubiquitination på en række cellulære processer.

P53-proteinet er et af de vigtigste tumorundertrykkende proteiner og udviser genetiske mutationer eller inaktivering i næsten alle humane kræftformer 8,9,10,11. P53 stabilitet og aktivitet reguleres delikat in vivo ved posttranslationelle modifikationer, herunder ubiquitination, phosphorylering, acetylering og methylering12,13. P53-proteinet har en kort halveringstid på mellem 6 min og 40 min i forskellige celler, hvilket hovedsageligt skyldes dets polyubiquitination og efterfølgende proteasomal nedbrydning10,12. Mus dobbelt minut 2 (Mdm2) er en E3 ubiquitin ligase af p53, der binder til N-terminalen af p53 for at hæmme dens transkriptionelle aktivitet12,14,15. Mdm2 fremmer polyubiquitination og proteasomal nedbrydning af p53 for at kontrollere dens stabilitet og inducerer monoubiquitination af p53 for at lette sin nukleare eksport12,14,15,16. Her bruges Mdm2-medieret p53 ubiquitination som et eksempel til at introducere en metode til oprensning af allestedsnærværende proteiner fra pattedyrceller i detaljer. De regulatorer, der påvirker ubiquitinationsstatus for målproteiner, kan identificeres ved hjælp af dette in vivo ubiquitination assay, når de overudtrykkes eller slås ned / slås ud i pattedyrceller. Derudover kan ubiquitinerede proteiner anvendes som substrater til in vitro deubiquitination assay. En screening med høj kapacitet kan udføres for at identificere specifikke DUB'er for målproteiner ved at inkubere allestedsnærværende substrater med individuelle DUB'er. Ubiquitinerede proteiner kan fungere som et stillads for at rekruttere nedstrøms signalproteiner i celler. Et allestedsnærværende målproteinkompleks kan oprenses ved sekventiel immunoprecipitation under native oprensningsbetingelser og identificeres ved massespektrometri. Den nuværende protokol kan i vid udstrækning bruges til at undersøge de cellulære proteiner reguleret af ubiquitination.

Flere metoder er blevet etableret til at rense ubiquitinerede proteiner, som omfatter brugen af affinitetsmærkede ubiquitin, ubiquitinantistoffer, ubiquitinbindende proteiner og isolerede ubiquitinbindende domæner (UBD'er)17. Her leverer vi en protokol, der bruger affinitetsmærket ubiquitin som mediator til at rense allestedsnærværende proteiner i pattedyrceller. Brugen af poly-his-tagged ubiquitin giver fordele i forhold til de andre metoder. Ubiquitinerede proteiner oprenses i nærvær af stærke denatureringsmidler, hvilket reducerer ikke-specifik binding til nikkelladet harpiks ved linearisering af cellulære proteiner og forstyrrende protein-proteininteraktioner. I modsætning hertil kan brugen af ubiquitinantistoffer, ubiquitinbindende proteiner og isolerede UBD'er som mediatorer ikke effektivt udelukke bindende partnere fra målprotein, fordi oprensning skal udføres under mindre strenge betingelser. Desuden kan oprensning også føre til øget binding af ikke-relaterede proteiner ved anvendelse af disse mediatorer. Derudover er der en bindingstilbøjelighed til forskellige ubiquitinbindingstyper samt mono- og poly-ubiquitination ved ubiquitinbindende proteiner eller isolerede UBD'er17. Brugen af poly-his-tagged ubiquitin bidrager til at trække ned alle cellubiquitinerede proteiner. Alternativt gør brugen af kommercielt tilgængelig anti-Flag eller anti-HA antistofkonjugeret agarose det lettere at immunprecipitate store flag- eller HA-mærkede målproteiner under ikke-denaturerende forhold. Et andet oprensningstrin, for eksempel ved nikkelladet harpiks rettet mod poly-his-mærket ubiquitin, kan bruges til at erhverve ubiquitinerede målproteiner med en høj renhed til downstream-eksperimenter. Især kan en epitopmærkningsrensningsstrategi tilpasses, når et specifikt antistof ikke kan erhverves effektivt til immunoprecipitate målproteiner. Endelig bevarer oprensning af allestedsnærværende proteiner i pattedyrceller sammenlignet med oprensning in vitro ubiquitinbindingstilstanden for målproteiner under mere fysiologiske forhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: H1299-celler blev venligst leveret af Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences og viste sig at være negative for mycoplasma-forurening.

