Summary
Представлен протокол развития эпителиальных органоидных культур, начиная с зубов человека. Органоиды надежно расширяются и рекапитулируют эпителиальные стволовые клетки зуба, включая их способность дифференцировать амелобласты. Уникальная органоидная модель предоставляет многообещающий инструмент для изучения биологии зубов человека (стволовых клеток) с перспективами для зубо-регенеративных подходов.
Abstract
Зубы имеют ключевое значение в жизни не только для жевания пищи и речи, но и для психологического благополучия. Знаний о развитии зубов человека и биологии мало. В частности, мало что известно об эпителиальных стволовых клетках зуба и их функции. Нам удалось разработать новую органоидную модель, начиная с ткани человеческого зуба (то есть зубного фолликула, выделенного из удаленных зубов мудрости). Органоиды надежно и в долгосрочной перспективе расширяются и повторяют предложенный компартмент эпителиальных стволовых клеток человеческого зуба с точки зрения экспрессии маркеров, а также функциональной активности. В частности, органоиды способны разворачивать процесс дифференцировки амелобласта, происходящий in vivo во время амелогенеза. Эта уникальная органоидная модель предоставит мощный инструмент для изучения не только развития зубов человека, но и стоматологической патологии, и может проложить путь к регенеративной терапии зубов. Замена потерянных зубов биологическим зубом, основанным на этой новой органоидной модели, может стать привлекательной альтернативой нынешней стандартной имплантации синтетических материалов.
Introduction
Зубы играют важную роль в жевании пищи, речи и психологическом благополучии (самооценке). Зуб человека состоит из высокоминерализованных тканей различной плотности и твердости1. Зубная эмаль, основной компонент коронки зуба, является самой высокой минерализованной тканью в организме человека. Во время образования эмали (амелогенеза), когда развиваются зубы, зубные эпителиальные стволовые клетки (DESC) дифференцируются в эмалообразующие клетки (амелобласты). После образования эмаль редко восстанавливается или обновляется из-за апоптотической потери амелобластов в начале прорезывания зуба1. Восстановление поврежденной ткани эмали, вызванной травмой или бактериальным заболеванием, в настоящее время осуществляется с использованием синтетических материалов; тем не менее, они обеспокоены важными недостатками, такими как микроразрыв, нижняя остеоинтеграция и крепление, конечная продолжительность жизни и отсутствие полностью функционального ремонта2. Следовательно, прочная и надежная культура человеческих DESC, обладающих способностью генерировать амелобласты и потенциалом для производства минерализованной ткани, станет важным шагом вперед в области регенеративной области зубов.
Знания о фенотипе DESC человека и биологической функции скудны 3,4,5. Интересно, что DESC человеческих зубов были предложены для существования в остатках эпителиальных клеток Малассеза (ERM), клеточных кластерах, присутствующих в зубном фолликуле (DF), который окружает неразъединенные зубы и остается присутствующим в периодонтальной связке вокруг корня после прорезывания зуба1. Было обнаружено, что клетки ERM, культивируемые совместно с пульпой зуба, дифференцируются в амелобластоподобные клетки и генерируют эмалеобразную ткань6. Однако глубокие исследования специфической роли ERM-клеток в генерации эмали (re-) были ограничены из-за отсутствия надежных моделей исследования7. Современные системы культивирования ERM in vitro затруднены ограниченной продолжительностью жизни и быстрой потерей фенотипа в 2D-условиях, стандартно используемых 8,9,10,11,12. Следовательно, крайне необходима разрешимая система in vitro для добросовестного расширения, изучения и дифференциации человеческих DESC.
В течение последнего десятилетия мощная техника выращивания эпителиальных стволовых клеток in vitro была успешно применена к нескольким типам (человеческих) эпителиальных тканей для изучения их биологии, а также заболеваний 13,14,15,16. Эта технология позволяет тканевым эпителиальным стволовым клеткам самостоятельно развиваться в 3D-клеточные конструкции (то есть органоиды) при посеве во внеклеточный матрикс (ECM), имитирующий каркас (обычно Matrigel), и культивируемый в определенной среде, реплицирующей нишу стволовых клеток ткани, сигнализирующую и / или эмбриогенез. Типичные факторы роста, необходимые для развития органоидов, включают эпидермальный фактор роста (EGF) и активаторы сайта интеграции MMTV бескрылого типа (WNT) 14,15,16. Полученные органоиды характеризуются длительной точностью в имитации оригинальных эпителиальных стволовых клеток ткани, а также высокой расширяемостью при сохранении их фенотипа и функциональных свойств, тем самым преодолевая часто ограниченную первичную доступность тканей человека, приобретенную в клинике. Для установления органоидов выделение эпителиальных стволовых клеток из гетерогенной ткани (т.е. содержащей другие типы клеток, таких как мезенхимальные клетки) до культивирования не требуется, поскольку мезенхимальные клетки не прикрепляются или не процветают в ECM, что в конечном итоге приводит к чисто эпителиальным органоидам 13,16,17,18,19 . Эта многообещающая и универсальная технология привела к разработке многообразных органоидных моделей из различных эпителиальных тканей человека. Однако органоиды человеческого происхождения, ценные для глубокого изучения развития, регенерации и заболеваний зубов, еще не были установлены20,21. Недавно нам удалось разработать такую новую органоидную модель, начиная с DF-ткани из третьих моляров (зубов мудрости), удаленных у пациентов подросткового возраста19.
Здесь мы описываем протокол развития эпителиальных органоидных культур из взрослого человеческого зуба (т.е. из DF третьих моляров) (рисунок 1A). Результирующие органоиды экспрессируют ERM-ассоциированные маркеры стволовости, будучи при этом долгосрочными расширяемыми. Интересно, что в отличие от большинства других органоидных моделей, обычно необходимый EGF является избыточным для устойчивого развития и роста органоидов. Интересно, что органоиды ствола проявляют свойства дифференцировки амелобласта, тем самым имитируя особенности и процессы ERM/DESC, происходящие in vivo. Новая и уникальная органоидная модель, описанная здесь, позволяет исследовать биологию, пластичность и дифференциацию DESC и открывает двери для первых шагов к зубо-регенеративным подходам.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь, были одобрены Комитетом по этике исследований UZ/KU Leuven (13/0104U). Удаленные третьи моляры (зубы мудрости) были получены после информированного согласия пациентов.
1. Препараты
- Предварительно прогреть 48-луночную культуральную пластину в течение 15-20 ч в 1,9% CO2 инкубаторе при 37 °C.
- Сжижение аликвоты Матригеля (снижение фактора роста; фенол не содержит красного цвета; далее называется базальной мембранной матрицей; BMM) на льду (4°C) в течение как минимум 2 ч до этапа 2.1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте циклов замораживания/оттаивания BMM. Разжижают БММ в течение 15-20 ч на льду и аликвоте по 1 мл в микроцентрифужных пробирках и хранят при -20 °C. - Охладите центрифугу до 4 °C.
- Подготовьте среду и процедите раствор через фильтр 0,22 мкм. Следующие тома основаны на коллекции DF из всех четырех третьих моляров, обычно извлекаемых одновременно.
- Готовят 20 мл коллекционной среды DF (таблица 1): минимально необходимую среднюю орлиную (αMEM), содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 0,5% амфотерицина B и 1% пенициллина-стрептомицина. Переложите 4 мл среды сбора DF в трубку объемом 15 мл и переложите трубки на лед.
