Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטת ניקוי רקמות והכתמה אימונופלואורסצנטית שלמה להדמיית כליות תלת-ממדית (3D). טכניקה זו יכולה להציע פרספקטיבות מקרוסקופיות בפתולוגיה של הכליות, מה שמוביל לתגליות ביולוגיות חדשות.
Abstract
למרות שהפתולוגיה הקונבנציונלית סיפקה מידע רב על מיקרו-מבנה הכליות, היה קשה לדעת את המבנה המדויק של כלי דם, צינוריות פרוקסימליות, צינורות איסוף, גלומרולי ועצבים סימפתטיים בכליה בשל היעדר מידע תלת מימדי (3D). סליקה אופטית היא אסטרטגיה טובה להתגבר על המשוכה הגדולה הזו. ניתן לנתח תאים מרובים באיבר שלם ברזולוציה של תא בודד על ידי שילוב של ניקוי רקמות וטכניקת הדמיה תלת-ממדית. עם זאת, שיטות תיוג תאים להדמיית איברים שלמים עדיין אינן מפותחות. בפרט, צביעת איברים שלמים היא מאתגרת בגלל הקושי בחדירת נוגדנים. הפרוטוקול הנוכחי פיתח כתמי כליה של עכברים שלמים להדמיה תלת-ממדית בשיטת ניקוי הרקמות CUBIC (קוקטיילים ברורים ללא הפרעה להדמיית מוח/גוף ואנליזה חישובית). הפרוטוקול איפשר לדמיין ניתוק עצבים סימפתטי כלייתי לאחר פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה וגלומרולאומגהליה בשלב מוקדם של מחלת כליות סוכרתית מנקודת מבט מקיפה. לפיכך, טכניקה זו יכולה להוביל לתגליות חדשות בחקר הכליות על ידי מתן פרספקטיבה מקרוסקופית.
Introduction
הכליה מורכבת מאוכלוסיות תאים שונות. למרות שהפתולוגיה הקונבנציונלית נותנת לנו מידע רב על המיקרו-סביבה של הכליות, יש צורך בהדמיה תלת-ממדית (3D) כדי להבין במדויק את ההצלבה הבין-תאית במהלך התקדמות מחלת הכליות. בעבר, היה צורך לבצע מספר עצום של חתכים סדרתיים ושחזור תמונה עבור הדמיה תלת-ממדית של איבר שלם1. עם זאת, שיטה זו דרשה מאמץ רב מדי והיו לה בעיות מבחינת יכולת השכפול.
סליקה אופטית היא אסטרטגיה טובה להתגבר על מכשולזה 2,3. אטימות הרקמות נובעת בעיקר מפיזור וספיגת אור מכיוון שכל איבר מורכב מחומרים שונים, כולל מים, חלבון ושומנים. לפיכך, האסטרטגיה הבסיסית של ניקוי רקמות היא החלפת מים ושומנים ברקמות עם מקדם שבירה (RI) תואם ריאגנטים בעלי תכונות אופטיות זהות לאלה של חלבונים4. על מנת לצפות בדגימה שקופה, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של גיליון אור שימושית5. לוחות אור מאירים את הדגימה השקופה מהצד, ואותות עירור נרכשים דרך העדשה האובייקטיבית הממוקמת במצב אנכי6. מיקרוסקופיה זו מקבלת מידע חתך רוחב במטאטא אחד, השונה מהמיקרוסקופיה הפלואורסצנטית הקונפוקלית או הרב-פוטונית. לכן, הוא יכול לרכוש במהירות z-stack תמונות עם רמה נמוכה של photobleaching.
קוקטיילים ברורים ללא הפרעה של דימות מוח/גוף ואנליזה חישובית (CUBIC) היא אחת משיטות ניקוי הרקמות המאפשרת הדמיה של איברים שלמים על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור 2,7,8. מכתים אימונופלואורסצנטיים מעוקבים ושלמים ממוטבים במחקר הנוכחי כדי לדמיין מבנים תלת-ממדיים של כליות עכברים 9,10,11. באמצעות שיטת צביעה זו, השינוי בעצבים סימפתטיים כלייתיים הוא הדמיה לאחר פגיעה איסכמיה-reperfusion 9,10 ו glomerulomegaly בשלב מוקדם של מחלת כליות סוכרתית 11, כמו גם כלי דם, צינוריות פרוקסימליות, ואיסוף צינורות בכליה שלמה9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים אושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת טוקיו. כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו על פי הנחיות המכונים הלאומיים לבריאות. עכברי C57BL/6NJcl זכרים, בני 8 שבועות, שימשו למחקר הנוכחי. העכברים התקבלו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים).
