Summary
Vi præsenterer en protokol til udvikling af epitelorganoidkulturer startende fra menneskelig tand. Organoiderne er robust udvidelige og rekapitulerer tandens epitelstamceller, herunder deres ameloblastdifferentieringskapacitet. Den unikke organoidmodel giver et lovende værktøj til at studere human dental (stamcelle) biologi med perspektiver for tandregenerative tilgange.
Abstract
Tænder er af afgørende betydning i livet, ikke kun for madmastikation og tale, men også for psykologisk velvære. Viden om menneskets tandudvikling og biologi er knap. Især er der ikke meget kendt om tandens epitelstamceller og deres funktion. Det lykkedes os at udvikle en ny organoidmodel, der starter fra menneskeligt tandvæv (dvs. tandfollikel, isoleret fra ekstraherede visdomstænder). Organoiderne er robust og langsigtede udvidelige og rekapitulerer det foreslåede menneskelige tandepitel stamcellerum med hensyn til markørekspression såvel som funktionel aktivitet. Især er organoiderne i stand til at udfolde en ameloblastdifferentieringsproces som forekommer in vivo under amelogenese. Denne unikke organoidmodel vil give et kraftfuldt værktøj til at studere ikke kun menneskelig tandudvikling, men også tandpatologi og kan bane vejen for tandregenerativ terapi. Udskiftning af tabte tænder med en biologisk tand baseret på denne nye organoidmodel kan være et tiltalende alternativ til den nuværende standardimplantation af syntetiske materialer.
Introduction
Tænder har vigtige roller i madmastikation, tale og psykologisk velvære (selvbillede). Den menneskelige tand består af stærkt mineraliserede væv med varierende tæthed og hårdhed1. Tandemalje, hovedkomponenten i tandkronen, er det højeste mineraliserede væv i menneskekroppen. Under emaljedannelse (amelogenese), når tænderne udvikler sig, differentierer dental epitelstamceller (DESC'er) sig til emaljedannende celler (ameloblaster). Når emaljen er dannet, repareres eller fornyes emaljen sjældent på grund af det apoptotiske tab af ameloblasterne ved begyndelsen af tandudbrud1. Restaurering af beskadiget emaljevæv, som forårsaget af traume eller bakteriel sygdom, udføres i øjeblikket ved hjælp af syntetiske materialer; disse er dog plaget af vigtige mangler såsom mikroleakage, ringere osseointegration og forankring, begrænset levetid og mangel på fuldt funktionel reparation2. Derfor ville en robust og pålidelig kultur af humane DESC'er med kapacitet til at generere ameloblaster og potentialet til at producere mineraliseret væv være et stort skridt fremad på det dentalregenerative område.
Viden om human DESC-fænotype og biologisk funktion er knap 3,4,5. Interessant nok er DESC'er af menneskelige tænder blevet foreslået at eksistere i Epitelcelle hviler af Malassez (ERM), celleklynger til stede i tandfollikel (DF), som omgiver ubrudte tænder og forbliver til stede i periodontal ledbånd omkring roden, når tanden bryder ud1. ERM-celler, der er dyrket sammen med tandmasse, har vist sig at differentiere sig til ameloblastlignende celler og generere emaljelignende væv6. Imidlertid har dybtgående undersøgelser af ERM-cellernes specifikke rolle i emaljegenerering (re-) været begrænsede på grund af manglen på pålidelige undersøgelsesmodeller7. Nuværende ERM in vitro-kultursystemer hæmmes af begrænset levetid og hurtigt tab af fænotype under de 2D-betingelser, der normalt anvendes 8,9,10,11,12. Derfor er der et stærkt behov for et medgørligt in vitro-system til trofast at udvide, studere og differentiere humane DESC'er.
I løbet af det sidste årti er en kraftfuld teknik til at dyrke epitelstamceller in vitro med succes blevet anvendt på flere typer (humane) epitelvæv for at studere deres biologi såvel som sygdom 13,14,15,16. Denne teknologi gør det muligt for vævsepitelstamcellerne at udvikle sig selv til 3D-cellekonstruktioner (dvs. organoider), når de podes i et ekstracellulært matrix (ECM) -efterlignende stillads (typisk Matrigel) og dyrkes i et defineret medium, der replikerer vævets stamcelle niche signalering og / eller embryogenese. Typiske vækstfaktorer, der er nødvendige for organoid udvikling, omfatter epidermal vækstfaktor (EGF) og vingeløs type MMTV-integrationssted (WNT) aktivatorer 14,15,16. De resulterende organoider er kendetegnet ved varig troskab ved at efterligne vævets oprindelige epitelstamceller samt høj ekspanderbarhed, samtidig med at deres fænotype og funktionelle egenskaber bevares, hvorved den ofte begrænsede primære humane vævstilgængelighed som erhvervet fra klinikken bevares. For at etablere organoider er isolering af epitelstamcellerne fra det heterogene væv (dvs. omfattende andre celletyper såsom mesenkymale celler) før dyrkning ikke påkrævet, da mesenkymale celler ikke binder sig til eller trives i ECM, hvilket i sidste ende resulterer i rent epitelorganoider 13,16,17,18,19 . Denne lovende og alsidige teknologi har ført til udviklingen af mangfoldige organoidmodeller fra forskellige humane epitelvæv. Imidlertid blev menneskelige tandafledte organoider, der er værdifulde til dyb undersøgelse af tandudvikling, regenerering og sygdom, endnu ikke etableret20,21. Det lykkedes os for nylig at udvikle en sådan ny organoidmodel, der starter fra DF-væv fra tredje kindtænder (visdomstænder) udtrukket fra unge patienter19.
Her beskriver vi protokollen til udvikling af epitelorganoidkulturer fra den voksne menneskelige tand (dvs. fra DF af tredje molarer) (figur 1A). De resulterende organoider udtrykker ERM-associerede stamhedsmarkører, mens de er langsigtede ekspanderbare. Interessant nok, modsat de fleste andre organoidmodeller, er den typisk nødvendige EGF overflødig for robust organoidudvikling og vækst. Interessant nok viser stamhedsorganoiderne ameloblastdifferentieringsegenskaber og efterligner derved ERM / DESC-funktioner og processer, der forekommer in vivo. Den nye og unikke organoidmodel, der er beskrevet her, gør det muligt at udforske DESC-biologi, plasticitet og differentieringskapacitet og åbner døren for at tage de første skridt mod tandregenerative tilgange.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, der er beskrevet her, er godkendt af Den Etiske Komité Forskning UZ/KU Leuven (13/0104U). Ekstraherede tredje kindtænder (visdomstænder) blev opnået efter patienternes informerede samtykke.
1. Præparater
- Forvarm en 48-brønds kulturplade i 15-20 timer i en 1,9% CO2-inkubator ved 37 °C.
- Flydende en Matrigel aliquot (vækstfaktor-reduceret; phenol rødfri; yderligere benævnt kældermembranmatrix; BMM) på is (4 °C) i mindst 2 timer før trin 2.1.
BEMÆRK: Undgå frysnings-/optøningscyklusser for BMM. BMM'en flydende i 15-20 timer på is og aliquot ved 1 ml i mikrocentrifugerør og opbevar ved -20 °C. - Centrifugen afkøles til 4 °C.
- Forbered mediet, og opløsningen filtreres gennem et 0,22 μm filter. De følgende bind er baseret på DF'ernes samling fra alle fire tredje molarer, der typisk er udvundet samtidigt.