ПРИМЕЧАНИЕ: Одной пробирки объемом 15 мл на одного пациента достаточно для отбора проб (т.е. для четырех третей моляров). - Сделать 20 мл зубной органоидной среды (далее именуемой ТОМ; Таблица 2) с использованием безымянной определенной среды (SFDM; Таблица 3). Храните TOM при температуре 4 °C в течение максимум 2 недель.
- Готовят 8 мл диссоциационной среды (таблица 4), т.е. фосфат-буферного физиологического раствора (PBS), содержащего коллагеназу VI (3 мг/мл) и диспазу II (4 мг/мл). Предварительно согрейте диссоциационную среду на водяной бане с температурой 37 °C в течение не менее 10 минут перед использованием и перенесите ее в две трубки по 15 мл (4 мл на трубку) для диссоциации четырех тканей DF.
- Подготовьте промывочную плиту (12 скважин), содержащую: три скважины с 70% EtOH, три скважины с PBS и три скважины со средой сбора DF.
- Сделать 15 мл среды А на образец (т.е. 5 мл на два ФД на пациента; Таблица 5).
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие действия следует выполнять в стерильных условиях.
- Готовят 20 мл коллекционной среды DF (таблица 1): минимально необходимую среднюю орлиную (αMEM), содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 0,5% амфотерицина B и 1% пенициллина-стрептомицина. Переложите 4 мл среды сбора DF в трубку объемом 15 мл и переложите трубки на лед.
2. Диссоциация зубных фолликулов
- После того, как третьи коренные зубы с ассоциированными ДФ собраны в среде сбора (на льду), перенесите содержимое трубок в чашку Петри.
- Удерживайте зуб пинцетом и тщательно изолируйте ДФ с помощью хирургического лезвия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг требует практики; будьте осторожны с лезвием. - Чтобы смыть оставшуюся кровь с DF, поместите DF-ткани ненадолго в первую лунку 70% EtOH (моющая пластина) на 20 с, а затем перенесите в следующую скважину EtOH на 20 с, а далее в третью лунку EtOH (максимум 1 мин в 70% EtOH в общей сложности; более длительное время инкубации приведет к снижению жизнеспособности клеток).
- Затем продолжайте промывку в трех скважинах PBS (максимум 2 мин в общей сложности).
- Промывайте ДФ в трех оставшихся скважинах для сбора DF (максимум до 20 мин в общей сложности).
- Переложите промытые TF на новую чашку Петри.
- Вырежьте небольшой кусочек одного из DF (~5 мм2) для фиксации параформальдегида (PFA) (см. раздел 7) и храните его на льду (максимум 6 ч) в микроцентрифужной трубке, содержащей 500 мкл среды сбора DF до фиксации PFA.
- Измельчите остальные TF небольшими кусочками (~1 мм2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется немедленно обрабатывать свежеизолированные ткани DF для оптимального органоидного образования и эффективности роста, а не начинать с криоконсервированной ткани, что приводит к снижению эффективности. Тем не менее, на этом этапе можно криоконсервировать первичную ткань DF (см. криоконсервационную среду и протокол в разделе 5). - Переложить измельченные ДФ в пробирку объемом 15 мл, содержащую 4 мл предварительной диссоциационной среды, и высиживать на водяной бане 37 °C в течение 2 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте два ДФ на 4 мл предварительной диссоциационной среды (одна трубка) для обеспечения оптимальной диссоциации. - Каждые 15 минут пипетируйте DF-диссоциационную среду, смешивая вверх и вниз, используя стеклянную пипетку Пастера, чтобы ускорить распад тканей. Когда куски DF больше не наблюдаются (обычно через 1 ч), продолжайте диссоциацию DF с использованием суженной огнеполированной пипетки Пастера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимальной диссоциации DF переключитесь на пипетку Пастера, суженную огнеупорной полировкой, не позднее 1 ч изоляции DF.- Тем временем готовят 10 мл среды А, содержащей 50 мкл ДНКазы (0,2 мг/мл; Таблица 5).
- Добавляют 5 мл среды А (содержащей ДНКазу) в каждую пробирку с диссоциированным ДФ и инкубируют в течение 1 мин при комнатной температуре (RT).
- Фильтруйте клеточную суспензию (содержащую одиночные клетки и мелкоклеточные сгустки) через клеточный сетчатый фильтр 40 мкм, чтобы удалить оставшиеся крупные фрагменты и (большую часть) фиброзную ткань.
- Объедините несколько трубок с диссоциированным DF у одного пациента на этом этапе.
- Промыть фильтр 1 мл среды А. Центрифугировать фильтрованную клеточную суспензию при 200 х г в течение 10 мин при 4 °С.
- Удалите супернатант, повторно суспендируйте гранулу в 1 мл SFDM (таблица 3) и перенесите клеточную суспензию в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
- Рассчитайте концентрацию ячеек с помощью автоматического счетчика ячеек. Пренебрегайте клеточными сгустками, которые остаются.
- Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин при 4 °C.
3. Создание органоидной культуры зубов (рисунок 1А и рисунок 2А)
- Исходя из полученного номера ячейки, рассчитайте количество лунок, которые можно засеять. Одна капля 20 мкл должна содержать 20 000 клеток. Конечная смесь состоит из клеточной суспензии и BMM в соотношении 30:70.
- Удалите соответствующее количество супернатанта и повторно суспендируйте в ледяном BMM для получения соотношения 70:30 BMM: клеточная суспензия для покрытия. Например, при получении 200 000 клеток пластинчатая 10 капель по 20 мкл. Таким образом, удаляют супернатант до тех пор, пока не останется 60 мкл клеточной суспензии, добавляют 140 мкл ледяного BMM и повторно суспендируют.
- Медленно восстанавливайте, чтобы избежать образования пузырьков воздуха. После повторного суспендирования в BMM держите трубку микроцентрифуги на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сохранение трубки микроцентрифуги на льду имеет решающее значение для предотвращения затвердевания BMM.
- Медленно восстанавливайте, чтобы избежать образования пузырьков воздуха. После повторного суспендирования в BMM держите трубку микроцентрифуги на льду.
- Пипетка капель БММ объемом 20 мкл в центре скважин предварительно нагретой 48-луночной культуральной пластины.
- Переверните пластину вверх дном, поместите ее в инкубатор с 1,9% CO2 (% CO2 в соответствии с буфером SFDM) и дайте ей затвердеть в течение не менее 20 минут при 37 °C.
- Добавьте ингибитор ROCK (RI; 10 мкМ) и амфотерицин B (0,1%) к TOM и предварительно разогрейте среду на водяной бане с температурой 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Амфотерицин B является светочувствительным. - Возьмите 48-луночную пластину из инкубатора, поместите вертикально и добавьте 250 мкл подготовленной предварительно подготовленной среды в каждую лунку с каплями / клетками BMM и верните пластину в инкубатор 1,9% CO2 .
- Чтобы освежить среду (предпочтительно каждые 2-3 дня), наклоните 48-луночную пластину под углом 45°, осторожно удалите предыдущую среду, избегая прикосновения к капле BMM, и добавьте 250 мкл новой предварительно выровненной среды TOM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется обновлять не реже трех раз в неделю, чтобы избежать истощения ключевых питательных веществ и факторов роста. RI необходимо добавлять к TOM только при первоначальном посеве и в первые дни каждого пассирования (см. раздел 4), чтобы предотвратить гибель клеток аноикисом и усилить рост органоидов. Амфотерицин B добавляют в среду только во время прохождения 0 (P0), чтобы блокировать возможное грибковое загрязнение.
