Summary
हम मानव दांत से शुरू होने वाले उपकला ऑर्गेनोइड संस्कृतियों को विकसित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। ऑर्गेनोइड मजबूती से विस्तार योग्य होते हैं और दांत की उपकला स्टेम कोशिकाओं को दोहराते हैं, जिसमें उनकी अमेलोब्लास्ट भेदभाव क्षमता भी शामिल है। अद्वितीय ऑर्गेनॉइड मॉडल दांत-पुनर्योजी दृष्टिकोण के दृष्टिकोण के साथ मानव दंत चिकित्सा (स्टेम सेल) जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक आशाजनक उपकरण प्रदान करता है।
Abstract
दांत न केवल भोजन और भाषण के लिए बल्कि मनोवैज्ञानिक कल्याण के लिए भी जीवन में महत्वपूर्ण महत्व रखते हैं। मानव दांत विकास और जीव विज्ञान पर ज्ञान दुर्लभ है। विशेष रूप से, दांत की उपकला स्टेम कोशिकाओं और उनके कार्य के बारे में बहुत कुछ ज्ञात नहीं है। हम मानव दांत ऊतक (यानी, दंत कूप, निकाले गए ज्ञान दांतों से पृथक) से शुरू होने वाले एक उपन्यास ऑर्गेनोइड मॉडल को विकसित करने में सफल रहे। ऑर्गेनोइड मजबूत और दीर्घकालिक विस्तार योग्य हैं और मार्कर अभिव्यक्ति के साथ-साथ कार्यात्मक गतिविधि के संदर्भ में प्रस्तावित मानव दांत उपकला स्टेम सेल डिब्बे को दोहराते हैं। विशेष रूप से, ऑर्गेनोइड एक एमेलोब्लास्ट भेदभाव प्रक्रिया को प्रकट करने में सक्षम हैं जैसा कि एमेलोजेनेसिस के दौरान विवो में होता है। यह अनूठा ऑर्गेनॉइड मॉडल न केवल मानव दांत विकास बल्कि दंत विकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करेगा, और दांत-पुनर्योजी चिकित्सा की ओर मार्ग प्रशस्त कर सकता है। इस नए ऑर्गेनोइड मॉडल के आधार पर जैविक दांत के साथ खोए हुए दांतों को बदलना सिंथेटिक सामग्री के वर्तमान मानक आरोपण का एक आकर्षक विकल्प हो सकता है।
Introduction
खाद्य मैस्टिकेशन, भाषण और मनोवैज्ञानिक कल्याण (आत्म-छवि) में दांतों की आवश्यक भूमिका होती है। मानव दांत में अलग-अलग घनत्व और कठोरता के अत्यधिक खनिज युक्त ऊतक होते हैं1. दंत तामचीनी, दांत मुकुट का मुख्य घटक, मानव शरीर में उच्चतम खनिज युक्त ऊतक है। तामचीनी गठन (एमेलोजेनेसिस) के दौरान, जब दांत विकसित होते हैं, तो दंत उपकला स्टेम कोशिकाएं (डीईएससी) तामचीनी बनाने वाली कोशिकाओं (एमेलोब्लास्ट्स) में अंतर करती हैं। एक बार बनने के बाद, दांत विस्फोट की शुरुआत में एमेलोब्लास्ट्स के एपोप्टोटिक नुकसान के कारण तामचीनी की शायद ही कभी मरम्मत या नवीनीकृत किया जाता है1. क्षतिग्रस्त तामचीनी ऊतक की बहाली, जैसा कि आघात या जीवाणु रोग के कारण होता है, वर्तमान में सिंथेटिक सामग्री का उपयोग करके पूरा किया जाता है; हालाँकि, ये महत्वपूर्ण कमियों जैसे माइक्रोलीकेज, अवर ओसियोइंटीग्रेशन और एंकरेज, परिमित जीवन काल और पूरी तरह कार्यात्मक मरम्मत की कमी से परेशान हैं2. इसलिए, एमेलोब्लास्ट उत्पन्न करने की क्षमता और खनिज युक्त ऊतक का उत्पादन करने की क्षमता के साथ मानव डीईएससी की एक मजबूत और विश्वसनीय संस्कृति दंत पुनर्योजी क्षेत्र में एक बड़ा कदम होगा।
मानव डीईएससी फेनोटाइप और जैविक कार्य पर ज्ञान दुर्लभ 3,4,5 है। दिलचस्प बात यह है कि मानव दांतों के डीईएससी को एपिथेलियल सेल रेस्ट्स ऑफ मलासेज़ (ईआरएम) में मौजूद होने का प्रस्ताव दिया गया है, दंत कूप (डीएफ) के भीतर मौजूद सेल क्लस्टर, जो अनियंत्रित दांतों को घेरता है, और दांत फटने के बाद जड़ के चारों ओर पीरियडोंटल लिगामेंट में मौजूद रहता है1. दंत लुगदी के साथ सह-संवर्धित ईआरएम कोशिकाओं को अमेलोब्लास्ट जैसी कोशिकाओं में अंतर करने और तामचीनी जैसे ऊतक उत्पन्न करने के लिए पाया गयाहै 6. हालांकि, तामचीनी (पुन: ) पीढ़ी में ईआरएम कोशिकाओं की विशिष्ट भूमिका का गहन अध्ययन विश्वसनीय अध्ययन मॉडल7 की कमी के कारण सीमित किया गया है। वर्तमान ईआरएम इन विट्रो संस्कृति प्रणालियों को सीमित जीवन काल और 2 डी स्थितियों में फेनोटाइप के त्वरित नुकसान से बाधित किया जाता है जो मानक रूप से उपयोग की जाने वाली 8,9,10,11,12 हैं। इसलिए, मानव डीईएससी का ईमानदारी से विस्तार, अध्ययन और अंतर करने के लिए एक ट्रैक्टेबल इन विट्रो सिस्टम की दृढ़ता से आवश्यकता है।
पिछले दशक के दौरान, इन विट्रो में उपकला स्टेम कोशिकाओं को विकसित करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक को उनके जीव विज्ञान के साथ-साथ रोग13,14,15,16 का अध्ययन करने के लिए कई प्रकार के (मानव) उपकला ऊतकों पर सफलतापूर्वक लागू किया गया है। यह तकनीक ऊतक उपकला स्टेम कोशिकाओं को 3 डी सेल निर्माण (यानी, ऑर्गेनोइड्स) में आत्म-विकसित करने में सक्षम बनाती है जब एक बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) -नकल मचान (आमतौर पर, मैट्रिगेल) में वरीयता प्राप्त होती है और ऊतक के स्टेम सेल आला सिग्नलिंग और / ऑर्गेनॉइड विकास के लिए आवश्यक विशिष्ट विकास कारकों में एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ) और विंगलेस-टाइप एमएमटीवी इंटीग्रेशन साइट (डब्ल्यूएनटी) एक्टिवेटर14,15,16 शामिल हैं। परिणामी ऑर्गेनोइड को ऊतक की मूल उपकला स्टेम कोशिकाओं की नकल करने में स्थायी निष्ठा की विशेषता है, साथ ही साथ उनके फेनोटाइप और कार्यात्मक गुणों को बनाए रखते हुए उच्च विस्तारशीलता, जिससे क्लिनिक से प्राप्त अक्सर सीमित प्राथमिक मानव ऊतक उपलब्धता पर काबू पा लिया जाता है। ऑर्गेनोइड स्थापित करने के लिए, संवर्धन से पहले विषम ऊतक (यानी, अन्य सेल प्रकार जैसे मेसेनकाइमल कोशिकाओं को शामिल करते हुए) से उपकला स्टेम कोशिकाओं के अलगाव की आवश्यकता नहीं होती है क्योंकि मेसेनकाइमल कोशिकाएं ईसीएम से जुड़ी या पनपती नहीं हैं, जिसके परिणामस्वरूप अंततः विशुद्ध रूप से उपकला ऑर्गेनोइड 13,16,17,18,19 . इस आशाजनक और बहुमुखी तकनीक ने विभिन्न मानव उपकला ऊतकों से कई गुना ऑर्गेनोइड मॉडल के विकास का नेतृत्व किया है। हालांकि, मानव दांत-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड, दांतों के विकास, उत्थान और बीमारी के गहन अध्ययन के लिए मूल्यवान, अभी तक20,21 स्थापित नहीं किए गए थे। हम हाल ही में किशोर रोगियों से निकाले गए तीसरे दाढ़ (ज्ञान दांत) से डीएफ ऊतक से शुरू होने वाले इस तरह के एक नए ऑर्गेनोइड मॉडल को विकसित करने में सफलरहे।
यहां, हम वयस्क मानव दांत (यानी, तीसरे दाढ़ के डीएफ से) (चित्रा 1 ए) से उपकला ऑर्गेनोइड संस्कृतियों को विकसित करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। परिणामी ऑर्गेनोइड दीर्घकालिक विस्तार योग्य होने के दौरान ईआरएम से जुड़े स्टेमनेस मार्करों को व्यक्त करते हैं। दिलचस्प बात यह है कि अधिकांश अन्य ऑर्गेनोइड मॉडल के विपरीत, आमतौर पर आवश्यक ईजीएफ मजबूत ऑर्गेनोइड विकास और विकास के लिए अनावश्यक है। दिलचस्प बात यह है कि स्टेमनेस ऑर्गेनोइड अमेलोब्लास्ट भेदभाव गुण दिखाते हैं, जिससे विवो में होने वाली ईआरएम / डीईएससी सुविधाओं और प्रक्रियाओं की नकल होती है। यहां वर्णित नया और अनूठा ऑर्गेनॉइड मॉडल डीईएससी जीव विज्ञान, प्लास्टिसिटी और भेदभाव क्षमता की खोज करने की अनुमति देता है और दांत-पुनर्योजी दृष्टिकोण की ओर पहला कदम उठाने के लिए दरवाजा खोलता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
यहां वर्णित सभी तरीकों को आचार समिति अनुसंधान यूजेड / केयू ल्यूवेन (13/0104 यू) द्वारा अनुमोदित किया गया है। निकाले गए तीसरे दाढ़ (ज्ञान दांत) रोगियों की सूचित सहमति के बाद प्राप्त किए गए थे।
1. तैयारी
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 1.9% सीओ 2 इनक्यूबेटर में15-20 घंटे के लिए एक 48-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट प्रीवॉर्म करें।
- मैट्रिगेल विभाज्य (विकास कारक-कम; फिनोल लाल मुक्त; आगे तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के रूप में जाना जाता है; बीएमएम) चरण 2.1 से पहले न्यूनतम 2 घंटे के लिए बर्फ (4 डिग्री सेल्सियस) पर।
नोट: बीएमएम के फ्रीज/पिघलना चक्र से बचें। बर्फ पर 15-20 घंटे के लिए बीएमएम को तरलीकृत करें और माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में 1 एमएल पर विभाज्य करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। - अपकेंद्रित्र को 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
- मीडिया तैयार करें और 0.22 μm फ़िल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर करें। निम्नलिखित वॉल्यूम आमतौर पर एक साथ निकाले गए सभी चार तीसरे दाढ़ों से डीएफ के संग्रह पर आधारित हैं।
- डीएफ संग्रह माध्यम (तालिका 1) के 20 एमएल तैयार करें: न्यूनतम आवश्यक मध्यम ईगल (αMEM) जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 0.5% एम्फोटेरिसिन बी और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन शामिल हैं। डीएफ संग्रह माध्यम के 4 मिलीलीटर को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और बर्फ पर ट्यूबों को स्थानांतरित करें।