- Forbered 20 ml DF-opsamlingsmedium (tabel 1): minimum essentiel medium eagle (αMEM) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 0,5% amphotericin B og 1% penicillin-streptomycin. Overfør 4 ml DF-opsamlingsmedium til et 15 ml rør og overfør rørene på is.
BEMÆRK: Et 15 ml rør er tilstrækkeligt pr. patient til prøveindsamling (dvs. til fire tredje molarer). - Lav 20 ml tandorganoidmedium (yderligere benævnt TOM; Tabel 2) anvendelse af serumfrit defineret medium (SFDM; Tabel 3). Opbevar TOM ved 4 °C i højst 2 uger.
- Der fremstilles 8 ml dissociationsmedium (tabel 4), dvs. phosphatbufferet saltvand (PBS) indeholdende collagenase VI (3 mg/ml ) og dispase II (4 mg/ml). Forvarm dissociationsmediet i et 37 ° C vandbad i mindst 10 minutter før brug og overfør det til to 15 ml rør (4 ml pr. Rør) for at dissociere fire DF-væv.
- Forbered en vaskeplade (12-brønd), der indeholder: tre brønde med 70% EtOH, tre brønde med PBS og tre brønde med DF-opsamlingsmedium.
- Der fremstilles 15 ml medium A pr. prøve (dvs. 5 ml pr. to DF'er pr. patient; Tabel 5).
BEMÆRK: Følgende trin skal udføres under sterile forhold.
- Forbered 20 ml DF-opsamlingsmedium (tabel 1): minimum essentiel medium eagle (αMEM) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 0,5% amphotericin B og 1% penicillin-streptomycin. Overfør 4 ml DF-opsamlingsmedium til et 15 ml rør og overfør rørene på is.
2. Dental follikel dissociation
- Når de tredje kindtænder med tilhørende DF'er er samlet i opsamlingsmediet (på is), overføres indholdet af rørene til en petriskål.
- Hold tanden med en pincet og isoler forsigtigt DF ved hjælp af et kirurgisk blad.
BEMÆRK: Dette trin kræver øvelse; vær forsigtig med bladet. - For at vaske det resterende blod af DF'erne skal du placere DF-vævene kort i den første brønd på 70% EtOH (vaskeplade) i 20 s og derefter overføre til den næste EtOH-brønd i 20 s og videre til den tredje EtOH-brønd (maksimalt 1 minut i 70% EtOH i alt; længere inkubationstid vil resultere i reduceret cellelevedygtighed).
- Fortsæt derefter med at skylle i de tre PBS-brønde (maks. 2 minutter i alt).
- Skyl DF'erne i de tre resterende DF-opsamlingsbrønde (op til maksimalt 20 min i alt).
- Overfør de skyllede DF'ere til en ny petriskål.
- Skær et lille stykke af en af DF'erne (~ 5 mm2) til paraformaldehyd (PFA) fiksering (se afsnit 7) og opbevar det på is (i højst 6 timer) i et mikrocentrifugerør indeholdende 500 μL DF-opsamlingsmedium indtil PFA-fiksering.
- Hak resten af DF'erne i små stykker (~1 mm2).
BEMÆRK: Det anbefales straks at behandle de frisk isolerede DF-væv for optimal organoiddannelse og væksteffektivitet i stedet for at starte fra kryopræserveret væv, hvilket resulterer i lavere effektivitet. Ikke desto mindre er det muligt at kryopreservere primært DF-væv på dette trin (se kryopræserveringsmedium og protokol i afsnit 5). - De hakkede DF'er overføres til et 15 ml rør indeholdende 4 ml forvarmt dissociationsmedium, og der inkuberes i et 37 °C vandbad i 2 timer.
BEMÆRK: Tilføj to DF'er pr. 4 ml forvarmt dissociationsmedium (et rør) for at sikre optimal dissociation. - Hvert 15. minut blandes DF-dissociationsmediet op og ned ved hjælp af et Pasteur-glasrør for at fremskynde vævsopløsningen. Når DF-stykker ikke længere observeres (normalt efter 1 time), skal du fortsætte med DF-dissociation ved hjælp af et indsnævret brandpoleret Pasteur-rør.
BEMÆRK: For optimal DF-dissociation skal du skifte til et Pasteur-rør indsnævret ved brandpolering senest 1 time DF-isolering.- I mellemtiden fremstilles 10 ml medium A indeholdende 50 μL DNase (0,2 mg/ml; Tabel 5).
- Der tilsættes 5 ml medium A (indeholdende DNase) til hvert rør med dissocieret DF, og der inkuberes i 1 minut ved stuetemperatur (RT).
- Cellesuspensionen (indeholdende enkeltceller og småcelleklumper) filtreres gennem en 40 μm cellesi for at fjerne de resterende store fragmenter og (det meste af) det fibrøse væv.
- Kombiner de flere rør med dissocieret DF fra en patient på dette trin.
- Filtret skylles med 1 ml medium A. Den filtrerede cellesuspension centrifugeres ved 200 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Fjern supernatanten, resuspender pelleten i 1 ml SFDM (tabel 3), og overfør cellesuspensionen til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Beregn cellekoncentrationen ved hjælp af en automatiseret celletæller. Forsøm de celleklumper, der er tilbage.
- Centrifuger ved 200 x g i 5 minutter ved 4 °C.
3. Etablering af tandorganoidkultur (figur 1A og figur 2A)
- Baseret på det opnåede cellenummer beregnes antallet af brønde, der kan sås. En 20 μL dråbe skal indeholde 20.000 celler. Den endelige blanding består af cellesuspension og BMM i et forhold på 30:70.
- Den passende mængde supernatant fjernes, og der resuspend i iskold BMM for at opnå et forhold på 70:30 mellem BMM: cellesuspension til plettering. For eksempel, når der opnås 200.000 celler, plade 10 dråber på 20 μL. Fjern således supernatanten, indtil 60 μL af cellesuspensionen er tilbage, tilsæt 140 μL iskold BMM og resuspend.
- Resuspend langsomt for at undgå dannelse af luftboble. Når det er resuspended i BMM, skal du holde mikrocentrifugerøret på is.
BEMÆRK: At holde mikrocentrifugerøret på is er afgørende for at undgå BMM-størkning.
- Resuspend langsomt for at undgå dannelse af luftboble. Når det er resuspended i BMM, skal du holde mikrocentrifugerøret på is.
- Rør 20 μL BMM-dråberne i midten af brøndene på den forvarmede 48-brønds kulturplade.
- Vend pladen på hovedet, læg den i en 1,9% CO2 -inkubator (% CO2 ifølge SFDM-buffer), og lad den størkne i mindst 20 minutter ved 37 ° C.
- Der tilsættes ROCK inhibitor (RI; 10 μM) og Amphotericin B (0,1%) til TOM og forvarm mediet i et 37 °C vandbad.
BEMÆRK: Amphotericin B er lysfølsom. - Tag pladen med 48 brønde fra inkubatoren, placer den lodrette og tilsæt 250 μL af det forberedte forvarmede medium til hver brønd med BMM-dråbe / celler, og returner pladen til 1,9% CO2-inkubatoren .
- For at opdatere mediet (helst hver 2-3 dag) skal du vippe pladen med 48 brønde i en vinkel på 45 °, fjerne det forrige medium forsigtigt, mens du undgår at røre ved BMM-dråben, og tilsæt 250 μL nyt forvarmet TOM-medium.
