Summary
我们提出了一种从人类牙齿开始开发上皮类器官培养物的方案。类器官具有强大的可膨胀性，可重现牙齿的上皮干细胞，包括其阿美巴分化能力。独特的类器官模型为研究人类牙齿（干细胞）生物学提供了一种有前途的工具，并为牙齿再生方法提供了前景。
Abstract
牙齿在生活中不仅对食物咀嚼和言语至关重要，而且对心理健康也至关重要。关于人类牙齿发育和生物学的知识很少。特别是，人们对牙齿的上皮干细胞及其功能知之甚少。我们成功地开发了一种从人类牙齿组织（即从拔出的智齿中分离出来的牙齿毛囊）开始的新型类器官模型。类器官具有稳健和长期可扩展性，并在标记表达和功能活性方面概括所提出的人类牙齿上皮干细胞区室。特别是，类器官能够展开在变色过程中 在体内 发生的阿美母细胞分化过程。这种独特的类器官模型将提供一种强大的工具，不仅可以研究人类牙齿发育，还可以研究牙齿病理学，并可能为牙齿再生疗法铺平道路。用基于这种新的类器官模型的生物牙齿替换丢失的牙齿可能是当前合成材料标准植入的一种有吸引力的替代方案。
Introduction
牙齿在食物咀嚼，言语和心理健康（自我形象）中起着至关重要的作用。人牙由不同密度和硬度的高度矿化组织组成1.牙釉质是牙冠的主要成分，是人体内矿化程度最高的组织。在牙釉质形成（amelogenesis）期间，当牙齿发育时，牙齿上皮干细胞（DESCs）分化成牙釉质形成细胞（ameloblasts）。一旦形成，由于在牙齿萌出开始时，阿米伯父细胞凋亡性丧失，珐琅质很少修复或更新1。由创伤或细菌性疾病引起的受损牙釉质组织的修复目前使用合成材料完成;然而，这些都存在重要的缺点，例如微裂，下骨整合和锚固，有限的寿命以及缺乏功能齐全的修复2。因此，具有产生阿米母细胞能力和产生矿化组织潜力的人类DEC的稳健可靠的培养将是牙科再生领域向前迈出的重要一步。
关于人类DESC表型和生物学功能的知识稀缺3，4，5。有趣的是，人类牙齿的DESC已被提出存在于Malassez的上皮细胞休息（ERM）中，该细胞簇存在于牙齿卵泡（DF）内，其周围是未脱出的牙齿，并且一旦牙齿萌出，它们仍然存在于根部周围的牙周韧带中1。已经发现与牙髓共培养的ERM细胞分化成阿美母细胞样细胞并产生牙釉质样组织6。然而，由于缺乏可靠的研究模型7，对ERM细胞在牙釉质（再）生成中的特异性作用的深入研究受到限制。目前的ERM体外培养系统受到有限的寿命和标准使用的2D条件下表型快速丧失的阻碍8，9，10，11，12。因此，迫切需要一个易于处理的体外系统来忠实地扩展，研究和区分人类DESC。
在过去的十年中，一种 在体外 生长上皮干细胞的强大技术已成功应用于几种类型的（人类）上皮组织，以研究其生物学以及疾病13，14，15，16。该技术使组织上皮干细胞能够自我发育成3D细胞结构（即类器官），当接种到细胞外基质（ECM）模拟支架（通常为Matrigel）中并在定义的培养基中培养，复制组织的干细胞位信号传导和/或胚胎发生。类器官发育所需的典型生长因子包括表皮生长因子（EGF）和无翼型MMTV整合位点（WNT）激活剂14，15，16。所得类器官的特征在于模仿组织原始上皮干细胞的持久保真度，以及高可膨胀性，同时保持其表型和功能特性，从而克服了从诊所获得的通常有限的原代人体组织可用性。为了建立类器官，不需要在培养之前从异质组织（即包含其他细胞类型，如间充质细胞）中分离上皮干细胞，因为间充质细胞不附着或在ECM中茁壮成长，最终导致纯上皮类器官13，16，17，18，19.这种有前途的多功能技术导致了来自各种人体上皮组织的歧管类器官模型的发展。然而，对于深入研究牙齿发育，再生和疾病有价值的人类牙齿衍生类器官尚未建立20，21。我们最近成功地开发了这样一种新的类器官模型，从从青少年患者中提取的第三磨牙（智齿）的DF组织开始19。
在这里，我们描述了从成人人类牙齿（即从第三磨牙的DF）开发上皮类器官培养物的方案（图1A）。所得类器官表达ERM相关的干性标志物，同时具有长期可扩展性。有趣的是，与大多数其他类器官模型相反，通常需要的EGF对于健壮的类器官发育和生长是多余的。有趣的是，茎性类器官显示出阿美母细胞的分化特性，从而模仿 了体内发生的ERM / DESC特征和过程。这里描述的新的和独特的类器官模型允许探索DESC生物学，可塑性和分化能力，并为迈出牙齿再生方法的第一步打开了大门。
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Protocol
此处描述的所有方法均已获得鲁汶伦理委员会研究（13/0104U）的批准。提取的第三磨牙（智齿）是在患者知情同意后获得的。
1. 准备工作
- 在37°C的1.9%CO 2培养箱中预热48孔培养板15-20 小时。
- 液化一种基质胶等分试样（生长因子还原;无酚红;进一步称为基底膜基质;BMM）在步骤2.1之前在冰上（4°C）上至少2小时。
注意：避免 BMM 的冻融循环。将BMM在冰上液化15-20小时，并在微量离心管中以1mL等分试样，并在-20°C下储存。 - 将离心机冷却至4°C。
- 制备培养基并通过0.22μm过滤器过滤溶液。以下体积基于通常同时提取的所有四个第三磨牙的DF的集合。
- 准备20mLDF收集培养基（表1）：含有10%胎牛血清（FBS），0.5%两性霉素B和1%青霉素 - 链霉素的最小必需培养基（αMEM）。将4 mL DF收集培养基转移到15 mL管中，并将管转移到冰上。
注意：每位患者一个15 mL的试管足以收集样本（即，对于四个第三磨牙）。 - 制作20毫升牙齿类器官培养基（进一步称为TOM; 表 2）使用无血清定义培养基（SFDM; 表 3）。将TOM储存在4°C下最多2周。
- 准备8mL解离培养基（表4），即含有胶原酶VI（3mg / mL）和dispase II（4mg / mL）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）。使用前在37°C水浴中预热解离培养基至少10分钟，并将其转移到两个15mL管中（每管4mL）以解离四个DF组织。