1. Cellekultur

  1. Til den indledende kultur placeres 1 x 106 celler af human lungeadenocarcinomcellelinje, H1299 i en 10 cm petriskål med 10-12 ml RPMI 1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% glutaminadditiv, 1% natriumpyruvat og antibiotika (100 U / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin). Cellerne holdes ved 37 °C i en befugtet inkubator med 5 % CO2. Opdel cellerne hver 2-3 dage afhængigt af hvornår de når 80% -90% sammenløb.
  2. En dag før transfektion tilberedes 6-9 x 10 6 celler til tre petriskåle og tallerken 2-3 x 106 celler i en enkelt 10 cm petriskål indeholdende 10-12 ml medium for at opnå en sammenløb på 70% -90% under transfekt.
    BEMÆRK: HEK293T-celler kan også bruges til at rense allestedsnærværende proteiner på grund af deres høje transfektionseffektivitet og proteinekspressionsniveau.

2. Plasmidtransfektion

  1. Der tilsættes 1,5 ml reduceret serummedium i tre 15 ml centrifugerør.
  2. Tilsæt plasmid-DNA klar til transfektion til hvert rør for at fremstille fortyndinger som følger. Rør 1: 1 μg Flag-p53 plasmid, 12 μg tom vektor; Rør 2: 1 μg Flag-p53 plasmid, 3 μg His-HA-Ub (HH-Ub) plasmid og 9 μg tom vektor; Rør 3: 1 μg Flag-p53 plasmid, 3 μg HH-Ub plasmid og 9 μg Mdm2 plasmid. Tilsæt i alt 0,2 μg grønt fluorescerende protein (GFP) plasmid til hvert rør for at overvåge transfektionseffektiviteten.
    BEMÆRK: Der skal udføres et pilotforsøg for at bestemme de optimale mængder plasmider, der er nødvendige for at opnå effektiv målproteinekspression i celler.
  3. Der tilsættes 78 μL liposomtransfektionsreagens til 4,5 ml reduceret serummedium i et andet centrifugerør for at fortynde liposomer. Bland grundigt ved at svirpe røret og lad det stå i 5 minutter ved stuetemperatur (RT).
  4. Der tilsættes 1,5 ml fortyndet liposomopløsning i hvert rør fra trin 2.2 indeholdende 1,5 ml fortyndet DNA-opløsning. Bland grundigt og tværbinding af plasmider med liposomerne i mindst 20 minutter ved RT. Brug et plasmid-DNA: liposomforhold på 1: 2 (μg: μL) for hver transfektion.
  5. Kassér det originale medium fra petriskålene og tilsæt 9 ml reduceret serummedium i hver skål. Tilsæt 3 ml liposom-DNA-blanding til hver skål og bland opløsningen ved forsigtigt at ryste pladen frem og tilbage 3x og derefter venstre og højre 3x for jævn fordeling af blandingen i pladen.
  6. Dyrkning af cellerne i en befugtet inkubator ved 37 °C med 5 % CO2. Udskift mediet efter 4-6 timer og fortsæt med at dyrke cellerne i 24-36 timer.

3. Celle indsamling

  1. Efter 24-36 timer behandles cellerne med MG132 i en endelig koncentration på 10 μM i 4-6 timer.
    BEMÆRK: MG132 er et peptidaldehyd, der effektivt blokerer den proteolytiske aktivitet af 26S proteasomkomplekset. Mængderne af proteiner, der er allestedsnærværende med lysin-48 (K48)-bundne polyubiquitinkæder, kan øges, efter at cellerne er behandlet med MG132 eller andre proteasomhæmmere.
  2. Kassér mediet, vask cellerne 2x (pas på ikke at skylle cellerne ud) med iskoldt fosfatbufferet saltvand (PBS), og opsug cellerne med serologiske pipetter.
  3. Tilsæt 1 ml PBS til skålen, fjern cellerne ved at skrabe med en ren skraber, og overfør cellesuspensionen til mikrocentrifugerør. Centrifuge ved 700 x g i 5 minutter for at samle cellepiller.