4. Амплификация и прохождение органоидной культуры зубов (рисунок 1B и рисунок 2B)
- Прохождение органоидов между 10 и 14 днями культивирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте культивирования в течение более длительного периода, так как длительная культура может ограничить отрастание и проходимость органоидов. Только при начальном развитии (Р0) органоиды можно культивировать до 20 суток в зависимости от скорости их роста (до достижения максимального ±200 мкм в диаметре). - Удалите среду из колодцев с органоидами, которые необходимо пройти. В пределах одного условия культивирования объединяют до четырех сливающихся скважин (см. рис. 2С).
- Чтобы собрать органоиды, добавьте 400 мкл ледяного SFDM на лунку непосредственно на каплю BMM и многократно пипетируйте среду вверх и вниз, пока вся капля BMM не будет смещена.
- В случае, если скважины объединяются, перенесите 400 мкл из первой скважины в следующую (и так далее), чтобы вытеснить органоидсодержащие капли BMM всех скважин, которые необходимо объединить.
- Переместите смещенный BMM-органоидный узел в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл и повторите шаг 4,3 еще раз, пока все органоидные структуры не будут собраны из скважин.
- Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин при 4 °C.
- Предваренная аликвота TrypLE Express (дополненная RI при 5 мкМ) на водяной бане 37 °C. На микроцентрифужную трубку органоидов необходим объем 400 мкл TrypLE Express.
- После центрифугирования удаляют супернатант и повторно суспендируют гранулу в 400 мкл TrypLE. Инкубировать суспензию на водяной бане при температуре 37 °C в течение 12 мин.
- Добавьте 400 мкл ледяного SFDM для инактивации фермента и центрифуги при 200 х г в течение 5 мин при 4 °C. Удалите супернатант.
- Предварительно покройте наконечник (объем см. ниже) ледяным SFDM и повторно суспендируйте органоидную гранулу.
- Чтобы избежать потери органоидов, повторно используйте один и тот же (предварительно покрытый) наконечник как можно больше, не ставя под угрозу стерильность.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем SFDM, необходимый для повторного использования гранулы, зависит от количества полученных органоидных структур и текущего проходного числа. - Как правило, для проходов от P0 до P2-3 (обычно все еще растет низкое количество органоидов) используется объем 200 мкл SFDM. Из проходов P3-4 или выше (обычно дающих большее количество органоидов) используют объем 700 мкл SFDM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обе процедуры называются соответственно методами "низкого прохода" и "более высокого прохода" (см. шаги 4.10 и 4.11). Правильное применение различных методов имеет решающее значение для эффективного прохождения органоидов. При методе более высокого прохода органоиды легче теряются и не должны применяться к низкому количеству органоидов (т. Е. От P0 до P2-3). Тем не менее, метод более высокого прохода необходим для эффективной диссоциации большего количества органоидов.
- Чтобы избежать потери органоидов, повторно используйте один и тот же (предварительно покрытый) наконечник как можно больше, не ставя под угрозу стерильность.
- Метод с низким проходом: Повторное суспендирование гранулы в 200 мкл ледяного SFDM. Прижмите полностью опорожненный наконечник пипетки к нижней части трубки микроцентрифуги, чтобы уменьшить ее диаметр. Проверьте, достаточно ли мал диаметр (медленная аспирация, поток перекошен, но не заблокирован). Пипетка вверх и вниз в течение 5 мин, чтобы механически нарушить работу органоидов.
- Метод более высокого прохода: Повторное суспендирование гранулы в 700 мкл ледяного SFDM с наконечником P1000. Добавьте наконечник P200 (без фильтра) поверх этого наконечника P1000 и предварительно покройте ледяным SFDM. Предотвратите образование пузырьков воздуха, регулируя настройку объема пипетки, чтобы достичь не менее 90% объема среды (с органоидами). Пипетка вверх и вниз в течение 5 мин, чтобы механически нарушить работу органоидов.
- Проверьте под световым микроскопом (при 4-кратном увеличении), если в основном получаются одиночные клетки с (только) несколькими недисперсированными структурами.
- Добавьте 500 мкл ледяного SFDM в микроцентрифужную трубку и осторожно смешайте диссоциированную клеточную смесь со свежим SFDM путем пипетки.
- Дайте крупным недисперсированным структурам оседать в течение 10 мин, вертикально поместив трубку микроцентрифуги на лед.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо удалить недисперсные структуры, поскольку они негативно влияют на органоидную проходимость. Для инициации органоидов (P0) эта стадия осаждения не нужна. - Соберите супернатант (~500-1000 мкл в зависимости от метода пассирования), содержащий одиночные ячейки и небольшие кластеры клеток; перевести в новую микроцентрифужную трубку и центрифугу при 190 х г в течение 10 мин при 4 °C.
- Рассчитайте концентрацию ячеек с помощью автоматического счетчика ячеек. Пренебрегайте клеточными сгустками, которые остаются.
- Подсчитайте, сколько скважин может быть засеяно, и рассчитайте соответствующее соотношение клеточной суспензии/BMM, как описано выше (раздел 3).
- Добавьте 70% BMM в гранулу ячейки и поддерживайте трубку микроцентрифуги на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно держать трубку микроцентрифуги на льду, чтобы избежать затвердевания BMM. - Перейдите к шагам с 3.3 по 3.7 и снова пройдите между 10-м и 14-м днем культуры.
5. Криоконсервация органоидов зубов
- Соберите и диссоциируйте органоиды, как упоминалось выше для пассажа (шаг 4). Центрифугируют клеточную суспензию при 200 х г в течение 5 мин при 4 °С.
- Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл криоконсервационной среды, содержащей SFDM (70%), FBS (20%) и DMSO (10%).
- Переведите суспензию в криовиальную и положите ее на лед. Поместите криовиалы в криобокс и перенесите на -80 °C (не менее 4 ч).
- В течение 1 месяца переведите замороженные образцы в жидкий азот для длительного (>12 месяцев) хранения.
6. Оттаивание криоконсервированных зубных органоидов
- Перед началом процедуры оттаивания поместите одну трубку объемом 15 мл на криовиал на лед, содержащий 10 мл SFDM с 20% FBS.
- Извлеките криовиал из жидкого азота и положите его на лед.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги как можно быстрее и избегайте слишком длительного времени оттаивания (>5 мин), а также слишком длинных интервалов между шагами (>5 мин), так как такое продление снизит выживаемость клеток. - Поместите криовиаль на ванну с теплой водой (37 °C) до размораживания (~1-2 мин).
- Немедленно перенесите содержимое криовиала в ледяную трубку объемом 15 мл и центрифугу при 200 х г в течение 5 мин при 4 °С.
- Удалить 9 мл супернатанта и центрифугировать оставшийся 1 мл при 200 х г в течение 5 мин при 4 °C. Удалите супернатант и промойте гранулу 1 мл ледяного SFDM.
- Перенесите суспензию ячейки в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл и подсчитайте ячейки с помощью автоматизированного счетчика клеток.
- Подсчитайте, сколько скважин может быть засеяно, и рассчитайте соответствующее соотношение клеточной суспензии/BMM, как описано выше (раздел 3).
- Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин при 4 °C. Повторно суспендировать гранулу в соотношении 70:30 BMM:TOM и держать на льду.
- Переходите к шагам с 3.3 по 3.7 и переходу между 10-м и 14-м днем культуры.