- 准备一个洗涤板（12孔），其中包含：三个具有70%EtOH的孔，三个具有PBS的孔和三个具有DF收集培养基的孔。
- 每个样品制作15 mL培养基A（即，每个患者每两个DF产生5 mL; 表 5）。
注意：以下步骤应在无菌条件下进行。
- 准备20mLDF收集培养基（表1）：含有10%胎牛血清（FBS），0.5%两性霉素B和1%青霉素 - 链霉素的最小必需培养基（αMEM）。将4 mL DF收集培养基转移到15 mL管中，并将管转移到冰上。
2. 牙囊解离
- 一旦将具有相关DF的第三磨牙收集在收集培养基中（在冰上），将管的内容物转移到培养皿中。
- 用镊子握住牙齿，并使用手术刀片小心地隔离DF。
注意：此步骤需要练习;小心刀片。 - 为了洗净DFs上剩余的血液，将DF组织短暂地放在70%EtOH（洗涤板）的第一个孔中20秒，然后转移到下一个EtOH孔20秒，然后进一步转移到第三个EtOH孔（总共70%EtOH中最大1分钟;较长的孵育时间将导致细胞活力降低）。
- 接下来，继续在三个PBS孔中冲洗（总共最多2分钟）。
- 在剩余的三个DF收集培养孔中冲洗DFs（总共最多20分钟）。
- 将冲洗过的DFs转移到新的培养皿中。
- 切一小块DF（约5mm2）用于多聚甲醛（PFA）固定（见第7节），并将其储存在冰上（最多6小时）在含有500μLDF收集培养基的微量离心管中，直到PFA固定。
- 将其余的DF切成小块（〜1 mm2）。
注意：建议立即处理新鲜分离的DF组织，以获得最佳的类器官形成和生长效率，而不是从冷冻保存的组织开始，这会导致效率降低。然而，可以在该步骤中冷冻保存原代DF组织（参见第5节的冷冻保存培养基和方案）。 - 将切碎的DFs转移到含有4mL预热解离培养基的15mL管中，并在37°C水浴中孵育2小时。
注意：每4 mL预热解离培养基（一管）添加两个DF，以确保最佳解离。 - 每15分钟，使用玻璃巴斯德移液管上下移液DF解离培养基混合物以加速组织分解。当不再观察到DF片时（通常在1小时后），使用狭窄的火抛光巴斯德移液管进行DF解离。
注意：为了获得最佳的DF解离，请切换到巴斯德移液管，通过火抛光在不迟于1小时的DF分离中缩小。- 同时，制备10mL含有50μL脱氧核酸酶（0.2mg / mL; 表 5）。
- 向具有解离DF的每个管中加入5mL培养基A（含有DNA酶），并在室温（RT）下孵育1分钟。
- 通过40μm细胞过滤器过滤细胞悬浮液（含有单细胞和小细胞团块）以除去剩余的大碎片和（大部分）纤维组织。
- 在此步骤中，将几根管与一名患者的解离DF组合。
- 用1mL培养基A冲洗过滤器，在4°C下以200× g 离心过滤的细胞悬浮液10分钟。
- 除去上清液，将沉淀重悬于1mL SFDM中（表3），并将细胞悬浮液转移到1.5mL微量离心管中。
- 使用自动细胞计数器计算细胞浓度。忽略残留的细胞团块。
- 在4°C下以200× g 离心5分钟。
3.建立牙齿类器官培养物（图1A 和 图2A）
- 根据获得的细胞数，计算可以接种的孔数。一个20μL液滴应包含20，000个细胞。最终的混合物由细胞悬浮液和BMM组成，比例为30：70。
- 除去适量的上清液，重悬于冰冷的BMM中，得到70∶30比例的BMM：细胞悬浮液进行电镀。例如，当获得200，000个细胞时，平板10滴20μL。因此，除去上清液直至留下60μL细胞悬浮液，加入140μL冰冷的BMM并重悬。
- 缓慢重悬以避免形成气泡。一旦重悬于BMM中，将微量离心管保持在冰上。
注意：将微量离心管保持在冰上对于避免BMM凝固至关重要。
- 缓慢重悬以避免形成气泡。一旦重悬于BMM中，将微量离心管保持在冰上。
- 移液到预热的48孔培养板孔中心的20μL BMM液滴。
- 将板倒置，将其放入1.9%CO2 培养箱（根据SFDM缓冲液的%CO2 ）中，并使其在37°C下固化至少20分钟。
- 向TOM中加入ROCK抑制剂（RI;10μM）和两性霉素B（0.1%），并在37°C水浴中预热培养基。
注意：两性霉素B对光敏感。 - 从培养箱中取出48孔板，直立放置并将250μL制备的预热培养基与BMM液滴/细胞一起加入每个孔中，并将板返回到1.9%CO2 培养箱中。
- 要刷新培养基（最好每2-3天一次），以45°角倾斜48孔板，轻轻取出先前的培养基，同时避免接触BMM液滴，并加入250μL新的预热TOM培养基。
注意：建议每周至少刷新三次，以避免关键营养素和生长因子的消耗。RI只需要在初始播种和每次传代的第一天（见第4节）添加到TOM中，以防止细胞因无花果而死亡并增强类器官的生长。两性霉素B仅在通过0（P0）期间添加到培养基中以阻断可能的真菌污染。
4.牙齿类器官培养物的扩增和传代（图1B 和 图2B）
- 在培养10至14天之间通过类器官。
注意：避免长时间培养，因为长时间培养可能会限制类器官的再生和可传代性。只有在初始发育（P0）时，根据其生长速率，类器官可以培养长达20天（直到达到最大直径±200μm）。 - 用需要通过的类器官从孔中取出培养基。在一个培养条件下，汇集多达四个汇合孔（见 图2C）。
- 为了收集类器官，每孔直接在BMM液滴上加入400μL冰冷的SFDM，并反复上下移液培养基，直到整个BMM液滴被移出。
- 如果孔被池化，将400μL从第一个孔转移到下一个孔（依此类推），以清除需要池化的所有孔的含有类器官的BMM液滴。
- 将脱落的BMM-类器官组件转移到1.5mL微量离心管中，并再次重复步骤4.3，直到从孔中收集所有类器官结构。
- 在4°C下以200× g 离心5分钟。
- 在37°C水浴中预热等分试样的TrypLE Express（在5μM处补充RI）。每个类器官的微量离心管，需要400μLTrypLE Express的体积。
- 离心后，除去上清液并将沉淀重悬于400μLTrypLE中。将悬浮液在37°C水浴中孵育12分钟。
