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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Purification des protéines p53 ubiquitinées à partir de cellules de mammifères

Published: March 21, 2022 doi: 10.3791/63602
Automatic Translation
1, 1, 1
1Center for Translational Medicine, The Affiliated Zhangjiagang Hospital of Soochow University

Summary

Le protocole décrit une méthode étape par étape pour purifier les protéines ubiquitinées à partir de cellules de mammifères en utilisant la protéine suppresseur de tumeur p53 comme exemple. Les protéines p53 ubiquitinées ont été purifiées à partir de cellules dans des conditions strictes de non-dénaturation et de dénaturation.

Abstract

L’ubiquitination est un type de modification post-traductionnelle qui régule non seulement la stabilité, mais aussi la localisation et la fonction d’une protéine substrat. Le processus d’ubiquitination se produit intracellulaire chez les eucaryotes et régule presque tous les processus biologiques cellulaires de base. La purification des protéines ubiquitinées aide à étudier le rôle de l’ubiquitination dans le contrôle de la fonction des protéines substrat. Ici, une procédure étape par étape pour purifier les protéines ubiquitinées dans les cellules de mammifères est décrite avec la protéine suppresseur de tumeur p53 à titre d’exemple. Les protéines p53 ubiquitinées ont été purifiées dans des conditions strictes de non-dénaturation et de dénaturation. La protéine p53 totale marquée au drapeau cellulaire a été purifiée avec de l’agarose conjuguée à l’anticorps anti-drapeau dans des conditions non dénaturantes. Alternativement, la protéine ubiquitinée totale marquée His cellulaire a été purifiée à l’aide de résine chargée de nickel dans des conditions de dénaturation. Les protéines p53 ubiquitinées dans les éluats ont été détectées avec succès avec des anticorps spécifiques. En utilisant cette procédure, les formes ubiquitinées d’une protéine donnée peuvent être efficacement purifiées à partir de cellules de mammifères, facilitant ainsi les études sur les rôles de l’ubiquitination dans la régulation de la fonction protéique.

Introduction

L’ubiquitine est une protéine conservée au cours de l’évolution de 76 acides aminés 1,2,3. L’ubiquitine se lie de manière covalente aux résidus de lysine sur les protéines cibles par des cascades impliquant des enzymes activatrices (E1), conjuguées (E2) et ligases (E3). L’ubiquitine est d’abord activée par l’enzyme E1, puis transférée aux enzymes conjuguées E2. Par la suite, E3 ubiquitin ligases interagit à la fois avec les enzymes E2 chargées d’ubiquitine et les protéines de substrat et médie la formation d’une liaison isopeptidique entre le C-terminal de l’ubiquitine et un résidu de lysine dans le substrat 1,2,3,4,5. L’ubiquitination implique la fixation de fractions ubiquitine à des résidus de lysine sur des protéines substrats ou à elle-même, conduisant à une monoubiquitination ou une polyubiquitination des protéines. Ce processus d’ubiquitination se produit intracellulaire chez les eucaryotes et régule une grande variété de processus biologiques. L’ubiquitination entraîne la dégradation des protéines du substrat via le système ubiquitine-protéasome 1,2,3,4,5. De plus, l’ubiquitination module la localisation subcellulaire des protéines, la formation de complexes protéiques et le trafic de protéines dans les cellules 3,5. Les fractions ubiquitine ligaturées sur les protéines substrat peuvent être éliminées par des enzymes déubiquitinantes (DUB)6,7. Notamment, les différentes façons dont les chaînes ubiquitines sont assemblées fournissent une myriade de moyens pour réguler divers processus biologiques 1,5. Les rôles exacts de l’ubiquitination dans la régulation de la fonction des protéines du substrat restent incomplètement compris jusqu’à présent. La purification des protéines ubiquitinées contribue à l’élucidation des effets de l’ubiquitination des protéines sur une variété de processus cellulaires.

La protéine p53 est l’une des protéines suppressrices de tumeurs les plus importantes et présente des mutations génétiques ou une inactivation dans presque tous les cancers humains 8,9,10,11. La stabilité et l’activité de P53 sont délicatement régulées in vivo par des modifications post-traductionnelles, y compris l’ubiquitination, la phosphorylation, l’acétylation et la méthylation12,13. La protéine p53 a une demi-vie courte allant de 6 min à 40 min dans diverses cellules, ce qui résulte principalement de sa polyubiquitination et de sa dégradation protéasomale ultérieure10,12. La souris double minute 2 (Mdm2) est une ubiquitine ligase E3 de p53 qui se lie à l’extrémité N de p53 pour inhiber son activité transcriptionnelle12,14,15. Mdm2 favorise la polyubiquitination et la dégradation protéasomale de p53 pour contrôler sa stabilité et induit une monoubiquitination de p53 pour faciliter son exportation nucléaire12,14,15,16. Ici, l’ubiquitination p53 médiée par Mdm2 est utilisée comme exemple pour introduire une méthode de purification des protéines ubiquitinées à partir de cellules de mammifères en détail. Les régulateurs qui influencent le statut d’ubiquitination des protéines cibles peuvent être identifiés à l’aide de ce test d’ubiquitination in vivo lorsqu’ils sont surexprimés ou renversés / assommés dans des cellules de mammifères. En outre, les protéines ubiquitinées peuvent être utilisées comme substrats pour le test de déubiquitination in vitro. Un criblage à haut débit peut être effectué pour identifier des DUB spécifiques pour les protéines cibles en incubant des substrats ubiquitinés avec des DUB individuels. Les protéines ubiquitinées peuvent agir comme un échafaudage pour recruter des protéines de signalisation en aval dans les cellules. Un complexe protéique cible ubiquitiné peut être purifié par immunoprécipitation séquentielle dans des conditions de purification natives et identifié par spectrométrie de masse. Le protocole actuel peut être largement utilisé pour étudier les protéines cellulaires régulées par ubiquitination.