नोट: नमूना संग्रह के लिए प्रति रोगी एक 15 एमएल ट्यूब पर्याप्त है (यानी, चार तिहाई दाढ़ के लिए)। - टूथ ऑर्गेनॉइड माध्यम के 20 एमएल बनाएं (आगे टीओएम के रूप में जाना जाता है; तालिका 2) सीरम मुक्त परिभाषित माध्यम (एसएफडीएम) का उपयोग करना; तालिका 3)। अधिकतम 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर टॉम स्टोर करें।
- पृथक्करण माध्यम (तालिका 4) के 8 एमएल तैयार करें, अर्थात, फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) जिसमें कोलेजनेज VI (3 मिलीग्राम / एमएल) और डिस्पेस II (4 मिलीग्राम / उपयोग से पहले कम से कम 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पृथक्करण माध्यम को प्रीवार्म करें और चार डीएफ ऊतकों को अलग करने के लिए इसे दो 15 एमएल ट्यूबों (4 एमएल प्रति ट्यूब) में स्थानांतरित करें।
- एक वॉशिंग प्लेट (12-अच्छी तरह से) तैयार करें जिसमें: 70% ईटीओएच के साथ तीन कुएं, पीबीएस के साथ तीन कुएं और डीएफ संग्रह माध्यम के साथ तीन कुएं।
- प्रति नमूना मध्यम ए के 15 एमएल बनाएं (यानी, प्रति रोगी प्रति दो डीएफ प्रति 5 एमएल; तालिका 5)।
नोट: निम्नलिखित चरणों बाँझ शर्तों के तहत किया जाना चाहिए।
- डीएफ संग्रह माध्यम (तालिका 1) के 20 एमएल तैयार करें: न्यूनतम आवश्यक मध्यम ईगल (αMEM) जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 0.5% एम्फोटेरिसिन बी और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन शामिल हैं। डीएफ संग्रह माध्यम के 4 मिलीलीटर को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और बर्फ पर ट्यूबों को स्थानांतरित करें।
2. दंत कूप पृथक्करण
- एक बार संबंधित डीएफ के साथ तीसरे दाढ़ संग्रह माध्यम (बर्फ पर) में एकत्र किए जाते हैं, ट्यूबों की सामग्री को पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
- एक चिमटी के साथ दांत पकड़ो और सावधानी से एक सर्जिकल ब्लेड का उपयोग कर डीएफ को अलग करें।
नोट: इस चरण अभ्यास की आवश्यकता है; ब्लेड से सावधान रहें। - डीएफ से शेष रक्त को धोने के लिए, डीएफ ऊतकों को 20 एस के लिए 70% ईटीओएच (वॉशिंग प्लेट) के पहले कुएं में संक्षेप में रखें, और फिर 20 एस के लिए अगले ईटीओएच कुएं में स्थानांतरित करें, और आगे तीसरे ईटीओएच कुएं (कुल मिलाकर 70% ईटीओएच में अधिकतम 1 मिनट; लंबे समय तक इनक्यूबेशन समय के परिणामस्वरूप सेल व्यवहार्यता कम हो जाएगी)।
- अगला, तीन पीबीएस कुओं (कुल में अधिकतम 2 मिनट) में कुल्ला जारी रखें।
- तीन शेष डीएफ संग्रह मध्यम कुओं (कुल मिलाकर अधिकतम 20 मिनट तक) में डीएफ कुल्ला।
- कुल्ला डीएफ को एक नए पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
- पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) निर्धारण के लिए डीएफ (~ 5 मिमी2) में से एक का एक छोटा टुकड़ा काटें (धारा 7 देखें) और इसे बर्फ पर स्टोर करें (अधिकतम 6 घंटे के लिए) एक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में जिसमें 500 μL डीएफ संग्रह माध्यम होता है जब तक कि पीएफए निर्धारण न हो।
- छोटे टुकड़ों (~ 1 मिमी 2) में डीएफ के बाकी हिस्सों को कीमाबनाएं।
नोट: क्रायोप्रिजर्व्ड ऊतक से शुरू करने के बजाय इष्टतम ऑर्गेनोइड गठन और विकास दक्षता के लिए ताजा पृथक डीएफ ऊतकों को तुरंत संसाधित करने की सलाह दी जाती है, जिसके परिणामस्वरूप कम दक्षता होती है। फिर भी, इस चरण में प्राथमिक डीएफ ऊतक को क्रायोप्रेज़र्व करना संभव है (अनुभाग 5 में क्रायोप्रेज़र्वेशन माध्यम और प्रोटोकॉल देखें)। - कीमा बनाया हुआ डीएफ को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 4 एमएल प्रीवॉर्ड पृथक्करण माध्यम होता है और 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सेते हैं।
नोट: इष्टतम पृथक्करण को आश्वस्त करने के लिए 4 एमएल प्रीवर्म्ड पृथक्करण माध्यम (एक ट्यूब) प्रति दो डीएफ जोड़ें। - हर 15 मिनट, ऊतक विघटन को गति देने के लिए एक ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके डीएफ-पृथक्करण माध्यम मिश्रण को ऊपर और नीचे पाइप करें। जब डीएफ टुकड़े अब नहीं देखे जाते हैं (आमतौर पर 1 घंटे के बाद), एक संकुचित अग्नि-पॉलिश पाश्चर पिपेट का उपयोग करके डीएफ पृथक्करण के साथ आगे बढ़ें।
नोट: इष्टतम डीएफ पृथक्करण के लिए, डीएफ अलगाव के 1 घंटे से बाद में अग्नि-पॉलिशिंग द्वारा संकुचित पाश्चर पिपेट पर स्विच करें।- इस बीच, मध्यम ए के 10 मिलीलीटर तैयार करें जिसमें 50 μL डीएनएएसई (0.2 मिलीग्राम / तालिका 5)।
- पृथक डीएफ के साथ प्रत्येक ट्यूब में मध्यम ए (डीएनएस युक्त) के 5 एमएल जोड़ें, और कमरे के तापमान (आरटी) पर 1 मिनट के लिए सेते हैं।
- शेष बड़े टुकड़ों और (अधिकांश) रेशेदार ऊतक को हटाने के लिए 40 μm सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन (एकल कोशिकाओं और छोटे सेल गुच्छों युक्त) को फ़िल्टर करें।
- इस चरण में एक रोगी से अलग डीएफ के साथ कई ट्यूबों को मिलाएं।
- मध्यम ए अपकेंद्रित्र के 1 मिलीलीटर के साथ फिल्टर कुल्ला 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 200 एक्स जी पर फ़िल्टर सेल निलंबन।
- सतह पर तैरनेवाला निकालें, एसएफडीएम (तालिका 3) के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें, और सेल निलंबन को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर सेल एकाग्रता की गणना करें। कोशिका गुच्छों की उपेक्षा करें जो बने रहते हैं।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र।
3. दांत ऑर्गेनॉइड संस्कृति की स्थापना (चित्रा 1 ए और चित्रा 2 ए)
- प्राप्त सेल नंबर के आधार पर, उन कुओं की संख्या की गणना करें जिन्हें वरीयता दी जा सकती है। एक 20 μL छोटी बूंद में 20,000 कोशिकाएं होनी चाहिए। अंतिम मिश्रण 30:70 के अनुपात में सेल निलंबन और बीएमएम से बना है।
- बीएमएम के 70:30 अनुपात प्राप्त करने के लिए बर्फ-ठंडे बीएमएम में सतह पर तैरनेवाला और पुन: निलंबित की उचित मात्रा निकालें: चढ़ाना के लिए सेल निलंबन। उदाहरण के लिए, जब 200,000 कोशिकाएं प्राप्त होती हैं, तो 20 μL की प्लेट 10 बूंदें। इस प्रकार, सेल निलंबन के 60 μL छोड़ दिया जाता है जब तक सतह पर तैरनेवाला हटा दें, बर्फ ठंडा बीएमएम के 140 μL जोड़ें और पुन: निलंबित।
- हवा के बुलबुले के गठन से बचने के लिए धीरे-धीरे फिर से निलंबित करें। एक बार बीएमएम में फिर से निलंबित होने के बाद, बर्फ पर माइक्रोसेंट्रिफुग ट्यूब रखें।
नोट: बर्फ पर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब रखना बीएमएम जमने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है।
- हवा के बुलबुले के गठन से बचने के लिए धीरे-धीरे फिर से निलंबित करें। एक बार बीएमएम में फिर से निलंबित होने के बाद, बर्फ पर माइक्रोसेंट्रिफुग ट्यूब रखें।
- पहले से गरम 48-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट के कुओं के केंद्र में 20 μL BMM बूंदों को पाइप करें।
- प्लेट को उल्टा फ्लिप करें, इसे 1.9% सीओ2 इनक्यूबेटर (एसएफडीएम बफर के अनुसार% सीओ2 ) में रखें, और इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 20 मिनट के लिए जमने दें।
- टॉम में रॉक अवरोधक (आरआई; 10 μM) और एम्फोटेरिसिन बी (0.1%) जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में माध्यम को प्रीवार्म करें।
नोट: एम्फोटेरिसिन बी प्रकाश-संवेदनशील है। - इनक्यूबेटर से 48-अच्छी तरह से प्लेट लें, सीधे रखें और बीएमएम छोटी बूंद / कोशिकाओं के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से तैयार प्रीवॉर्ड माध्यम के 250 μL जोड़ें और प्लेट को 1.9% सीओ2 इनक्यूबेटर में वापस करें।
- माध्यम को ताज़ा करने के लिए (अधिमानतः हर 2-3 दिनों में), 48-अच्छी तरह से प्लेट को 45 ° कोण पर झुकाएं, धीरे-धीरे बीएमएम बूंद को छूने से बचने के दौरान पिछले माध्यम को हटा दें, और नए प्रीवर्म्ड टीओएम माध्यम के 250 μL जोड़ें।
नोट: प्रमुख पोषक तत्वों और विकास कारकों की कमी से बचने के लिए सप्ताह में कम से कम तीन बार ताज़ा करने की सिफारिश की जाती है। एनोइकिस द्वारा कोशिका मृत्यु को रोकने और ऑर्गेनोइड आउटग्रोथ को बढ़ाने के लिए आरआई को केवल प्रारंभिक सीडिंग और प्रत्येक पासिंग के पहले दिनों (धारा 4 देखें) में टीओएम में जोड़ा जाना चाहिए। एम्फोटेरिसिन बी को केवल संभावित कवक संदूषण को अवरुद्ध करने के लिए मार्ग 0 (पी 0) के दौरान माध्यम में जोड़ा जाता है।
4. दांत ऑर्गेनॉइड संस्कृति का प्रवर्धन और पासिंग (चित्रा 1 बी और चित्रा 2 बी)
- संस्कृति के 10 और 14 दिनों के बीच ऑर्गेनोइड पारित करें।
