Summary
Le présent protocole décrit une méthode de nettoyage tissulaire et une coloration immunofluorescente à montage entier pour l’imagerie rénale tridimensionnelle (3D). Cette technique peut offrir des perspectives macroscopiques en pathologie rénale, conduisant à de nouvelles découvertes biologiques.
Abstract
Bien que la pathologie conventionnelle fournisse de nombreuses informations sur la microstructure rénale, il était difficile de connaître la structure précise des vaisseaux sanguins, des tubules proximaux, des canaux collecteurs, des glomérules et des nerfs sympathiques dans le rein en raison du manque d’informations tridimensionnelles (3D). La compensation optique est une bonne stratégie pour surmonter ce gros obstacle. Plusieurs cellules d’un organe entier peuvent être analysées à une résolution unicellulaire en combinant la clairance tissulaire et la technique d’imagerie 3D. Cependant, les méthodes de marquage cellulaire pour l’imagerie des organes entiers restent sous-développées. En particulier, la coloration des organes entiers est difficile en raison de la difficulté de pénétration des anticorps. Le présent protocole a développé une coloration rénale de souris à montage entier pour l’imagerie 3D avec la méthode de nettoyage tissulaire CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis). Le protocole a permis de visualiser la dénervation sympathique rénale après une lésion d’ischémie-reperfusion et une glomérulomégalie au stade précoce de la maladie rénale diabétique d’un point de vue global. Ainsi, cette technique peut mener à de nouvelles découvertes dans la recherche rénale en fournissant une perspective macroscopique.
Introduction
Le rein est composé de diverses populations cellulaires. Bien que la pathologie conventionnelle nous donne beaucoup d’informations sur le microenvironnement rénal, l’imagerie tridimensionnelle (3D) est nécessaire pour comprendre précisément la diaphonie intercellulaire au cours de la progression de la maladie rénale. Dans le passé, un grand nombre de coupes en série et de reconstruction d’images devaient être effectuées pour l’imagerie 3D de l’organe entier1. Cependant, cette méthode nécessitait trop d’efforts et présentait des problèmes en termes de reproductibilité.
Le défrichage optique est une bonne stratégie pour surmonter cet obstacle 2,3. L’opacité tissulaire est principalement due à la diffusion et à l’absorption de la lumière, car chaque organe est constitué de diverses substances, notamment de l’eau, des protéines et des lipides. Ainsi, la stratégie de base de la clairissance tissulaire consiste à remplacer l’eau et les lipides dans les tissus par des réactifs correspondant à l’indice de réfraction (IR) qui ont les mêmes propriétés optiques que les protéines4. Afin d’observer un échantillon transparent, une microscopie fluorescente à feuille de lumière est utile5. Des feuilles lumineuses éclairent l’échantillon transparent de côté, et les signaux d’excitation sont acquis à travers la lentille de l’objectif située en position verticale6. Cette microscopie permet d’obtenir des informations de coupe transversale en un seul balayage, ce qui est différent de la microscopie confocale ou multiphotonique. Ainsi, il peut rapidement acquérir des images z-stack avec un faible niveau de photoblanchiment.
Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) est l’une des méthodes de nettoyage des tissus qui permet l’imagerie d’organes entiers par microscopie fluorescenteà feuille de lumière 2,7,8. La coloration immunofluorescente CUBIC et à montage entier est optimisée dans la présente étude pour visualiser les structures 3D des reinsde souris 9,10,11. En utilisant cette méthode de coloration à montage entier, l’altération des nerfs sympathiques rénaux est visualisée après une lésion d’ischémie-reperfusion 9,10 et une glomérulomégalie au stade précoce de la maladie rénale diabétique 11, ainsi que des vaisseaux sanguins, des tubules proximaux et des canaux collecteurs dans un rein entier 9.
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Protocol
Toutes les expériences ont été approuvées par le comité d’examen institutionnel de l’Université de Tokyo. Toutes les procédures animales ont été effectuées conformément aux directives des National Institutes of Health. Des souris C57BL/6NJcl mâles, âgées de 8 semaines, ont été utilisées pour la présente étude. Les souris ont été obtenues de sources commerciales (voir le tableau des matériaux).
1. Préparation animale et fixation rénale
- Effectuez la fixation de perfusion en suivant les étapes ci-dessous.