Plusieurs méthodes ont été établies pour purifier les protéines ubiquitinées, notamment l’utilisation d’ubiquitine marquée par affinité, d’anticorps ubiquitine, de protéines de liaison à l’ubiquitine et de domaines isolés de liaison à l’ubiquitine (UBD)17. Ici, nous fournissons un protocole utilisant l’ubiquitine marquée par affinité comme médiateur pour purifier les protéines ubiquitinées dans les cellules de mammifères. L’utilisation de l’ubiquitine poly-marquée offre des avantages par rapport aux autres méthodes. Les protéines ubiquitinées sont purifiées en présence de dénaturants puissants, ce qui réduit la liaison non spécifique à la résine chargée de nickel en linéarisant les protéines cellulaires et en perturbant les interactions protéine-protéine. En revanche, l’utilisation d’anticorps ubiquitine, de protéines de liaison à l’ubiquitine et d’UBD isolés comme médiateurs ne peut pas exclure efficacement les partenaires de liaison de la protéine cible, car la purification doit être effectuée dans des conditions moins strictes. De plus, la purification peut également conduire à une liaison accrue de protéines non apparentées à l’aide de ces médiateurs. De plus, il existe une propension à se lier à divers types de liaison ubiquitine ainsi qu’à la mono- et poly-ubiquitination par des protéines de liaison à l’ubiquitine ou des UBD isolés17. L’utilisation de l’ubiquitine poly-marquée contribue à abattre toutes les protéines cellulaires ubiquitinées. Alternativement, l’utilisation d’agarose conjuguée anti-Flag ou anti-HA disponible dans le commerce facilite l’immunoprécipitation de protéines cibles marquées Flag ou HA à grande échelle dans des conditions non dénaturantes. Une deuxième étape de purification, par exemple, par résine chargée de nickel ciblant l’ubiquitine marquée poly-His, peut être utilisée pour acquérir des protéines cibles ubiquitinées d’une grande pureté pour des expériences en aval. Notamment, une stratégie de purification du marquage des épitopes peut être adaptée lorsqu’un anticorps spécifique ne peut pas être acquis pour immunoprécipiter efficacement les protéines cibles. Enfin, la purification des protéines ubiquitinées dans les cellules de mammifères, en comparaison avec la purification in vitro, conserve le mode de liaison ubiquitine des protéines cibles dans des conditions plus physiologiques.

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Protocol

REMARQUE: Les cellules H1299 ont été aimablement fournies par la Banque de cellules souches de l’Académie chinoise des sciences et se sont révélées négatives pour la contamination par les mycoplasmes.

1. Culture cellulaire

  1. Pour la culture initiale, placer 1 x 106 cellules de lignée cellulaire d’adénocarcinome pulmonaire humain, H1299 dans une boîte de Petri de 10 cm avec 10-12 mL de milieu RPMI 1640 complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 1% d’additif glutamine, 1% de pyruvate de sodium et des antibiotiques (100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine). Maintenir les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO2. Divisez les cellules tous les 2-3 jours selon le moment où elles atteignent 80% à 90% de confluence.
  2. Un jour avant la transfection, préparer 6-9 x 10 6 cellules pour trois boîtes de Petri et plaquer 2-3 x 106 cellules dans une seule boîte de Petri de 10 cm contenant 10-12 ml de milieu pour obtenir une confluence de 70%-90% pendant la transfection.
    REMARQUE: Les cellules HEK293T peuvent également être utilisées pour purifier les protéines ubiquitinées en raison de leur efficacité de transfection élevée et de leur niveau d’expression protéique.