BEMÆRK: Det anbefales at opdatere mindst tre gange om ugen for at undgå udtømning af vigtige næringsstoffer og vækstfaktorer. RI skal kun tilføjes til TOM ved første såning og de første dage af hver passaging (se afsnit 4) for at forhindre celledød af anoikis og forbedre organoid udvækst. Amphotericin B tilsættes kun til mediet under passage 0 (P0) for at blokere mulig svampeforurening.
4. Forstærkning og passaging af tandorganoidkultur (figur 1B og figur 2B)
- Passage organoiderne mellem 10 og 14 dages kultur.
BEMÆRK: Undgå dyrkning i længere tid, da langvarig dyrkning kan begrænse organoid genvækst og passage. Kun ved den første udvikling (P0) må organoider dyrkes i op til 20 dage afhængigt af deres vækstrate (indtil maksimal ±200 μm i diameter er nået). - Fjern mediet fra brøndene med organoider, der skal passeres. Inden for en kulturbetingelse skal du samle op til fire sammenløbsbrønde (se figur 2C).
- For at opsamle organoiderne tilsættes 400 μL iskold SFDM pr. brønd direkte på BMM-dråben og gentagne gange rører mediet op og ned, indtil hele BMM-dråben er løsnet.
- Hvis brønde samles, overføres 400 μL fra den første brønd til den næste (og så videre) for at fjerne de organoidholdige BMM-dråber fra alle brønde, der skal samles.
- Overfør den løsnede BMM-organoidsamling til et 1,5 ml mikrocentrifugerør og gentag trin 4.3 igen, indtil alle organoidstrukturer er opsamlet fra brøndene.
- Centrifuger ved 200 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Forvarm en aliquot af TrypLE Express (suppleret med RI ved 5 μM) i et 37 ° C vandbad. Pr. mikrocentrifugerør af organoider er der brug for et volumen på 400 μL TrypLE Express.
- Efter centrifugering fjernes supernatanten, og pelleten resuspenderes i 400 μL TrypLE. Inkuber suspensionen i et 37 °C vandbad i 12 min.
- Der tilsættes 400 μL iskold SFDM for at inaktivere enzymet og centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved 4 °C. Fjern supernatanten.
- Forspænd en spids (for volumen se nedenfor) med iskold SFDM og resuspend organoidpillen.
- For at undgå tab af organoid skal du genbruge den samme (forbelagte) spids så meget som muligt uden at bringe steriliteten i fare.
BEMÆRK: Volumenet af SFDM, der kræves til genoplivning af pelleten, afhænger af antallet af opnåede organoidstrukturer og det aktuelle passagenummer. - Som en tommelfingerregel bruger P0 til P2-3 (generelt stadig et lavt antal organoider) et volumen på 200 μL SFDM. Fra passager bruger P3-4 eller højere (generelt giver et større antal organoider) et volumen på 700 μL SFDM.
BEMÆRK: Begge procedurer benævnes henholdsvis »lavpassage« og »højere passage«-metoder (se trin 4.10 og 4.11). Korrekt anvendelse af de forskellige metoder er afgørende for effektiv passaging af organoiderne. Med den højere passagemetode går organoider lettere tabt og bør ikke anvendes på et lavt antal organoider (dvs. ved P0 til P2-3). Imidlertid er den højere passagemetode nødvendig for effektivt at dissociere større mængder organoider.
- For at undgå tab af organoid skal du genbruge den samme (forbelagte) spids så meget som muligt uden at bringe steriliteten i fare.
- Lavpassagemetode: Resuspender pelleten i 200 μL iskold SFDM. Skub den helt tømte pipettespids mod bunden af mikrocentrifugerøret for at reducere dens diameter. Kontroller, om diameteren er lille nok (langsommere aspiration, flow er skævt, men ikke blokeret). Rør op og ned i 5 minutter for mekanisk at forstyrre organoiderne.
- Metode med højere passage: Resuspender pelleten i 700 μL iskold SFDM med en P1000-spids. Tilføj en P200-spids (intet filter) oven på denne P1000-spids og forlak med iskold SFDM. Undgå dannelse af luftboble ved at justere pipettens volumenindstilling for at stræbe efter mindst 90% af mediumvolumenet (med organoider). Rør op og ned i 5 minutter for mekanisk at forstyrre organoiderne.
- Kontroller under lysmikroskopet (ved 4x forstørrelse), hvis der hovedsageligt opnås enkeltceller med (kun) nogle få ikke-spredte strukturer.
- Der tilsættes 500 μL iskold SFDM til mikrocentrifugerøret, og den dissocierede celleblanding blandes forsigtigt med den friske SFDM ved pipettering.
- Lad store ikke-spredte strukturer sedimentere i 10 minutter ved lodret at placere mikrocentrifugerøret på is.
BEMÆRK: Det er nødvendigt at fjerne de ikke-spredte strukturer, fordi de påvirker organoidpassagen negativt. Til organoidinitiering (P0) er dette sedimentationstrin ikke nødvendigt. - Supernatanten (~ 500-1.000 μL afhængigt af passagingsmetoden) indeholdende enkeltceller og små celleklynger; overføres til et nyt mikrocentrifugerør, og centrifugeres ved 190 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Beregn cellekoncentrationen ved hjælp af en automatiseret celletæller. Forsøm de celleklumper, der er tilbage.
- Tæl, hvor mange brønde der kan sås, og beregn det passende cellesuspension/BMM-forhold som beskrevet ovenfor (afsnit 3).
- Tilsæt 70% BMM til cellepillen og vedligehold mikrocentrifugerøret på is.
BEMÆRK: Det er afgørende at holde mikrocentrifugerøret på is for at undgå BMM-størkning. - Fortsæt med trin 3.3 til 3.7 og passage igen mellem dag 10 og dag 14 i kulturen.
5. Kryopræservering af tandorganoider
- Organoiderne opsamles og dissocieres som nævnt ovenfor til passaging (trin 4). Cellesuspensionen centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten kasseres, og pelleten genanvendes i 1 ml kryopræserveringsmedium indeholdende SFDM (70 %), FBS (20 %) og DMSO (10 %).
- Overfør suspensionen til en kryofil og læg den på is. Kryoviralerne anbringes i en kryokasse og overføres til -80 °C (i mindst 4 timer).
- Inden for 1 måned overføres de frosne prøver til flydende nitrogen til langvarig (>12 måneder) opbevaring.
6. Optøning af kryopreserverede tandorganoider
- Før optøningsproceduren påbegyndes, skal du placere et 15 ml rør pr. kryovin på is indeholdende 10 ml SFDM med 20% FBS.
- Fjern kryoviralet fra det flydende nitrogen og læg det på is.
BEMÆRK: Udfør følgende trin så hurtigt som muligt og undgå for lang optøningstid (>5 min) samt for lange intervaller mellem trinene (>5 min), da en sådan forlængelse vil reducere celleoverlevelsen. - Anbring kryoviralen i et varmt vandbad (37 °C), indtil den er optøet (~1-2 min).«)
- Cryovialindholdet overføres straks til det iskolde 15 ml rør og centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten fjernes, og de resterende 1 ml centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved 4 °C. Fjern supernatanten og vask pelleten med 1 ml iskold SFDM.
- Overfør cellesuspension til et 1,5 ml mikrocentrifugerør og tæl cellerne ved hjælp af en automatiseret celletæller.
- Tæl, hvor mange brønde der kan sås, og beregn det passende cellesuspension/BMM-forhold som beskrevet ovenfor (afsnit 3).