1. הכנת בעלי חיים וקיבוע כליות
- בצע קיבוע פרפוזיה לפי השלבים הבאים.
- הרדמת העכבר על ידי שאיפת איזופלורן (3%, 2.0 ליטר/דקה) ומתן תוך-צפקי של מדטומידין הידרוכלוריד (0.3 מ"ג/ק"ג), בוטורפנול טרטרט (5 מ"ג/ק"ג) ומידזולם (4 מ"ג/ק"ג) (ראו טבלת חומרים).
- יש ליטול את החיה עם 20 מ"ל של PBS (pH 7.4) ו-30 מ"ל של 4% PFA בחיץ פוספט (PB) דרך החדר השמאלי של הלב12.
- בצעו את קיבוע הטבילה מיד לאחר קיבוע הזלף ודגימת הכליות9.
- טבלו את הכליה ב-4% PFA ב-4 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות נוספות, ואז שטפו אותה עם PBS במשך שעתיים (שלוש פעמים)9 (איור 1).
אזהרה: פורמלדהיד ופרפורמלדהיד הם חומרים מגרים רעילים. טפלו בריאגנטים במכסה אדים עם ציוד מגן אישי מתאים.
- טבלו את הכליה ב-4% PFA ב-4 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות נוספות, ואז שטפו אותה עם PBS במשך שעתיים (שלוש פעמים)9 (איור 1).
2. דה-קולוריזציה ודליפידציה
- הכן את CUBIC-L לדה-צביעה ולעדנה המורכבת מ-10 wt% של טריטון X-100 ו-10 wt% של N-buthyldiethanolamine (ראו טבלת חומרים), בעקבות דוחות שפורסמו בעבר 4,8,9.
- בצע דה-צביעה והפחתה על-ידי CUBIC-L בהתאם לשלבים הבאים.
- טבלו את הכליה הקבועה ב-7 מ"ל של 50% (v/v) CUBIC-L (תערובת של 1:1 של מים ו-CUBIC-L) בצינור תחתון עגול של 14 מ"ל (ראו טבלת חומרים) עם ניעור עדין בטמפרטורת החדר למשך 6 שעות (איור 2A). לאחר מכן, טבלו אותו ב-7 מ"ל של CUBIC-L בצינור תחתון עגול של 14 מ"ל עם רעידות עדינות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים.
- רענן את CUBIC-L מדי יום במהלך תהליך זה. לאחר תהליך הדה-צביעה וההעדה, שטפו את הכליה עם PBS בטמפרטורת החדר למשך שעתיים (שלוש פעמים)9 (איור 1). השתמשו בכף חלוקה לטיפול בדגימה (איור 2B).
3. צביעה אימונופלואורסצנטית שלמה
- מכינים את המאגרים המכתימים.
- הכינו את חיץ הצביעה לנוגדנים ראשוניים על ידי ערבוב של 0.5% (v/v) Triton X-100, 0.5% קזאין ב-PBS ו-0.05% נתרן אזיד9.
- הכינו את מאגר הצביעה לנוגדנים משניים על ידי ערבוב של 0.5% (v/v) Triton X-100, 0.1% קזאין ב-PBS ו-0.05% נתרן אזיד9.
- בצע צביעה עם נוגדנים ראשוניים.
- Immunostain הכליה הפגועה עם נוגדנים ראשוניים (1:100 או 1:200, ראו טבלת חומרים) במאגר המכתים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין למשך 7 ימים.
הערה: כמות חיץ הכתמים הדרושה לכליה אחת היא 500-600 μL (איור 2C). - שטפו את הכליה ב-0.5% (v/v) Triton X-100 ב-PBS (PBST) בטמפרטורת החדר למשך יוםאחד 9 (איור 1).
- Immunostain הכליה הפגועה עם נוגדנים ראשוניים (1:100 או 1:200, ראו טבלת חומרים) במאגר המכתים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין למשך 7 ימים.