2. Transfection plasmidique

  1. Ajouter 1,5 mL de milieu sérique réduit dans trois tubes centrifugés de 15 mL.
  2. Ajouter l’ADN plasmidique prêt pour la transfection dans chaque tube pour faire les dilutions comme suit. Tube 1 : 1 μg de plasmide Flag-p53, 12 μg de vecteur vide ; Tube 2 : 1 μg de plasmide Flag-p53, 3 μg de plasmide His-HA-Ub (HH-Ub) et 9 μg de vecteur vide ; Tube 3 : 1 μg de plasmide Flag-p53, 3 μg de plasmide HH-Ub et 9 μg de plasmide Mdm2. Ajouter un total de 0,2 μg de plasmide de protéine fluorescente verte (GFP) à chaque tube pour surveiller l’efficacité de la transfection.
    NOTE: Une expérience pilote doit être effectuée pour déterminer les quantités optimales de plasmides nécessaires pour obtenir une expression efficace des protéines cibles dans les cellules.
  3. Ajouter 78 μL de réactif de transfection des liposomes à 4,5 mL de milieu sérique réduit dans un autre tube de centrifugation pour diluer les liposomes. Bien mélanger en agitant le tube et laisser reposer pendant 5 min à température ambiante (RT).
  4. Ajouter 1,5 mL de la solution de liposomes diluée dans chaque tube de l’étape 2.2 contenant 1,5 mL de la solution d’ADN dilué. Bien mélanger et réticuler les plasmides avec les liposomes pendant au moins 20 minutes à TA. Utilisez un rapport ADN plasmidique: liposome de 1:2 (μg:μL) pour chaque transfection.
  5. Jeter le milieu original des boîtes de Petri et ajouter 9 ml de milieu sérique réduit dans chaque boîte. Ajouter 3 mL du mélange liposome-ADN à chaque plat et mélanger la solution en secouant doucement la plaque d’avant en arrière 3x, puis à gauche et à droite 3x pour une répartition uniforme du mélange dans la plaque.
  6. Culture des cellules dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5% de CO2. Remplacez le milieu après 4-6 h et continuez à cultiver les cellules pendant 24-36 h.

3. Collecte de cellules

  1. Après 24-36 h, traiter les cellules avec MG132 à une concentration finale de 10 μM pendant 4-6 h.
    REMARQUE: MG132 est un aldéhyde peptidique qui bloque efficacement l’activité protéolytique du complexe protéasome 26S. Les quantités de protéines ubiquitinées avec des chaînes de polyubiquitine liées à la lysine-48 (K48) peuvent être augmentées après que les cellules sont traitées avec MG132 ou d’autres inhibiteurs du protéasome.
  2. Jeter le milieu, laver les cellules 2x (en prenant soin de ne pas rincer les cellules) avec une solution saline tamponnée au phosphate glacé (PBS) et aspirer les cellules avec des pipettes sérologiques.
  3. Ajouter 1 mL de PBS à la boîte, retirer les cellules en grattant avec un grattoir propre et transférer la suspension cellulaire dans des tubes de microcentrifugation. Centrifuger à 700 x g pendant 5 min pour recueillir les pastilles cellulaires.

4. Purification des protéines ubiquitinées dans des conditions non dénaturantes

  1. Préparer le tampon de lyse Flag (50 mM Tris-HCl (pH 7,9), 137 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM éthylène diamine tétraacétique acide (EDTA), 1% Triton X-100, 0,2% sarkosyl et 10% glycérol) fraîchement complété avec un cocktail inhibiteur de protéase avant utilisation.
  2. Ajouter 800 μL de tampon de lyse Flag glacé aux cellules de chaque tube, mélanger les cellules à l’aide d’un oscillateur vortex ou d’un pistolet à pipette, puis incuber le mélange sur un rotateur à 4 °C pendant 30 min.
  3. Soumettre le mélange à 5-10 brèves impulsions d’ultrasons. Effectuez les ultrasons sur la glace à une fréquence de sonication de 20 kHZ et une amplitude de 80% avec chaque impulsion d’une durée de 1 s. Incuber le mélange sur un rotateur à 40 tours par minute (tr/min) à 4 °C pendant 30 min.
  4. Centrifuger les échantillons ultrasoniques à 8 000 x g pendant 20-30 min à 4 °C. Transférer le surnageant dans un nouveau tube microcentrifugeux.
  5. Aliquote 80 μL (1/10) de la cellule extraire et mélanger avec 20 μL de 5x tampon de charge de dodécylsulfate de sodium (SDS). Faire bouillir les échantillons à 98 °C pendant 5 min, laisser refroidir sur de la glace pendant 2 min et conserver à -20 °C jusqu’à utilisation. Utilisez ces échantillons comme groupe d’entrée pour surveiller l’expression des protéines.
  6. Ajouter 30 μL de billes conjuguées à des anticorps anti-Flag M2 (Flag/M2) aux extraits cellulaires restants et incuber sur un rotateur à 4 °C pendant au moins 4 h ou toute la nuit.
  7. Centrifuger à 1 500 x g pendant 2 min à 4 °C pour recueillir les billes. Ajouter 1 ml de tampon de lyse Flag glacé aux billes et mélanger en retournant le tube plusieurs fois.
  8. Centrifuger à 1 500 x g pendant 2 min à 4 °C pour recueillir les billes. Répétez l’étape 4.7 pendant 4 à 6 fois.
  9. Ajouter 40 μL de peptides Flag à une concentration finale de 200 ng/μL aux billes et incuber sur un rotateur à 4 °C pendant 2 h pour éluer les protéines liées.
  10. Centrifuger à 1 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Transférer le surnageant dans un nouveau tube microcentrifugeux.
  11. Ajouter 10 μL de 5x tampon de chargement SDS, faire bouillir le mélange à 98 °C pendant 5 min, refroidir sur de la glace pendant 2 min et conserver à -20 °C pour le Western blot. Vous pouvez également stocker l’éluat de l’étape 4.10 directement à -80 °C pour d’autres expériences en aval.
    REMARQUE: La quantité de protéines ubiquitinées purifiées peut être augmentée en augmentant le nombre de cellules et les quantités de plasmides transfectés. Une stratégie de marquage des épitopes peut être adaptée pour purifier les complexes cellulaires qui se lient spécifiquement à p53 ubiquitiné dans des conditions de purification natives. En co-exprimant Flag-p53, mdm2 et HA-ubiquitine, le complexe protéique p53 ubiquitiné peut être immunoprécipité par une agarose séquentielle conjuguée à l’anticorps Flag et HA provenant de cellules de mammifères. Pour conserver les partenaires de liaison des protéines p53 ubiquitinées, le tampon de lyse BC100 moins strict (20 mM Tris-HCl (pH 7,9), 100 mM NaCl, 10% glycérol, 0,2 mM EDTA, 0,2% Triton X-100 et 1x inhibiteur de protéase) doit être utilisé pendant le processus de purification. L’éluat du peptide HA est soumis à la spectrométrie de masse pour identifier tous les partenaires qui se lient spécifiquement à p53 ubiquitiné.