- Anesthésier la souris par inhalation d’isoflurane (3 %, 2,0 L/min) et administration intrapéritonéale de chlorhydrate de médétomidine (0,3 mg/kg), de tartrate de butorphanol (5 mg/kg) et de midazolam (4 mg/kg) (voir le tableau des matières).
- Perfuser l’animal avec 20 mL de PBS (pH 7,4) et 30 mL de PFA à 4% dans un tampon phosphate (PB) à travers le ventricule gauche du cœur12.
- Effectuer la fixation par immersion juste après la fixation de perfusion et le prélèvement de rein9.
- Immergez le rein dans du PFA à 4 % à 4 °C pendant 16 heures supplémentaires, puis lavez-le avec du PBS pendant 2 h (trois fois)9 (Figure 1).
ATTENTION : Le formaldéhyde et le paraformaldéhyde sont des irritants toxiques. Manipuler les réactifs dans une hotte avec l’équipement de protection individuelle approprié.
- Immergez le rein dans du PFA à 4 % à 4 °C pendant 16 heures supplémentaires, puis lavez-le avec du PBS pendant 2 h (trois fois)9 (Figure 1).
2. Décoloration et délipidation
- Préparer CUBIC-L pour la décoloration et la délipidation consistant en 10 % en poids de Triton X-100 et 10 % en poids de N-buthyldiéthanolamine (voir le tableau des matériaux), conformément aux rapports précédemment publiés 4,8,9.
- Effectuer la décoloration et la délipidation par CUBIC-L en suivant les étapes ci-dessous.
- Tremper le rein fixe dans 7 mL de CUBIC-L à 50 % (v/v) (mélange 1:1 d’eau et de CUBIC-L) dans un tube à fond rond de 14 ml (voir le tableau des matières) en agitant doucement à température ambiante pendant 6 h (figure 2A). Ensuite, plongez-le dans 7 mL de CUBIC-L dans un tube à fond rond de 14 ml en agitant doucement à 37 °C pendant 5 jours.
- Actualisez CUBIC-L tous les jours pendant ce processus. Après le processus de décoloration et de délipidation, laver le rein avec du PBS à température ambiante pendant 2 h (trois fois)9 (Figure 1). Utiliser une cuillère de distribution pour la manipulation des échantillons (figure 2B).
3. Coloration immunofluorescente à montage entier
- Préparez les tampons de coloration.
- Préparer le tampon de coloration pour les anticorps primaires en mélangeant 0,5% (v / v) Triton X-100, 0,5% de caséine dans PBS et 0,05% d’azoture de sodium9.
- Préparer le tampon de coloration pour les anticorps secondaires en mélangeant 0,5% (v / v) Triton X-100, 0,1% de caséine dans PBS et 0,05% d’azoture de sodium9.
- Effectuer une coloration avec des anticorps primaires.
- Immunocolorer le rein délipidé avec des anticorps primaires (1:100 ou 1:200, voir le tableau des matières) dans le tampon de coloration à 37 °C avec agitation douce pendant 7 jours.
REMARQUE : La quantité de tampon de coloration nécessaire pour un rein est de 500 à 600 μL (figure 2C). - Laver le rein avec du Triton X-100 à 0,5 % (v/v) dans du PBS (PBST) à température ambiante pendant 1 jour9 (Figure 1).
- Immunocolorer le rein délipidé avec des anticorps primaires (1:100 ou 1:200, voir le tableau des matières) dans le tampon de coloration à 37 °C avec agitation douce pendant 7 jours.
- Effectuer une coloration avec des anticorps secondaires.
- Immunocolorer le rein avec des anticorps secondaires (1:100 ou 1:200, voir le tableau des matières) dans le tampon de coloration à 37 °C en agitant doucement pendant 7 jours. Lavez le rein avec du PBST à température ambiante pendant 1 jour9 (Figure 1).
- Après la fixation9, immerger le rein dans du formaldéhyde à 1 % dans du PB (mélange 1:36 de formaldéhyde à 37 % et de PB) pendant 3 h, puis le laver avec du PBS à température ambiante pendant 6 h (Figure 1).
4. Appariement de l’indice de réfraction (IR)
- Préparez CUBIC-R+.
- Préparer CUBIC-R en mélangeant 45 % en poids de 2,3-diméthyl-1-phényl-5-pyrazolone/antipyrine et 30 % en poids de nicotinamide (voir le tableau des matières).
- Préparer CUBIC-R+ pour l’appariement de l’indice de réfraction (IR) en ajoutant 0,5 v% de N-buthyldiéthanolamine à CUBIC-R en suivant les rapports précédemment publiés 4,8,9.