- 加入400μL冰冷的SFDM以灭活酶，并在4°C下以200× g 离心5分钟。 取出上清液。
- 用冰冷的SFDM预涂上尖端（体积见下文），然后重悬于类器官颗粒。
- 为避免类器官损失，请尽可能重复使用相同的（预涂覆）尖端，而不会危及无菌。
注意：重悬沉淀所需的SFDM体积取决于获得的类器官结构的数量和当前的通过数量。 - 根据经验，对于传代，P0至P2-3（通常仍在生长少量的类器官）使用200μL SFDM的体积。从传代中，P3-4或更高（通常产生大量类器官）使用体积为700μL的SFDM。
注意：这两个程序分别称为“低通道”和“高通道”方法（见步骤4.10和4.11）。正确应用不同的方法对于类器官的有效传代至关重要。使用高通道方法，类器官更容易丢失，不应应用于少量的类器官（即，在P0至P2-3处）。然而，需要更高的通道方法来有效地解离大量类器官。
- 为避免类器官损失，请尽可能重复使用相同的（预涂覆）尖端，而不会危及无菌。
- 低通过方法：将沉淀重悬于200μL冰冷的SFDM中。将完全清空的移液器尖端推向微量离心管的底部，以减小其直径。检查直径是否足够小（抽吸速度较慢，流量偏斜但不堵塞）。上下移液5分钟，以机械方式破坏类器官。
- 更高的通过方法：将沉淀重悬于700μL冰冷的SFDM中，并带有P1000尖端。在此 P1000 吸头顶部添加一个 P200 吸头（无过滤器），并用冰冷的 SFDM 进行预涂。通过调整移液器的体积设置来防止气泡形成，以便至少90%的培养基体积（使用类器官）。上下移液5分钟，以机械方式破坏类器官。
- 在光学显微镜下（在4倍放大倍率下）检查是否主要获得具有（仅）几个未分散结构的单细胞。
- 向微量离心管中加入500μL冰冷的SFDM，并通过移液将解离的细胞混合物与新鲜的SFDM轻轻混合。
- 通过将微量离心管垂直放置在冰上，让大型未分散的结构沉淀10分钟。
注意：有必要去除未分散的结构，因为它们会对类器官的可通行性产生负面影响。对于类器官起始（P0），不需要该沉降步骤。 - 收集含有单细胞和小细胞簇的上清液（约500-1，000μL，取决于传代方法）;转移到新的微量离心管中，并在4°C下以190× g 离心10分钟。
- 使用自动细胞计数器计算细胞浓度。忽略残留的细胞团块。
- 计算可以接种的孔数，并如上所述计算适当的细胞悬浮液/ BMM比率（第3节）。
- 向细胞沉淀中加入70%的BMM，并将微量离心管保持在冰上。
注意：将微量离心管保持在冰上以避免BMM凝固至关重要。 - 继续步骤3.3直到3.7，并在培养的第10天和第14天之间再次通过。
5. 牙齿类器官的冷冻保存
- 如上所述收集和解离类器官以进行传代（步骤4）。在4°C下以200× g 离心细胞悬浮液5分钟。
- 弃去上清液并将沉淀重悬于1mL含有SFDM（70%），FBS（20%）和DMSO（10%）的冷冻保存培养基中。
- 将悬浮液转移到冷冻室中并将其放在冰上。将冷冻管置于冷冻箱中并转移到-80°C（至少4小时）。
- 在1个月内，将冷冻样品转移到液氮中进行长期（>12个月）储存。
6. 冷冻保存的牙齿类器官解冻
- 在开始解冻程序之前，将每个冷冻管一个15 mL管放在含有10 mL SFDM和20%FBS的冰上。
- 从液氮中取出冷冻管并将其放在冰上。
注意：尽可能快地执行以下步骤，避免解冻时间过长（>5分钟）以及步骤之间的间隔过长（>5分钟），因为这种延长会降低细胞存活率。 - 将冷冻管置于温水浴（37°C）中直至解冻（约1-2分钟）。
- 立即将冷冻管的内容物转移到冰冷的15mL管中，并在4°C下以200× g 离心5分钟。
- 除去9mL上清液，并在4°C下以200× g 离心剩余的1mL5分钟。 除去上清液并用1mL冰冷的SFDM洗涤沉淀。
- 将细胞悬浮液转移到1.5 mL微量离心管中，并使用自动细胞计数器对细胞进行计数。
- 计算可以接种的孔数，并如上所述计算适当的细胞悬浮液/ BMM比率（第3节）。
- 在4°C下以200× g 离心5分钟。 以70：30的比例重悬颗粒BMM：TOM并保持在冰上。
- 继续步骤3.3至3.7，并在培养的第10天和第14天之间通过。
7. 牙齿类器官的固定和石蜡包埋
注意：该过程（包括第8节和第9节）也可以应用于原代DF组织。
- 在PFA中固定牙齿类器官
- 从每个孔中取出培养基，如步骤4.2所示。
- 通过移位BMM液滴来收集类器官（步骤4.3）。将BMM-类器官混合物转移到1.5 mL微量离心管中。
- 在4°C下以200× g 离心5分钟。
- 除去上清液并加入500μL4%PFA，并在室温下孵育至少30分钟（最大1小时），在轨道振荡器上轻轻混合。
注意：使用 PFA 时，请使用化学罩。 - 在4°C下以200× g 离心5分钟。 除去上清液，用PBS冲洗类器官沉淀，在室温下轻轻摇动10分钟。
- 将类器官沉淀（步骤7.1.5）另外洗涤两次。在4°C下以200× g 旋转固定的类器官5分钟。
- 将沉淀重悬于500μL70%EtOH（去离子水中）中。将类器官在4°C的70%EtOH中储存长达1个月。
- 琼脂糖和石蜡包埋牙齿类器官
注意：为了有效地将类器官包埋在石蜡中，需要一个额外的步骤来包埋琼脂糖。- 在4°C下以200× g 在70%EtOH中离心PFA固定的类器官5分钟。 取出上清液。
- 在玻璃瓶中制备30 mL PBS中的2%琼脂糖溶液。在微波炉中加热琼脂糖 - PBS混合物，直到观察到凝胶状结构（在600 W下约2.5分钟）。
- 同时，将30 mL PBS加入另一个玻璃瓶中，并在微波炉中加热（在600 W下约2.5分钟）。让琼脂糖溶液冷却1分钟。
- 切割P200尖端的末端，以便精确地使用琼脂糖溶液并避免气泡。
- 在温暖的PBS中预热P200吸头，方法是上下移液几次。
- 向类器官沉淀中加入150μL预热琼脂糖溶液，并轻轻移液至类器官琼脂糖混合物（重悬最小），同时避免气泡。