4. Oprensning af allestedsnærværende proteiner under ikke-denaturerende forhold

  1. Forbered Flag lysis buffer (50 mM Tris-HCI (pH 7,9), 137 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 1% Triton X-100, 0,2% sarkosyl og 10% glycerol) frisk suppleret med proteasehæmmercocktail før brug.
  2. Tilsæt 800 μL iskold flaglysisbuffer til cellerne i hvert rør, bland cellerne ved hjælp af en hvirveloscillator eller pipettepistol, og inkuber derefter blandingen på en rotator ved 4 °C i 30 min.
  3. Udsæt blandingen for 5-10 korte impulser af ultralydbehandling. Udfør ultralydbehandling på isen ved en sonikeringsfrekvens på 20 kHZ og 80% amplitude med hver puls, der varer i 1 s. Blandingen inkuberes på en rotator ved 40 omdrejninger i minuttet (omdr./min.) ved 4 °C i 30 min.
  4. Centrifuge de ultralydbehandlede prøver ved 8.000 x g i 20-30 minutter ved 4 °C. Overfør supernatanten til et nyt mikrocentrifugerør.
  5. Aliquot 80 μL (1/10) af celleekstraktet og blandes med 20 μL 5x natriumdodecylsulfat (SDS) belastningsbuffer. Prøverne koges ved 98 °C i 5 min., afkøles på is i 2 min., og opbevares ved -20 °C indtil brug. Brug disse prøver som inputgruppe til at overvåge proteinekspression.
  6. Der tilsættes 30 μL anti-Flag M2 antistofkonjugerede (Flag/M2) perler til de resterende celleekstrakter og inkuberes på en rotator ved 4 °C i mindst 4 timer eller natten over.
  7. Der centrifugeres ved 1.500 x g i 2 minutter ved 4 °C for at samle perlerne. Tilsæt 1 ml iskold flaglysisbuffer til perlerne og bland ved at vende røret flere gange.
  8. Der centrifugeres ved 1.500 x g i 2 minutter ved 4 °C for at samle perlerne. Gentag trin 4.7 i 4-6 gange.
  9. Der tilsættes 40 μL flagpeptider i en slutkoncentration på 200 ng/μL til perlerne, og der inkuberes på en rotator ved 4 °C i 2 timer for at eluere de bundne proteiner.
  10. Centrifuge ved 1.500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Overfør supernatanten til et nyt mikrocentrifugerør.
  11. Tilsæt 10 μL 5x SDS-påfyldningsbuffer, kog blandingen ved 98 °C i 5 min., afkøles på is i 2 min. og opbevares ved -20 °C til Western blotting. Alternativt kan eluatet opbevares fra trin 4.10 direkte ved -80 °C til andre downstream-eksperimenter.
    BEMÆRK: Mængden af oprensede allestedsnærværende proteiner kan skaleres op ved at øge antallet af celler og mængder af plasmider, der transfekteres. En epitop-mærkningsstrategi kan tilpasses til at rense cellulære komplekser, der binder specifikt til allestedsnærværende p53 under native rensningsbetingelser. Ved at co-udtrykke Flag-p53, mdm2 og HA-ubiquitin kan det allestedsnærværende p53-proteinkompleks immunprecipitateres af sekventiel Flag- og HA-antistofkonjugeret agarose fra pattedyrceller. For at holde bindingspartnere af allestedsnærværende p53-proteiner bør den mindre strenge BC100-lysisbuffer (20 mM Tris-HCI (pH 7,9), 100 mM NaCl, 10% glycerol, 0,2 mM EDTA, 0,2% Triton X-100 og 1x proteasehæmmer) anvendes under oprensningsprocessen. Eluatet fra HA-peptid udsættes for massespektrometri for at identificere alle partnere, der binder specifikt til allestedsnærværende p53.