- Effectuez la correspondance RI.
- Plongez le rein dans 7 mL de CUBIC-R+ à 50 % (v/v) (mélange 1:1 d’eau et de CUBIC-R+) dans un tube à fond rond de 14 ml en agitant doucement à température ambiante pendant 1 jour. Ensuite, plongez-le dans 7 mL de CUBIC-R+ dans un tube à fond rond de 14 mL en agitant doucement à température ambiante pendant 2 jours9 (Figure 1).
REMARQUE : Bien que le rein flotte à 50 % dans CUBIC-R+ au début de l’appariement IR, il coule et devient transparent dans CUBIC-R+ à la fin du processus (Figure 2D).
- Plongez le rein dans 7 mL de CUBIC-R+ à 50 % (v/v) (mélange 1:1 d’eau et de CUBIC-R+) dans un tube à fond rond de 14 ml en agitant doucement à température ambiante pendant 1 jour. Ensuite, plongez-le dans 7 mL de CUBIC-R+ dans un tube à fond rond de 14 mL en agitant doucement à température ambiante pendant 2 jours9 (Figure 1).
5. Acquisition et reconstruction d’images
- Immergez le rein compatible IR dans un mélange d’huile de silicium (IR = 1,555) et d’huile minérale (IR = 1,467) (55:45) pendant l’acquisition de l’image (IR = 1,51)5 (Figure 3).
- Obtenez des images 3D du rein entier avec un microscope fluorescent personnaliséà 9 feuilles de lumière (voir Tableau des matériaux). Collectez toutes les données d’image brutes au format TIFF 16 bits. Visualisez et capturez les images rendues en 3D avec le logiciel d’analyse d’imagerie (Imaris, voir Tableau des matériaux).
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Representative Results
En utilisant cette méthode de coloration, les nerfs sympathiques [anticorps anti-tyrosine hydroxylase (TH)] et les artères [anticorps anti-actine α-muscle lisse (αSMA)] dans un rein entier (Figure 4A, B et Vidéo 1) ont été visualisés9. Des nerfs sympathiques rénaux anormaux ont également été visualisés après une lésion d’ischémie/reperfusion (IRI)9,10 (figure 4C). De plus, la visualisation des nerfs sympathiques dans toute la rate13 a été réalisée à l’aide de ce protocole (Figure 4D). Un exemple de quantification des données d’immunofluorescence 3D est présenté à la figure 5.
De plus, la visualisation des canaux collecteurs [anticorps anti-aquaporine 2 (AQP2)], du segment S1 des tubules proximaux [anticorps anti-cotransporteur de glucose sodique 2 (SGLT2)] et des glomérules (anticorps anti-podocine) dans un rein entier9 a été réussie (Figure 6A). À l’aide de cette imagerie 3D des glomérules, la glomérulomégalie (anticorps anti-podocine) a été visualisée dans les premiers stades de la maladie rénale diabétique, qui a été supprimée par l’administration du médicament11 (Figure 6B).
Figure 1 : Nettoyage des tissus et coloration immunofluorescente à montage entier. Le nettoyage tissulaire par CUBIC est un processus en deux étapes : la délipidation (CUBIC-L) et l’appariement de l’indice de réfraction (RI) (CUBIC-R+). La coloration de montage entier est effectuée après le processus de délipidation. Barre d’échelle = 10 mm. L’image est reproduite à partir de Hasegawa et al.9. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Images du processus de manutention. (A) L’échantillon est immergé dans 7 mL de CUBIC-L à 50 % ou à 100 % dans un tube à fond rond de 14 mL. Le tube est maintenu à l’horizontale en agitant doucement pendant le processus de délipidation. (B) Une cuillère de distribution est utilisée pour la manipulation des échantillons. (C) La quantité de tampon de coloration nécessaire pour un rein est de 500 à 600 μL. Le tube est maintenu vertical pendant le processus de coloration. (D) Bien que l’échantillon flotte dans 50% CUBIC-R+ au début de l’appariement IR, il coule et devient transparent dans CUBIC-R+ à la fin du processus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Microscopie fluorescente à feuille de lumière pour l’imagerie 3D du rein entier. La microscopie fluorescente à feuille de lumière (LSFM) permet l’imagerie tridimensionnelle (3D) d’échantillons transparents. Cette image est reproduite à partir de Hasegawa et al.9. L’huile d’immersion est utilisée lors de l’acquisition des données. Des feuilles lumineuses des deux côtés éclairent l’échantillon. Les signaux d’excitation sont acquis à travers la lentille de l’objectif située en position verticale. La scène se déplace dans la direction axiale et des images z-stack sont obtenues. Barre d’échelle = 10 