नोट: लंबी अवधि के लिए संवर्धन से बचें क्योंकि लंबे समय तक संस्कृति ऑर्गेनोइड पुनर्विकास और पारित होने की क्षमता को सीमित कर सकती है। केवल प्रारंभिक विकास (पी 0) ऑर्गेनोइड को उनकी वृद्धि दर के आधार पर 20 दिनों तक सुसंस्कृत किया जा सकता है (व्यास में अधिकतम ±200 μm तक पहुंचने तक)। - ऑर्गेनोइड के साथ कुओं से माध्यम को हटा दें जिन्हें पारित करने की आवश्यकता है। एक संस्कृति की स्थिति के भीतर, चार संगम कुओं तक पूल करें ( चित्रा 2 सी देखें)।
- ऑर्गेनोइड्स को इकट्ठा करने के लिए, बीएमएम छोटी बूंद पर सीधे प्रति अच्छी तरह से बर्फ-ठंडे एसएफडीएम के 400 μL जोड़ें और बार-बार माध्यम को ऊपर और नीचे पाइप करें जब तक कि पूरे बीएमएम बूंद को हटा न दिया जाए।
- यदि कुओं को पूल किया जा रहा है, तो पूल किए जाने वाले सभी कुओं के ऑर्गेनोइड युक्त बीएमएम बूंदों को हटाने के लिए 400 μL को पहले कुएं से अगले (और इसी तरह) में स्थानांतरित करें।
- विस्थापित बीएमएम-ऑर्गेनोइड असेंबली को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और चरण 4.3 को फिर से दोहराएं जब तक कि सभी ऑर्गेनोइड संरचनाएं कुओं से एकत्र न हो जाएं।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र।
- 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ट्रिपल एक्सप्रेस (5 μM पर आरआई के साथ पूरक) के एक विभाज्य को प्रीवॉर्म करें। ऑर्गेनोइड के प्रति माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब, 400 μL ट्रिपल एक्सप्रेस की मात्रा की आवश्यकता होती है।
- सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और ट्रिपले के 400 μL में गोली को फिर से निलंबित करें। 12 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में निलंबन सेते हैं।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 एक्स जी पर एंजाइम और अपकेंद्रित्र को निष्क्रिय करने के लिए बर्फ-ठंडा एसएफडीएम के 400 μL जोड़ें। सतह पर तैरनेवाला निकालें।
- बर्फ-ठंडे एसएफडीएम के साथ एक टिप (वॉल्यूम के लिए नीचे देखें) को प्री-कोट करें और ऑर्गेनोइड गोली को फिर से निलंबित करें।
- ऑर्गेनोइड हानि से बचने के लिए, बाँझपन को खतरे में डाले बिना जितना संभव हो उतना उसी (पूर्व-लेपित) टिप का फिर से उपयोग करें।
नोट: गोली को फिर से निलंबित करने के लिए आवश्यक एसएफडीएम की मात्रा प्राप्त ऑर्गेनोइड संरचनाओं की संख्या और वर्तमान मार्ग संख्या पर निर्भर करती है। - अंगूठे के एक नियम के रूप में, मार्ग के लिए, पी 0 से पी 2-3 (आमतौर पर अभी भी ऑर्गेनोइड की कम संख्या बढ़ रही है) 200 μL एसएफडीएम की मात्रा का उपयोग करते हैं। मार्ग से, पी 3-4 या उच्चतर (आमतौर पर बड़ी संख्या में ऑर्गेनोइड उत्पन्न करते हैं) एसएफडीएम के 700 μL की मात्रा का उपयोग करते हैं।
नोट: दोनों प्रक्रियाओं को क्रमशः 'कम मार्ग' और 'उच्च मार्ग' विधियों के रूप में संदर्भित किया जाता है (चरण 4.10 और 4.11 देखें)। ऑर्गेनोइड के कुशल पासिंग के लिए अलग-अलग तरीकों को सही ढंग से लागू करना महत्वपूर्ण है। उच्च मार्ग विधि के साथ, ऑर्गेनोइड अधिक आसानी से खो जाते हैं और ऑर्गेनोइड की कम संख्या (यानी, पी 0 से पी 2-3 पर) पर लागू नहीं किया जाना चाहिए। हालांकि, बड़ी मात्रा में ऑर्गेनोइड को कुशलतापूर्वक अलग करने के लिए उच्च मार्ग विधि की आवश्यकता होती है।
- ऑर्गेनोइड हानि से बचने के लिए, बाँझपन को खतरे में डाले बिना जितना संभव हो उतना उसी (पूर्व-लेपित) टिप का फिर से उपयोग करें।
- कम मार्ग विधि: बर्फ-ठंडे एसएफडीएम के 200 μL में गोली को फिर से निलंबित करें। इसके व्यास को कम करने के लिए माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब के तल के खिलाफ पूरी तरह से खाली पिपेट टिप को दबाएं। जांचें कि व्यास काफी छोटा है (धीमी आकांक्षा, प्रवाह तिरछा है लेकिन अवरुद्ध नहीं है)। यंत्रवत् ऑर्गेनोइड को बाधित करने के लिए 5 मिनट के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें।
- उच्च मार्ग विधि: पी 1000 टिप के साथ बर्फ-ठंडे एसएफडीएम के 700 μL में गोली को फिर से निलंबित करें। बर्फ-ठंडे एसएफडीएम के साथ इस पी 1000 टिप और प्री-कोट के शीर्ष पर एक पी 200 टिप (कोई फ़िल्टर नहीं) जोड़ें। मध्यम मात्रा (ऑर्गेनोइड के साथ) के कम से कम 90% की आकांक्षा करने के लिए पिपेट की मात्रा सेटिंग को समायोजित करके हवा के बुलबुले के गठन को रोकें। यंत्रवत् ऑर्गेनोइड को बाधित करने के लिए 5 मिनट के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें।
- प्रकाश माइक्रोस्कोप (4x आवर्धन पर) के तहत जाँच करें यदि मुख्य रूप से (केवल) कुछ अनियंत्रित संरचनाओं के साथ एकल कोशिकाएं प्राप्त की जाती हैं।
- माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में बर्फ-ठंडा एसएफडीएम के 500 μL जोड़ें और धीरे-धीरे पाइपिंग द्वारा ताजा एसएफडीएम के साथ पृथक सेल मिश्रण मिलाएं।
- बर्फ पर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब को लंबवत रखकर 10 मिनट के लिए बड़ी अनियंत्रित संरचनाओं को तलछट दें।
नोट: अनियंत्रित संरचनाओं को हटाना आवश्यक है क्योंकि वे ऑर्गेनोइड मार्गशीलता को नकारात्मक रूप से प्रभावित करते हैं। ऑर्गेनोइड दीक्षा (पी 0) के लिए, इस अवसादन चरण की आवश्यकता नहीं है। - सतह पर तैरनेवाला (~ 500-1,000 μL पासिंग विधि के आधार पर) एकल कोशिकाओं और छोटे सेल समूहों युक्त ले लीजिए; एक नए माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरण, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 190 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र।
- एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर सेल एकाग्रता की गणना करें। कोशिका गुच्छों की उपेक्षा करें जो बने रहते हैं।
- गिनती करें कि कितने कुओं को वरीयता दी जा सकती है और ऊपर वर्णित उपयुक्त सेल निलंबन / बीएमएम अनुपात की गणना करें (धारा 3)।
- सेल गोली में बीएमएम का 70% जोड़ें और बर्फ पर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब बनाए रखें।
नोट: बीएमएम जमने से बचने के लिए बर्फ पर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब रखना महत्वपूर्ण है। - चरण 3.3 से 3.7 तक आगे बढ़ें और संस्कृति के दिन 10 और दिन 14 के बीच फिर से पारित करें।
5. दांतों के ऑर्गेनोइड का क्रायोप्रिजर्वेशन
- पासिंग (चरण 4) के लिए ऊपर वर्णित ऑर्गेनोइड को इकट्ठा करें और अलग करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 एक्स जी पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र।
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें और एसएफडीएम (70%), एफबीएस (20%), और डीएमएसओ (10%) युक्त क्रायोप्रिजर्वेशन माध्यम के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें।
- निलंबन को क्रायोवियल में स्थानांतरित करें और इसे बर्फ पर रखें। क्रायोवियल्स को क्रायो बॉक्स में रखें और -80 डिग्री सेल्सियस (कम से कम 4 घंटे के लिए) में स्थानांतरित करें।
- 1 महीने के भीतर, जमे हुए नमूनों को दीर्घकालिक (>12 महीने) भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।
6. क्रायोप्रिजर्व्ड टूथ ऑर्गेनोइड का पिघलना
- विगलन प्रक्रिया शुरू करने से पहले, 20% एफबीएस के साथ एसएफडीएम के 10 एमएल युक्त बर्फ पर प्रति क्रायोवियल एक 15 मिलीलीटर ट्यूब रखें।
- तरल नाइट्रोजन से क्रायोवियल निकालें और इसे बर्फ पर रखें।
नोट: जितनी जल्दी हो सके निम्नलिखित चरणों को निष्पादित करें और बहुत लंबे विगलन समय (>5 मिनट) के साथ-साथ चरणों (>5 मिनट) के बीच बहुत लंबे अंतराल से बचें, क्योंकि इस तरह के लम्बाई सेल अस्तित्व को कम कर देगी। - एक गर्म पानी के स्नान (37 डिग्री सेल्सियस) में क्रायोवियल रखें जब तक कि पिघला हुआ (~ 1-2 मिनट)।
- तुरंत 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए बर्फ-ठंडा 15 एमएल ट्यूब और अपकेंद्रित्र पर 200 एक्स जी पर क्रायोवियल की सामग्री को स्थानांतरित करें।
- सतह पर तैरनेवाला के 9 एमएल निकालें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 एक्स जी पर शेष 1 एमएल अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला निकालें और 1 एमएल बर्फ-ठंडा एसएफडीएम के साथ गोली धो लें।
- एक 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण और एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर कोशिकाओं की गिनती।
- गिनती करें कि कितने कुओं को वरीयता दी जा सकती है और ऊपर वर्णित उपयुक्त सेल निलंबन / बीएमएम अनुपात की गणना करें (धारा 3)।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र। बीएमएम: टीओएम के 70:30 अनुपात में गोली को फिर से निलंबित करें और बर्फ पर रखें।