7. Фиксация и парафин-встраивание зубных органоидов
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура (включая разделы 8 и 9) также может быть применена к первичной ткани DF.
- Фиксация органоидов зубов в PFA
- Удалите среду из каждой скважины, как на шаге 4.2.
- Соберите органоиды, вытеснив каплю BMM (шаг 4.3). Перенесите смесь BMM-органоидов в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
- Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин при 4 °C.
- Удалите супернатант и добавьте 500 мкл 4% PFA и инкубируйте в течение минимум 30 мин (максимум 1 ч) при RT с мягким перемешиванием на орбитальном шейкере.
ВНИМАНИЕ: Используйте химическую вытяжку при работе с PFA. - Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин при 4 °C. Удалите супернатант и промойте органоидную гранулу PBS в течение 10 мин при RT с легким встряхиванием.
- Промыть органоидную гранулу (этап 7.1.5) дополнительно два раза. Раскрутите фиксированные органоиды вниз при 200 х г в течение 5 мин при 4 °C.
- Повторно суспендировать гранулы в 500 мкл 70% EtOH (в деионизированной воде). Хранить органоиды до 1 месяца в 70% EtOH при 4 °C.
- Агаро- и парафин-встраивание зубных органоидов
ПРИМЕЧАНИЕ: Для эффективного встраивания органоидов в парафин необходим дополнительный этап встраивания в агарозу.- Центрифугировать PFA-фиксированные органоиды в 70% EtOH при 200 х г в течение 5 мин при 4 °C. Удалите супернатант.
- Приготовьте 2% раствор агарозы в 30 мл ПБС в стеклянном флаконе. Разогрейте смесь агароза-PBS в микроволновой печи до тех пор, пока не будет наблюдаться гелеобразная структура (примерно 2,5 мин при 600 Вт).
- Параллельно добавьте 30 мл PBS в другую стеклянную бутылку и разогрейте в микроволновой печи (примерно 2,5 мин при 600 Вт). Дайте раствору агарозы остыть в течение 1 мин.
- Вырежьте конец наконечника P200, чтобы обеспечить точную работу с раствором агарозы и избежать пузырьков воздуха.
- Предварите наконечник P200 в теплом PBS, несколько раз пипеткой вверх и вниз.
- Добавьте 150 мкл предварительно приготовленного раствора агарозы к органоидной грануле и осторожно пипетируйте органоидно-агарозную смесь (с минимальным повторным суспензией), избегая пузырьков воздуха.
ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальное повторное суспендирование позволит лучше расположить органоиды в агарозном геле при сечении микротомов, поскольку органоиды тогда находятся ближе друг к другу. - Немедленно перенесите органоидно-агарозную смесь в тот же колпачок микроцентрифуги, поместите трубку горизонтально и дайте агарозе затвердеть (~20 мин при RT). А пока маркируйте кассеты.
- После затвердевания удалите агарозный гель из колпачка микроцентрифуги с помощью пинцета и перенесите его на маркированную кассету.
- Переложите агарозсодержащую кассету в стакан, содержащий 50% EtOH в деионизированной воде. Накройте стакан парапленкой, чтобы избежать испарения EtOH.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем стакана зависит от количества кассет. - Обработайте образцы в тканевом процессоре в течение ночи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку парафин затвердевает при RT, следующие шаги должны быть выполнены быстро. - Предварительно прогрейте нагревательный блок во встраиваемой рабочей станции в течение 15 мин.
- Извлеките органоид-содержащий агарозный гель, заключенный в кассету, и поместите его в предварительно расплавленный нагревательный блок. Снимите колпачок с кассеты и отложите его в сторону для последующего использования.
- Заполните оставшийся нагревательный блок парафином.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте пинцетом, находится ли органоидный агарозный гель в нижней части нагревательного блока. Из-за его легкого веса он может начать плавать, что приведет к потере образца. - Поместите колпачок кассеты поверх нагревательного блока. Дайте ему затвердеть в течение 30 минут на холодной тарелке. Снимите нагревательный блок и храните парафиновые блоки при температуре 4 °C.
8. Микротомовое сечение и окрашивание органоидов зубов (Рисунок 2В и Рисунок 3А-С)
- Микротомовое сечение органоидсодержащих парафиновых блоков
- Срежьте 5 мкм участков органоидов зуба в парафиновых блоках с помощью микротома.
- Поместите ломтики парафина поверх стеклянного предметного стекла микроскопа. Поместите стеклянный слайд микроскопа на теплую пластину при 37 °C и накройте ее деионизированной водой с помощью пипетки Пастера.
- Дайте стеклу микроскопа высохнуть в течение ночи.
- Окрашивание органоидных участков зуба
- Депарафинизируйте органоидные участки (на стеклянном предметном стекле микроскопа) в духовке в течение 1 ч при 58 °C.
- Регидратируйте органоидные участки (на стеклянном предметном стекле микроскопа) в уменьшающемся ряду EtOH внутри химического капота в следующем порядке:
Ксилол 2x по 3 мин каждый
100% EtOH 2x по 3 мин каждый
95% EtOH 2x в течение 3 мин каждый
90% EtOH 2x по 3 мин каждый
70% EtOH 3x по 3 мин каждый
ВНИМАНИЕ: Используйте химическую вытяжку при работе с ксилолом. - Промойте стеклянный предмет микроскопа в водопроводной воде в течение 5 минут при RT. Затем промойте его в PBS в течение 5 минут на RT.
- Выполните извлечение антигена, поместив органоидные участки (на стеклянном предметном стекле микроскопа) в предварительно расплавленный цитратный буфер (10 мМ лимонной кислоты в деионизированной воде с рН 6; в пластиковый контейнер; предварительно расплавленный в течение 10 мин на водяной бане 95 °C) в течение 30 мин на водяной бане 95 °C.
- Дайте стеклу микроскопа остыть в течение 20 мин при RT. Промойте стеклянный слайд микроскопа в PBS в течение 5 минут при RT, а затем в PBS, содержащем 0,1% Triton-X (PBT) в течение 5 минут при RT.
- Используйте маркировочную ручку, чтобы создать гидрофобный барьер на границах каждого слайда.
- Блокировать в течение минимум 1 ч при РТ в блокирующем буфере (содержащем 1,5 мг/мл глицина, 2 мг/мл альбумина в бычьей сыворотке (БСА), растворенной в ПБТ) плюс 10% ослиной сыворотки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, на стеклянный предмет микроскопа требуется 300 мкл блокирующего буфера плюс 10% ослиной сыворотки. - Поместите стеклянный предмет микроскопа во влажную камеру. Используйте герметичный ящик, где все слайды помещаются, и смочите несколько бумажных салфеток водой, чтобы поместить их на дно коробки. Это предотвратит высыхание горок во время последующих этапов окрашивания.
- Удалите блокирующий буфер, добавьте первичное антитело (таблица 6), приготовленное в блокирующем буфере плюс 1% ослиную сыворотку, и инкубируйте слайд, покрытый раствором антител, на ночь во влажной камере при 4 °C. При необходимости повторите маркировку границы пера.
- Промыть стеклянный предмет микроскоп три раза в ПБТ при RT в течение 10 мин с мягким перемешиванием на орбитальном шейкере (75-150 об/мин).
- Добавляют вторичное антитело (табл. 6), приготовленное в блокирующем буфере плюс 1% ослиной сыворотке, и инкубируют в течение 1 ч во влажной камере при РТ.