- בצע צביעה עם נוגדנים משניים.
- מכתים את הכליה בנוגדנים משניים (1:100 או 1:200, ראו טבלת חומרים) בחיץ המכתים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם רעידות עדינות למשך 7 ימים. שטפו את הכליה עם PBST בטמפרטורת החדר למשך יוםאחד 9 (איור 1).
- לאחר קיבוע9, טבלו את הכליה בפורמלדהיד 1% ב-PB (תערובת של 37% פורמלדהיד ו-PB ביחס של 1:36) למשך 3 שעות, ושטפו אותה עם PBS בטמפרטורת החדר למשך 6 שעות (איור 1).
4. התאמת מקדם שבירה (RI)
- הכן CUBIC-R+.
- הכינו את CUBIC-R על ידי ערבוב של 45 wt% של 2,3-דימתיל-1-פניל-5-פיראזולון/אנטיפירין ו-30 wt% של ניקוטין-אמיד (ראו טבלת חומרים).
- הכן את CUBIC-R+ להתאמת מקדם השבירה (RI) על ידי הוספת 0.5 v% של N-buthyldiethanolamine ל- CUBIC-R בעקבות הדוחות שפורסמו בעבר 4,8,9.
- בצע את התאמת ה- RI.
- יש לטבול את הכליה ב-7 מ"ל של 50% (v/v) CUBIC-R+ (תערובת של 1:1 של מים ו-CUBIC-R+) בצינור תחתון עגול של 14 מ"ל עם ניעור עדין בטמפרטורת החדר למשך יום אחד. לאחר מכן, טבלו אותו ב-7 מ"ל של CUBIC-R+ בצינור תחתון עגול של 14 מ"ל עם ניעור עדין בטמפרטורת החדר למשך יומיים9 (איור 1).
הערה: למרות שהכליה צפה ב-50% CUBIC-R+ בתחילת התאמת ה-RI, היא שוקעת והופכת לשקופה ב-CUBIC-R+ בסוף התהליך (איור 2D).
- יש לטבול את הכליה ב-7 מ"ל של 50% (v/v) CUBIC-R+ (תערובת של 1:1 של מים ו-CUBIC-R+) בצינור תחתון עגול של 14 מ"ל עם ניעור עדין בטמפרטורת החדר למשך יום אחד. לאחר מכן, טבלו אותו ב-7 מ"ל של CUBIC-R+ בצינור תחתון עגול של 14 מ"ל עם ניעור עדין בטמפרטורת החדר למשך יומיים9 (איור 1).
5. רכישת תמונה ושחזורה
- טבלו את הכליה התואמת ל-RI בתערובת של שמן סיליקון (RI = 1.555) ושמן מינרלי (RI = 1.467) (55:45) במהלך רכישת התמונה (RI = 1.51)5 (איור 3).
- קבל תמונות תלת-ממדיות של הכליה כולה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטיבעל 9 יריעות אור שנבנה בהתאמה אישית (ראו טבלת חומרים). אסוף את כל נתוני התמונה הגולמיים בתבנית TIFF של 16 סיביות. הצג באופן חזותי ולכוד את התמונות המעובדות בתלת-ממד באמצעות תוכנת ניתוח ההדמיה (Imaris, ראה טבלת חומרים).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות שיטת הכתמים הזו,הודגמו עצבים סימפתטיים [נוגדן אנטי-טירוזין הידרוקסילאז (TH)] ועורקים [נוגדן אקטין נגד α שריר חלק (αSMA)] בכליה שלמה (איור 4A,B ווידאו 1). עצבים סימפתטיים כלייתיים חריגים הודגמו גם לאחר פגיעה באיסכמיה/רפרפוזיה (IRI)9,10 (איור 4C). יתר על כן, הדמיה של עצבים סימפתטיים בכל הטחול13 הושגה באמצעות פרוטוקול זה (איור 4D). דוגמה אחת לכימות הנתונים האימונופלואורסצנטיים התלת-ממדיים מוצגת באיור 5.