- Centrifuger ved 200 x g i 5 minutter ved 4 °C. Resuspend pelleten i forholdet 70:30 BMM: TOM og hold på is.
- Fortsæt med trin 3.3 til 3.7 og passage mellem dag 10 og dag 14 af kultur.
7. Fiksering og paraffinindlejring af tandorganoider
BEMÆRK: Denne procedure (herunder afsnit 8 og 9) kan også anvendes på det primære DF-væv.
- Fiksering af tandorganoider i PFA
- Mediet fjernes fra hver brønd som i trin 4.2.
- Organoiderne opsamles ved at løsne BMM-dråben (trin 4.3). Overfør BMM-organoidblandingen til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Centrifuger ved 200 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Fjern supernatanten og tilsæt 500 μL 4% PFA og inkuber i mindst 30 minutter (maks. 1 time) ved RT med skånsom blanding på en orbitalryster.
FORSIGTIG: Brug kemikaliehætten, når du arbejder med PFA. - Centrifuger ved 200 x g i 5 minutter ved 4 °C. Fjern supernatanten og skyl organoidpillen med PBS i 10 minutter ved RT med let omrystning.
- Organoidpellet (trin 7.1.5) vaskes yderligere to gange. Drej de faste organoider ned ved 200 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Resuspender pelleten i 500 μL 70% EtOH (i deioniseret vand). Organoiderne opbevares i op til 1 måned i 70% EtOH ved 4 °C.
- Agarose- og paraffinindlejring af tandorganoider
BEMÆRK: For effektivt at indlejre organoider i paraffin er der behov for et yderligere trin med indlejring i agarose.- De PFA-faste organoider centrifugeres i 70 % EtOH ved 200 x g i 5 minutter ved 4 °C. Fjern supernatanten.
- Forbered en 2% agaroseopløsning i 30 ml PBS i en glasflaske. Opvarm agarose-PBS-blandingen i en mikrobølgeovn, indtil der observeres en gellignende struktur (ca. 2,5 min ved 600 W).
- Parallelt tilsættes 30 ml PBS til en anden glasflaske og opvarmes i mikrobølgeovnen (ca. 2,5 min ved 600 W). Lad agaroseopløsningen køle af i 1 min.
- Skær enden af en P200-spids for at gøre det muligt at arbejde præcist med agaroseopløsningen og for at undgå luftbobler.
- Forvarm P200-spidsen i den varme PBS ved at pipettere op og ned et par gange.
- Der tilsættes 150 μL præwarmed agaroseopløsning til organoidpellet, og organoid-agaroseblandingen forsigtigt op (med minimal resuspension), samtidig med at luftbobler undgås.
BEMÆRK: Den minimale resuspension vil muliggøre bedre lokalisering af organoiderne i agarosegelen ved mikrotomsektion, da organoiderne derefter er tættere på hinanden. - Overfør straks organoid-agaroseblandingen til den samme mikrocentrifuge rørhætte, sæt røret vandret, og lad agarosen størkne (~ 20 min ved RT). I mellemtiden mærkes kassetterne.
- Når den er størknet, skal du fjerne agarosegelen fra mikrocentrifugehætten ved hjælp af en pincet og overføre den til en mærket kassette.
- Den agaroseholdige kassette overføres til et bægerglas indeholdende 50% EtOH i deioniseret vand. Bægerglasset dækkes med parafilm for at undgå fordampning af EtOH.
BEMÆRK: Bægerglassets volumen afhænger af antallet af kassetter. - Behandl prøverne i en vævsprocessor natten over.
BEMÆRK: Da paraffin størkner ved RT, skal følgende trin udføres hurtigt. - Forvarm en varmeblok i indlejringsarbejdsstationen i 15 min.
- Fjern den organoidholdige agarosegel, der er lukket i kassetten, og læg den i den forvarmede varmeblok. Fjern hætten fra kassetten, og læg den til side til senere brug.
- Fyld den resterende varmeblok med paraffin.
BEMÆRK: Kontroller med en pincet, om den organoidholdige agarosegel stadig er placeret i bunden af varmeblokken. På grund af sin lette vægt kan den begynde at flyde, hvilket resulterer i prøvetab. - Placer kassettehætten oven på varmeblokken. Lad det størkne i 30 min på en kold plade. Varmeblokken fjernes, og paraffinblokkene opbevares ved 4 °C.
8. Mikrotomsektionering og farvning af tandorganoider (figur 2B og figur 3A-C)
- Mikrotomsektionering af organoidholdige paraffinblokke
- Skær 5 μm sektioner af tandorganoiderne i paraffinblokkene ved hjælp af et mikrotom.
- Placer paraffinskiverne oven på et mikroskopglasglas. Anbring mikroskopglasglasset på en varm plade ved 37 °C, og dæk det med deioniseret vand ved hjælp af et Pasteur-rør.
- Lad mikroskopglasset glide tørt natten over.
- Farvning af tandorganoid sektioner
- Deparaffiniser organoidsektionerne (på mikroskopglasglasset) i en ovn i 1 time ved 58 °C.
- Rehydrere organoidsektionerne (på mikroskopglasglasset) i faldende EtOH-serier inde i den kemiske hætte i følgende rækkefølge:
Xylen 2x i 3 minutter hver
100% EtOH 2x i 3 minutter hver
95% EtOH 2x i 3 min hver
90% EtOH 2x i 3 min hver
70% EtOH 3x i 3 minutter hver
FORSIGTIG: Brug kemikaliehætten, når du arbejder med Xylen. - Skyl mikroskopglasglasset i postevand i 5 minutter ved RT. Skyl det derefter i PBS i 5 minutter ved RT.
- Udfør antigenhentning ved at placere organoidsektionerne (på mikroskopglasglasset) i forvarmet citratbuffer (10 mM citronsyre i deioniseret vand med pH 6; i en plastbeholder; forvarmet i 10 minutter i et 95 ° C vandbad) i 30 minutter i et 95 ° C vandbad.
- Lad mikroskopglasset glide af i 20 min ved RT. Skyl mikroskopglasset i PBS i 5 min ved RT, og derefter i PBS indeholdende 0,1% Triton-X (PBT) i 5 min ved RT.
- Brug en markeringspen til at skabe en hydrofob barriere ved grænserne af hvert dias.
- Blok i mindst 1 time ved RT i blokerende buffer (indeholdende 1,5 mg/ml glycin, 2 mg/ml albumin bovint serum (BSA) opløst i PBT) plus 10 % æselserum.
BEMÆRK: Typisk er der brug for 300 μL blokeringsbuffer plus 10% æselserum pr. Mikroskopglasglasglas. - Placer mikroskopglasglasset i et fugtigt kammer. Brug en lufttæt kasse, hvor alle dias passer, og våd et par papirservietter med vand til at placere i bunden af kassen. Dette forhindrer diasene i at tørre ud under de efterfølgende farvningstrin.
- Blokeringsbufferen fjernes, det primære antistof (tabel 6), der er fremstillet i blokerende buffer plus 1 % æselserum, og diaset dækkes med antistofopløsning natten over i det fugtige kammer ved 4 °C. Gentag markeringspenns kant, hvis det er nødvendigt.
- Mikroskopglasglasset vaskes tre gange i PBT ved RT i 10 minutter med skånsom blanding på en orbitalryster (75-150 omdr./min.).
- Det sekundære antistof (tabel 6), fremstillet i blokerende buffer plus 1% æselserum, tilsættes, og der inkuberes i 1 time i det fugtige kammer ved RT.