- Снимите блокирующий буфер и трижды промойте стеклянный слайд микроскопа в PBT at RT в течение 10 минут с мягким перемешиванием на орбитальном шейкере.
- Добавьте антизатухающую монтажную среду с DAPI (от 1 до 3 капель) на стеклянную крышку и установите ее поверх органоидных секций (на стеклянном предметном стекле микроскопа). Приступайте к визуализации; хранить слайды не более 1 недели при температуре 4 °C.
9. Экстракция РНК и RT-qPCR зубных органоидов (рисунок 2B и рисунок 3D)
- Удаление РНК органоидов зуба
- Извлеките среду из каждой лунки (шаг 4.2).
- Соберите органоиды, вытеснив каплю BMM (стадия 4.3), перенесите смесь BMM-органоидов в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл и центрифугу при 200 х г в течение 5 мин при 4 °C.
- Удалить надосадочный материал, энергично повторно суспендировать в 350 мкл 1% β-меркаптоэтанола, растворенного в буфере лизиса (Таблица материалов), и положить на лед.
ВНИМАНИЕ: Выполните все шаги с β-меркаптоэтанолом в химической вытяжке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут храниться на этом этапе до 1 месяца при -80 °C. Разморозьте образцы на льду, прежде чем приступить к этапу 9.1.4. - Вращайте образцы до тех пор, пока органоидные структуры больше не будут наблюдаться.
- Приступайте к экстракции РНК с помощью набора для экстракции РНК (Таблица материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
- RT-qPCR зубных органоидов (таблица 7)
- Реверс-транскрибировать (RT) РНК19 с помощью набора обратной транскрипции (Таблица материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
- Анализ полученных образцов кДНК с помощью количественной ПЦР (qPCR)19 на основе SYBR Green с использованием системы ПЦР в реальном времени (Таблица материалов).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Развитие органоидов зуба
Мы предоставляем подробный протокол для установления органоидных культур из DF-ткани человека, приобретенной после удаления зуба мудрости (рисунок 1A). Изолированный ДФ ферментативно и механически диссоциирован. Полученные клетки культивируют в пределах БММ в средах, которые были эмпирически определены для оптимального развития и роста органоидов (зубная органоидная среда; ТОМ)19.
Органоиды обычно развиваются в течение 2 недель после посева клеток DF (P0; Рисунок 2А). Органоиды являются долгосрочными расширяемыми (до 11 проходов до сих пор) (рисунок 2B, показанный на P4). Посев около 20 000 клеток на каплю BMM (как в P0, так и в последующих проходах) дает оптимальную плотность органоидов (рисунок 2C), тогда как посев более высоких чисел клеток приводит к неоптимальному органоидному росту (то есть меньшим органоидам при слишком высокой плотности), поскольку недостаточно места для роста (рисунок 2D). В конечном итоге оптимизированные условия культивирования позволяют развивать органоиды из образцов DF со 100% эффективностью19.
Характеристика и валидация органоидов зубов
Развитые органоиды показывают плотный вид и содержат клетки, демонстрирующие высокое нуклеоцитоплазматическое соотношение, как аналогично наблюдается в клетках ERM7 (рисунок 3A). Более того, и в дальнейшей аналогии, органоиды экспрессируют ERM-маркер цитокератин 14 (CK14)22, тем самым подтверждая свое эпителиальное происхождение (фиг.3B), а также другие предложенные маркеры ERM (такие как P63, CD44 и ITGα6 12,22,23 (Рисунок 3B). Кроме того, органоиды экспрессируют SOX2, хорошо известный маркер DESC у мышей, а также присутствуют в эпителии развивающихся зубов человека (рисунок 3B)1. Интересно, что амелогенин (AMELX), основной компонент эмалевой матрицы, также обнаруженный в органоидах, также обнаружен в ERM24 (Рисунок 3C). Экспрессия еще других маркеров ERM/stemness описана в нашем недавнем исследовании19 и может быть использована для дальнейшей сертификации полученных органоидов. Кроме того, органоиды сохраняют свой фенотип ERM/stemness во время пассирования, среди прочего, что проявляется стабильной экспрессией маркеров ERM/стволовых клеток (рисунок 3D). Наконец, органоиды, полученные из зубов, демонстрируют способность дифференцировать амелобластные (подобные) клетки, которые также могут быть применены для проверки полученных органоидных культур, демонстрируя экспрессию зрелых маркеров амелобласта, таких как одонтогенно-амелобластный ассоциированный белок (ODAM) и амелотин (AMTN) после переноса в дифференцирующую среду (см.19).
Рисунок 1: Схематический рабочий процесс развития, характеристики и применения органоидов зубов. (A) Развитие органоида зуба из ткани зубного фолликула (DF), выделенной из неразвитых третьих моляров. (B) Амплификация, характеристика и потенциал применения зубных органоидов. г, день; , пассаж. Создано с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Развитие органоидов зуба. (А) Развитие органоидов из ткани DF. Репрезентативные изображения яркого поля, показанные в разные дни (d) после посева (P0; , пассаж; 2.5x). (B) Изображения Брайтфилда, показывающие надежную проходимость зубной органоидной линии (2,5x). (C) Изображения Брайтфилда, показывающие органоидную линию зуба непосредственно при прохождении (d0; слева; 2,5x), засеянную при плотности 20 000 клеток на лунку, и результирующую сливающуюся органоидную культуру, готовую к прохождению (d14; справа; 2,5x). (D) Изображения Брайтфилда, показывающие зубную органоидную линию, которая была засеяна с плотностью > 20 000 клеток, что привело к меньшим органоидам при слишком высокой плотности при d14 (2,5x). Шкала: 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Характеристика органоидов зубов. (A) Изображения Брайтфилда органоидных культур, полученных из DF, при различных увеличениях, показывающие плотные структуры, развитые через 14 дней в TOM (P4; 5-20x)). Окрашивание органоида гематоксилином и эозином (Р1, день 11). Коробка увеличена. Стрелками обозначены клетки с высоким нуклеоцитоплазматическим соотношением. (B) Иммунофлуоресцентное окрашивание эпителиальных/ЭРМ/стволовых маркеров в органоидах, выращенных TOM (20x). (C) Иммунофлуоресцентное окрашивание амелогенина (AMELX) в органоиде, выращенном TOM (20x). DAPI (синий) использовался для маркировки ядер. (D) Уровни экспрессии генов (относительно GAPDH) маркеров ERM/stemness в органоидах, выращенных P1 и P5 TOM, на 14-й день культивирования (средняя ± SEM; n = 3 биологических репликата). Шкала: 50 мкм, если не указано иное. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Среда сбора зубного фолликула (DF) | |
| Имя | Концентрация |
| Минимально необходимый средний орел (αMEM) | |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | 10% |
| Амфотерицин B | 0.5% |
| Пенициллин-стрептомицин (Pen/Strep) | 1% |
Таблица 1: Среда сбора зубных фолликулов (DF). В таблице перечислены компоненты носителя коллекции DF.