- चरण 3.3 से 3.7 तक आगे बढ़ें और संस्कृति के दिन 10 और दिन 14 के बीच पारित करें।
7. दांत ऑर्गेनोइड का निर्धारण और पैराफिन-एम्बेडिंग
नोट: यह प्रक्रिया (धारा 8 और 9 सहित) को प्राथमिक डीएफ ऊतक पर भी लागू किया जा सकता है।
- पीएफए में दांत ऑर्गेनोइड का निर्धारण
- चरण 4.2 में प्रत्येक अच्छी तरह से माध्यम निकालें।
- बीएमएम छोटी बूंद (चरण 4.3) को हटाकर ऑर्गेनोइड एकत्र करें। बीएमएम-ऑर्गेनोइड मिश्रण को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र।
- सतह पर तैरनेवाला निकालें और 4% पीएफए के 500 μL जोड़ें और एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर कोमल मिश्रण के साथ आरटी पर 30 मिनट (अधिकतम 1 घंटे) की एक न्यूनतम के लिए सेते हैं।
सावधानी: पीएफए के साथ काम करते समय रासायनिक हुड का उपयोग करें। - 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला निकालें और कोमल मिलाते हुए के साथ आरटी पर 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ ऑर्गेनोइड गोली कुल्ला।
- ऑर्गेनोइड गोली (चरण 7.1.5) को अतिरिक्त दो बार धो लें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 एक्स जी पर फिक्स्ड ऑर्गेनोइड को नीचे स्पिन करें।
- 70% ईटीओएच (विआयनीकृत पानी में) के 500 μL में गोली को फिर से निलंबित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 70% ईटीओएच में 1 महीने तक ऑर्गेनोइड स्टोर करें।
- दांत ऑर्गेनोइड के एगरोज़- और पैराफिन-एम्बेडिंग
नोट: पैराफिन में ऑर्गेनोइड को कुशलतापूर्वक एम्बेड करने के लिए, एगरोज़ में एम्बेडिंग के एक अतिरिक्त चरण की आवश्यकता होती है।- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 एक्स जी पर 70% ईटीओएच में पीएफए-फिक्स्ड ऑर्गेनोइड्स को अपकेंद्रित्र करें। सतह पर तैरनेवाला निकालें।
- एक कांच की बोतल में पीबीएस के 30 मिलीलीटर में 2% एगरोज़ समाधान तैयार करें। एक माइक्रोवेव में एगरोज़-पीबीएस मिश्रण को गर्म करें जब तक कि जेल जैसी संरचना नहीं देखी जाती है (600 डब्ल्यू पर लगभग 2.5 मिनट)।
- समानांतर में, एक और कांच की बोतल में 30 मिलीलीटर पीबीएस जोड़ें और माइक्रोवेव में गर्म करें (600 डब्ल्यू पर लगभग 2.5 मिनट)। एगरोज़ समाधान को 1 मिनट के लिए ठंडा होने दें।
- एगरोज़ समाधान के साथ ठीक से काम करने की अनुमति देने और हवा के बुलबुले से बचने के लिए पी 200 टिप के अंत में कटौती करें।
- कुछ बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके गर्म पीबीएस में पी 200 टिप को प्रीवार्म करें।
- ऑर्गेनोइड गोली के लिए प्रीवॉर्ड एगरोज़ समाधान के 150 μL जोड़ें और हवा के बुलबुले से परहेज करते हुए धीरे-धीरे ऑर्गेनोइड-एगरोज़ मिश्रण (न्यूनतम पुन: निलंबन के साथ) को पाइप करें।
नोट: न्यूनतम पुन: निलंबन माइक्रोटोम सेक्शनिंग पर एगरोज़ जेल में ऑर्गेनोइड का बेहतर पता लगाने की अनुमति देगा क्योंकि ऑर्गेनोइड तब एक दूसरे के करीब होते हैं। - ऑर्गेनोइड-एगरोज़ मिश्रण को तुरंत एक ही माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब कैप में स्थानांतरित करें, ट्यूब को क्षैतिज रूप से रखें, और एगरोज़ को जमने दें (आरटी पर ~ 20 मिनट)। इस बीच, कैसेट को लेबल करें।
- एक बार जमने के बाद, चिमटी का उपयोग करके माइक्रोसेंट्रिफ्यूज कैप से एगरोज़ जेल को हटा दें और इसे लेबल वाले कैसेट में स्थानांतरित करें।
- विआयनीकृत पानी में 50% ईटीओएच युक्त बीकर में एगरोज़ युक्त कैसेट को स्थानांतरित करें। ईटीओएच के वाष्पीकरण से बचने के लिए पैराफिल्म के साथ बीकर को कवर करें।
नोट: बीकर की मात्रा कैसेट की संख्या पर निर्भर करती है। - रात भर एक ऊतक प्रोसेसर में नमूनों को संसाधित करें।
नोट: जैसा कि पैराफिन आरटी पर जम जाता है, निम्नलिखित चरणों को तेजी से किया जाना चाहिए। - 15 मिनट के लिए एम्बेडिंग वर्कस्टेशन में एक हीटिंग ब्लॉक प्रीवार्म करें।
- कैसेट में संलग्न ऑर्गेनोइड युक्त एगरोज जेल को हटा दें और इसे प्रीवॉर्ड हीटिंग ब्लॉक में रखें। कैसेट से टोपी निकालें और बाद में उपयोग के लिए इसे एक तरफ रख दें।
- पैराफिन के साथ शेष हीटिंग ब्लॉक भरें।
नोट: एक चिमटी के साथ जांचें कि ऑर्गेनोइड युक्त एगरोज़ जेल अभी भी हीटिंग ब्लॉक के नीचे स्थित है या नहीं। इसके हल्के वजन के कारण, यह तैरना शुरू कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप नमूना हानि हो सकती है। - हीटिंग ब्लॉक के शीर्ष पर कैसेट टोपी रखें। इसे ठंडी प्लेट पर 30 मिनट के लिए जमने दें। हीटिंग ब्लॉक निकालें और पैराफिन ब्लॉक को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
8. माइक्रोटोम सेक्शनिंग और दांत ऑर्गेनोइड का धुंधला होना (चित्रा 2 बी और चित्रा 3 ए-सी)
- ऑर्गेनोइड युक्त पैराफिन ब्लॉकों का माइक्रोटोम सेक्शनिंग
- एक माइक्रोटोम का उपयोग करके पैराफिन ब्लॉक में दांत ऑर्गेनोइड के 5 μm वर्गों को स्लाइस करें।
- एक माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड के शीर्ष पर पैराफिन स्लाइस रखें। माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म प्लेट पर रखें और इसे पाश्चर पिपेट का उपयोग करके विआयनीकृत पानी के साथ कवर करें।
- माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड रात भर सूखने दें।
- दांत ऑर्गेनोइड वर्गों का धुंधला होना
- 58 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए ओवन में ऑर्गेनोइड वर्गों (माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड पर) को डिपराफिनाइज करें।
- निम्नलिखित क्रम में रासायनिक हुड के अंदर ईटीओएच श्रृंखला को कम करने में ऑर्गेनोइड वर्गों (माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड पर) को पुनर्जलीकरण करें:
3 मिनट प्रत्येक के लिए जाइलीन 2x
3 मिनट प्रत्येक के लिए 100% ईटीओएच 2x
3 मिनट प्रत्येक के लिए 95% ईटीओएच 2x
3 मिनट प्रत्येक के लिए 90% ईटीओएच 2x
70% ईटीओएच 3x प्रत्येक 3 मिनट के लिए
सावधानी: ज़ाइलीन के साथ काम करते समय रासायनिक हुड का उपयोग करें। - आरटी पर 5 मिनट के लिए नल के पानी में माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड कुल्ला। फिर, इसे आरटी पर 5 मिनट के लिए पीबीएस में कुल्ला।
- 95 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 30 मिनट के लिए प्रीवॉर्ड साइट्रेट बफर (पीएच 6 के साथ विआयनीकृत पानी में साइट्रिक एसिड के 10 एमएम; एक प्लास्टिक कंटेनर में; 95 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 10 मिनट के लिए प्रीवर्म्ड) में ऑर्गेनोइड वर्गों (माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड पर) रखकर एंटीजन पुनर्प्राप्ति करें।
- आरटी पर 5 मिनट के लिए पीबीएस में माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड कुल्ला, और फिर आरटी पर 5 मिनट के लिए 0.1% ट्राइटन-एक्स (पीबीटी) युक्त पीबीएस में।
- प्रत्येक स्लाइड की सीमाओं पर हाइड्रोफोबिक अवरोध बनाने के लिए एक अंकन पेन का उपयोग करें।
- अवरुद्ध बफर में आरटी पर कम से कम 1 घंटे के लिए ब्लॉक (पीबीटी में भंग 1.5 मिलीग्राम / एमएल ग्लाइसिन, 2 मिलीग्राम / एमएल एल्बुमिन गोजातीय सीरम (बीएसए) प्लस 10% गधा सीरम।
नोट: आम तौर पर, अवरुद्ध बफर प्लस 10% गधा सीरम के 300 μL माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड प्रति की आवश्यकता है। - एक आर्द्र कक्ष में माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड रखें। एक एयरटाइट बॉक्स का उपयोग करें जहां सभी स्लाइड्स बॉक्स के नीचे रखने के लिए पानी के साथ कुछ पेपर ऊतकों को फिट और गीला करें। यह बाद के धुंधला चरणों के दौरान स्लाइड को सूखने से रोक देगा।
- अवरुद्ध बफर निकालें, बफर प्लस 1% गधा सीरम को अवरुद्ध करने में तैयार प्राथमिक एंटीबॉडी (तालिका 6) जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्र कक्ष में रात भर एंटीबॉडी समाधान के साथ कवर स्लाइड सेते हैं। यदि आवश्यक हो तो अंकन पेन बॉर्डर को फिर से करें।
- एक कक्षीय प्रकार के बरतन (75-150 आरपीएम) पर कोमल मिश्रण के साथ 10 मिनट के लिए आरटी पर पीबीटी में तीन बार माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड धो लें।
- माध्यमिक एंटीबॉडी (तालिका 6) जोड़ें, बफर प्लस 1% गधा सीरम को अवरुद्ध करने में तैयार किया गया है, और आरटी पर आर्द्र कक्ष में 1 घंटे के लिए सेते हैं।
- अवरुद्ध बफर निकालें और एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर कोमल मिश्रण के साथ 10 मिनट के लिए आरटी पर पीबीटी में तीन बार माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड धो लें।
- एक ग्लास कवरस्लिप पर डीएपीआई (1 से 3 बूंदों) के साथ एंटीफेड बढ़ते माध्यम जोड़ें और इसे ऑर्गेनोइड वर्गों (माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड पर) के शीर्ष पर माउंट करें। इमेजिंग के साथ आगे बढ़ें; 4 डिग्री सेल्सियस पर अधिकतम 1 सप्ताह के लिए स्लाइड स्टोर करें।