בנוסף, הדמיה של צינורות איסוף [נוגדן אנטי-אקוופורין 2 (AQP2)], מקטע S1 של צינוריות פרוקסימליות [נוגדן אנטי-נתרן גלוקוז קוטרנספורטר 2 (SGLT2)], והגלומרולי (נוגדן אנטי-פודוצין) בכליה שלמה9 הייתה מוצלחת (איור 6A). באמצעות הדמיה תלת-ממדית זו של גלומרולי, גלומרולאומגהלי (נוגדן נגד פודוצין) הודגם בשלבים המוקדמים של מחלת כליות סוכרתית, אשר דוכאה על-ידי מתן תרופות11 (איור 6B).
איור 1: ניקוי רקמות והכתמה אימונופלואורסצנטית שלמה. ניקוי רקמות על ידי CUBIC הוא תהליך בן שני שלבים: דליפידציה (CUBIC-L) והתאמת מקדם שבירה (RI) (CUBIC-R+). צביעה בהרכבה מלאה מתבצעת לאחר תהליך ההשמטה. סרגל קנה מידה = 10 מ"מ. התמונה מועתקת מתוך Hasegawa et al.9. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: תמונות של תהליך הטיפול . (A) המדגם שקוע ב-7 מ"ל של 50% או 100% CUBIC-L בצינור תחתון עגול של 14 מ"ל. הצינור נשמר אופקי עם ניעור עדין במהלך תהליך ההעדה. (B) כף חלוקה משמשת לטיפול בדגימה. (C) כמות חיץ הכתמים הדרושה לכליה אחת היא 500-600 μL. הצינור נשמר אנכית במהלך תהליך ההכתמה. (D) למרות שהדגימה צפה ב-50% CUBIC-R+ בתחילת התאמת ה-RI, היא שוקעת והופכת לשקופה ב-CUBIC-R+ בסוף התהליך. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור להדמיה תלת-ממדית של כליות שלמות. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור (LSFM) מאפשרת הדמיה תלת-ממדית (תלת-ממדית) של דגימות שקופות. תמונה זו מועתקת מתוך Hasegawa et al.9. שמן טבילה משמש במהלך רכישת נתונים. יריעות אור משני הצדדים מאירות את הדגימה. אותות העירור נרכשים דרך העדשה האובייקטיבית הממוקמת במיקום אנכי. הבמה נעה בכיוון הצירי, ומתקבלות תמונות z-stack. סרגל קנה מידה = 10 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
תרשים 4. הדמיה תלת מימדית של כליות שלמות של עצבים ועורקים סימפתטיים. (A) עצבים סימפתטיים [נוגדן אנטי-טירוזין הידרוקסילאז (TH), ירוק] ועורקים [נוגדן אקטין שריר חלק α (αSMA), מגנטה] מוצגים בכליה שלמה. (B) מוצגת תמונת מישור x-y מוגדלת של (A) [נוגדן אנטי-TH, ירוק; נוגדן אנטי-αSMA, מגנטה]. (C) ניתוק עצבים מתמשך לאחר פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה כלייתית (IRI) הוא דמיוני. (D) עצבים סימפתטיים בטחול מדומים גם בטחול שלם על ידי הפרוטוקול הנוכחי. תמונה זו מועתקת מתוך Hasegawa et al.9. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: כימות של כתמים אימונופלואורסצנטיים תלת-ממדיים. תהליך כימות היחס בין נפח חיובי לאות לנפח הכליות הכולל מוצג. המרה בינארית מתבצעת בהתאם לכל סף. הנפחים מתקבלים על ידי חישוב האינטגרל של שטח העניין (גודל ווקסל: x = 6.45 מיקרומטר, y = 6.45 מיקרומטר, z = 7 מיקרומטר). התמונה מועתקת מתוך Hasegawa et al.9. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: הדמיה תלת-ממדית של כליות שלמות של צינורות איסוף, צינוריות פרוקסימליות וגלומרולי. (A) צינורות איסוף [נוגדן נגד אקוופורין 2 (AQP2)], מקטע S1 של צינוריות פרוקסימליות [נוגדן אנטי-נתרן גלוקוז cotransporter 2 (SGLT2)], וגלומרולי (נוגדן אנטי-פודוצין) מוצגים בהתאמה בכליה שלמה. התמונה מועתקת מתוך Hasegawa et al.9. (B) גלומרולאומגהליה נצפתה בשלב מוקדם של מחלת כליות סוכרתית (נוגדן אנטי-פודוצין), אשר מדוכאת על ידי מתן תרופות. התמונה מועתקת מתוך Hasegawa et al.11. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
וידאו 1: סרט מסתובב של הכליה. הסרט המסתובב של הכליה באיור 4A מוצג. עצבים סימפתטיים [נוגדן אנטי-טירוזין הידרוקסילאז (TH), ירוק] ועורקים [נוגדן אקטין שריר חלק α (αSMA), מגנטה] הם דמיון. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול הנוכחי איפשר הדמיה תלת-ממדית של כליות שלמות של מבנים שונים כגון עצבים סימפתטיים, צינורות איסוף, עורקים, צינוריות פרוקסימליות וגלומרולי 9,10,11. שיטת צביעה זו הציעה תצפית מקרוסקופית והובילה לתגליות ביולוגיות חדשות, על ידי הדמיה של השינוי בעצבים הסימפתטיים הכלייתיים לאחר פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה 9,10 וגלומרולאומגהליה בשלב הראשוני של מחלת כליות סוכרתית 11.