5. Purification des protéines ubiquitinées dans des conditions de dénaturation

  1. Ajouter 1 mL de PBS glacé aux granulés de cellules obtenus à l’étape 3.3 et mélanger uniformément. Aliquote 100 μL (1/10 volume) de la suspension cellulaire dans un tube microcentrifuge comme échantillon d’entrée.
  2. Centrifuger à 700 x g pendant 5 min à 4 °C pour recueillir les pastilles de cellule. Ajouter 80 μL de tampon de lyse Flag à l’échantillon d’entrée, mélanger les cellules à l’aide d’un oscillateur vortex ou d’un pistolet à pipette et lyser les cellules sur de la glace pendant 1 h.
  3. Centrifuger à 8 000 x g pendant 20-30 min à 4 °C. Aliquote 80 μL du surnageant dans un nouveau tube microcentrifugeux.
  4. Ajouter 20 μL de tampon de chargement FDS 5x au surnageant, faire bouillir à 98 °C pendant 5-10 min, refroidir sur de la glace pendant 2 min et conserver à -20 °C jusqu’à utilisation.
  5. Centrifuger les 900 μL restants de la suspension cellulaire à 700 x g pendant 5 min à 4 °C pour recueillir la pastille de cellule. Ajouter 1 mL de tampon ubiquitine 1 (tampon UB 1; guanidine-HCI 6 M, 0,1 M Na 2 HPO 4, 6,8 mM NaH 2 PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) et0,2% Triton X-100, fraîchement complété avec 10 mM β-mercaptoéthanol et 5 mM imidazole) aux pastilles cellulaires et mélanger plusieurs fois en pipetant de haut en bas pour répartir uniformément les cellules.
    NOTE: La concentration d’imidazole peut varier de 5 mM à 20 mM pour diminuer la liaison protéique non spécifique sur la résine chargée de nickel. Le tampon ubiquitine contient du chlorhydrate de guanidine, qui inactive à la fois les ligases et les DUB. β-mercaptoéthanol est un liquide clair et incolore avec une odeur forte et désagréable semblable à celle des œufs pourris. Une solution à forte concentration causera de graves dommages aux muqueuses, aux voies respiratoires supérieures, à la peau et aux yeux. Portez des gants et des lunettes de protection et opérez dans la hotte.
  6. Soumettre les lysats cellulaires à 10-20 cycles d’ultrasons jusqu’à ce que la solution ne soit plus visqueuse. Effectuez les ultrasons sur la glace à une fréquence de sonication de 20 kHZ et une amplitude de 80% avec chaque impulsion d’une durée de 1 s. Centrifuger à 8 000 x g pendant 20-30 min à TA et transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugeuse.
  7. Ajouter 30 μL de résine chargée de nickel au surnageant et incuber sur un rotateur réglé à 15 tr/min pendant 4 h ou toute la nuit à TA. Centrifuger à 1 500 x g pendant 2 min à TA pour recueillir les billes.
  8. Ajouter 1 mL de tampon UB 1, incuber en rotation dans un agitateur pendant 10 min à TA et centrifuger à 1 500 x g pendant 2 min à TA pour recueillir les billes.
  9. Ajouter 1 mL de tampon ubiquitine 2 (tampon UB 2; urée 8 M, 0,1 M Na 2 HPO 4, 6,8 mM NaH 2 PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) et 0,2% Triton X-100) aux billes, incuber en rotation dans un agitateur pendant 10 min à TA et centrifuger à 1 500 x g pendant2min pour recueillir les billes. Répétez cela une fois de plus.
  10. Aux billes, ajouter 1 mL de PBS, incuber en rotation dans un agitateur pendant 10 min à TA et centrifuger à 1 500 x g pendant 2 min à TA pour recueillir les billes. Répétez cela une fois de plus.
  11. Éluer les protéines liées en incubant les billes avec 40 μL d’imidazole à une concentration finale de 0,5 M pendant 1 h à TA. Centrifuger à 1 500 x g pendant 2 min à TA.
  12. Transférer le surnageant dans un tube microcentrifuge propre, ajouter 10 μL de 5x tampon de chargement SDS, faire bouillir à 98 °C pendant 5 min, refroidir sur de la glace pendant 2 min et conserver à -20 °C pour le Western blot. Sinon, stockez l’éluat non traité à -80 °C pour d’autres expériences en aval.