9. दांत ऑर्गेनोइड के आरएनए निष्कर्षण और आरटी-क्यूपीसीआर (चित्रा 2 बी और चित्रा 3 डी)
- दांत ऑर्गेनोइड का आरएनए निष्कर्षण
- प्रत्येक कुएं से माध्यम निकालें (चरण 4.2)।
- बीएमएम छोटी बूंद (चरण 4.3) को हटाकर ऑर्गेनोइड्स को इकट्ठा करें, बीएमएम-ऑर्गेनोइड मिश्रण को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र।
- सतह पर तैरनेवाला निकालें, लाइसिस बफर (सामग्री की तालिका) में भंग 1% β-मर्कैप्टोइथेनॉल के 350 μL में सख्ती से निलंबित करें, और बर्फ पर डाल दिया।
सावधानी: एक रासायनिक हुड में β-मर्कैप्टोइथेनॉल के साथ सभी चरणों का पालन करें।
नोट: नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने के लिए इस कदम पर संग्रहीत किया जा सकता है। चरण 9.1.4 के साथ आगे बढ़ने से पहले बर्फ पर नमूनों को पिघलाएं। - नमूनों को भंवर जब तक कोई ऑर्गेनोइड संरचनाएं अब नहीं देखी जाती हैं।
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार आरएनए निष्कर्षण किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके आरएनए निष्कर्षण के साथ आगे बढ़ें।
- दांत ऑर्गेनोइड का आरटी-क्यूपीसीआर (तालिका 7)
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके आरएनए19 को रिवर्स-ट्रांसक्राइब (आरटी)।
- एक वास्तविक समय पीसीआर प्रणाली (सामग्री की तालिका) का उपयोग करएसवाईबीआर ग्रीन आधारित मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) 19 के साथ परिणामी सीडीएनए नमूनों का विश्लेषण करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
दांत ऑर्गेनोइड विकास
हम ज्ञान दांत निष्कर्षण (चित्रा 1 ए) के बाद अधिग्रहित मानव डीएफ ऊतक से ऑर्गेनोइड संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। पृथक डीएफ एंजाइमेटिक और यंत्रवत् रूप से अलग है। प्राप्त कोशिकाओं को मीडिया में बीएमएम के भीतर सुसंस्कृत किया जाता है जिन्हें इष्टतम ऑर्गेनोइड विकास और विकास (टूथ ऑर्गेनोइड माध्यम) के लिए अनुभवजन्य रूप से परिभाषित किया गया था; टॉम) 19.
ऑर्गेनोइड आमतौर पर डीएफ सेल सीडिंग के बाद 2 सप्ताह के भीतर विकसित होते हैं (पी 0; चित्रा 2 ए)। ऑर्गेनोइड दीर्घकालिक विस्तार योग्य हैं (अब तक 11 मार्ग तक) (चित्रा 2 बी, पी 4 पर दिखाया गया है)। बीएमएम छोटी बूंद (पी 0 और आगे के मार्ग दोनों पर) प्रति लगभग 20,000 कोशिकाओं को बोने से ऑर्गेनोइड (चित्रा 2 सी) का इष्टतम घनत्व पैदा होता है, जबकि उच्च सेल संख्याओं को बोने से सबऑप्टिमल ऑर्गेनोइड आउटग्रोथ (यानी, बहुत अधिक घनत्व पर छोटे ऑर्गेनोइड) की ओर जाता है क्योंकि बढ़ने के लिए अपर्याप्त जगह होती है (चित्रा 2 डी)। अंततः अनुकूलित संस्कृति की स्थिति 100% दक्षता 19 पर डीएफ नमूनों से ऑर्गेनोइडके विकास की अनुमति देती है।
दांत ऑर्गेनोइड लक्षण वर्णन और सत्यापन
विकसित ऑर्गेनोइड एक घने उपस्थिति दिखाते हैं और इसमें उच्च न्यूक्लियो-साइटोप्लाज्मिक अनुपात प्रदर्शित करने वाली कोशिकाएं होती हैं, जैसा कि ईआरएम कोशिकाओं7 (चित्रा 3 ए) में देखा गया है। इसके अलावा, और आगे सादृश्य में, ऑर्गेनोइड ईआरएम मार्कर साइटोकेरेटिन 14 (सीके 14)22 को व्यक्त करते हैं, जिससे उनके उपकला मूल (चित्रा 3 बी), साथ ही अन्य प्रस्तावित ईआरएम मार्करों (जैसे पी 63, सीडी 44 और आईटीजी 612,22,23 (चित्रा 3 बी) की पुष्टि होती है। इसके अलावा, ऑर्गेनोइड एसओएक्स 2, चूहों में एक प्रसिद्ध डीईएससी मार्कर व्यक्त करते हैं और मानव दांतों (चित्रा 3 बी) 1 के विकास के उपकला में भी मौजूद हैं। दिलचस्प बात यह है कि, अमेलोजेनिन (एएमईएलएक्स), तामचीनी मैट्रिक्स का मुख्य घटक, जो ऑर्गेनोइड में भी पाया जाता है, ईआरएम24 (चित्रा 3 सी) में भी पाया जाता है। स्टेमनेस मार्करों की अभिव्यक्ति हमारे हाल के अध्ययन19 में वर्णित है और इसका उपयोग प्राप्त ऑर्गेनोइड को और प्रमाणित करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, ऑर्गेनोइड पासिंग के दौरान अपने ईआरएम / स्टेमनेस फेनोटाइप को बनाए रखते हैं, दूसरों के बीच ईआरएम / स्टेम सेल मार्करों (चित्रा 3 डी) की स्थिर अभिव्यक्ति द्वारा दिखाया गया है। अंत में, दांत-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड अमेलोब्लास्ट (-जैसे) कोशिकाओं के लिए भेदभाव क्षमता दिखाते हैं, जिसे प्राप्त ऑर्गेनोइड संस्कृतियों को मान्य करने के लिए भी लागू किया जा सकता है, जो परिपक्व अमेलोब्लास्ट मार्करों की अभिव्यक्ति दिखाता है जैसे कि ओडोन्टोजेनिक-अमेलोब्लास्ट संबद्ध प्रोटीन (ओडीएएम) और एमेलोटिन (एएमटीएन) भेदभाव माध्यम में स्थानांतरण के बाद (19 देखें)।
चित्रा 1: दांत ऑर्गेनॉइड विकास, लक्षण वर्णन और अनुप्रयोगों का योजनाबद्ध वर्कफ़्लो( ए) दंत कूप (डीएफ) ऊतक से दांत ऑर्गेनोइड विकास अप्रकाशित तीसरे दाढ़ से अलग। (बी) दांत ऑर्गेनोइड के प्रवर्धन, लक्षण वर्णन और अनुप्रयोग क्षमता। डी, दिन; पी, मार्ग। BioRender.com के साथ बनाया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: दांत ऑर्गेनोइड विकास( ए) डीएफ ऊतक से ऑर्गेनोइड विकास। प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड छवियों को अलग-अलग दिनों में दिखाया गया है (डी) बोने के बाद (पी 0; पी, मार्ग; (बी) ब्राइटफील्ड छवियां एक दांत ऑर्गेनॉइड लाइन (2.5x) की मजबूत पारित होने की क्षमता दिखाती हैं। (सी) ब्राइटफील्ड छवियां पासिंग (डी 0; बाएं; 2.5 एक्स) पर तुरंत एक दांत ऑर्गेनॉइड लाइन दिखाती हैं, जो प्रति अच्छी तरह से 20,000 कोशिकाओं के घनत्व पर वरीयता प्राप्त होती हैं, और परिणामस्वरूप संगम ऑर्गेनोइड संस्कृति पारित होने के लिए तैयार होती है (डी 14; दाएं; 2.5 एक्स)। (डी) एक दांत ऑर्गेनॉइड लाइन दिखाने वाली ब्राइटफील्ड छवियां, जिसे >20,000 कोशिकाओं के घनत्व पर वरीयता दी गई थी, जिससे डी 14 (2.5 एक्स) पर बहुत अधिक घनत्व पर छोटे ऑर्गेनोइड होते हैं। स्केल सलाखों: 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: टूथ ऑर्गेनॉइड लक्षण वर्णन (ए) टीओएम (पी 4; 5-20 एक्स)) में 14 दिनों में विकसित घने संरचनाओं को दिखाते हुए विभिन्न आवर्धनों पर डीएफ-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड संस्कृतियों की ब्राइटफील्ड छवियां। एक ऑर्गेनोइड (पी 1, दिन 11) के हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन धुंधला हो जाना। बॉक्स बढ़ा हुआ है। तीर एक उच्च न्यूक्लियो-साइटोप्लाज्मिक अनुपात के साथ कोशिकाओं को इंगित करते हैं। (बी) टीओएम-विकसित ऑर्गेनोइड्स (20 एक्स) में उपकला / ईआरएम / स्टेमनेस मार्करों के लिए इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला हो जाना। (सी) टीओएम-विकसित ऑर्गेनोइड (20 एक्स) में अमेलोजेनिन (एएमईएलएक्स) के लिए इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला हो जाना। नाभिक को लेबल करने के लिए डीएपीआई (नीला) का उपयोग किया गया था। (डी) संस्कृति के दिन 14 पर पी 1 और पी 5 टीओएम-उगाए गए ऑर्गेनोइड्स में ईआरएम / स्टेमनेस मार्करों के जीन अभिव्यक्ति स्तर ( जीएपीडीएच के सापेक्ष) (एसईएम ± मतलब; एन = 3 जैविक प्रतिकृतियां)। स्केल सलाखों: 50 μm, जब तक अन्यथा संकेत दिया. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| दंत कूप (डीएफ) संग्रह माध्यम | |
| नाम | एकाग्रता |
| न्यूनतम आवश्यक मध्यम ईगल (αMEM) | |
| भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) | 10% |
| एम्फोटेरिसिन बी | 0.5% |
| पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन / | 1% |
तालिका 1: दंत कूप (डीएफ) संग्रह माध्यम। तालिका डीएफ संग्रह माध्यम के घटकों को सूचीबद्ध करती है।
| टूथ ऑर्गेनॉइड माध्यम (टीओएम) | |
| नाम | एकाग्रता |
| सीरम-मुक्त परिभाषित माध्यम (एसएफडीएम) | रचना के लिए तालिका 3 देखें |
| A83-01 | 0.5 μM |
| बी 27 (विटामिन ए के बिना) | 2% |
| हैजा विष | 100 एनजी/एमएल |
| एफजीएफ 2 (= मूल एफजीएफ) | 20 एनजी/एमएल |
| एफजीएफ 8 | 200 एनजी/एमएल |
| एफजीएफ 10 | 100 एनजी/एमएल |
| एल-ग्लूटामाइन | 2 एमएम |
| आईजीएफ -1 | 100 एनजी/एमएल |
| एन 2 | 1% |
| एन-एसिटाइल एल-सिस्टीन | 1.25 एमएम |
| निकोटिनामाइड | 10 एमएम |
| नोगिन | 100 एनजी/एमएल |
| आरएसपीओ 1 | 200 एनजी/एमएल |
| एसबी 202190 (पी 38 आई) | 10 μM |
| श | 100 एनजी/एमएल |
| डब्ल्यूएनटी 3 ए | 200 एनजी/एमएल |
तालिका 2: टूथ ऑर्गेनॉइड माध्यम (टीओएम)। तालिका दांत ऑर्गेनॉइड माध्यम तैयार करने के लिए आवश्यक घटकों और उनके संबंधित सांद्रता को सूचीबद्ध करती है।
| सीरम मुक्त परिभाषित माध्यम (एसएफडीएम) (पीएच 7.3) | |
| नाम | एकाग्रता |