5. Oprensning af allestedsnærværende proteiner under denatureringsbetingelser

  1. Der tilsættes 1 ml iskold PBS til de cellepiller, der opnås i trin 3.3, og blandes jævnt. Aliquot 100 μL (1/10 volumen) af cellesuspensionen i et mikrocentrifugerør som inputprøve.
  2. Centrifuge ved 700 x g i 5 minutter ved 4 °C for at opsamle cellepillerne. Tilsæt 80 μL flaglysisbuffer til inputprøven, bland cellerne ved hjælp af en hvirveloscillator eller pipettepistol, og lys cellerne på is i 1 time.
  3. Centrifuge ved 8.000 x g i 20-30 min ved 4 °C. Aliquot 80 μL af supernatanten i et nyt mikrocentrifugerør.
  4. Tilsæt 20 μL 5x SDS-påfyldningsbuffer til supernatanten, kog ved 98 °C i 5-10 min., afkøles på is i 2 min. og opbevares ved -20 °C indtil brug.
  5. De resterende 900 μL af cellesuspensionen centrifugeres ved 700 x g i 5 minutter ved 4 °C for at opsamle cellepelleten. Tilsæt 1 ml ubiquitinbuffer 1 (UB-buffer 1; 6 M guanidin-HCI, 0,1 M Na 2 HPO 4, 6,8 mM NaH 2 PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) og 0,2% Triton X-100, frisk suppleret med 10 mM β-mercaptoethanol og 5 mM imidazol) til cellepillerne og bland flere gange ved at pipettere op og ned for jævnt at fordele cellerne.
    BEMÆRK: Koncentrationen af imidazol kan variere fra 5 mM til 20 mM for at reducere uspecifik proteinbinding på den nikkelladede harpiks. Ubiquitinbuffer indeholder guanidinhydrochlorid, som inaktiverer både ligaser og DUB'er. β-mercaptoethanol er en klar, farveløs væske med en stærk, ubehagelig lugt svarende til rådne æg. En opløsning med høj koncentration vil forårsage alvorlig skade på slimhinden, øvre luftveje, hud og øjne. Brug handsker og beskyttelsesbriller og betjen i røghætten.
  6. Udsæt cellelysaterne for 10-20 runder ultralydbehandling, indtil opløsningen ikke længere er tyktflydende. Udfør ultralydbehandling på isen ved en sonikeringsfrekvens på 20 kHZ og 80% amplitude med hver puls, der varer i 1 s. Der centrifugeres ved 8.000 x g i 20-30 minutter ved RT, og supernatanten overføres til et nyt mikrocentrifugerør.
  7. Der tilsættes 30 μL nikkelladet harpiks til supernatanten, og der inkuberes på en rotator, der er indstillet til 15 o/min. i 4 timer eller natten over ved RT. Centrifuge ved 1.500 x g i 2 minutter ved RT for at opsamle perlerne.
  8. Tilsæt 1 ml UB-buffer 1, inkuber med rotation i en shaker i 10 minutter ved RT, og centrifuge ved 1.500 x g i 2 minutter ved RT for at samle perlerne.
  9. Tilsæt 1 ml ubiquitinbuffer 2 (UB-buffer 2; 8 M urinstof, 0,1 M Na 2 HPO 4, 6,8 mM NaH 2 PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) og 0,2% Triton X-100) til perlerne, inkuberes med rotation i en ryster i 10 minutter ved RT, og centrifuge ved 1.500 x g i 2minutter for at samle perlerne. Gentag dette endnu en gang.
  10. Til perlerne tilsættes 1 ml PBS, inkuberes med rotation i en shaker i 10 minutter ved RT og centrifuge ved 1.500 x g i 2 minutter ved RT for at opsamle perlerne. Gentag dette endnu en gang.
  11. Elutebundne proteiner ved at inkubere perlerne med 40 μL imidazol i en slutkoncentration på 0,5 M i 1 time ved RT. Centrifuge ved 1.500 x g i 2 minutter ved RT.
  12. Overfør supernatanten til et rent mikrocentrifugerør, tilsæt 10 μL 5x SDS-påfyldningsbuffer, kog ved 98 °C i 5 minutter, afkøles på is i 2 min. og opbevares ved -20 °C til Western blotting. Alternativt opbevares det uforarbejdede eluat ved -80 °C til andre downstream-eksperimenter.