6. Détection de protéines ubiquitinées purifiées par transfert Western

  1. Résoudre les échantillons des étapes 4.11 et 5.12 par électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE), puis les transférer sur une membrane de nitrocellulose par transfert Western pour détecter les protéines cibles à l’aide des anticorps correspondants décrits18.
  2. En bref, incuber la membrane en immergeant dans 20 mL de solution bloquante contenant 5% de poudre de lait defat dans un tampon TBST (15 mM Tris-HCI; pH = 7,6, 4,6 mM Tris-base, 150 mM NaCI, fraîchement complété avec 0,1% Tween-20 avant utilisation) à TA pendant 1 h. Ensuite, incuber la membrane avec des anticorps primaires à TA pendant 2 h ou toute la nuit à 4 °C. Utilisez les anticorps suivants pour chaque série. Tous les anticorps primaires ont été utilisés à une dilution de 1:1000.
    1. Détecter la protéine p53 totale, y compris la protéine p53 ubiquitinée, à l’aide d’un anticorps monoclonal anti-p53 après immunoprécipitation avec des billes d’agarose Flag/M2.
    2. Détecter les protéines p53 ubiquitinées avec un anticorps anti-HA ou anti-ubiquitine après immunoprécipitation avec des billes d’agarose Flag/M2.
    3. Détecter les protéines p53 ubiquitinées avec un anticorps monoclonal anti-p53 après extraction de résine chargée de nickel.
    4. Détecter la protéine ubiquitinée totale avec un anticorps anti-HA ou un anticorps anti-ubiquitine après l’extraction de la résine chargée de nickel.
  3. Incuber la membrane avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) à TA pendant 1 h après avoir lavé 3x avec un tampon TBST pendant 5 min chacun. Tous les anticorps secondaires ont été utilisés à une dilution de 1:3000. Ensuite, laver la membrane avec un tampon TBST 3x pendant 5 min chacune en agitant doucement.
  4. Démarrer le système d’imagerie par chimiluminescence pour détecter les signaux du Western blotting. Préparer la solution de substrat pour HRP en mélangeant les solutions A et B dans un rapport de 1:1.
  5. Placer la membrane de nitrocellulose dans la camera obscura face vers le haut et enduire la solution de substrat uniformément sur la membrane à l’aide d’un pistolet à pipetage. Sélectionnez la procédure d’exposition automatique pour capturer les signaux chimioluminescents et ajustez manuellement le temps d’exposition jusqu’à ce qu’un signal idéal soit acquis.

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Representative Results

Le diagramme schématique montre les protéines p53 (Flag-p53) et His/HA ubiquitin double-marqué (HH-Ub) (Figure 1A). Les procédures utilisées pour purifier les protéines ubiquitinées sont résumées à la figure 1B. L’ubiquitine marquée par Poly-His peut être ligaturée pour cibler les protéines dans les cellules de mammifères. Les protéines ubiquitinées peuvent être purifiées avec des billes Flag/M2 dans des conditions non dénaturantes ou par chromatographie d’affinité d’ions métalliques immobilisés (IMAC) dans des conditions de dénaturation (Figure 1B). La protéine p53 totale, y compris la protéine p53 ubiquitinée, a été immunoprécipitée avec des billes Flag/M2 provenant de cellules H1299 dans des conditions non dénaturantes. Le signal de la protéine p53 ubiquitinée, qui apparaît comme une bande étalée de faible à haut poids moléculaire, a été nettement augmenté lorsque Mdm2 a été exprimé ectopiquement dans ces cellules, suggérant que la protéine p53 ubiquitinée a été efficacement purifiée à partir de cellules (Figure 2). Ensuite, les cellules ont été lysées dans des conditions de dénaturation, et la protéine ubiquitinée cellulaire totale a été tirée vers le bas avec de la résine chargée de nickel. La protéine cellulaire totale a été détectée par transfert Western à l’aide d’un anticorps monoclonal anti-HA et la protéine p53 ubiquitinée a été détectée à l’aide d’un anticorps monoclonal anti-p53. Les résultats ont montré que le niveau total de protéines ubiquitinées était inchangé, mais que le niveau de protéine p53 ubiquitinée a été considérablement augmenté après que Mdm2 ait été surexprimé dans ces cellules. Ces résultats ont indiqué que les protéines totales d’ubiquitine contenant du p53 ubiquitiné étaient efficacement extraites des lysats cellulaires dans des conditions de dénaturation (Figure 3).