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 4. Imagerie tridimensionnelle des nerfs et des artères sympathiques du rein entier. (A) Les nerfs sympathiques [anticorps anti-tyrosine hydroxylase (TH), vert] et les artères [anticorps anti-actine musculaire lisse α (αSMA), magenta] sont visualisés dans un rein entier. (B) L’image agrandie du plan x-y de (A) est montrée [anticorps anti-TH, vert; anticorps anti-αSMA, magenta]. (C) Une dénervation persistante après une lésion d’ischémie-reperfusion rénale (IRI) est visualisée. (D) Les nerfs sympathiques dans une rate sont également visualisés dans une rate entière par le protocole actuel. Cette image est reproduite à partir de Hasegawa et al.9. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Quantification de la coloration immunofluorescente tridimensionnelle. Le processus de quantification du rapport entre le volume signal-positif et le volume total des reins est présenté. La conversion binaire est effectuée en fonction de chaque seuil. Les volumes sont obtenus en calculant l’intégrale de la zone d’intérêt (taille du voxel : x = 6,45 μm, y = 6,45 μm, z = 7 μm). L’image est reproduite à partir de Hasegawa et al.9. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Imagerie tridimensionnelle des canaux collecteurs, des tubules proximaux et des glomérules dans les reins entiers. (A) Les canaux collecteurs [anticorps anti-aquaporine 2 (AQP2)], le segment S1 des tubules proximaux [anticorps anti-cotransporteur de glucose sodique 2 (SGLT2)] et les glomérules (anticorps anti-podocine) sont respectivement visualisés dans un rein entier. L’image est reproduite à partir de Hasegawa et al.9. (B) La glomérulomégalie est observée au stade précoce de la maladie rénale diabétique (anticorps anti-podocine), qui est supprimée par l’administration du médicament. L’image est reproduite à partir de Hasegawa et al.11. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Vidéo 1: Film rotatif du rein. Le film rotatif du rein de la figure 4A est montré. Les nerfs sympathiques [anticorps anti-tyrosine hydroxylase (TH), vert] et les artères [anticorps anti-actine musculaire lisse α (αSMA), magenta] sont visualisés. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
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Discussion
Le protocole actuel a permis l’imagerie 3D du rein entier de diverses structures telles que les nerfs sympathiques, les canaux collecteurs, les artères, les tubules proximaux et les glomérules 9,10,11. Cette méthode de coloration offrait une observation macroscopique et conduisait à de nouvelles découvertes biologiques, en visualisant l’altération des nerfs sympathiques rénaux après une lésion d’ischémie-reperfusion 9,10 et une glomérulomégalie au stade initial de la maladie rénale diabétique 11.
L’opacité est dérivée de l’inhomogénéité optique dans un tissu5. Le principe commun de diverses méthodes de nettoyage des tissus est d’éliminer les diffuseurs / absorbeurs de lumière et de remplir l’espace avec des réactifs compatibles RI. Comparé aux méthodes à base de solvants organiques telles que l’imagerie 3D d’organes nettoyés par solvant (3DISCO/iDISCO)3,14, CUBIC est basé sur des réactifs hydrophiles et est donc supérieur en conservation fluorescente5. Cette caractéristique de CUBIC permet aux chercheurs d’observer les signaux fluorescents des souches2 de souris rapporteures ainsi que les signaux de coloration immunofluorescente à monture entière, offrant ainsi plus d’options pour une compréhension globale des structures des organes 3D.
Le protocole actuel de nettoyage tissulaire basé sur CUBIC peut atteindre une grande transparence pour l’imagerie 3D par rapport aux recherches précédentes sur l’élimination des reins chez la souris15. Cependant, il faut noter que ce protocole de compensation convient aux reins de souris. Un processus de délipidation plus fort est nécessaire pour dégager les reins humains. Par exemple, Zhao et al. ont récemment présenté une approche pour la cartographie des organes humains intacts en développant la méthode efficace de nettoyage des tissus appelée SHANEL (small-micelle-mediated human organ efficient clearing and labeling)16. Comme une délipidation plus forte endommage les échantillons, les chercheurs doivent choisir une méthode de nettoyage tissulaire appropriée en fonction de leur objectif.