- Fjern blokeringsbufferen, og vask mikroskopglasglasset tre gange i PBT ved RT i 10 minutter med skånsom blanding på en orbitalryster.
- Tilsæt antifade monteringsmedium med DAPI (1 til 3 dråber) på en glasdæksler og monter dette oven på organoidsektionerne (på mikroskopglasglasglasset). Fortsæt med billeddannelse; opbevare dias i højst 1 uge ved 4 °C.
9. RNA-ekstraktion og RT-qPCR af tandorganoider (figur 2B og figur 3D)
- RNA-ekstraktion af tandorganoider
- Fjern mediet fra hver brønd (trin 4.2).
- Organoiderne opsamles ved at løsne BMM-dråben (trin 4.3), BMM-organoidblandingen overføres til et 1,5 ml mikrocentrifugerør, og der centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten fjernes, resuspender kraftigt i 350 μL 1% β-mercaptoethanol opløst i lysisbuffer (materialetabel), og læg på is.
FORSIGTIG: Udfør alle trin med β-mercaptoethanol i en kemisk hætte.
BEMÆRK: Prøver kan opbevares på dette trin i op til 1 måned ved -80 °C. Tø prøverne op på is, inden trin 9.1.4 fortsættes. - Vortex prøverne, indtil der ikke længere observeres organoidstrukturer.
- Fortsæt med RNA-ekstraktion ved hjælp af RNA-ekstraktionssættet (Materialetabel) i henhold til producentens anvisninger.
- RT-qPCR af tandorganoider (tabel 7)
- Omvendt transskribering (RT) RNA19 ved hjælp af omvendt transkriptionssæt (materialetabel) i henhold til producentens anvisninger.
- Analyser de resulterende cDNA-prøver med SYBR Green-baseret kvantitativ PCR (qPCR)19 ved hjælp af et realtids-PCR-system (materialetabel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tandorganoid udvikling
Vi leverer en detaljeret protokol til etablering af organoidkulturer fra humant DF-væv erhvervet efter visdomstandekstraktion (figur 1A). Isoleret DF er enzymatisk og mekanisk dissocieret. De opnåede celler dyrkes inden for BMM i medier, der empirisk blev defineret for optimal organoid udvikling og vækst (tandorganoid medium; TOM)19.
Organoiderne udvikler sig typisk inden for 2 uger efter DF-cellesåning (P0; Figur 2A). Organoiderne kan udvides på lang sigt (op til 11 passager indtil videre) (figur 2B, vist på P4). Såning af omkring 20.000 celler pr. BMM-dråbe (ved både P0 og yderligere passager) giver en optimal tæthed af organoider (figur 2C), mens såning af højere celletal fører til suboptimal organoidudvækst (dvs. mindre organoider ved for høj densitet), da der ikke er tilstrækkelig plads til at vokse (figur 2D). De til sidst optimerede kulturforhold tillader udvikling af organoider fra DF-prøver med 100% effektivitet19.
Tandorganoid karakterisering og validering
De udviklede organoider viser et tæt udseende og indeholder celler, der viser et højt nukleo-cytoplasmisk forhold, som tilsvarende observeret i ERM-celler7 (figur 3A). Desuden og i yderligere analogi udtrykker organoiderne ERM-markøren cytokeratin 14 (CK14)22 og bekræfter derved deres epiteloprindelse (figur 3B) samt andre foreslåede ERM-markører (såsom P63, CD44 og ITGα6 12,22,23 (figur 3B). Desuden udtrykker organoider SOX2, en velkendt DESC-markør hos mus og også til stede i epitelet for udvikling af menneskelige tænder (figur 3B)1. Interessant nok detekteres amelogenin (AMELX), hovedkomponenten i emaljematrixen, der også findes udtrykt i organoiderne, også i ERM24 (figur 3C). Ekspression af endnu andre ERM/stemness markører er beskrevet i vores nylige undersøgelse19 og kan bruges til yderligere at certificere de opnåede organoider. Desuden bevarer organoiderne deres ERM/stemness-fænotype under passaging, bl.a. vist ved stabil ekspression af ERM/stamcellemarkører (figur 3D). Endelig viser de tandafledte organoider differentieringskapacitet til ameloblast (-lignende) celler, som også kan anvendes til at validere de opnåede organoidkulturer, der viser ekspression af modne ameloblastmarkører såsom odontogen-ameloblast associeret protein (ODAM) og amelotin (AMTN) efter overførsel til differentieringsmedium (se19).
Figur 1: Skematisk arbejdsgang for tandorganoid udvikling, karakterisering og applikationer. (A) Tandorganoid udvikling fra dental follikel (DF) væv isoleret fra ubrudte tredje molarer. (B) Forstærkning, karakterisering og anvendelsespotentiale af tandorganoider. d, dag; P, passage. Oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Tandorganoid udvikling. (A) Organoid udvikling fra DF væv. Repræsentative brightfield-billeder vist på forskellige dage (d) efter såning (P0; P, passage; 2,5x). (B) Brightfield-billeder, der viser robust passage af en tandorganoid linje (2,5x). (C) Brightfield-billeder, der viser en tandorganoidlinje umiddelbart ved passage (d0; venstre; 2,5x) podet med en densitet på 20.000 celler pr. brønd og den resulterende sammenflydende organoidkultur klar til passage (d14; højre; 2,5x). (D) Brightfield-billeder, der viser en tandorganoidlinje, som var blevet podet med en tæthed på >20.000 celler, hvilket førte til mindre organoider ved for høj densitet ved d14 (2,5x). Vægtstænger: 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Tandorganoid karakterisering. (A) Brightfield-billeder af DF-afledte organoidkulturer ved forskellige forstørrelser, der viser tætte strukturer udviklet efter 14 dage i TOM (P4; 5-20x)). Hæmatoxylin og eosinfarvning af en organoid (P1, dag 11). Kassen er forstørret. Pile angiver celler med et højt nukleo-cytoplasmisk forhold. (B) Immunofluorescerende farvning til epitel/ ERM / stemness markører i TOM-dyrkede organoider (20x). (C) Immunofluorescerende farvning for amelogenin (AMELX) i TOM-dyrket organoid (20x). DAPI (blå) blev brugt til at mærke kerner. (D) Genekspressionsniveauer (i forhold til GAPDH) af ERM/stemnessmarkører i P1- og P5 TOM-dyrkede organoider på kulturdag 14 (gennemsnitlig ± SEM; n = 3 biologiske replikater). Vægtstænger: 50 μm, medmindre andet er angivet. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Dental follikel (DF) indsamlingsmedium | |
| Navn | Koncentration |
| Mindste essentielle mellemørn (αMEM) | |
| Føtalt bovint serum (FBS) | 10% |
| Amfotericin B | 0.5% |
| Penicillin-streptomycin (Pen/Strep) | 1% |
Tabel 1: Dental follikel (DF) opsamlingsmedium. Tabellen viser DF's vælgere.