注意：最小的重悬将允许在切片机切片时更好地定位琼脂糖凝胶中的类器官，因为类器官彼此更靠近。 - 立即将类器官 - 琼脂糖混合物转移到相同的微量离心管盖上，水平放置管，让琼脂糖凝固（在室温下约20分钟）。同时，为盒式磁带贴上标签。
- 凝固后，使用镊子从微量离心机盖上取出琼脂糖凝胶并将其转移到标记的盒中。
- 将含琼脂糖的盒转移到含有50%EtOH的烧杯中去离子水中。用薄膜覆盖烧杯，以避免EtOH蒸发。
注：烧杯的体积取决于暗盒的数量。 - 在组织处理器中处理样品过夜。
注意：由于石蜡在室温下凝固，必须快速执行以下步骤。 - 在包埋工作站中预热加热块15分钟。
- 取出盒中封闭的含类器官琼脂糖凝胶，并将其置于预热加热块中。从暗盒中取出盖子，放在一边供以后使用。
- 用石蜡填充剩余的加热块。
注意：用镊子检查含类器官琼脂糖凝胶是否仍位于加热块的底部。由于其重量轻，它可能会开始漂浮，导致样品损失。 - 将盒式磁带盖放在加热块的顶部。让它在冷板上固化30分钟。取出加热块并将石蜡块储存在4°C。
8.切片机切片和牙齿类器官染色（图2B 和 图3A-C）
- 含类器官石蜡阻滞的切片机切片
- 使用切片机在石蜡块中切片5μm切片的牙齿类器官。
- 将石蜡片放在显微镜载玻片的顶部。将显微镜载玻片放在37°C的温板上，并使用巴斯德移液管用去离子水覆盖。
- 让显微镜载玻片干燥过夜。
- 牙齿类器官部分的染色
- 在58°C下在烤箱中脱蜡类器官切片（在显微镜载玻片上）1小时。
- 按以下顺序在化学罩内以递减的EtOH系列重新水化类器官切片（在显微镜载玻片上）：
二甲苯 2x，每次 3 分钟
100%乙氧乙烷醇，每次2次，每次3分钟
95%乙氧乙烷，每次2次，每次3分钟
90%乙氧乙烷2x，每次3分钟
70%乙氧烷3x，每次3分钟
注意：使用二甲苯时使用化学罩。 - 在室温下用自来水冲洗显微镜载玻片5分钟。然后，在室温下在PBS中冲洗5分钟。
- 通过将类器官切片（在显微镜载玻片上）置于预热的柠檬酸盐缓冲液（10mM柠檬酸在pH 6的去离子水中;在塑料容器中;在95°C水浴中预热10分钟）中在95°C水浴中预热30分钟来进行抗原检索。
- 让显微镜载玻片在室温下冷却20分钟，在室温下在PBS中冲洗显微镜载玻片5分钟，然后在含有0.1%Triton-X（PBT）的PBS中在室温下冲洗5分钟。
- 使用记号笔在每张幻灯片的边界处创建疏水屏障。
- 在封闭缓冲液（含有1.5mg / mL甘氨酸，溶解在PBT中的2mg / mL白蛋白牛血清（BSA））加10%驴血清中放疗至少1小时。
注意：通常，每个显微镜载玻片需要300μL封闭缓冲液加10%驴血清。 - 将显微镜载玻片置于潮湿的室内。使用所有载玻片都适合的气密盒子，用水打湿一些纸巾，放在盒子的底部。这将防止载玻片在随后的染色步骤中变干。
- 除去封闭缓冲液，加入在封闭缓冲液中制备的一抗（表6）加1%驴血清，并将覆盖有抗体溶液的载玻片在4°C的潮湿室中孵育过夜。 如果需要，请重做标记笔边框。
- 在室温下在PBT中洗涤显微镜载玻片三次，在轨道振荡器（75-150rpm）上轻轻混合10分钟。
- 加入二抗（表6），在封闭缓冲液加1%驴血清中制备，并在室温室中孵育1小时。
- 取出封闭缓冲液，在室温下在PBT中洗涤显微镜载玻片三次，在轨道振荡器上轻轻混合10分钟。
- 在玻璃盖玻片上添加带有DAPI（1至3滴）的防褪色安装介质，并将其安装在类器官部分的顶部（在显微镜载玻片上）。继续进行成像;在4°C下储存载玻片最多1周。
9. 牙齿类器官的RNA提取和RT-qPCR（图2B 和 图3D）
- 牙齿类器官的RNA提取
- 从每个孔中取出培养基（步骤4.2）。
- 通过移位BMM液滴（步骤4.3）收集类器官，将BMM - 类器官混合物转移到1.5mL微量离心管中，并在4°C下以200× g 离心5分钟。
- 除去上清液，重悬于350μL溶解在裂解缓冲液中的1%β巯基乙醇中（材料表），并置于冰上。
注意：在化学罩中使用β巯基乙醇执行所有步骤。
注意：样品可以在-80°C下在此步骤中储存长达1个月。 在继续步骤9.1.4之前，在冰上解冻样品。 - 涡旋样品，直到不再观察到类器官结构。
- 根据制造商的说明，使用RNA提取试剂盒（材料表）进行RNA提取。
- 牙齿类器官的RT-qPCR（表7）
- 根据制造商的说明，使用逆转录试剂盒（材料表）反向转录（RT）RNA19。
- 使用实时荧光定量 PCR 系统（材料表）使用基于 SYBR Green 的定量 PCR （qPCR）19 分析所得 cDNA 样品。
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Representative Results
牙齿类器官发育
我们提供了一个详细的方案，用于从智齿拔除后获得的人类DF组织中建立类器官培养物（图1A）。分离的DF被酶促和机械解离。获得的细胞在BMM中培养，这些培养基根据经验被定义为最佳的类器官发育和生长（牙齿类器官培养基;汤姆）19.
类器官通常在DF细胞接种后2周内发育（P0; 图 2A）。类器官是长期可扩展的（到目前为止最多11个传代）（图2B，显示在P4）。每个BMM液滴接种约20，000个细胞（在P0和进一步传代中）产生最佳的类器官密度（图2C），而接种较高的细胞数量会导致类器官生长欠佳（即，密度太高时较小的类器官），因为没有足够的空间生长（图2D）。最终优化的培养条件允许以100%的效率从DF样品中开发类器官19。
牙齿类器官表征和验证