Figure 1
Figure 1 : Résumé des procédures utilisées pour purifier les protéines ubiquitinées. (A) Diagramme schématique des protéines p53 marquées Flagged (Flag-p53) et His/HA ubiquitin double-tagged (HH-Ub). (B) Les protéines ubiquitinées peuvent être purifiées avec des billes Flag/M2 dans des conditions non dénaturantes et par IMAC dans des conditions de dénaturation. Abréviations : Hès/HA = polyhistidine/hémagglutinine; Ub = ubiquitine; Perles Flag/M2 = perles conjuguées anticorps M2 anti-Flag; IMAC = chromatographie d’affinité par ions métalliques immobilisés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Les protéines p53 ubiquitinées ont été purifiées dans des conditions non dénaturantes. Le plasmide d’expression Flag-p53 a été transfecté seul, avec HH-Ub, ou avec Mdm2 et HH-Ub en cellules H1299. Les protéines p53 totales et les formes ubiquitinées ont été immunoprécipitées par des billes Flag/M2 provenant d’extraits cellulaires. L’éluat a été soumis à un transfert Western avec des anticorps monoclonaux anti-p53 (A) et anti-HA (B). (C) Les extraits de cellules brutes (Input) ont été soumis à un transfert Western avec des anticorps monoclonaux anti-p53 et anti-Mdm2. GFP a été utilisé comme contrôle de chargement. Abréviations : HH-Ub = His/HA ubiquitin à double balisage; HA = hémagglutinine; Perles Flag/M2 = perles conjuguées anticorps M2 anti-Flag; GFP = protéine fluorescente verte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Les protéines p53 ubiquitinées ont été purifiées dans des conditions de dénaturation. Le plasmide d’expression Flag-p53 a été transfecté seul, avec HH-Ub, ou avec Mdm2 et HH-Ub en cellules H1299. Les protéines cellulaires ubiquitinées totales ont été arrachées avec de la résine chargée de nickel et ont ensuite été soumises à un transfert Western avec des anticorps monoclonaux anti-p53 et anti-HA. (A) La protéine p53 ubiquitinée a été détectée à l’aide d’un anticorps anti-p53. (B) La protéine ubiquitinée totale a été détectée à l’aide d’un anticorps anti-HA. (C) Les extraits de cellules brutes (Input) ont été soumis à un transfert Western avec des anticorps monoclonaux anti-p53 et anti-Mdm2. GFP a été utilisé comme contrôle de chargement. Abréviations : HH-Ub = His/HA ubiquitin à double balisage; HA = hémagglutinine; GFP = protéine fluorescente verte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

L’ubiquitination joue un rôle essentiel dans presque tous les processus cellulaires physiologiques et pathologiques2. Ces dernières années, de grands progrès ont été réalisés dans la compréhension du rôle moléculaire de l’ubiquitine dans les voies de signalisation et de la façon dont les changements dans le système ubiquitine conduisent à différentes maladies humaines2. La purification des protéines ubiquitinées contribue à fournir un aperçu des rôles exacts de l’ubiquitination dans ces processus. Les mélanges de protéines conjuguées à l’ubiquitine peuvent être purifiés à partir de cellules dans des conditions non dénaturantes et dénaturantes. L’IMAC utilisant des résines de nickel peut être utilisée pour purifier les protéines marquées poly-His dans des conditions de dénaturation. L’objectif de la purification des protéines ubiquitinées dans des conditions de dénaturation est d’éliminer les partenaires d’interaction des protéines cibles. Tous les composants cellulaires se liant aux protéines cibles seront supprimés de l’élution dans des conditions de dénaturation. En revanche, certaines protéines cellulaires se liant aux protéines cibles peuvent être maintenues dans l’élution dans des conditions natives, ce qui peut interférer avec les expériences en aval. Les protéines ubiquitinées peuvent être purifiées même en présence de dénaturants puissants, ce qui diminue considérablement la liaison des protéines non spécifiques aux résines de nickel. En revanche, les protéines cibles totales, y compris leurs formes ubiquitinées, peuvent être purifiées par des stratégies de marquage des épitopes utilisant des billes d’agarose conjuguées aux anticorps dans des conditions non dénaturantes. Les protéines ont été purifiées dans des conditions moins strictes parce que la purification par affinité médiée par les anticorps a été utilisée au cours de ce processus. Les protéines cibles et leurs formes ubiquitinées ont été détectées avec des anticorps spécifiques aux protéines ou à l’ubiquitine. Les protéines marquées HA et Myc peuvent être facilement purifiées en utilisant la même procédure avec des billes d’agarose conjuguées par anticorps. Notamment, il est plus facile de détecter les protéines avec des chaînes monoubiquitines simples ou multiples que celles avec des chaînes de polyubiquitine avec des anticorps spécifiques aux protéines. En revanche, les protéines avec des chaînes de polyubiquitine peuvent être plus facilement reconnues par des anticorps spécifiques de l’ubiquitine.