| Tandorganoid medium (TOM) | |
| Navn | Koncentration |
| Serumfrit defineret medium (SFDM) | Se tabel 3 for sammensætning |
| A83-01 | 0,5 μM |
| B27 (uden vitamin A) | 2% |
| Koleratoksin | 100 ng/ml |
| FGF2 (= grundlæggende FGF) | 20 ng/ml |
| FGF8 | 200 ng/ml |
| FGF10 | 100 ng/ml |
| L-glutamin | 2 mM |
| IGF-1 | 100 ng/ml |
| N2 | 1% |
| N-acetyl L-cystein | 1,25 mM |
| Nicotinamid | 10 mM |
| Noggin | 100 ng/ml |
| RSPO1 | 200 ng/ml |
| SB202190 (s. 38i) | 10 μM |
| Shh | 100 ng/ml |
| WNT3a | 200 ng/ml |
Tabel 2: Tandorganoid medium (TOM). Tabellen viser de bestanddele og deres respektive koncentrationer, der kræves for at forberede tandorganoidmediet.
| Serumfrit defineret substrat (SFDM) (pH 7.3) | |
| Navn | Koncentration |
| Steril H2O | |
| DMEM 1:1 F12 uden Fe | 16,8 g/l |
| Transferrin | 5 mg/l |
| Insulin fra kvæg bugspytkirtel | 5 mg/l |
| Penicillin G natriumsalt | 35 mg/l |
| Streptomycinsulfat salt | 50 mg/l |
| Ethanol absolut, ≥99,8% (EtOH) | 600 μL/L |
| Katalase fra kvæglever | 50 μL/L |
| Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) | 1 g/l |
| Albumin Kvæg (cellekulturkvalitet) | 5 g/l |
Tabel 3: Serumfrit defineret substrat (SFDM) (pH 7.3). Tabellen viser sammensætningen af det serumfrie definerede medium.
| Dissociationsmedium | |
| Navn | Koncentration |
| Fosfatbufferet saltvand (PBS) | |
| Collagenase IV | 3 mg/ml |
| Dispase II | 4 mg/ml |
Tabel 4: Dissociationsmedium. Liste over bestanddele og deres nødvendige koncentrationer til fremstilling af dissociationsmediet.
| Mellem A (pH 7,3) | |
| Navn | Koncentration |
| Steril H2O | |
| DMEM pulver høj glukose | 13,38 g/l |
| HEPES | 5.958 g/l |
| Natriumpyruvat (C3H3NaO3) | 110 mg/l |
| Penicillin G natriumsalt | 35 mg/l |
| Streptomycinsulfat salt | 50 mg/l |
| Natriumchlorid (NaCl) | 0,5 g/l |
| Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) | 1 g/l |
| Albumin Kvæg (cellekulturkvalitet) | 3 g/l |
| Dnase* | 0,2 mg/ml |
| * tilføj, når det er nævnt |
Tabel 5: Medium A (pH 7,3). Tabellen viser koncentrationen af de bestanddele, der anvendes til fremstilling af medium A.
| Primære antistoffer | ||
| Navn | Vært | Koncentration |
| AMELX | mus | 1:100 |
| Cd44 | mus | 1:200 |
| CK14 | mus | 1:200 |
| Itga6 | kanin | 1:200 |
| P63 | kanin | 1:1000 |
| Sox2 | kanin | 1:2000 |
| Sekundære antistoffer | ||
| Navn | Vært | Koncentration |
| mus IgG (Alexa 555) | æsel | 1:1000 |
| Kanin IgG (Alexa 488) | æsel | 1:1000 |
Tabel 6: Liste over antistoffer og deres fortyndinger. Tabellen viser antistofferne og deres respektive fortyndinger, der er anvendt i denne undersøgelse.
| Primere | ||
| Gen | Fremadgående primer | Omvendt primer |
| GAPDH | GGTATCGTGGAAGGACTCATGAC | ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG |
| P63 | CAACGCAGTAGACACCATTTCC | CCCAAAACCTTCTCGCTTGTT |
| Itga6 | GGCGGTGTTATGTCCTGAGTC | AATCGCCCATCACAAAAGCTC |
| Sox2 | GCTGGGACATGTGAAGTCTG | CCCTGTGGTTACCTCTTCCT |
| Pitx2 | CAGCGGACTCACTTTACCAG | ATTCTTGAACCAAACCCGGAC |
Tabel 7: Liste over primere. Tabellen viser primerne af GAPDH, P63, ITGA6, SOX2 og PITX2 , der blev brugt i denne undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver den effektive og reproducerbare generation af organoider startende fra den menneskelige tand. Så vidt vi ved, er dette den første metode til etablering af nuværende koncept (epitel) organoider startende fra humant tandvæv. Organoiderne kan udvides på lang sigt og viser en tandepitelstammefænotype, der duplikerer DESC'er, der tidligere er rapporteret i ERM-rummet i DF7. Desuden replikerer organoiderne funktionelle DESC/ERM-egenskaber, herunder udfoldelsen af en ameloblastdifferentieringsproces 7,25,26. Resultaterne er robuste, da der blev fundet sammenlignelige resultater med uafhængige patientorganoidlinjer19.
Ved udførelse af denne tandorganoidprotokol skal der tages hensyn til flere kritiske punkter. For det første er tilsætning af Rho-associeret kinase (ROCK) hæmmer Y-27632 ved indledende såning og umiddelbart efter hver passaging afgørende for at forhindre de enkelte celler i at gennemgå anoikis27. Derudover kræves Amphotericin B i alle medieforfriskninger under P0 for at undgå (oral) svampeudvækst. For det andet anbefales det straks at behandle de frisk isolerede DF-væv for optimal organoiddannelse og væksteffektivitet, snarere end at starte fra kryopræserveret væv, hvilket resulterer i lavere effektivitet. For det tredje, når du optøer en kryopreserveret organoidlinje til dyrkning, skal du udføre trin så hurtigt som muligt og undgå for lang optøningstid samt for lange intervaller mellem trinene, da tidsforlængelse reducerer celleoverlevelsen. For det fjerde skal det bemærkes, at antallet af organoider ved tidlig passage (P0-P3) kan forblive begrænset, også fordi kun et begrænset antal ERM (stamceller) kan være til stede i de specifikke isolerede DF-vævsprøver. Derfor bør organoidkulturerne ved tidlig passage håndteres med omhu og omtanke. Derfor anbefales det at (i) undgå hurtig ekspansion af organoidkulturen (dvs. kun begynde at opdele ved 1: 3 eller mere startende fra P3-4 og før kl. 1: 0,5 eller 1: 1); ii) anvende den passende opdelingsmetode (lav passage - højere passage) som beskrevet. I denne sammenhæng anbefales det at indsamle ubrudte visdomstænder hos unge unge patienter (15 til 19 år), da ERM-celler falder i antal med tandudvikling ogalder 28 år. For det femte forårsager resterende ikke-udtørrede hårde vævsfragmenter fra DF-vævet i cellesuspensionen (selv efter filtrering), at BMM-dråben er mindre stabil og mere tilbøjelig til at løsne sig under dyrkning. En højere procentdel af BMM (såsom 80%) anbefales, hvis der observeres flere ikke-udgående hårde vævsfragmenter i den dissocierede DF-cellesuspension. For det sjette anbefales det kraftigt at passere organoiderne mellem dag 10 og dag 14 i kulturen, da længere kultur vil påvirke organoidudvidelsesevnen negativt på grund af mindre optimal dissociation. Hvis organoider af den ene eller den anden grund dyrkes længere end 14 dage, kan TryplE Express-mængde og inkubationstid for organoid dissociation forlænges for effektiv dissociation, selvom 15 minutters enzymatisk eksponering ikke bør overskrides. Inden for samme sammenhæng skal kulturmediet opdateres hver 2-3 dag for at forhindre næringsstof- og vækstfaktorudmattelse. Hvis organoider ikke udvider sig ordentligt, uanset de kritiske punkter, der er nævnt ovenfor, bør man fokusere på at holde alle værktøjer (BMM, iskold SFDM til forbelægningsspids, mikrocentrifugerør), der anvendes under passaging på is. Derudover er det afgørende at anvende de forskellige passagingsmetoder (lav passage og højere passage metode) korrekt for effektiv passaging af organoiderne.