发育的类器官表现出致密的外观，并含有显示出高核细胞质比的细胞，如在ERM细胞7 中类似地观察到的那样（图3A）。此外，在进一步的类比中，类器官表达ERM标记物细胞角蛋白14（CK14）22，从而确认其上皮起源（图3B），以及其他提出的ERM标记物（如P63，CD44和ITGα612，22，23 （图3B）。此外，类器官表达SOX2，SOX2是小鼠中众所周知的DESC标志物，也存在于发育中的人类牙齿的上皮中（图3B）1。有趣的是，牙釉质基质的主要成分阿美洛因（AMELX）也在类器官中表达，也在ERM24 中检测到（图3C）。我们最近的研究19 描述了其他ERM /干性标记物的表达，可用于进一步证明获得的类器官。此外，类器官在传代过程中保留其ERM /干性表型，其中包括ERM /干细胞标记物的稳定表达（图3D）。最后，牙齿来源的类器官显示出对阿美母细胞（样）细胞的分化能力，这也可以用于验证获得的类器官培养物，显示成熟的阿美巴体标志物的表达，例如牙本质 - 成形 - 成形体相关蛋白（ODAM）和amelotin（AMTN）转移到分化培养基后（见19）。
图1：牙齿类器官发育，表征和应用的工作流程示意图。 （A）从从未上脱的第三磨牙中分离出的牙囊（DF）组织发育牙齿类器官。（二）牙齿类器官的扩增、表征和应用潜力。d， 天;P，通道。使用 BioRender.com 创建。 请点击此处查看此图的大图。
图2：牙齿类器官发育。 （A）从DF组织发育的类器官。播种后不同日期（d）显示的代表性明场图像（P0;P，通道;（B）明场图像显示牙齿类器官线的坚固可通性（2.5x）。（C）明场图像显示以每孔20，000个细胞的密度接种的牙齿类器官线（d0;左;2.5x），并且所得的融合类器官培养物准备传代（d14;右;2.5x）。（D）明场图像显示牙齿类器官系，其以>20，000个细胞的密度接种，导致在d14（2.5x）处密度过高的较小类器官。比例尺：200 μm。 请点击此处查看此图的大图。
（A）不同放大倍率下DF衍生类器官培养物的明场图像，显示TOM在14天时形成的致密结构（P4; 5-20x））。苏木精和益星类器官染色（P1，第11天）。框已放大。箭头表示具有高核细胞质比的细胞。（B）TOM生长的类器官（20x）中上皮/ ERM /茎性标志物的免疫荧光染色。（C）TOM生长的类器官（20x）中阿美洛因（AMELX）的免疫荧光染色。DAPI（蓝色）用于标记细胞核。（D）培养第14天P1和P5 TOM生长的类器官中ERM/茎性标记的基因表达水平（相对于GAPDH）（平均±SEM;n = 3个生物重复）。比例尺：50 μm，除非另有说明。请点击此处查看此图的大图。
| 牙囊 （DF） 收集培养基 | |
| 名字 | 浓度 |
| 最低必需中型鹰 （αMEM） | |
| 胎牛血清 | 10% |
| 两性霉素 B | 0.5% |
| 青霉素-链霉素（笔/链球菌） | 1% |
表1：牙囊（DF）收集培养基。下表列出了 DF 收集介质的成分。
| 牙齿类器官培养基（TOM） | |
| 名字 | 浓度 |
| 无血清限定培养基 （SFDM） | 组成见表3 |
| A83-01 | 0.5 微米 |
| B27（不含维生素A） | 2% |
| 霍乱毒素 | 100纳克/毫升 |
| FGF2 （= 基本 FGF） | 20纳克/毫升 |
| 断续器 | 200纳克/毫升 |
| FGF10 | 100纳克/毫升 |
| L-谷氨酰胺 | 2 毫米 |
| 胰岛素样生长因子-1 | 100纳克/毫升 |
| 氮2 | 1% |
| N-乙酰基 L-半胱氨酸 | 1.25 毫米 |
| 烟 酰 胺 | 10 毫米 |
| 诺金 | 100纳克/毫升 |
| 断续器 | 200纳克/毫升 |
| SB202190 （p38i） | 10 微米 |
| 嘘 | 100纳克/毫升 |
| WNT3a | 200纳克/毫升 |
表2：牙齿类器官培养基（TOM）。 该表列出了制备牙齿类器官培养基所需的成分及其各自的浓度。
| 无血清限定培养基 （SFDM） （pH 7.3） | |
| 名字 | 浓度 |
| 无菌 H2O | |
| DMEM 1：1 F12 不带铁 | 16.8 克/升 |
| 转铁蛋白 | 5毫克/升 |
| 来自牛胰腺的胰岛素 | 5毫克/升 |
| 青霉素G钠 | 35毫克/升 |
| 硫酸链霉素盐 | 50毫克/升 |
| 无水乙醇， ≥99.8% （乙氧乙氧烷） | 600 微升/升 |
| 来自牛肝的过氧化氢酶 | 50 微升/升 |
| 碳酸氢钠 | 1 克/升 |
| 牛白蛋白（细胞培养级） | 5 克/升 |
表3：无血清限定培养基（SFDM）（pH 7.3）。 该表列出了无血清定义培养基的组成。
| 解离介质 | |
| 名字 | 浓度 |
| 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） | |
| 胶原酶 IV | 3毫克/毫升 |
| 分散酶 II | 4毫克/毫升 |
表4：解离培养基。 成分列表及其制备解离培养基所需的浓度。
| 培养基 A （pH 7.3） | |
| 名字 | 浓度 |
| 无菌 H2O | |
| DMEM粉高糖 | 13.38 克/升 |
| 赫皮斯 | 5.958克/升 |
| 丙酮酸钠（C3H3NaO3） | 110毫克/升 |
| 青霉素G钠 | 35毫克/升 |
| 硫酸链霉素盐 | 50毫克/升 |
| 氯化钠 | 0.5 克/升 |
| 碳酸氢钠 | 1 克/升 |
| 牛白蛋白（细胞培养级） | 3 克/升 |
| 脱氧核糖核酸* | 0.2毫克/毫升 |
| *提及时添加 |
表5：培养基A（pH 7.3）。 该表列出了用于制备培养基A的成分的浓度。
| 一抗 | ||
| 名字 | 主机 | 浓度 |
| 阿梅尔克斯 | 鼠 | 1:100 |
| CD44型 | 鼠 | 1:200 |
| 断续器 CK14 | 鼠 | 1:200 |
| 断续器 | 兔 | 1:200 |
| P63 | 兔 | 1:1000 |
| 断续器 | 兔 | 1:2000 |
| 偶氮抗体 | ||
| 名字 | 主机 | 浓度 |
| 鼠标 IgG （Alexa 555） | 驴 | 1:1000 |
| 兔子 IgG （Alexa 488） | 驴 | 1:1000 |