אטימות נגזרת מאי-הומוגניות אופטית ברקמה5. העיקרון המשותף בשיטות שונות לניקוי רקמות הוא הסרת מפזרים/בולמי אור ומילוי החלל באמצעות ריאגנטים תואמי RI. בהשוואה לשיטות מבוססות ממסים אורגניים כגון הדמיה תלת-ממדית של איברים מנוקים ממסים (3DISCO/iDISCO)3,14, CUBIC מבוסס על ריאגנטים הידרופיליים, ולכן הוא עדיף בשימור פלואורסצנטי5. מאפיין זה של CUBIC מאפשר לחוקרים לצפות באותות פלואורסצנטיים מזנים של עכברים מדווחים2, כמו גם באותות מכתמים אימונופלואורסצנטיים שלמים, ומספק אפשרויות נוספות להבנה מקיפה של מבני האיברים התלת-ממדיים.
פרוטוקול ניקוי הרקמות הנוכחי המבוסס על CUBIC יכול להשיג שקיפות גבוהה להדמיה תלת-ממדית בהשוואה למחקרים קודמים לניקוי כליות עכברים15. עם זאת, יש לציין כי פרוטוקול ניקוי זה מתאים לכליות עכבר. יש צורך בתהליך דליקציה חזק יותר כדי לנקות את הכליות האנושיות. לדוגמה, Zhao et al. הציגו לאחרונה גישה למיפוי איברים אנושיים שלמים על ידי פיתוח שיטת ניקוי רקמות יעילה בשם SHANEL (ניקוי ותיוג יעיל של איברים אנושיים בתיווך מיצלה קטנה)16. מכיוון שהתענוגות חזקים יותר פוגעים בדגימות, החוקרים צריכים לבחור שיטת ניקוי רקמות מתאימה בהתאם למטרתם.
צביעת איברים שלמים היא מאתגרת בגלל הקושי בחדירת נוגדנים; הפרוטוקול הנוכחי נקבע לאחר ניסוי וטעייה. מכיוון שיציבות הכתמים מתועדפת, זמן הדגירה עשוי להיות ארוך מהמינימום הנדרש. כתוצאה מכך, פרוטוקול זה הדגים צביעה איכותית של הכליות על ידי הנוגדנים. עם זאת, קיימת אפשרות כי זה לא יכול לעבוד טוב, בהתאם אנטיגנים היעד כי לא ניסינו. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי צביעה דו-שלבית באמצעות נוגדנים ראשוניים ומשניים כמו הפרוטוקול הנוכחי אינה אופטימלית במקרים מסוימים להכתמה מלאה של מוחות עכברים17. הסיבה לכך היא שכאשר כמות המטרה גדולה, הנוגדן העיקרי שלה ממלא את הדגימה, מה שמקשה על הנוגדן המשני לחדור עמוק לתוך הרקמה17. לכן, הנוגדן הראשוני המסומן פלואורסצנטי, או הקומפלקס של הנוגדן הראשוני ומקטע פאבהמשני 17, שווה לנסות אם חדירת הנוגדנים אינה יעילה.