Tidligere har andre grupper rapporteret in vitro-vækst af primært humant DESC/ERM-væv 8,9,10,11,12,21. Imidlertid var kulturer hovedsageligt 2D (monolag) og ikke 3D, såsom denne organoidmodel, der desuden kun viste kortvarig vækst og fænotyperetention. Alternativt blev der ofte (spontant) udødeliggjorte celler anvendt, som dog ikke er fysiologiske og kun viser begrænset lighed med væv eller oprindelsesceller. Desuden blev disse cellelinjer afledt af embryonalt væv og / eller fra dyr. Desuden er ameloblastdifferentiering enten ikke beskrevet eller kun begrænset dokumenteret. Den organoidmodel, der præsenteres her, giver således flere fordele, idet den er (i) trofast rekapitulation af væv / celler af oprindelse, (ii) langsigtet udvidelig, (iii) dyrket i 3D tættere repræsenterer in vivo-konfigurationen, (iv) af menneskelig oprindelse og postnatal alder og (v) i stand til at differentiere sig til modne tandceller (ameloblastcelletype) (se19).
Således genererede vi et værdifuldt forskningsværktøj, der ikke blev rapporteret før, og indeholdt flere interessante applikationer (figur 1B). Organoiderne kan anvendes til at studere human DESC / ERM stamme og plasticitet. Det giver mulighed for at få yderligere indsigt i biologien i den stadig gådefulde ERM-cellepopulation ved hjælp af immunofluorescerende, genekspression og (enkeltcelle) transkriptomiske analyser. Derudover er organoider særligt velegnede til modellering af humane sygdomme til at dechiffrere patogenetiske mekanismer, identificere (nye) terapeutiske mål og generere lægemiddelopdagelses- og screeningsværktøjer29. Mere specifikt kan denne model anvendes på odontogne cyster (for hvilke der ikke findes nogen pålidelig forskningsmodel), som kan sammenlignes med sunde tandafledte organoider. Derudover kan denne tandorganoide tilgang udnyttes til at modellere og studere tandsygdomme lige fra bakteriers indvirkning til genetiske mutationer forbundet med tandanomalier (såsom mutationer i P63, som kunne introduceres ved hjælp af banebrydende genredigeringsmetoder såsom CRISPR-Cas)30, hvilket i sidste ende fører til potentielle og nye, terapeutiske mål og behandlinger. Andre anvendelser af tandorganoidprotokollen kan omfatte biobanking (i øjeblikket allerede tilgængelig for tandmasse, såsom Future Health Biobank)31 til indsamling af organoidlinjer fra mangfoldige personer og sygdomme (f.eks. til grundlæggende og translationel forskning såsom lægemiddelscreening). Desuden er der for nylig offentliggjort flere rapporter om sammensatte organoidmodeller, der ikke kun indeholder epitel, men også andre celletyper af oprindelsesvævet32,33. Da tandsammensætningen er ret kompleks og imødekommer mesenkymale, immun- og endotelceller, er det et tiltalende perspektiv at anvende denne epitelorganoidmodel i kombination med disse celletyper til mere detaljeret at repræsentere deres in vivo-modstykke. Dette system giver også mulighed for at udforske amelogenese i den menneskelige tand, i øjeblikket kun dårligt forstået, men bestemt afhængig af epitel-mesenkymale interaktioner. Dechifrering af ameloblastudvikling forventes at repræsentere et vigtigt spring fremad i den tandvidenskabelige og kliniske verden, da produktionen af emalje, den kendetegnende komponent i vores tænder, er et meget jaget mål inden for reparation af tandvæv. Desuden kan den organoidmodellering, der er beskrevet i denne undersøgelse, betyde starten mod dannelsen af mineraliserede væv in vitro og bane vejen for at udvikle en bioengineered tand (eller i det mindste dele) til substitutionsterapi.
En af begrænsningerne ved organoidmodellen er, at den udelukkende repræsenterer epitelkomponenten i væv. Som beskrevet detaljeret ovenfor kunne denne mangel imidlertid løses ved tilsætning af andre celle-/vævstyper, såsom dental mesenchyme19. Et andet aspekt, der kan anerkendes som en begrænsning, er oprindelsen af den BMM, der anvendes her (Matrigel). Denne BMM er afledt af et sarkom (Engelbrecht-Holm-Swarm) af en mus og skal derfor udskiftes, før den organoide tilgang oversættes til klinikken. For nylig er der gjort flere bestræbelser på at erstatte Matrigel med syntetiske hydrogeler 34,35. Imidlertid er der behov for mere forskning for at kunne dyrke organoider i sådanne ikke-naturlige geler. Selvom organoidteknologien giver en interessant tilgang til fremtidig dental regenerativ terapi - for eksempel udviklingen af en bioteknologisk tand - bør der rejses etiske spørgsmål vedrørende celledonorers privatliv samt kommercialisering af humane organoider og væv afledt heraf. Indtil videre er der ikke nået nogen konklusioner vedrørende organoid kommercialisering til regenerative formål36. Dental pulp biobanker har været stigende31, samt organoid biobanker fra flere, hovedsageligt kræftvæv, til lægemiddelscreeningsformål. I betragtning af at organoider ikke kan kategoriseres som celler, kønsceller, væv eller organer (som alle er reguleret ved lov), er der et presserende behov for at skildre dets juridiske status til dets anvendelse i kliniske, videnskabelige eller kommercielle omgivelser. Selvom organoiderne har vist sig at deponere mineraliseret væv, når de subkutant transplanteres in vivo19, kræves der yderligere undersøgelser for at analysere deres potentiale til at deponere emalje svarende til en naturlig menneskelig tand.