Pour purifier efficacement les protéines ubiquitinées, le niveau d’expression des protéines cibles doit être élevé dans les cellules de mammifères. Des vecteurs d’expression avec de puissants promoteurs du CMV peuvent être utilisés pour atteindre des niveaux élevés d’expression protéique dans les cellules. De plus, l’ubiquitine ligase E3 et l’ubiquitine peuvent être co-exprimées avec les protéines cibles. Il ajoutera des fractions ubiquitine plus efficacement aux protéines. L’activité du protéasome 26S peut être bloquée par un inhibiteur de petites molécules afin d’accumuler des protéines ubiquitinées dans les cellules. Pour que les protéines ubiquitinées se lient efficacement à la résine, les extraits cellulaires doivent être brièvement soniqués pour perturber le complexe d’ADN et rendre la solution non visqueuse. Pour diminuer la liaison non spécifique, une faible concentration d’imidazole doit être ajoutée au tampon de lyse dans des conditions de dénaturation. Les protéines ubiquitinées avec un poids moléculaire très élevé sont plus faciles à attacher à la résine après la procédure de dénaturation et de repliement. Afin d’augmenter l’efficacité de l’élution, essayez d’utiliser une concentration plus élevée d’imidazole. Si l’efficacité de l’élution était encore extrêmement faible, essayez d’éluer les protéines ubiquitinées en les faisant bouillir directement dans le tampon de chargement SDS Laemmli. La plupart des protéines ubiquitinées liées à la résine peuvent être éluées dans ce puissant tampon dénaturant. Pour obtenir une plus grande pureté des protéines ubiquitinées, une purification par affinité en deux étapes peut être adaptée. Après l’immunoprécipitation Flag/M2 dans des conditions non dénaturantes, une deuxième étape de purification par résine chargée de nickel peut être utilisée pour abattre la protéine ubiquitinée marquée par His et se débarrasser des substrats non ubiquitinés. En revanche, après l’arrachage de la résine chargée de nickel dans des conditions de dénaturation, une deuxième étape de purification d’affinité peut être adaptée pour immunoprécipiter les protéines cibles en utilisant la stratégie de marquage des épitopes par des billes d’agarose conjuguées anti-Flag ou anti-HA.

Nous avons utilisé un immunoblot plus sensible au lieu de la coloration à l’argent ou de la coloration de Coomassie pour détecter les protéines ubiquitinées, car nous avons effectué une petite échelle de purification dans cette étude. En fait, bien que certaines protéines cellulaires soient facilement ubiquitinées dans les cellules, seule une petite partie des protéines peut être ligaturée avec des fractions ubiquitine. Pour détecter avec succès ces protéines par coloration à l’argent ou coloration de Coomassie, une grande échelle de purification doit être effectuée. Pour augmenter la pureté des protéines ubiquitinées, une deuxième étape de purification par affinité doit également être effectuée. Nous n’avons pas réalisé ces expériences car les protéines ubiquitinées purifiées par ce protocole répondent complètement aux exigences des analyses en aval. Par exemple, afin d’identifier des DUB spécifiques pour une protéine cible régulée par ubiquitination, nous devons purifier une grande quantité de protéines cibles ubiquitinées. Ces protéines peuvent être incubées avec des DUB individuels purifiés à partir de cellules de mammifères dans un tampon de déubiquitination. Grâce à ce criblage in vitro à haut débit, nous pouvons identifier des DUB spécifiques d’une protéine cible dans les cellules de mammifères.