表6：抗体及其稀释度列表。 该表列出了本研究中使用的抗体及其各自的稀释液。
| 引 | ||
| 基因 | 前向引物 | 反向底漆 |
| 加普德 | GGTATCGTGGAAGGACTCATGAC | ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG |
| P63 | CAACGCAGTAGACACCATTTCC | CCCAAAACCTTCTCTCGTGTGTTT |
| 断续器 | GGCGGTGTGTGTGTCTCTGAGTC | AATCGCCCATCAAAAGCTC |
| 断续器 | GCTGGGACATGTGAAGTCTG | CCCTGTGGTTACCTTTTCCT |
| PITX2 | CAGCGGACTACTTTACCAG | ATTCTTGAACCAAACCCGGAC |
表7：引物清单。 该表列出了本研究中使用的 GAPDH， P63， ITGA6， SOX2 和 PITX2 的引物。
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Discussion
该协议描述了从人类牙齿开始的类器官的高效和可重复的产生。据我们所知，这是从人类牙齿组织开始建立当前概念（上皮）类器官的第一种方法。类器官可长期扩张，并显示牙齿上皮干性表型，与先前在DF7的ERM室中报道的DSC重复。此外，类器官复制了功能性DESC / ERM特征，包括展开阿美巴分化过程7，25，26。由于在独立患者类器官系19中发现了可比较的结果，因此研究结果很可靠。
在执行这种牙齿类器官方案时，需要考虑几个关键点。首先，在初始接种时和每次传代后立即添加Rho相关激酶（ROCK）抑制剂Y-27632对于防止单细胞经历anoikis27至关重要。此外，在P0期间的所有培养基茶点中都需要两性霉素B，以避免（口服）真菌生长。其次，建议立即处理新鲜分离的DF组织，以获得最佳的类器官形成和生长效率，而不是从冷冻保存的组织开始，这导致效率降低。第三，当解冻冷冻保存的类器官系用于培养时，请尽可能快地执行步骤，并避免解冻时间过长以及步骤之间的间隔过长，因为时间延长会降低细胞存活率。第四，应该注意的是，早期传代时的类器官数量（P0-P3）可能仍然有限，也因为仅在特定分离的DF组织样品中存在有限数量的ERM（干细胞）细胞。因此，应谨慎和考虑早期通过时的类器官培养。因此，建议（i）避免类器官培养的快速扩张（即，从P3-4开始仅在1：3或更高时开始分裂，并在1：0.5或1：1之前开始分裂）;（ii）使用所描述的适当拆分方法（低通道 - 高通道）。在这种情况下，建议收集年轻青少年患者（15至19岁）的未更新智齿，因为ERM细胞数量随着牙齿发育和年龄28岁而减少。第五，细胞悬浮液中DF组织中剩余的未分散的硬组织片段（即使在过滤后）导致BMM滴不稳定，并且在培养过程中更容易脱落。如果在解离的DF细胞悬浮液中观察到多个未分散的硬组织片段，则建议使用较高百分比的BMM（例如80%）。第六，强烈建议在培养的第10天和第14天之间通过类器官，因为较长的培养时间会对类器官的可膨胀性产生负面影响，因为解离效果较差。如果由于一种或另一种原因，类器官的培养时间超过14天，则可以延长TryplE Express的数量和用于类器官解离的孵育时间以实现有效的解离，尽管不应超过15分钟的酶暴露。在相同的情况下，培养基必须每2-3天刷新一次，以防止营养和生长因子耗尽。如果类器官不能正常膨胀，无论上面提到的临界点如何，都应该专注于保留所有工具（BMM，用于预涂层尖端的冰冷SFDM，微量离心管）在冰上传代期间使用。此外，正确应用不同的传代方法（低传代和高传代方法）对于类器官的有效传代至关重要。
以前，其他组报告了原代人DESC / ERM组织的 体外 生长8，9，10，11，12，21。然而，培养物主要是2D（单层）而不是3D，例如这种类器官模型，而且仅显示短期生长和表型保留。或者，经常（自发地）使用永生化细胞，然而，它们不是生理性的，并且仅显示出与起源组织或细胞的有限相似性。此外，这些细胞系来自胚胎组织和/或动物。此外，阿美母细胞的分化要么没有描述，要么只被有限地记录下来。因此，这里介绍的类器官模型提供了几个优点，即（i）忠实地概括起源组织/细胞，（ii）长期可扩展，（iii）在3D中培养更紧密地代表 体内 配置，（iv）人类起源和产后年龄，以及（v）能够分化成成熟的牙科细胞（ameloblast细胞类型）（见19）。
因此，我们生成了一个有价值的研究工具，以前没有报告过，其中包含几个有趣的应用程序（图1B）。类器官可用于研究人体DESC / ERM干性和可塑性。它提供了通过免疫荧光，基因表达和（单细胞）转录组分析进一步深入了解仍然神秘的ERM细胞群生物学的机会。此外，类器官特别适用于人类疾病建模，以破译致病机制，识别（新的）治疗靶点并生成药物发现和筛选工具29。更具体地说，该模型可以应用于牙源性囊肿（没有可靠的研究模型可用），可以与健康的牙齿衍生类器官进行比较。此外，这种牙齿类器官方法可用于模拟和研究牙齿疾病，从细菌的影响到与牙齿异常相关的基因突变（例如P63中的突变，可以使用尖端的基因编辑方法（如CRISPR-Cas）30引入，最终导致潜在的，新颖的治疗靶点和治疗方法。牙齿类器官方案的其他应用可能包括生物样本库（目前已经可用于牙髓，例如Future Health Biobank）31 以收集来自多种人和疾病的类器官系（例如，用于基础和转化研究，例如药物筛选）。此外，最近发表了几份关于复合类器官模型的报告，该模型不仅含有上皮，还含有起源组织的其他细胞类型32，33。由于牙齿组成相当复杂，容纳间充质，免疫和内皮细胞，将这种上皮类器官模型与这些细胞类型结合使用以更详细地代表其 体内 对应物是一个吸引人的观点。此外，该系统允许探索人类牙齿中的变质发生，目前只是知之甚少，但肯定依赖于上皮 - 间充质相互作用。破译阿美巴斯特的发展有望代表牙科科学和临床领域的重要飞跃，因为牙釉质的生产，我们牙齿的典型成分，是牙科组织修复中备受追逐的目标。此外，本研究中详述的类器官建模可能意味着 体外 矿化组织形成的开始，并为开发用于替代疗法的生物工程牙齿（或至少部分）铺平了道路。