| बाँझ एच2हे | |
| डीएमईएम 1: 1 एफई के बिना एफ 12 | 16.8 ग्राम / |
| ट्रांसफरिन | 5 मिलीग्राम / |
| गोजातीय अग्न्याशय से इंसुलिन | 5 मिलीग्राम / |
| पेनिसिलिन जी सोडियम नमक | 35 मिलीग्राम / |
| स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट नमक | 50 मिलीग्राम / |
| इथेनॉल निरपेक्ष, ≥99.8% (ईटीओएच) | 600 μL/लीटर |
| गोजातीय यकृत से कैटालेज | 50 μL/लीटर |
| सोडियम हाइड्रोजन कार्बोनेट (एनएएचसीओ3) | 1 ग्राम/लीटर |
| एल्बुमिन बोवाइन (सेल संस्कृति ग्रेड) | 5 ग्राम/लीटर |
तालिका 3: सीरम मुक्त परिभाषित माध्यम (एसएफडीएम) (पीएच 7.3)। तालिका सीरम मुक्त परिभाषित माध्यम की संरचना को सूचीबद्ध करती है।
| पृथक्करण माध्यम | |
| नाम | एकाग्रता |
| फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) | |
| कोलेजनेज चतुर्थ | 3 मिलीग्राम/एमएल |
| द्वितीय को विचलित करें | 4 मिलीग्राम / |
तालिका 4: पृथक्करण माध्यम। पृथक्करण माध्यम तैयार करने के लिए घटकों और उनकी आवश्यक सांद्रता की सूची।
| मध्यम ए (पीएच 7.3) | |
| नाम | एकाग्रता |
| बाँझ एच2हे | |
| डीएमईएम पाउडर उच्च ग्लूकोज | 13.38 ग्राम / |
| हेप्स | 5.958 ग्राम / |
| सोडियम-पाइरूवेट (सी3एच3एनएओ3) | 110 मिलीग्राम / |
| पेनिसिलिन जी सोडियम नमक | 35 मिलीग्राम / |
| स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट नमक | 50 मिलीग्राम / |
| सोडियम क्लोराइड (एनएसीएल) | 0.5 ग्राम/ |
| सोडियम हाइड्रोजन कार्बोनेट (एनएएचसीओ3) | 1 ग्राम/लीटर |
| एल्बुमिन बोवाइन (सेल संस्कृति ग्रेड) | 3 ग्राम/लीटर |
| डीएनएएसई* | 0.2 मिलीग्राम / |
| * जब उल्लेख किया जोड़ें |
तालिका 5: मध्यम ए (पीएच 7.3)। तालिका मध्यम ए तैयार करने के लिए उपयोग किए जाने वाले घटकों की एकाग्रता को सूचीबद्ध करती है।
| प्राथमिक एंटीबॉडी | ||
| नाम | मेज़बान | एकाग्रता |
| एएमईएलएक्स | चूहा | 1:100 |
| सीडी 44 | चूहा | 1:200 |
| सीके 14 | चूहा | 1:200 |
| आईटीजीए6 | खरगोश | 1:200 |
| पी 63 | खरगोश | 1:1000 |
| एसओएक्स 2 | खरगोश | 1:2000 |
| अलग-अलग एंटीबॉडी | ||
| नाम | मेज़बान | एकाग्रता |
| माउस आईजीजी (एलेक्सा 555) | गधा | 1:1000 |
| खरगोश आईजीजी (एलेक्सा 488) | गधा | 1:1000 |
तालिका 6: एंटीबॉडी और उनके कमजोर पड़ने की सूची। तालिका इस अध्ययन में उपयोग किए गए एंटीबॉडी और उनके संबंधित कमजोर पड़ने को सूचीबद्ध करती है।
| प्राइमरों | ||
| जीन | प्राइमर अग्रेषित करें | रिवर्स प्राइमर |
| जीएपीडीएच | जीजीटीएटीसीजीजीसीएटीएसीसीएटीजीसी | एटीजीसीसीटीसीटीसीजीटीसीएजी |
| पी 63 | सीएएसीजीसीएजीटीएजीएसीसीटीएसीटीटीसीटीसीसी | सीसीसीएएएसीसीटीसीटीसीटीसीटीटीजीटीटी |
| आईटीजीए6 | जीजीसीजीजीटीजीटीटीटीसीटीसीटीजीजीटीसी | एएटीसीजीसीसीसीएसीएसीएएएजीसीटीसी |
| एसओएक्स 2 | जीसीटीजीजीजीजीटीएजीटीएजीएटीजीटीजीटीजी | सीसीसीटीजीटीजीटीटीटीसीटीसीसीटी |
| पीआईटीएक्स 2 | सीएजीसीजीसीटीसीटीटीएसीटीटीएजी | एटीटीसीटीजीएसीएसीएसीसीजीजीजी |
तालिका 7: प्राइमरों की सूची। तालिका इस अध्ययन में उपयोग किए गए जीएपीडीएच, पी 63, आईटीजीए 6, एसओएक्स 2 और पीआईटीएक्स 2 के प्राइमरों को सूचीबद्ध करती है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
यह प्रोटोकॉल मानव दांत से शुरू होने वाले ऑर्गेनोइड की कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पीढ़ी का वर्णन करता है। हमारे ज्ञान के लिए, यह मानव दंत ऊतक से शुरू होने वाले वर्तमान-अवधारणा (उपकला) ऑर्गेनोइड की स्थापना के लिए पहली पद्धति है। ऑर्गेनोइड दीर्घकालिक विस्तार योग्य हैं और एक दांत उपकला स्टेमनेस फेनोटाइप प्रदर्शित करते हैं, जो पहले डीएफ7 के ईआरएम डिब्बे में रिपोर्ट किए गए डीईएससी को डुप्लिकेट करते हैं। इसके अलावा, ऑर्गेनोइड कार्यात्मक डीईएससी / ईआरएम विशेषताओं को दोहराते हैं, जिसमें एक एमेलोब्लास्ट भेदभाव प्रक्रिया 7,25,26 का खुलासा शामिल है। निष्कर्ष मजबूत हैं क्योंकि तुलनीय परिणाम स्वतंत्र रोगी ऑर्गेनोइड लाइनों19 के साथ पाए गए थे।
इस टूथ ऑर्गेनॉइड प्रोटोकॉल को निष्पादित करते समय, कई महत्वपूर्ण बिंदुओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए। सबसे पहले, प्रारंभिक बीजारोपण में आरएचओ-जुड़े किनेज (रॉक) अवरोधक वाई -27632 के अलावा और प्रत्येक पासिंग के तुरंत बाद एकल कोशिकाओं को एनोइकिस27 से गुजरने से रोकने के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, (मौखिक) कवक बहिर्वाह से बचने के लिए पी 0 के दौरान सभी मीडिया जलपान में एम्फोटेरिसिन बी की आवश्यकता होती है। दूसरा, क्रायोप्रिजर्व्ड ऊतक से शुरू करने के बजाय इष्टतम ऑर्गेनोइड गठन और विकास दक्षता के लिए ताजा पृथक डीएफ ऊतकों को तुरंत संसाधित करने की सलाह दी जाती है, जिसके परिणामस्वरूप कम दक्षता होती है। तीसरा, संवर्धन के लिए क्रायोप्रिजर्व्ड ऑर्गेनॉइड लाइन को पिघलाते समय, जितनी जल्दी हो सके कदम उठाएं और बहुत लंबे विगलन समय के साथ-साथ चरणों के बीच बहुत लंबे अंतराल से बचें क्योंकि समय लम्बाई सेल अस्तित्व को कम करती है। चौथा, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रारंभिक मार्ग (पी 0-पी 3) पर ऑर्गेनोइड की संख्या सीमित रह सकती है, क्योंकि विशिष्ट पृथक डीएफ ऊतक नमूनों में केवल सीमित संख्या में ईआरएम (स्टेम) कोशिकाएं मौजूद हो सकती हैं। इसलिए, प्रारंभिक मार्ग पर ऑर्गेनोइड संस्कृतियों को देखभाल और विचार के साथ संभाला जाना चाहिए। इसलिए, यह अनुशंसा की जाती है (i) ऑर्गेनोइड संस्कृति के तेजी से विस्तार से बचें (यानी, केवल पी 3-4 से शुरू होने वाले 1: 3 या उससे अधिक पर विभाजित करना शुरू करें, और 1: 0.5 या 1: 1 से पहले); (ii) वर्णित के रूप में उपयुक्त विभाजन विधि (कम मार्ग - उच्च मार्ग) का उपयोग करें। इस संदर्भ में, युवा किशोर रोगियों (15 से 19 वर्ष) के अनियंत्रित ज्ञान दांतों को इकट्ठा करने की सलाह दी जाती है क्योंकि ईआरएम कोशिकाएं दांतों के विकास और28 वर्ष की आयु के साथ संख्या में कमी आती हैं। पांचवां, सेल निलंबन (फ़िल्टरिंग के बाद भी) में डीएफ ऊतक से शेष कठोर ऊतक के टुकड़े बीएमएम ड्रॉप को कम स्थिर और संस्कृति के दौरान विस्थापित होने की अधिक संभावना का कारण बनते हैं। बीएमएम (जैसे 80%) का एक उच्च प्रतिशत अनुशंसित है यदि पृथक डीएफ सेल निलंबन में कई अनियंत्रित कठोर ऊतक टुकड़े देखे जाते हैं। छठा, संस्कृति के दिन 10 और दिन 14 के बीच ऑर्गेनोइड को पारित करने की दृढ़ता से सलाह दी जाती है क्योंकि लंबी संस्कृति कम इष्टतम पृथक्करण के कारण ऑर्गेनोइड विस्तार क्षमता को नकारात्मक रूप से प्रभावित करेगी। यदि एक या दूसरे कारण से, ऑर्गेनोइड को 14 दिनों से अधिक समय तक सुसंस्कृत किया जाता है, तो ऑर्गेनोइड पृथक्करण के लिए ट्रिपल एक्सप्रेस मात्रा और इनक्यूबेशन समय कुशल पृथक्करण के लिए बढ़ाया जा सकता है, हालांकि एंजाइमेटिक एक्सपोजर के 15 मिनट को पार नहीं किया जाना चाहिए। उसी संदर्भ में, पोषक तत्वों और विकास कारक थकावट को रोकने के लिए संस्कृति माध्यम को हर 2-3 दिनों में ताज़ा किया जाना चाहिए। यदि ऑर्गेनोइड ठीक से विस्तार नहीं करते हैं, तो ऊपर उल्लिखित महत्वपूर्ण बिंदुओं की परवाह किए बिना, किसी को बर्फ पर गुजरने के दौरान उपयोग किए जाने वाले सभी उपकरणों (बीएमएम, पूर्व-कोटिंग टिप के लिए बर्फ-ठंडा एसएफडीएम, माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब) रखने पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए। इसके अलावा, ऑर्गेनोइड के कुशल पासिंग के लिए अलग-अलग पासिंग विधियों (कम मार्ग और उच्च मार्ग विधि) को सही ढंग से लागू करना महत्वपूर्ण है।
इससे पहले, अन्य समूहों ने प्राथमिक मानव डीईएससी / ईआरएम ऊतक 8,9,10,11,12,21 के कृत्रिम परिवेशीय विकास की सूचना दी है। हालांकि, संस्कृतियां मुख्य रूप से 2 डी (मोनोलेयर) थीं और 3 डी नहीं थीं, जैसे कि यह ऑर्गेनोइड मॉडल, इसके अलावा केवल अल्पकालिक विकास और फेनोटाइप प्रतिधारण दिखा रहा है। वैकल्पिक रूप से, अक्सर (अनायास) अमर कोशिकाओं का उपयोग किया जाता था, जो हालांकि, शारीरिक नहीं होते हैं और मूल के ऊतक या कोशिकाओं के लिए केवल सीमित समानता दिखाते हैं। इसके अलावा, ये सेल लाइनें भ्रूण के ऊतकों और / या जानवरों से ली गई थीं। इसके अलावा, एमेलोब्लास्ट भेदभाव या तो वर्णित नहीं है या केवल सीमित रूप से प्रलेखित है। इस प्रकार, यहां प्रस्तुत ऑर्गेनोइड मॉडल कई फायदे प्रदान करता है, (i) मूल के ऊतक / कोशिकाओं का वफादार पुनरावृत्ति, (ii) दीर्घकालिक विस्तार योग्य, (iii) 3 डी में सुसंस्कृत विवो कॉन्फ़िगरेशन में अधिक बारीकी से प्रतिनिधित्व करता है, (iv) मानव मूल और प्रसवोत्तर आयु का, और (v) परिपक्व दंत कोशिकाओं (एमेलोब्लास्ट सेल प्रकार) में अंतर करने में सक्षम (19 देखें)।