La coloration des organes à montage entier est difficile en raison de la difficulté de pénétration des anticorps; Le présent protocole a été établi après essais et erreurs. Comme la stabilité de la coloration est prioritaire, le temps d’incubation peut être plus long que le minimum requis. En conséquence, ce protocole a démontré une coloration complète de haute qualité des reins par les anticorps. Cependant, il est possible que cela ne fonctionne pas bien, selon les antigènes cibles que nous n’avons pas essayés. Une étude récente a montré que la coloration en deux étapes à l’aide d’anticorps primaires et secondaires comme le protocole actuel n’est pas optimale dans certains cas pour la coloration complète du cerveau de souris17. En effet, lorsque la quantité cible est importante, son anticorps primaire remplit l’échantillon, ce qui rend difficile la pénétration profonde de l’anticorps secondaire dans le tissu17. Ainsi, l’anticorps primaire marqué par fluorescence, ou le complexe de l’anticorps primaire et du fragment Fab secondaire17, vaut la peine d’être essayé si la pénétration des anticorps n’est pas efficace.
En ce qui concerne le processus d’imagerie, les chercheurs doivent choisir un type approprié de microscopie et une résolution d’image en fonction de leur objectif. Si les chercheurs veulent effectuer une imagerie 3D du rein entier comme présenté dans cette étude, il est préférable d’utiliser la microscopie fluorescente à feuille de lumière, car elle peut rapidement acquérir de larges images z-stack avec un faible niveau de photoblanchiment. Comme la taille du fichier des données d’imagerie 3D est énorme, la résolution de l’image doit être réduite dans la mesure où l’imagerie d’organes entiers peut se tenir debout. En revanche, les chercheurs peuvent également utiliser des microscopies confocales ou multiphotoniques pour obtenir des données d’imagerie 3D à haute résolution dans un espace étroit.
En conclusion, la présente étude a développé la coloration rénale à montage entier pour l’imagerie 3D avec la méthode de nettoyage tissulaire CUBIC. Le protocole permet de visualiser des structures 3D dans un rein entier, offrant une perspective macroscopique pour la recherche rénale.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Une partie de ce travail a été menée en collaboration avec le professeur Hiroki R. Ueda (Université de Tokyo), le professeur Etsuo A. Susaki (Université Juntendo), le professeur Tetsuhiro Tanaka (Université de Tohoku), le professeur Masafumi Fukagawa, le Dr Takehiko Wada et le Dr Hirotaka Komaba (Université de Tokai).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube | Falcon | 352059 | Tissue clearing, staining, wash |
| 2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine | Tokyo Chemical Industry | D1876 | CUBIC-R+ |
| 37%-Formaldehyde Solution | Nacalai Tesque | 16223-55 | Post fixation |
| 4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Nacalai Tesque | 09154-85 | Kidney fixation |
| Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody | Invitrogen | A-21436 | Secondary antibody (1:100) |
| Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | A-31573 | Secondary antibody (1:200) |
| Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody | Abcam | ab199975 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-podocin antibody | Sigma-Aldrich | P0372 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody | Abcam | ab85626 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody | Abcam | ab113 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody | Abcam | ab5694 | Primary antibody (1:200) |
| Blocker Casein in PBS | Thermo Fisher Scientific | 37528 | Staining buffer |
| Butorphanol Tartrate | Meiji | 005526 | Anesthetic |
| C57BL/6NJcl | Nippon Bio-Supp.Center | N/A | Mouse strain |
| Imaris | Bitplane | N/A | Imaging analysis software |
| Macro-zoom microscope | OLYMPUS | MVX10 | The observation unit of the custom-built microscope |
| Medetomidine Hydrochloride | Kyoritsu-Seiyaku | 008656 | Anesthetic |
| Midazolam | SANDOZ | 27803229 | Anesthetic |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Immersion oil |
| N-buthyldiethanolamine | Tokyo Chemical Industry | B0725 | CUBIC-L, CUBIC-R+ |
| Nicotinamide | Tokyo Chemical Industry | N0078 | CUBIC-R+ |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | CUBIC-L, PBST |
| Silicon oil HIVAC-F4 | Shin-Etsu Chemical | 50449832 | Immersion oil |
| Sodium azide | Wako | 195-11092 | Staining buffer |
References
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