类器官模型的局限性之一是它仅代表组织的上皮成分。然而，如上所述，这一缺点可以通过添加其他细胞/组织类型来解决，例如牙齿间充质19。另一个可能被认为是限制的方面是这里使用的BMM的起源（Matrigel）。这种BMM来自小鼠的肉瘤（Engelbrecht-Holm-Swarm），因此在将类器官方法转化为临床之前必须更换。最近，已经做出了一些努力，用合成水凝胶34，35取代基质凝胶。然而，需要更多的研究才能在这种非天然凝胶中成功生长类器官。虽然类器官技术为未来的牙科再生疗法提供了一种有趣的方法 - 例如，生物工程牙齿的发展 - 但应该提出有关细胞供体的隐私以及人类类器官及其衍生组织的商业化的伦理问题。到目前为止，尚未得出关于用于再生目的的类器官商业化的结论36。牙髓生物库一直在上升31，以及来自几个（主要是癌组织）的类器官生物库，用于药物筛查目的。鉴于类器官不能被归类为细胞，配子，组织或器官（它们都受法律管制），因此迫切需要描述其在临床，科学或商业环境中使用的法律地位。尽管类器官已被证明在皮下移植到 体内19时会沉积矿化组织，但需要进一步的研究来分析它们沉积类似于天然人类牙齿的牙釉质的潜力。
总而言之，开发的新类器官模型为研究人类牙齿（干细胞）生物学和退化发生提供了一种有前途的宝贵工具，目前两者都只是探索不足，未来展望牙齿疾病建模和再生疗法。
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Disclosures
通讯作者确保所有作者都披露了任何和所有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢UZ Leuven口腔颌面外科（MKA）的所有工作人员以及患者在收集新鲜提取的第三磨牙方面提供的宝贵帮助。我们还要感谢Reinhilde Jacobs博士和Elisabeth Tijskens博士在样本收集方面的帮助。这项工作得到了鲁汶大学（BOF）和FWO-Flanders（G061819N）的资助。L.H.是FWO博士研究员（1S84718N）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120.086 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-6250 | |
| 48-well flat bottom plates | Corning | 3548 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330.03 | |
| AMELX antibody | Santa Cruz | sc-365284 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15200018 | |
| B27 (without vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Cassette | VWR | 7202191 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma-Aldrich | C100 | |
| CD44 antibody | Abcam | ab34485 | |
| Cell strainer, 40 µm | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759 | |
| CK14 antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-11599 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Cover glass | VWR | 6310146 | |
| Cryobox | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | |
| DMEM 1:1 F12 without Fe | Invitrogen | 074-90715A | |
| DMEM powder high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Dnase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 - 10ML | |
| Embedding workstation, 220 to 240 Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol absolute, ≥99.8% (EtOH) | Fisher Chemical | E/0650DF/15 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| FGF2 (= basic FGF) | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| FGF8 | Peprotech | AF-100-25 | |
| GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | RTN350-1KT | Includes 1% β-mercaptoethanol dissolved in lysis buffer |
| Glass Pasteur pipette | Niko Mechanisms | 170-40050 | |