6. Påvisning af oprensede ubiquitinerede proteiner ved Western blotting

  1. Prøverne fra trin 4.11 og 5.12 ved natriumdodecylsulfatpolyacrylmidgelelektroforese (SDS-PAGE) afhjælpes, og overfør dem derefter til en nitrocellulosemembran ved Western blotting for at detektere målproteiner ved hjælp af de tilsvarende antistoffer som beskrevet18.
  2. Kort sagt inkuberes membranen ved at nedsænke i 20 ml blokerende opløsning indeholdende 5% defat mælkepulver i TBST-buffer (15 mM Tris-HCI; pH = 7,6, 4,6 mM Tris-base, 150 mM NaCI, frisk suppleret med 0,1% Tween-20 før brug) ved RT i 1 time. Derefter inkuberes membranen med primære antistoffer ved RT i 2 timer eller natten over ved 4 °C. Brug følgende antistoffer til hvert sæt. Alle primære antistoffer blev anvendt ved en fortynding på 1:1000.
    1. Detekter total p53-protein, herunder allestedsnærværende p53, med et anti-p53 monoklonalt antistof efter immunoprecipitation med Flag / M2 agaroseperler.
    2. Detekter allestedsnærværende p53-proteiner med et anti-HA-antistof eller anti-ubiquitin-antistof efter immunoprecipitation med Flag/M2-agaroseperler.
    3. Detekter allestedsnærværende p53-proteiner med et anti-p53 monoklonalt antistof efter nikkelladet harpiksudtrækning.
    4. Detekter totalt ubiquitineret protein med et anti-HA-antistof eller anti-ubiquitin-antistof efter nikkelladet harpiksudtrækning.
  3. Inkubere membranen med peberrodsperoxidase (HRP)-konjugerede sekundære antistoffer ved RT i 1 time efter vask 3x med TBST-buffer i 5 minutter hver. Alle sekundære antistoffer blev anvendt ved en fortynding på 1:3000. Vask derefter membranen med TBST-buffer 3x i 5 minutter hver med blid omrøring.
  4. Start kemiluminescensbilleddannelsessystem for at detektere signaler fra Western blotting. Substratopløsningen til HRP fremstilles ved at blande opløsning A og B i forholdet 1:1.
  5. Placer nitrocellulosemembranen i camera obscura med forsiden opad, og belæg substratopløsningen jævnt på membranen ved hjælp af en pipetteringspistol. Vælg den automatiske eksponeringsprocedure for at fange kemiluminescerende signaler, og juster eksponeringstiden manuelt, indtil der opnås et ideelt signal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det skematiske diagram viser de flagmærkede p53 (Flag-p53) og his/HA dobbeltmærkede ubiquitin (HH-Ub) proteiner (figur 1A). De procedurer, der anvendes til at rense allestedsnærværende proteiner, er opsummeret i figur 1B. Poly-His-tagged ubiquitin kan ligeres til at målrette proteiner i pattedyrceller. Ubiquitinerede proteiner kan renses med Flag/M2 perler under ikke-denaturerende forhold eller ved immobiliseret metalionaffinitetskromatografi (IMAC) under denatureringsbetingelser (figur 1B). Total p53-protein, herunder allestedsnærværende p53, blev immunpræciperet med Flag/M2-perler fra H1299-celler under ikke-denaturerende forhold. Signalet fra ubiquitineret p53-protein, der fremstår som et udtværet bånd fra lav til høj molekylvægt, blev markant øget, da Mdm2 blev ekskopisk udtrykt i disse celler, hvilket tyder på, at ubiquitineret p53-protein er blevet effektivt oprenset fra celler (figur 2). Derefter blev cellerne lyset under denaturerende forhold, og total cellubiquitineret protein blev trukket ned med nikkelladet harpiks. Total cellulært protein blev påvist ved Western blotting ved anvendelse af et anti-HA monoklonalt antistof, og ubiquitineret p53-protein blev påvist ved anvendelse af et anti-p53 monoklonalt antistof. Resultaterne viste, at det samlede ubiquitinerede proteinniveau var uændret, men det allestedsnærværende p53-proteinniveau blev dramatisk øget, efter at Mdm2 blev overudtrykt i disse celler. Disse resultater viste, at total ubiquitinproteiner indeholdende ubiquitineret p53 effektivt blev trukket ned fra cellelysater under denatureringsbetingelser (figur 3).