इस प्रकार, हमने एक मूल्यवान शोध उपकरण उत्पन्न किया, पहले रिपोर्ट नहीं किया गया, कई दिलचस्प अनुप्रयोगों (चित्रा 1 बी) को पकड़े हुए। मानव डीईएससी / ईआरएम स्टेमनेस और प्लास्टिसिटी का अध्ययन करने के लिए ऑर्गेनोइड को लागू किया जा सकता है। यह इम्यूनोफ्लोरोसेंट, जीन अभिव्यक्ति और (एकल-कोशिका) ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण के माध्यम से अभी भी गूढ़ ईआरएम सेल आबादी के जीव विज्ञान में और अंतर्दृष्टि प्राप्त करने का अवसर प्रदान करता है। इसके अलावा, ऑर्गेनोइड विशेष रूप से रोगजनक तंत्र को समझने, (नए) चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने और दवा की खोज और स्क्रीनिंग टूल उत्पन्न करने के लिए मानव रोग मॉडलिंग के लिए अनुकूलहैं। अधिक विशेष रूप से, इस मॉडल को ओडोन्टोजेनिक अल्सर (जिसके लिए कोई विश्वसनीय शोध मॉडल उपलब्ध नहीं है) पर लागू किया जा सकता है, जिसकी तुलना स्वस्थ दांत-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड से की जा सकती है। इसके अलावा, इस दांत ऑर्गेनोइड दृष्टिकोण का उपयोग बैक्टीरिया के प्रभाव से लेकर दांत विसंगतियों से जुड़े आनुवंशिक उत्परिवर्तन (जैसे पी 63 में उत्परिवर्तन, जिसे अत्याधुनिक जीन-संपादन विधियों जैसे सीआरआईएसपीआर-सीएएस) 30 का उपयोग करके पेश किया जा सकता है, अंततः संभावित, और उपन्यास, चिकित्सीय लक्ष्य और उपचार के लिए अग्रणी। टूथ ऑर्गेनॉइड प्रोटोकॉल के अन्य अनुप्रयोगों में बायोबैंकिंग शामिल हो सकती है (वर्तमान में दंत लुगदी के लिए पहले से ही उपलब्ध है, जैसे कि फ्यूचर हेल्थ बायोबैंक)31 कई गुना व्यक्तियों और बीमारियों से ऑर्गेनोइड लाइनों को इकट्ठा करने के लिए (उदाहरण के लिए, दवा स्क्रीनिंग जैसे बुनियादी और अनुवादक अनुसंधान के लिए)। इसके अलावा, समग्र ऑर्गेनोइड मॉडल पर कई रिपोर्टें जिनमें न केवल उपकला बल्कि मूल के ऊतक के अन्य सेल प्रकार भी शामिल हैं, हाल ही में32,33 प्रकाशित किए गए हैं। चूंकि दांतों की संरचना जटिल है, मेसेनकाइमल, प्रतिरक्षा और एंडोथेलियल कोशिकाओं को समायोजित करना, इन सेल प्रकारों के साथ संयोजन में इस उपकला ऑर्गेनोइड मॉडल को लागू करना उनके विवो समकक्ष में अधिक विस्तार से प्रतिनिधित्व करना एक आकर्षक परिप्रेक्ष्य है। इसके अलावा, यह प्रणाली मानव दांत में एमेलोजेनेसिस का पता लगाने की अनुमति देती है, वर्तमान में केवल खराब समझी जाती है, लेकिन निश्चित रूप से उपकला-मेसेनकाइमल इंटरैक्शन पर निर्भर करती है। एमेलोब्लास्ट विकास को समझने से दंत वैज्ञानिक और नैदानिक दुनिया में एक महत्वपूर्ण छलांग का प्रतिनिधित्व करने की उम्मीद है क्योंकि तामचीनी का उत्पादन, हमारे दांतों का सर्वोत्कृष्ट घटक, दंत ऊतक की मरम्मत में एक अत्यधिक पीछा किया गया लक्ष्य है। इसके अलावा, इस अध्ययन में विस्तृत ऑर्गेनोइड मॉडलिंग इन विट्रो में खनिज ऊतकों के गठन की ओर शुरुआत का संकेत दे सकती है और प्रतिस्थापन चिकित्सा के लिए बायोइंजीनियर्ड दांत (या कम से कम भागों) को विकसित करने का मार्ग प्रशस्त कर सकती है।
ऑर्गेनोइड मॉडल की सीमाओं में से एक यह है कि यह पूरी तरह से ऊतक के उपकला घटक का प्रतिनिधित्व करता है। हालांकि, जैसा कि ऊपर विस्तार से वर्णित है, इस कमी को अन्य सेल / ऊतक प्रकारों के अलावा हल किया जा सकता है, जैसे कि दंत मेसेनकाइम19। एक अन्य पहलू जिसे सीमा के रूप में पहचाना जा सकता है, वह यहां उपयोग किए जाने वाले बीएमएम की उत्पत्ति है (मैट्रिगेल)। यह बीएमएम एक माउस के सारकोमा (एंगेलब्रेक्ट-होल्म-स्वार्म) से लिया गया है और इसलिए क्लिनिक में ऑर्गेनोइड दृष्टिकोण का अनुवाद करने से पहले इसे प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए। हाल ही में, मैट्रिगेल को सिंथेटिक हाइड्रोगेल34,35 के साथ बदलने के लिए कई प्रयास किए गए हैं। हालांकि, ऐसे गैर-प्राकृतिक जैल में ऑर्गेनोइड को सफलतापूर्वक विकसित करने के लिए अधिक शोध की आवश्यकता है। यद्यपि ऑर्गेनोइड तकनीक भविष्य के दंत पुनर्योजी चिकित्सा के लिए एक दिलचस्प दृष्टिकोण प्रदान करती है - उदाहरण के लिए, एक बायोइंजीनियर्ड दांत का विकास - सेल दाताओं की गोपनीयता के साथ-साथ मानव ऑर्गेनोइड और उससे प्राप्त ऊतकों के व्यावसायीकरण के बारे में नैतिक प्रश्न उठाए जाने चाहिए। अब तक, पुनर्योजी प्रयोजनों के लिए ऑर्गेनोइड व्यावसायीकरण के बारे में कोई निष्कर्षनहीं निकाला गया है। दंत लुगदी बायोबैंक31 बढ़ रहे हैं, साथ ही दवा स्क्रीनिंग उद्देश्यों के लिए कई, मुख्य रूप से कैंसर के ऊतकों से ऑर्गेनोइड बायोबैंक भी हैं। यह देखते हुए कि ऑर्गेनोइड को कोशिकाओं, युग्मकों, ऊतकों या अंगों (जो सभी कानून द्वारा विनियमित होते हैं) के रूप में वर्गीकृत नहीं किया जा सकता है, नैदानिक, वैज्ञानिक या वाणिज्यिक सेटिंग्स में इसके उपयोग के लिए इसकी न्यायिक स्थिति को चित्रित करने की तत्काल आवश्यकता है। भले ही ऑर्गेनोइड ने विवो19 में चमड़े के नीचे प्रत्यारोपित होने पर खनिज ऊतक जमा करने के लिए दिखाया है, लेकिन प्राकृतिक मानव दांत के समान तामचीनी जमा करने की उनकी क्षमता का विश्लेषण करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है।
कुल मिलाकर, विकसित किया गया नया ऑर्गेनॉइड मॉडल मानव दांत (स्टेम सेल) जीव विज्ञान और अमेलोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए एक आशाजनक, मूल्यवान उपकरण प्रस्तुत करता है, दोनों वर्तमान में केवल खराब खोजे जाते हैं, दांत रोग मॉडलिंग और पुनर्योजी उपचारों की ओर भविष्य के दृष्टिकोण के साथ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
संबंधित लेखक यह सुनिश्चित करता है कि सभी लेखकों ने हितों के किसी भी और सभी संघर्षों का खुलासा किया है।
Acknowledgments
हम यूजेड ल्यूवेन के ओरल और मैक्सिलोफेशियल सर्जरी (एमकेए) के सभी कर्मचारियों के सदस्यों के साथ-साथ रोगियों के लिए आभारी हैं, ताजा निकाले गए तीसरे दाढ़ को इकट्ठा करने में उनकी अमूल्य मदद के लिए। हम नमूना संग्रह में उनकी मदद के लिए डॉ रेनहिल्ड जैकब्स और डॉ एलिजाबेथ तिजस्केंस को भी धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को केयू ल्यूवेन (बीओएफ) और एफडब्ल्यूओ-फ्लैंडर्स (जी 061819 एन) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। एलएच एक एफडब्ल्यूओ पीएचडी फेलो (1 एस 84718 एन) है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120.086 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-6250 | |
| 48-well flat bottom plates | Corning | 3548 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330.03 | |
| AMELX antibody | Santa Cruz | sc-365284 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15200018 | |
| B27 (without vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Cassette | VWR | 7202191 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma-Aldrich | C100 | |
| CD44 antibody | Abcam | ab34485 | |
| Cell strainer, 40 µm | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759 | |
| CK14 antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-11599 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Cover glass | VWR | 6310146 | |
| Cryobox | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | |
| DMEM 1:1 F12 without Fe | Invitrogen | 074-90715A | |
| DMEM powder high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Dnase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 - 10ML | |
| Embedding workstation, 220 to 240 Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol absolute, ≥99.8% (EtOH) | Fisher Chemical | E/0650DF/15 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| FGF2 (= basic FGF) | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| FGF8 | Peprotech | AF-100-25 | |
| GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | RTN350-1KT | Includes 1% β-mercaptoethanol dissolved in lysis buffer |
| Glass Pasteur pipette | Niko Mechanisms | 170-40050 | |
| Glycine | VWR | 101194M | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| IGF-1 | PeproTech | 100-11 | |
| InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI) | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| ITGA6 antibody | Sigma-Aldrich | HPA012696 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Matrigel (growth factor-reduced; phenol red-free) | Corning | 15505739 | |