Alt i alt præsenterer den nye organoidmodel, der er udviklet, et lovende, værdifuldt værktøj til at studere menneskelig tand (stamcelle) biologi og amelogenese, begge i øjeblikket kun dårligt udforsket, med fremtidige perspektiver mod tandsygdomsmodellering og regenerative terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Den tilsvarende forfatter sikrer, at alle forfattere har afsløret alle interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for alle medarbejdere i oral og maxillofacial kirurgi (MKA) i UZ Leuven, såvel som patienterne, for deres uvurderlige hjælp til at indsamle frisk ekstraherede tredje molarer. Vi vil også gerne takke Dr. Reinhilde Jacobs og Dr. Elisabeth Tijskens for deres hjælp med prøvesamlingen. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra KU Leuven (BOF) og FWO-Flandern (G061819N). L.H. er ph.d.-stipendiat (1S84718N).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120.086 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-6250 | |
| 48-well flat bottom plates | Corning | 3548 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330.03 | |
| AMELX antibody | Santa Cruz | sc-365284 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15200018 | |
| B27 (without vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Cassette | VWR | 7202191 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma-Aldrich | C100 | |
| CD44 antibody | Abcam | ab34485 | |
| Cell strainer, 40 µm | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759 | |
| CK14 antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-11599 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Cover glass | VWR | 6310146 | |
| Cryobox | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | |
| DMEM 1:1 F12 without Fe | Invitrogen | 074-90715A | |
| DMEM powder high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Dnase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 - 10ML | |
| Embedding workstation, 220 to 240 Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol absolute, ≥99.8% (EtOH) | Fisher Chemical | E/0650DF/15 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| FGF2 (= basic FGF) | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| FGF8 | Peprotech | AF-100-25 | |
| GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | RTN350-1KT | Includes 1% β-mercaptoethanol dissolved in lysis buffer |
| Glass Pasteur pipette | Niko Mechanisms | 170-40050 | |
| Glycine | VWR | 101194M | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| IGF-1 | PeproTech | 100-11 | |
| InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI) | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| ITGA6 antibody | Sigma-Aldrich | HPA012696 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Matrigel (growth factor-reduced; phenol red-free) | Corning | 15505739 | |
| Microscope slide | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SLGV033R | |
| Minimum essential medium eagle (αMEM) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| mouse IgG (Alexa 555) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetyl L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| P63 antibody | Abcam | ab124762 | |
| Pap Pen | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | Marking pen |
| Paraformaldehyde (PFA), 16% | Merck | 8.18715 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| Petri dish | Corning | 353002 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Pipette (P20, P200, P1000) | Eppendorf or others | 2231300006 | |
| Plastic transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.001 | |
| Rabbit IgG (Alexa 488) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| RSPO1 | PeproTech | 120-38 | |
| SB202190 (p38i) | Biotechne (Tocris) | 1264 | |
| Scalpel (surgical blade) | Swann-Morton | 207 | |
| SHH | R&D Systems | 464-SH-200 | |
| Silicone molds (Heating block) | VWR | 720-1918 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P-5280 | |
| SOX2 antibody | Abcam | ab92494 | |
| StepOnePlus | Thermo Fisher Scientific | Real-Time PCR System | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile 1000 μL pipette tips with filter | Greiner | 740288 | |
| Sterile 20 μL pipette tips with filter | Greiner | 774288 | |
| Sterile 200 μL pipette tips with and without filter | Greiner | 739288 | |
| Sterile H2O | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Superscript III first-strand synthesis supermix | Invitrogen | 11752-050 | Reverse transcription kit |
| Tissue processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Transferrin | Serva | 36760.01 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| TrypLE express | Gibco | 12605-010 | |
| Vectashield mounting medium+DAPI | Labconsult NV | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| WNT3a | Biotechne (Tocris) | 5036-WN-500 | |
| Xylenes, 99%, for biochemistry and histology | VWR | 2,89,75,325 |
References
- Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development (Cambridge). 147 (2), (2020).
- Arrow, P. Dental enamel defects, caries experience and oral health-related quality of life: a cohort study. Australian Dental Journal. 62 (2), 165-172 (2017).
- Mitsiadis, T. A., Orsini, G., Jimenez-Rojo, L. Dental Stem Cells for Tooth Regeneration. Dental Stem Cells: Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. Zavan, B., Bressan, E. , Humana Press. Cham. (2016).
- Mitsiadis, T. A., Orsini, G. Editorial: a new era in dentistry: stem cell-based approaches for tooth and periodontal tissue regeneration. Frontiers in Physiology. 7, 357 (2016).
- Miran, S., Mitsiadis, T. A., Pagella, P. Innovative dental stem cell-based research approaches: the future of dentistry. Stem Cells International. 2016, 7231038 (2016).
- Shinmura, Y., Tsuchiya, S., Hata, K. I., Honda, M. J. Quiescent epithelial cell rests of malassez can differentiate into ameloblast-like cells. Journal of Cellular Physiology. 217 (3), 728-738 (2008).
- Davis, E. M. A review of the epithelial cell rests of Malassez on the bicentennial of their description. Journal of Veterinary Dentistry. 35 (4), 290-298 (2018).
- Athanassiou-Papaefthymiou, M., Papagerakis, P., Papagerakis, S. Isolation and characterization of human adult epithelial stem cells from the periodontal ligament. Journal of Dental Research. 94 (11), 1591-1600 (2015).
- Kim, G. -H., et al. Differentiation and establishment of dental epithelial-like stem cells derived from human ESCs and iPSCs. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-16 (2020).
- Nam, H., et al. Establishment of Hertwig's epithelial root sheath/ epithelial rests of malassez cell line from human periodontium. Molecules and Cells. 37 (7), 562-567 (2014).
- Nam, H., et al. Expression profile of the stem cell markers in human hertwig's epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells. Molecules and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).
- Tsunematsu, T., et al. Human odontogenic epithelial cells derived from epithelial rests of Malassez possess stem cell properties. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1063-1075 (2016).
- Artegiani, B., Clevers, H. Use and application of 3D-organoid technology. Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Cox, B., et al. Organoids from pituitary as a novel research model toward pituitary stem cell exploration. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development (Cambridge). 144 (10), 1775-1786 (2017).
- Schutgens, F., Clevers, H. Human organoids: tools for understanding biology and treating diseases). Annual Review of Pathology. 15, 211-234 (2020).
- Hemeryck, L., et al. Organoids from human tooth showing epithelial stemness phenotype and differentiation potential. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (3), 153 (2022).
- Gao, X., Wu, Y., Liao, L., Tian, W. Oral organoids: progress and challenges. Journal of Dental Research. 100 (5), 454-463 (2021).
- Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Scientific Reports. 10 (1), 4963 (2020).
- Xiong, J., Mrozik, K., Gronthos, S., Bartold, P. M. Epithelial cell rests of malassez contain unique stem cell populations capable of undergoing epithelial-mesenchymal transition. Stem Cells and Development. 21 (11), 2012-2025 (2012).
- Luan, X., Ito, Y., Diekwisch, T. G. H. Evolution and development of Hertwig's epithelial root sheath. Developmental Dynamics. 235 (5), 1167-1180 (2006).
- Fukumoto, S., et al. New insights into the functions of enamel matrices in calcified tissues. Japanese Dental Science Review. 50 (2), 47-54 (2014).
- Consolaro, A., Consolaro, M. F. M. O. ERM functions, EGF and orthodontic movement or Why doesn't orthodontic movement cause alveolodental ankylosis. Dental Press Journal of Orthodontics. 15 (2), 24-32 (2010).
- Guajardo, G., et al. Immunohistochemical localization of epidermal growth factor in cat paradental tissues during tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 118 (2), 210-219 (2000).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Gonçalves, J., Sasso-Cerri, E., Cerri, P. Cell death and quantitative reduction of rests of Malassez according to age. Journal of Periodontal Research. 43 (4), 478-481 (2008).
- Kim, J., Koo, B. -K., Knoblich, J. A. Human organoids: Model systems for human biology and medicine. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Razmi, M. T., Narang, T., Handa, S. ADULT (acro-dermato-ungual-lacrimal-tooth) syndrome: a case report from India. Indian Dermatology Online Journal. 9 (3), 194 (2018).
- Future Health Biobank. , Available from: https://futurehealthbiobank.com/ch-en/ (2022).
- Schreurs, R. R. C. E., Baumdick, M. E., Drewniak, A., Bunders, M. J. In vitro co-culture of human intestinal organoids and lamina propria-derived CD4+ T cells. STAR Protocols. 2 (2), 100519 (2021).
- Fiorini, E., Veghini, L., Corbo, V. Modeling cell communication in cancer with organoids: Making the complex simple. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 166 (2020).
- Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
- Zhang, Y., et al. Polyisocyanide hydrogels as a tunable platform for mammary gland organoid formation. Advanced Science. 7 (18), 2001797 (2020).
- Mollaki, V.