Figure 1
Figur 1: Et resumé af de procedurer, der anvendes til at rense allestedsnærværende proteiner. (A) Skematisk diagram over flagmærkede p53 (Flag-p53) og his/HA dobbeltmærkede ubiquitin (HH-Ub) proteiner. (B) Ubiquitinerede proteiner kan renses med Flag/M2 perler under ikke-denaturerende forhold og af IMAC under denatureringsbetingelser. Forkortelser: His/HA = polyhistidin/hæmagglutinin; Ub = ubiquitin; Flag/M2 perler = anti-Flag M2 antistofkonjugerede perler; IMAC = immobiliseret metalionaffinitetskromatografi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Ubiquitinerede p53-proteiner blev oprenset under ikke-denaturerende forhold. Flag-p53-ekspressionsplasmidet blev transficeret alene med HH-Ub eller med Mdm2 og HH-Ub til H1299-celler. De samlede p53-proteiner og allestedsnærværende former blev immunpræciperet af Flag/M2-perler fra celleekstrakter. Eluatet blev udsat for Western blotting med anti-p53 (A) og anti-HA (B) monoklonale antistoffer. (C) De rå celleekstrakter (Input) blev udsat for Western blotting med anti-p53 og anti-Mdm2 monoklonale antistoffer. GFP blev brugt som lastekontrol. Forkortelser: HH-Ub = Hans / HA dobbeltmærket ubiquitin; HA = hæmagglutinin; Flag/M2 perler = anti-Flag M2 antistofkonjugerede perler; GFP = grønt fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Ubiquitinerede p53-proteiner blev oprenset under denatureringsbetingelser. Flag-p53-ekspressionsplasmidet blev transficeret alene med HH-Ub eller med Mdm2 og HH-Ub til H1299-celler. De samlede cellubiquitinerede proteiner blev trukket ned med nikkelladet harpiks og blev derefter udsat for Western blotting med anti-p53 og anti-HA monoklonale antistoffer. (A) Ubiquitineret p53-protein blev påvist ved anvendelse af et anti-p53-antistof. (B) Total ubiquitineret protein blev påvist ved anvendelse af et anti-HA-antistof. (C) De rå celleekstrakter (Input) blev udsat for Western blotting med anti-p53 og anti-Mdm2 monoklonale antistoffer. GFP blev brugt som lastekontrol. Forkortelser: HH-Ub = Hans / HA dobbeltmærket ubiquitin; HA = hæmagglutinin; GFP = grønt fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ubiquitination spiller en kritisk rolle i næsten alle fysiologiske og patologiske cellulære processer2. I de senere år er der gjort store fremskridt med at forstå ubiquitins molekylære rolle i signalveje, og hvordan ændringer i ubiquitinsystemet fører til forskellige menneskelige sygdomme2. Oprensningen af allestedsnærværende proteiner bidrager til at give indsigt i de nøjagtige roller af ubiquitination i disse processer. Blandingerne af ubiquitinkonjugerede proteiner kan oprenses fra celler under ikke-denaturerende og denaturerende forhold. IMAC ved hjælp af nikkelharpikser kan bruges til at rense poly-his-mærkede proteiner under denatureringsbetingelser. Målet med at rense allestedsnærværende proteiner under denatureringsbetingelser er at kassere interaktionspartnerne fra målproteiner. Alle cellulære komponenter, der binder til målproteinerne, slettes fra elueringen under denatureringsbetingelser. I modsætning hertil kan nogle cellulære proteiner, der binder til målproteiner, opbevares i elutionen under indfødte forhold, hvilket kan forstyrre downstream-eksperimenterne. Ubiquitinerede proteiner kan oprenses selv i nærværelse af stærke denatureringsmidler, hvilket i høj grad reducerer uspecifik proteinbinding til nikkelharpikser. I modsætning hertil kan de samlede målproteiner, herunder deres allestedsnærværende former, oprenses ved epitopmærkningsstrategier ved anvendelse af antistofkonjugerede agaroseperler under ikke-denaturerende forhold. Proteiner blev oprenset under mindre strenge betingelser, fordi antistofmedieret affinitetsrensning blev anvendt under denne proces. Målproteinerne og deres allestedsnærværende former blev påvist med protein- eller ubiquitinspecifikke antistoffer. HA- og Myc-mærkede proteiner kan bekvemt oprenses ved hjælp af samme procedure med antistofkonjugerede agaroseperler. Især er det lettere at detektere proteiner med enkelte eller flere monoubiquitinkæder end dem med polyubiquitinkæder med proteinspecifikke antistoffer. I modsætning hertil kan proteiner med polyubiquitinkæder lettere genkendes af ubiquitinspecifikke antistoffer.

For effektivt at rense allestedsnærværende proteiner bør ekspressionsniveauet for målproteiner være højt i pattedyrceller. Ekspressionsvektorer med stærke CMV-promotorer kan bruges til at opnå høje niveauer af proteinekspression i celler. Derudover kan E3 ubiquitin ligase og ubiquitin udtrykkes sammen med målproteinerne. Det vil tilføje ubiquitin dele mere effektivt til proteinerne. Aktiviteten af 26S proteasom kan blokeres af småmolekylehæmmer for at akkumulere allestedsnærværende proteiner i celler. For at gøre allestedsnærværende proteiner effektivt bindende til harpiksen, bør celleekstrakter kortvarigt sonikeres for at forstyrre DNA-komplekset for at gøre opløsningen ikke-viskøs. For at mindske ikke-specifik binding bør der tilsættes en lav koncentration af imidazol til lysisbufferen under denatureringsbetingelser. De allestedsnærværende proteiner med meget høj molekylvægt er lettere at binde med harpiksen efter denaturerings- og refoldningsproceduren. For at øge effektiviteten af elution, prøv at anvende en højere koncentration af imidazol. Hvis elutionens effektivitet stadig var ekstremt lav, skal du prøve at elulutere de allestedsnærværende proteiner ved direkte kogning i SDS Laemmli loading buffer. De fleste af allestedsnærværende proteiner bundet til harpiksen kan eluluteres i denne stærke denatureringsbuffer. For at opnå en højere renhed af allestedsnærværende proteiner kan en to-trins affinitetsoprensning tilpasses. Efter Flag / M2 immunoprecipitation under ikke-naturerende forhold kan en anden trins oprensning med nikkelladet harpiks bruges til at trække ned his-mærket ubiquitineret protein og slippe af med ikke-allestedsnærværende substrater. I modsætning hertil kan et andet affinitetsrensningstrin efter nikkelladet harpiksudtrækning under denatureringstilstand tilpasses til immunprecipitatering af målproteinerne ved hjælp af epitopmærkningsstrategien ved anti-Flag eller anti-HA-antistofkonjugerede agaroseperler.