Il y a plusieurs limites de la technique. Les protéines ubiquitinées représentent une très petite partie des protéines cibles, il est difficile de purifier une grande quantité de protéines cibles ubiquitinées. Essayez d’augmenter l’expression des protéines dans les cellules afin d’atteindre une efficacité de purification élevée. Une alternative consiste à effectuer une réaction d’ubiquitination in vitro pour acquérir plus de protéines ubiquitinées. Certaines protéines sont difficiles à exprimer fortement dans les cellules de mammifères, ce qui limite encore la purification de plus grandes quantités de protéines ubiquitinées. Enfin, le protocole actuel se limite à la purification des protéines marquées qui sont surexprimées à l’aide de l’ADN plasmidique. Les niveaux d’expression des protéines cibles sont supérieurs à ceux des protéines cibles endogènes. Pour évaluer le statut d’ubiquitination endogène d’une protéine cible, les protéines avec leurs formes ubiquitinées peuvent être directement immunoprécipitées par des anticorps spécifiques à la protéine cible provenant de cellules. Les anticorps anti-ubiquitine peuvent être utilisés pour déterminer le statut d’ubiquitination de la protéine cible. Cependant, dans certaines circonstances, le niveau d’expression plus faible, le niveau d’ubiquitination plus faible de la protéine cible ou l’efficacité d’immunoprécipitation plus faible d’anticorps spécifiques peuvent limiter la détection du statut d’ubiquitination des protéines cibles endogènes à partir de cellules de mammifères. Le protocole actuel peut fournir un système expérimental à la place.

La protéine suppresseur de tumeur p53 joue un rôle essentiel dans la prévention de la transformation maligne des cellules normales 8,9,10,11. La stabilité de p53 est étroitement régulée par la dégradation médiée par l’ubiquitination dans les cellules. Mdm2 agit comme une ubiquitine ligase E3 pour favoriser la mono- et polyubiquitination p53 de manière dose-dépendante16. Ici, les protéines p53 ubiquitinées ont été purifiées dans des conditions dénaturantes et non dénaturantes dans des cellules de mammifères en présence d’une surexpression de Mdm2. Les protéines p53 monoubiquitinées ont été détectées préférentiellement avec des anticorps monoclonaux anti-p53, tandis que les formes polyubiquitinées ont été facilement détectées avec des anticorps spécifiques à l’ubiquitine. Les niveaux de formes polyubiquitinées peuvent être efficacement augmentés en élevant l’expression de Mdm2 dans les cellules. Cet article fournit un système expérimental idéal pour la préparation de protéines ubiquitinées afin d’élucider le rôle de l’ubiquitination dans la modulation de la fonction protéique. Les protéines ubiquitinées peuvent être utilisées pour identifier des DUB spécifiques pour une protéine cible et pour révéler les rôles de différents types de chaînes ubiquitines, par exemple, les chaînes liées K48 et K63, dans la signalisation. Ce protocole peut être utilisé pour étudier les rôles de l’ubiquitination dans l’interaction protéine-protéine et la formation de complexes protéiques.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81972624) à D.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
β-mercaptoethanol Sangon Biotech M6250
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) GE healthcare NA931 Secondary antibdoy
Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) GE healthcare NA935 Secondary antibdoy
Anti-Flag M2 Affinity Gel Sigma-Aldrich A2220 FLAG/M2 beads
Anti-GFP monocolonal antibody Santa cruz sc-9996 Primary antibody
Anti-HA High Affinity Roche 11867423001 Primary antibody
Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14) Santa cruz sc-965 Primary antibody
Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1) Santa cruz sc-126 Primary antibody
EDTA Sigma-Alddich E5134 solvent
Fetal Bovine Serum VivaCell C04001-500 FBS
FLAG Peptide Sigma-Alddich F3290 Prepare elution buffer
GlutaMAX Gibco 35050-061 supplement
Guanidine-HCI Sangon Biotech A100287-0500 solvent
H1299 Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences
Image Lab Bio-rad software
Immidazole Sangon Biotech A500529-0100 solvent
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate Millipore WBKLS0500
Lipofectamine 2000 reagents Invitrogen 11668019 Transfection reagent
MG132 MedChemExpress HY-13259 Proteasome inhibitor
Na2HPO4 Sangon Biotech A501727-0500 solvent
NaCl Sangon Biotech A610476-0005 solvent
NaF Sigma-Alddich 201154 solvent
NaH2PO4 Sangon Biotech A501726-0500 solvent
Ni-NTA Agarose QIAGEN 30230 nickel-charged resin
Nitrocellulose Blotting membrane GE healthcare 10600002 0.45 µm pore size
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985-070 Transfection medium
PBS Corning 21-040-cv
Penicillin-Streptomycin Solution Sangon Biotech E607011-0100 antibiotic
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340
RPMI 1640 Biological Industries 01-100-1ACS medium
Sarkosyl Sigma-Alddich L5777 solvent
SDS Loading Buffer Beyotime P0015L
Sodium Pyruvate Gibco 11360-070 supplement
Tris-base Sangon Biotech A501492-0005 solvent
Tris-HCI Sangon Biotech A610103-0250 solvent
Triton X-100 Sangon Biotech A110694-0500 reagent
Tween-20 Sangon Biotech A100777-0500 supplement
Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System Bio-rad ChemiDoc XRS+
Urea Sangon Biotech A510907-0500 solvent

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References

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Biochimie numéro 181
Purification des protéines p53 ubiquitinées à partir de cellules de mammifères
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Wu, D., He, M., Li, D. Purification… More

Wu, D., He, M., Li, D. Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (181), e63602, doi:10.3791/63602 (2022).

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