באשר לתהליך ההדמיה, החוקרים צריכים לבחור סוג מתאים של מיקרוסקופיה ורזולוציית תמונה בהתאם למטרתם. אם חוקרים רוצים לבצע הדמיה תלת-ממדית של כליות שלמות כפי שהוצג במחקר זה, עדיף להשתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור מכיוון שהיא יכולה להשיג במהירות תמונות z-stack רחבות עם רמה נמוכה של פוטו-הלבנה. מכיוון שגודל הקובץ של נתוני הדמיה תלת-ממדית הוא עצום, יש להקטין את רזולוציית התמונה במידה שבה הדמיה של איברים שלמים יכולה לעמוד. לעומת זאת, חוקרים יכולים גם להשתמש במיקרוסקופיות קונפוקליות או מולטיפוטונים בעת קבלת נתוני הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה בחלל צר.
לסיכום, המחקר הנוכחי פיתח כתמי כליה שלמים להדמיה תלת ממדית בשיטת ניקוי הרקמות CUBIC. הפרוטוקול מאפשר הדמיה של מבנים תלת-ממדיים בכליה שלמה, ומספק פרספקטיבה מקרוסקופית לחקר הכליות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
חלק מעבודה זו נערך בשיתוף פעולה עם פרופ' הירוקי ר. אואדה (אוניברסיטת טוקיו), פרופ' אטסואו א. סוסאקי (אוניברסיטת ג'ונטנדו), פרופ' טטסוהירו טאנאקה (אוניברסיטת טוהוקו), פרופ' מסאפומי פוקגאווה, ד"ר טקהיקו ואדה וד"ר הירוטאקה קומבה (אוניברסיטת טוקאי).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube | Falcon | 352059 | Tissue clearing, staining, wash |
| 2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine | Tokyo Chemical Industry | D1876 | CUBIC-R+ |
| 37%-Formaldehyde Solution | Nacalai Tesque | 16223-55 | Post fixation |
| 4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Nacalai Tesque | 09154-85 | Kidney fixation |
| Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody | Invitrogen | A-21436 | Secondary antibody (1:100) |
| Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | A-31573 | Secondary antibody (1:200) |
| Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody | Abcam | ab199975 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-podocin antibody | Sigma-Aldrich | P0372 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody | Abcam | ab85626 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody | Abcam | ab113 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody | Abcam | ab5694 | Primary antibody (1:200) |
| Blocker Casein in PBS | Thermo Fisher Scientific | 37528 | Staining buffer |
| Butorphanol Tartrate | Meiji | 005526 | Anesthetic |
| C57BL/6NJcl | Nippon Bio-Supp.Center | N/A | Mouse strain |
| Imaris | Bitplane | N/A | Imaging analysis software |
| Macro-zoom microscope | OLYMPUS | MVX10 | The observation unit of the custom-built microscope |
| Medetomidine Hydrochloride | Kyoritsu-Seiyaku | 008656 | Anesthetic |
| Midazolam | SANDOZ | 27803229 | Anesthetic |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Immersion oil |
| N-buthyldiethanolamine | Tokyo Chemical Industry | B0725 | CUBIC-L, CUBIC-R+ |
| Nicotinamide | Tokyo Chemical Industry | N0078 | CUBIC-R+ |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | CUBIC-L, PBST |
| Silicon oil HIVAC-F4 | Shin-Etsu Chemical | 50449832 | Immersion oil |
| Sodium azide | Wako | 195-11092 | Staining buffer |
References
- Velez-Fort, M., et al. The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing. Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Tainaka, K., et al. Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Hasegawa, S., et al. Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) visualizes abnormal renal sympathetic nerves after ischemia/reperfusion injury. Kidney International. 96 (1), 129-138 (2019).
- Hasegawa, S., Inoue, T., Inagi, R. Neuroimmune interactions and kidney disease. Kidney Research and Clinical Practice. 38 (3), 282-294 (2019).
- Hasegawa, S., et al. The oral hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor enarodustat counteracts alterations in renal energy metabolism in the early stages of diabetic kidney disease. Kidney International. 97 (5), 934-950 (2020).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hasegawa, S., et al. Activation of sympathetic signaling in macrophages blocks systemic inflammation and protects against renal ischemia-reperfusion injury. Journal of the American Society of Nephrology. 32 (7), 1599-1615 (2021).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1-22 (2020).