Vi har brugt mere følsom immunblotting i stedet for sølvfarvning eller Coomassie-farvning til at detektere allestedsnærværende proteiner, fordi vi udførte en lille skala af oprensning i denne undersøgelse. Faktisk, selvom nogle cellulære proteiner let er allestedsnærværende i celler, kan kun en lille del af proteinerne ligeres med ubiquitindele. For at kunne detektere disse proteiner ved sølvfarvning eller Coomassie-farvning, bør der udføres en stor grad af oprensning. For at øge renheden af allestedsnærværende proteiner bør der også udføres et andet affinitetsrensningstrin. Vi udførte ikke disse eksperimenter, fordi allestedsnærværende proteiner oprenset gennem denne protokol fuldstændigt opfylder kravet om downstream-analyser. For eksempel for at identificere specifikke DUB'er for et målprotein reguleret af ubiquitination, er vi nødt til at rense en stor mængde allestedsnærværende målproteiner. Disse proteiner kan inkuberes med individuelle DUB'er oprenset fra pattedyrceller i en deubiquitinationsbuffer. Ved denne in vitro-screening med høj kapacitet kan vi identificere DUB'er, der er specifikke for et målprotein i pattedyrceller.

Der er flere begrænsninger i teknikken. De allestedsnærværende proteiner tegner sig for en meget lille del af målproteinerne, det er vanskeligt at rense en stor mængde allestedsnærværende målproteiner. Prøv at opskalere proteinekspressionen i celler for at opnå høj oprensningseffektivitet. Et alternativ er at udføre en in vitro ubiquitination reaktion for at erhverve mere allestedsnærværende proteiner. Nogle proteiner er vanskelige at udtrykke højt i pattedyrcellerne, hvilket sætter en anden begrænsning på at rense større mængder af allestedsnærværende proteiner. Endelig er den nuværende protokol begrænset til oprensning af mærkede proteiner, der overudtrykkes ved anvendelse af plasmid-DNA. Ekspressionsniveauerne for målproteinerne er højere end for de endogene målproteiner. For at vurdere den endogene ubiquitinationsstatus for et målprotein kan proteinerne med deres allestedsnærværende former direkte immunprecipitateres af målproteinspecifikke antistoffer fra celler. Anti-ubiquitinantistoffer kan bruges til at bestemme målproteinets ubiquitinationsstatus. Under visse omstændigheder kan det lavere ekspressionsniveau, det lavere ubiquitinationsniveau for målproteinet eller den lavere immunprecipitationseffektivitet af specifikke antistoffer imidlertid begrænse påvisningen af ubiquitinationsstatus for de endogene målproteiner fra pattedyrceller. Den nuværende protokol kan give et eksperimentelt system i stedet.