| Microscope slide | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SLGV033R | |
| Minimum essential medium eagle (αMEM) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| mouse IgG (Alexa 555) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetyl L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| P63 antibody | Abcam | ab124762 | |
| Pap Pen | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | Marking pen |
| Paraformaldehyde (PFA), 16% | Merck | 8.18715 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| Petri dish | Corning | 353002 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Pipette (P20, P200, P1000) | Eppendorf or others | 2231300006 | |
| Plastic transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.001 | |
| Rabbit IgG (Alexa 488) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| RSPO1 | PeproTech | 120-38 | |
| SB202190 (p38i) | Biotechne (Tocris) | 1264 | |
| Scalpel (surgical blade) | Swann-Morton | 207 | |
| SHH | R&D Systems | 464-SH-200 | |
| Silicone molds (Heating block) | VWR | 720-1918 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P-5280 | |
| SOX2 antibody | Abcam | ab92494 | |
| StepOnePlus | Thermo Fisher Scientific | Real-Time PCR System | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile 1000 μL pipette tips with filter | Greiner | 740288 | |
| Sterile 20 μL pipette tips with filter | Greiner | 774288 | |
| Sterile 200 μL pipette tips with and without filter | Greiner | 739288 | |
| Sterile H2O | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Superscript III first-strand synthesis supermix | Invitrogen | 11752-050 | Reverse transcription kit |
| Tissue processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Transferrin | Serva | 36760.01 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| TrypLE express | Gibco | 12605-010 | |
| Vectashield mounting medium+DAPI | Labconsult NV | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| WNT3a | Biotechne (Tocris) | 5036-WN-500 | |
| Xylenes, 99%, for biochemistry and histology | VWR | 2,89,75,325 |
References
- Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development (Cambridge). 147 (2), (2020).
- Arrow, P. Dental enamel defects, caries experience and oral health-related quality of life: a cohort study. Australian Dental Journal. 62 (2), 165-172 (2017).
- Mitsiadis, T. A., Orsini, G., Jimenez-Rojo, L. Dental Stem Cells for Tooth Regeneration. Dental Stem Cells: Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. Zavan, B., Bressan, E. , Humana Press. Cham. (2016).
- Mitsiadis, T. A., Orsini, G. Editorial: a new era in dentistry: stem cell-based approaches for tooth and periodontal tissue regeneration. Frontiers in Physiology. 7, 357 (2016).
- Miran, S., Mitsiadis, T. A., Pagella, P. Innovative dental stem cell-based research approaches: the future of dentistry. Stem Cells International. 2016, 7231038 (2016).
- Shinmura, Y., Tsuchiya, S., Hata, K. I., Honda, M. J. Quiescent epithelial cell rests of malassez can differentiate into ameloblast-like cells. Journal of Cellular Physiology. 217 (3), 728-738 (2008).
- Davis, E. M. A review of the epithelial cell rests of Malassez on the bicentennial of their description. Journal of Veterinary Dentistry. 35 (4), 290-298 (2018).
- Athanassiou-Papaefthymiou, M., Papagerakis, P., Papagerakis, S. Isolation and characterization of human adult epithelial stem cells from the periodontal ligament. Journal of Dental Research. 94 (11), 1591-1600 (2015).
- Kim, G. -H., et al. Differentiation and establishment of dental epithelial-like stem cells derived from human ESCs and iPSCs. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-16 (2020).
- Nam, H., et al. Establishment of Hertwig's epithelial root sheath/ epithelial rests of malassez cell line from human periodontium. Molecules and Cells. 37 (7), 562-567 (2014).
- Nam, H., et al. Expression profile of the stem cell markers in human hertwig's epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells. Molecules and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).
- Tsunematsu, T., et al. Human odontogenic epithelial cells derived from epithelial rests of Malassez possess stem cell properties. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1063-1075 (2016).
- Artegiani, B., Clevers, H. Use and application of 3D-organoid technology. Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Cox, B., et al. Organoids from pituitary as a novel research model toward pituitary stem cell exploration. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development (Cambridge). 144 (10), 1775-1786 (2017).
- Schutgens, F., Clevers, H. Human organoids: tools for understanding biology and treating diseases). Annual Review of Pathology. 15, 211-234 (2020).
- Hemeryck, L., et al. Organoids from human tooth showing epithelial stemness phenotype and differentiation potential. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (3), 153 (2022).
- Gao, X., Wu, Y., Liao, L., Tian, W. Oral organoids: progress and challenges. Journal of Dental Research. 100 (5), 454-463 (2021).
- Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Scientific Reports. 10 (1), 4963 (2020).
- Xiong, J., Mrozik, K., Gronthos, S., Bartold, P. M. Epithelial cell rests of malassez contain unique stem cell populations capable of undergoing epithelial-mesenchymal transition. Stem Cells and Development. 21 (11), 2012-2025 (2012).
- Luan, X., Ito, Y., Diekwisch, T. G. H. Evolution and development of Hertwig's epithelial root sheath. Developmental Dynamics. 235 (5), 1167-1180 (2006).
- Fukumoto, S., et al. New insights into the functions of enamel matrices in calcified tissues. Japanese Dental Science Review. 50 (2), 47-54 (2014).
- Consolaro, A., Consolaro, M. F. M. O. ERM functions, EGF and orthodontic movement or Why doesn't orthodontic movement cause alveolodental ankylosis. Dental Press Journal of Orthodontics. 15 (2), 24-32 (2010).
- Guajardo, G., et al. Immunohistochemical localization of epidermal growth factor in cat paradental tissues during tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 118 (2), 210-219 (2000).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Gonçalves, J., Sasso-Cerri, E., Cerri, P. Cell death and quantitative reduction of rests of Malassez according to age. Journal of Periodontal Research. 43 (4), 478-481 (2008).
- Kim, J., Koo, B. -K., Knoblich, J. A. Human organoids: Model systems for human biology and medicine. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Razmi, M. T., Narang, T., Handa, S. ADULT (acro-dermato-ungual-lacrimal-tooth) syndrome: a case report from India. Indian Dermatology Online Journal. 9 (3), 194 (2018).
- Future Health Biobank. , Available from: https://futurehealthbiobank.com/ch-en/ (2022).
- Schreurs, R. R. C. E., Baumdick, M. E., Drewniak, A., Bunders, M. J. In vitro co-culture of human intestinal organoids and lamina propria-derived CD4+ T cells. STAR Protocols. 2 (2), 100519 (2021).
- Fiorini, E., Veghini, L., Corbo, V. Modeling cell communication in cancer with organoids: Making the complex simple. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 166 (2020).
- Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
- Zhang, Y., et al. Polyisocyanide hydrogels as a tunable platform for mammary gland organoid formation. Advanced Science. 7 (18), 2001797 (2020).
- Mollaki, V.