| Зубная органоидная среда (TOM) | |
| Имя | Концентрация |
| Определенная среда без сыворотки (SFDM) | Состав см. в таблице 3 |
| А83-01 | 0.5 мкМ |
| B27 (без витамина А) | 2% |
| Холерический токсин | 100 нг/мл |
| FGF2 (= базовый FGF) | 20 нг/мл |
| ФГФ8 | 200 нг/мл |
| ФГФ10 | 100 нг/мл |
| L-глютамин | 2 мМ |
| ИФР-1 | 100 нг/мл |
| Н2 | 1% |
| N-ацетил L-цистеин | 1.25 мМ |
| Никотинамид | 10 мМ |
| Башка | 100 нг/мл |
| РСПО1 | 200 нг/мл |
| SB202190 (стр. 38i) | 10 мкМ |
| Тсс | 100 нг/мл |
| WNT3a | 200 нг/мл |
Таблица 2: Зубная органоидная среда (ТОМ). В таблице перечислены компоненты и их соответствующие концентрации, необходимые для приготовления органоидной среды зуба.
| Определенная среда без сыворотки (SFDM) (pH 7,3) | |
| Имя | Концентрация |
| Стерильный H2O | |
| DMEM 1:1 F12 без Fe | 16,8 г/л |
| Трансферрин | 5 мг/л |
| Инсулин из поджелудочной железы крупного рогатого скота | 5 мг/л |
| Пенициллин G натриевая соль | 35 мг/л |
| Сульфатная соль стрептомицина | 50 мг/л |
| Этанол абсолютный, ≥99,8% (EtOH) | 600 мкл/л |
| Каталаза из печени крупного рогатого скота | 50 мкл/л |
| Гидрокарбонат натрия (NaHCO3) | 1 г/л |
| Альбумин крупного рогатого скота (сорт клеточной культуры) | 5 г/л |
Таблица 3: Определенная среда без сыворотки (SFDM) (рН 7,3). В таблице приведен состав безсыворочной определенной среды.
| Диссоциационная среда | |
| Имя | Концентрация |
| Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) | |
| Коллагеназа IV | 3 мг/мл |
| Диспаз II | 4 мг/мл |
Таблица 4: Диссоциационная среда. Перечень составляющих и их необходимых концентраций для приготовления диссоциационной среды.
| Среда А (рН 7,3) | |
| Имя | Концентрация |
| Стерильный H2O | |
| ПОРОШОК DMEM с высоким содержанием глюкозы | 13,38 г/л |
| ХЕПЕС | 5,958 г/л |
| Пируват натрия (C3H3NaO3) | 110 мг/л |
| Пенициллин G натриевая соль | 35 мг/л |
| Сульфатная соль стрептомицина | 50 мг/л |
| Хлорид натрия (NaCl) | 0,5 г/л |
| Гидрокарбонат натрия (NaHCO3) | 1 г/л |
| Альбумин крупного рогатого скота (сорт клеточной культуры) | 3 г/л |
| Днк* | 0,2 мг/мл |
| *добавить при упоминании |
Таблица 5: Среда А (рН 7,3). В таблице приведена концентрация компонентов, используемых для приготовления среды А.
| Первичные антитела | ||
| Имя | Хозяин | Концентрация |
| АМЕЛЬКС | мышь | 1:100 |
| СД44 | мышь | 1:200 |
| СК14 | мышь | 1:200 |
| ИТГА6 | кролик | 1:200 |
| П63 | кролик | 1:1000 |
| SOX2 | кролик | 1:2000 |
| Секундарные антитела | ||
| Имя | Хозяин | Концентрация |
| мышь IgG (Alexa 555) | осел | 1:1000 |
| кролик IgG (Alexa 488) | осел | 1:1000 |
Таблица 6: Перечень антител и их разведения. В таблице перечислены антитела и их соответствующие разведения, используемые в этом исследовании.
| Грунтовки | ||
| Ген | Грунтовка вперед | Обратная грунтовка |
| ГАПДХ | GGTATCGTGGAAGGACTCATGAC | ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG |
| П63 | CAACGCAGTAGACCATTTCC | CCCAAAACCTTCTCGCTTGTTTT |
| ИТГА6 | GGCGGTGTGTTATGTCCTGAGTC | AATCGCCCATCACAAAAGCTC |
| SOX2 | GCTGGGACATGTGAAGTCTG | CCCTGTGGTTACCTCTTCCT |
| ПИТХ2 | CAGCGGACTCACTTTACCAG | ATTCTTGAACCAAACCCGGAC |
Таблица 7: Перечень грунтовок. В таблице перечислены грунтовки GAPDH, P63, ITGA6, SOX2 и PITX2 , используемые в этом исследовании.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает эффективную и воспроизводимую генерацию органоидов, начиная с человеческого зуба. Насколько нам известно, это первая методология создания современно-концептуальных (эпителиальных) органоидов, начиная с зубной ткани человека. Органоиды являются долгосрочными расширяемыми и демонстрируют фенотип эпителиальной стволовости зуба, дублируя DESC, о которых ранее сообщалось в отсеке ERM DF7. Кроме того, органоиды воспроизводят функциональные характеристики DESC/ERM, включая развертывание процесса дифференцировки амелобласта 7,25,26. Результаты являются надежными, поскольку сопоставимые результаты были обнаружены с независимыми органоидными линиями пациента19.
При выполнении этого протокола органоида зуба необходимо учитывать несколько критических моментов. Во-первых, добавление ингибитора Rho-ассоциированной киназы (ROCK) Y-27632 при первоначальном посеве и сразу после каждого пассирования имеет важное значение для предотвращения прохождения аноикиса27 отдельными клетками. Кроме того, амфотерицин B требуется во всех прохладительных напитках во время P0, чтобы избежать (перорального) грибкового роста. Во-вторых, рекомендуется немедленно обрабатывать свежеизолированные ткани DF для оптимального органоидного образования и эффективности роста, а не начинать с криоконсервированной ткани, что приводит к снижению эффективности. В-третьих, при размораживании криоконсервированной органоидной линии для культивирования выполняйте шаги как можно быстрее и избегайте слишком длительного времени оттаивания, а также слишком длинных интервалов между шагами, поскольку удлинение времени снижает выживаемость клеток. В-четвертых, следует отметить, что количество органоидов при раннем прохождении (P0-P3) может оставаться ограниченным, также потому, что в конкретных изолированных образцах тканей DF может присутствовать только ограниченное количество ERM (стволовых) клеток. Следовательно, с органоидными культурами при раннем прохождении следует обращаться с осторожностью и вниманием. Поэтому рекомендуется (i) избегать быстрого расширения органоидной культуры (т.е. начинать расщепляться только при 1:3 и более, начиная с Р3-4, и раньше при 1:0,5 или 1:1); ii) использовать соответствующий метод расщепления (нижний проход - более высокий проход), как описано. В этом контексте рекомендуется собирать невозмутимые зубы мудрости у молодых пациентов подросткового возраста (от 15 до 19 лет), поскольку количество клеток ERM уменьшается с развитием зубов ивозрастом 28 лет. В-пятых, оставшиеся недисперсированными фрагменты твердой ткани из DF-ткани в клеточной суспензии (даже после фильтрации) приводят к тому, что падение BMM становится менее стабильным и с большей вероятностью смещается во время культивирования. Более высокий процент BMM (например, 80%) рекомендуется, если в диссоциированной клеточной суспензии DF наблюдается несколько недисперсированных фрагментов твердой ткани. В-шестых, настоятельно рекомендуется проходить органоиды между 10-м и 14-м днем культуры, поскольку более длинная культура негативно повлияет на расширяемость органоидов из-за менее оптимальной диссоциации. Если по той или иной причине органоиды культивируют дольше 14 дней, количество TryplE Express и время инкубации для диссоциации органоидов могут быть увеличены для эффективной диссоциации, хотя 15 мин ферментативного воздействия не должны быть превышены. В этом же контексте культуральную среду необходимо обновлять каждые 2-3 дня, чтобы предотвратить истощение питательных веществ и факторов роста. В случае, если органоиды не расширяются должным образом, независимо от критических точек, упомянутых выше, следует сосредоточиться на сохранении всех инструментов (BMM, ледяной SFDM для предварительного покрытия наконечника, микроцентрифужных трубок), используемых во время пассажа на льду. Кроме того, крайне важно правильно применять различные методы пассирования (метод низкого и более высокого прохода) для эффективного прохождения органоидов.
Ранее другие группы сообщали о росте in vitro первичной человеческой ткани DESC/ERM 8,9,10,11,12,21. Однако культуры были в основном 2D (монослоями), а не 3D, как эта органоидная модель, более того, показывая только краткосрочный рост и сохранение фенотипа. В качестве альтернативы часто (спонтанно) использовались увековеченные клетки, которые, однако, не являются физиологическими и показывают лишь ограниченное сходство с тканью или клетками происхождения. Более того, эти клеточные линии были получены из эмбриональной ткани и/или от животных. Кроме того, дифференциация амелобласта либо не описана, либо лишь ограниченно документирована. Таким образом, представленная здесь органоидная модель предлагает несколько преимуществ, заключающихся в том, что (i) достоверная рекапитуляция ткани/клеток происхождения, (ii) долгосрочная расширяемость, (iii) культивируемая в 3D более точно представляющая конфигурацию in vivo, (iv) человеческого происхождения и постнатального возраста и (v) способная дифференцироваться в зрелые зубные клетки (тип клеток амелобласта) (см.19).
Таким образом, мы создали ценный исследовательский инструмент, о котором ранее не сообщалось, содержащий несколько интересных приложений (рисунок 1B). Органоиды могут быть применены для изучения ствола и пластичности ЧЕЛОВЕКА DESC/ERM. Это дает возможность получить дальнейшее представление о биологии все еще загадочной популяции клеток ERM с помощью иммунофлуоресцентного, экспрессии генов и (одноклеточного) транскриптомного анализа. Кроме того, органоиды особенно подходят для моделирования заболеваний человека для расшифровки патогенетических механизмов, идентификации (новых) терапевтических мишеней и создания инструментов обнаружения и скрининга лекарств29. Более конкретно, эта модель может быть применена к одонтогенным кистам (для которых нет надежной исследовательской модели), которые можно сравнить со здоровыми органоидами, полученными из зубов. Кроме того, этот зубной органоидный подход может быть использован для моделирования и изучения заболеваний зубов, начиная от воздействия бактерий и заканчивая генетическими мутациями, связанными с аномалиями зубов (такими как мутации в P63, которые могут быть введены с использованием передовых методов редактирования генов, таких как CRISPR-Cas)30, что в конечном итоге приводит к потенциальным и новым терапевтическим мишеням и методам лечения. Другие применения протокола органоидов зубов могут включать биобанкинг (в настоящее время уже доступный для пульпы зубов, такой как Биобанк будущего здоровья)31 для сбора органоидных линий от различных людей и заболеваний (например, для фундаментальных и трансляционных исследований, таких как скрининг лекарств). Кроме того, недавно было опубликовано несколько отчетов о композитных органоидных моделях, содержащих не только эпителиальные, но и другие типы клеток ткани происхождения32,33. Поскольку состав зубов довольно сложен, аккомодируя мезенхимальные, иммунные и эндотелиальные клетки, применение этой эпителиальной органоидной модели в сочетании с этими типами клеток для более подробного представления их аналога in vivo является привлекательной перспективой. Также данная система позволяет исследовать амелогенез в зубе человека, в настоящее время лишь плохо изученный, но непременно опирающийся на эпителиально-мезенхимальные взаимодействия. Ожидается, что расшифровка развития амелобласта станет важным шагом вперед в стоматологическом научном и клиническом мире, поскольку производство эмали, квинтэссенции компонента наших зубов, является очень преследуемой целью в восстановлении зубной ткани. Более того, органоидное моделирование, подробно описанное в этом исследовании, может означать начало формирования минерализованных тканей in vitro и проложить путь к разработке биоинженерного зуба (или, по крайней мере, частей) для заместительной терапии.
Одним из ограничений органоидной модели является то, что она представляет собой исключительно эпителиальный компонент ткани. Однако, как подробно описано выше, этот недостаток может быть решен путем добавления других типов клеток / тканей, таких как зубной мезенхима19. Другим аспектом, который может быть признан ограничением, является происхождение используемого здесь BMM (Matrigel). Этот BMM получен из саркомы (Engelbrecht-Holm-Swarm) мыши и, следовательно, должен быть заменен перед переводом органоидного подхода в клинику. В последнее время было предпринято несколько усилий по замене Matrigel синтетическими гидрогелями34,35. Тем не менее, необходимы дополнительные исследования, чтобы успешно выращивать органоиды в таких неестественных гелях. Хотя органоидная технология обеспечивает интересный подход для будущей стоматологической регенеративной терапии - например, разработка биоинженерного зуба - этические вопросы должны быть подняты в отношении конфиденциальности доноров клеток, а также коммерциализации человеческих органоидов и тканей, полученных из них. До сих пор не было сделано никаких выводов относительно коммерциализации органоидов в регенеративных целях36. Биобанки зубной пульпы были на подъеме31, а также органоидные биобанки из нескольких, в основном раковых тканей, для целей скрининга лекарств. Учитывая, что органоиды не могут быть классифицированы как клетки, гаметы, ткани или органы (которые все регулируются законом), существует острая необходимость в изображении их юридического статуса для их использования в клинических, научных или коммерческих условиях. Несмотря на то, что органоиды показали, что они откладывают минерализованную ткань при подкожной трансплантации in vivo19, необходимы дальнейшие исследования для анализа их способности депонировать эмаль, аналогичную естественному человеческому зубу.
В целом, разработанная новая органоидная модель представляет собой многообещающий, ценный инструмент для изучения биологии зубов человека (стволовых клеток) и амелогенеза, которые в настоящее время плохо изучены, с будущими перспективами моделирования заболеваний зубов и регенеративной терапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Соответствующий автор гарантирует, что все авторы раскрыли любые и все конфликты интересов.
Acknowledgments
Мы благодарны всем сотрудникам Челюстно-лицевой хирургии (MKA) UZ Leuven, а также пациентам, за их неоценимую помощь в сборе свежеизвлеченных третьих моляров. Мы также хотели бы поблагодарить д-ра Рейнхильду Джейкобс и д-ра Элизабет Тийскенс за их помощь в сборе образцов. Эта работа была поддержана грантами KU Leuven (BOF) и FWO-Flanders (G061819N). Л.Х. является доктором философии FWO (1S84718N).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120.086 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-6250 | |
| 48-well flat bottom plates | Corning | 3548 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330.03 | |
| AMELX antibody | Santa Cruz | sc-365284 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15200018 | |
| B27 (without vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Cassette | VWR | 7202191 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma-Aldrich | C100 | |
| CD44 antibody | Abcam | ab34485 | |
| Cell strainer, 40 µm | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759 | |
| CK14 antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-11599 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Cover glass | VWR | 6310146 | |
| Cryobox | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | |
| DMEM 1:1 F12 without Fe | Invitrogen | 074-90715A | |
| DMEM powder high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Dnase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 - 10ML | |
| Embedding workstation, 220 to 240 Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol absolute, ≥99.8% (EtOH) | Fisher Chemical | E/0650DF/15 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| FGF2 (= basic FGF) | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| FGF8 | Peprotech | AF-100-25 | |
| GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | RTN350-1KT | Includes 1% β-mercaptoethanol dissolved in lysis buffer |
| Glass Pasteur pipette | Niko Mechanisms | 170-40050 | |
| Glycine | VWR | 101194M | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| IGF-1 | PeproTech | 100-11 | |
| InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI) | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| ITGA6 antibody | Sigma-Aldrich | HPA012696 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Matrigel (growth factor-reduced; phenol red-free) | Corning | 15505739 | |
| Microscope slide | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SLGV033R | |
| Minimum essential medium eagle (αMEM) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| mouse IgG (Alexa 555) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetyl L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| P63 antibody | Abcam | ab124762 | |
| Pap Pen | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | Marking pen |
| Paraformaldehyde (PFA), 16% | Merck | 8.18715 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| Petri dish | Corning | 353002 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Pipette (P20, P200, P1000) | Eppendorf or others | 2231300006 | |
| Plastic transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.001 | |
| Rabbit IgG (Alexa 488) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| RSPO1 | PeproTech | 120-38 | |
| SB202190 (p38i) | Biotechne (Tocris) | 1264 | |
| Scalpel (surgical blade) | Swann-Morton | 207 | |
| SHH | R&D Systems | 464-SH-200 | |
| Silicone molds (Heating block) | VWR | 720-1918 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P-5280 | |
| SOX2 antibody | Abcam | ab92494 | |
| StepOnePlus | Thermo Fisher Scientific | Real-Time PCR System | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile 1000 μL pipette tips with filter | Greiner | 740288 | |
| Sterile 20 μL pipette tips with filter | Greiner | 774288 | |
| Sterile 200 μL pipette tips with and without filter | Greiner | 739288 | |
| Sterile H2O | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Superscript III first-strand synthesis supermix | Invitrogen | 11752-050 | Reverse transcription kit |
| Tissue processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Transferrin | Serva | 36760.01 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| TrypLE express | Gibco | 12605-010 | |
| Vectashield mounting medium+DAPI | Labconsult NV | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| WNT3a | Biotechne (Tocris) | 5036-WN-500 | |
| Xylenes, 99%, for biochemistry and histology | VWR | 2,89,75,325 |
References
- Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development (Cambridge). 147 (2), (2020).
- Arrow, P. Dental enamel defects, caries experience and oral health-related quality of life: a cohort study. Australian Dental Journal. 62 (2), 165-172 (2017).
- Mitsiadis, T. A., Orsini, G., Jimenez-Rojo, L. Dental Stem Cells for Tooth Regeneration. Dental Stem Cells: Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. Zavan, B., Bressan, E. , Humana Press. Cham. (2016).
- Mitsiadis, T. A., Orsini, G. Editorial: a new era in dentistry: stem cell-based approaches for tooth and periodontal tissue regeneration. Frontiers in Physiology. 7, 357 (2016).
- Miran, S., Mitsiadis, T. A., Pagella, P. Innovative dental stem cell-based research approaches: the future of dentistry. Stem Cells International. 2016, 7231038 (2016).
- Shinmura, Y., Tsuchiya, S., Hata, K. I., Honda, M. J. Quiescent epithelial cell rests of malassez can differentiate into ameloblast-like cells. Journal of Cellular Physiology. 217 (3), 728-738 (2008).
- Davis, E. M. A review of the epithelial cell rests of Malassez on the bicentennial of their description. Journal of Veterinary Dentistry. 35 (4), 290-298 (2018).
- Athanassiou-Papaefthymiou, M., Papagerakis, P., Papagerakis, S. Isolation and characterization of human adult epithelial stem cells from the periodontal ligament. Journal of Dental Research. 94 (11), 1591-1600 (2015).
- Kim, G. -H., et al. Differentiation and establishment of dental epithelial-like stem cells derived from human ESCs and iPSCs. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-16 (2020).
- Nam, H., et al. Establishment of Hertwig's epithelial root sheath/ epithelial rests of malassez cell line from human periodontium. Molecules and Cells. 37 (7), 562-567 (2014).
- Nam, H., et al. Expression profile of the stem cell markers in human hertwig's epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells. Molecules and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).
- Tsunematsu, T., et al. Human odontogenic epithelial cells derived from epithelial rests of Malassez possess stem cell properties. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1063-1075 (2016).
- Artegiani, B., Clevers, H. Use and application of 3D-organoid technology. Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Cox, B., et al. Organoids from pituitary as a novel research model toward pituitary stem cell exploration. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development (Cambridge). 144 (10), 1775-1786 (2017).
- Schutgens, F., Clevers, H. Human organoids: tools for understanding biology and treating diseases). Annual Review of Pathology. 15, 211-234 (2020).
- Hemeryck, L., et al. Organoids from human tooth showing epithelial stemness phenotype and differentiation potential. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (3), 153 (2022).
- Gao, X., Wu, Y., Liao, L., Tian, W. Oral organoids: progress and challenges. Journal of Dental Research. 100 (5), 454-463 (2021).
- Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Scientific Reports. 10 (1), 4963 (2020).
- Xiong, J., Mrozik, K., Gronthos, S., Bartold, P. M. Epithelial cell rests of malassez contain unique stem cell populations capable of undergoing epithelial-mesenchymal transition. Stem Cells and Development. 21 (11), 2012-2025 (2012).
- Luan, X., Ito, Y., Diekwisch, T. G. H. Evolution and development of Hertwig's epithelial root sheath. Developmental Dynamics. 235 (5), 1167-1180 (2006).
- Fukumoto, S., et al. New insights into the functions of enamel matrices in calcified tissues. Japanese Dental Science Review. 50 (2), 47-54 (2014).
- Consolaro, A., Consolaro, M. F. M. O. ERM functions, EGF and orthodontic movement or Why doesn't orthodontic movement cause alveolodental ankylosis. Dental Press Journal of Orthodontics. 15 (2), 24-32 (2010).
- Guajardo, G., et al. Immunohistochemical localization of epidermal growth factor in cat paradental tissues during tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 118 (2), 210-219 (2000).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Gonçalves, J., Sasso-Cerri, E., Cerri, P. Cell death and quantitative reduction of rests of Malassez according to age. Journal of Periodontal Research. 43 (4), 478-481 (2008).
- Kim, J., Koo, B. -K., Knoblich, J. A. Human organoids: Model systems for human biology and medicine. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Razmi, M. T., Narang, T., Handa, S. ADULT (acro-dermato-ungual-lacrimal-tooth) syndrome: a case report from India. Indian Dermatology Online Journal. 9 (3), 194 (2018).
- Future Health Biobank. , Available from: https://futurehealthbiobank.com/ch-en/ (2022).
- Schreurs, R. R. C. E., Baumdick, M. E., Drewniak, A., Bunders, M. J. In vitro co-culture of human intestinal organoids and lamina propria-derived CD4+ T cells. STAR Protocols. 2 (2), 100519 (2021).
- Fiorini, E., Veghini, L., Corbo, V. Modeling cell communication in cancer with organoids: Making the complex simple. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 166 (2020).
- Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
- Zhang, Y., et al. Polyisocyanide hydrogels as a tunable platform for mammary gland organoid formation. Advanced Science. 7 (18), 2001797 (2020).
- Mollaki, V.