| Glycine | VWR | 101194M | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| IGF-1 | PeproTech | 100-11 | |
| InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI) | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| ITGA6 antibody | Sigma-Aldrich | HPA012696 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Matrigel (growth factor-reduced; phenol red-free) | Corning | 15505739 | |
| Microscope slide | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SLGV033R | |
| Minimum essential medium eagle (αMEM) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| mouse IgG (Alexa 555) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetyl L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| P63 antibody | Abcam | ab124762 | |
| Pap Pen | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | Marking pen |
| Paraformaldehyde (PFA), 16% | Merck | 8.18715 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| Petri dish | Corning | 353002 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Pipette (P20, P200, P1000) | Eppendorf or others | 2231300006 | |
| Plastic transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.001 | |
| Rabbit IgG (Alexa 488) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| RSPO1 | PeproTech | 120-38 | |
| SB202190 (p38i) | Biotechne (Tocris) | 1264 | |
| Scalpel (surgical blade) | Swann-Morton | 207 | |
| SHH | R&D Systems | 464-SH-200 | |
| Silicone molds (Heating block) | VWR | 720-1918 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P-5280 | |
| SOX2 antibody | Abcam | ab92494 | |
| StepOnePlus | Thermo Fisher Scientific | Real-Time PCR System | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile 1000 μL pipette tips with filter | Greiner | 740288 | |
| Sterile 20 μL pipette tips with filter | Greiner | 774288 | |
| Sterile 200 μL pipette tips with and without filter | Greiner | 739288 | |
| Sterile H2O | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Superscript III first-strand synthesis supermix | Invitrogen | 11752-050 | Reverse transcription kit |
| Tissue processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Transferrin | Serva | 36760.01 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| TrypLE express | Gibco | 12605-010 | |
| Vectashield mounting medium+DAPI | Labconsult NV | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| WNT3a | Biotechne (Tocris) | 5036-WN-500 | |
| Xylenes, 99%, for biochemistry and histology | VWR | 2,89,75,325 |
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