P53 tumorundertrykkende protein spiller en kritisk rolle i at forhindre ondartet transformation af normale celler 8,9,10,11. Stabiliteten af p53 er tæt reguleret af ubiquitination-medieret nedbrydning i celler. Mdm2 fungerer som en E3 ubiquitin ligase for at fremme p53 mono- og polyubiquitination på en dosisafhængig måde16. Her blev allestedsnærværende p53-proteiner oprenset under denaturerende og ikke-denaturerende forhold i pattedyrceller i nærvær af Mdm2-overekspression. De monoubiquitinerede p53-proteiner blev fortrinsvis påvist med anti-p53 monoklonale antistoffer, mens de polyubiquitinerede former let blev påvist med ubiquitinspecifikke antistoffer. Niveauerne af polyubiquitinerede former kan effektivt øges ved at hæve ekspressionen af Mdm2 i celler. Dette papir giver et ideelt eksperimentelt system til fremstilling af ubiquitinerede proteiner for at belyse ubiquitinationens rolle i modulerende proteinfunktion. Ubiquitinerede proteiner kan bruges til at identificere specifikke DUB'er for et målprotein og til at afsløre rollerne for forskellige typer ubiquitinkæder, for eksempel de K48- og K63-bundne kæder, i signalering. Denne protokol kan bruges til at undersøge ubiquitinationens roller i protein-proteininteraktion og proteinkompleksdannelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra National Natural Science Foundation of China (81972624) til D.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
β-mercaptoethanol Sangon Biotech M6250
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) GE healthcare NA931 Secondary antibdoy
Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) GE healthcare NA935 Secondary antibdoy
Anti-Flag M2 Affinity Gel Sigma-Aldrich A2220 FLAG/M2 beads
Anti-GFP monocolonal antibody Santa cruz sc-9996 Primary antibody
Anti-HA High Affinity Roche 11867423001 Primary antibody
Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14) Santa cruz sc-965 Primary antibody
Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1) Santa cruz sc-126 Primary antibody
EDTA Sigma-Alddich E5134 solvent
Fetal Bovine Serum VivaCell C04001-500 FBS
FLAG Peptide Sigma-Alddich F3290 Prepare elution buffer
GlutaMAX Gibco 35050-061 supplement
Guanidine-HCI Sangon Biotech A100287-0500 solvent
H1299 Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences
Image Lab Bio-rad software
Immidazole Sangon Biotech A500529-0100 solvent
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate Millipore WBKLS0500
Lipofectamine 2000 reagents Invitrogen 11668019 Transfection reagent
MG132 MedChemExpress HY-13259 Proteasome inhibitor
Na2HPO4 Sangon Biotech A501727-0500 solvent
NaCl Sangon Biotech A610476-0005 solvent
NaF Sigma-Alddich 201154 solvent
NaH2PO4 Sangon Biotech A501726-0500 solvent
Ni-NTA Agarose QIAGEN 30230 nickel-charged resin
Nitrocellulose Blotting membrane GE healthcare 10600002 0.45 µm pore size
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985-070 Transfection medium
PBS Corning 21-040-cv
Penicillin-Streptomycin Solution Sangon Biotech E607011-0100 antibiotic
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340
RPMI 1640 Biological Industries 01-100-1ACS medium
Sarkosyl Sigma-Alddich L5777 solvent
SDS Loading Buffer Beyotime P0015L
Sodium Pyruvate Gibco 11360-070 supplement
Tris-base Sangon Biotech A501492-0005 solvent
Tris-HCI Sangon Biotech A610103-0250 solvent
Triton X-100 Sangon Biotech A110694-0500 reagent
Tween-20 Sangon Biotech A100777-0500 supplement
Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System Bio-rad ChemiDoc XRS+
Urea Sangon Biotech A510907-0500 solvent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kwon, Y. T., Ciechanover, A. The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy. Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).
  2. Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
  3. Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
  4. Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. J. Ubiquitin-binding domains - from structures to functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 659-671 (2009).
  5. Oh, E., Akopian, D., Rape, M. Principles of ubiquitin-dependent signaling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 137-162 (2018).
  6. Clague, M. J., Urbe, S., Komander, D. Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).
  7. Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).
  8. Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J. Surfing the p53 network. Nature. 408 (6810), 307-310 (2000).
  9. Boutelle, A. M., Attardi, L. D. p53 and Tumor suppression: It takes a network. Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).
  10. Levine, A. J. p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery. Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).
  11. Vousden, K. H., Prives, C. Blinded by the light: The growing complexity of p53. Cell. 137 (3), 413-431 (2009).
  12. Brooks, C. L., Gu, W. p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond. Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).
  13. Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian. Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).
  14. Dobbelstein, M., Levine, A. J. Mdm2: Open questions. Cancer Science. 111 (7), 2203-2211 (2020).
  15. Kulikov, R., et al. Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).
  16. Li, M., et al. Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2. Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).
  17. Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. Methods for the purification of ubiquitinated proteins. Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).
  18. Green, M., Sambrook, J. Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition). 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. 28 (2012).

Tags

Biokemi udgave 181
Oprensning af allestedsnærværende p53-proteiner fra pattedyrceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, D., He, M., Li, D. Purification… More

Wu, D., He, M., Li, D. Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (181), e63602, doi:10.3791/63602 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter