Summary
يوضح هذا البروتوكول كيفية عزل الحويصلات الجذعية الصغيرة خارج الخلية للخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الحبل السري (hUC-MSC-sEVs) باستخدام إعداد بسيط على نطاق المختبر. يتميز توزيع الحجم وتركيز البروتين وعلامات sEVs ومورفولوجيا hUC-MSC-sEVs المعزولة بتحليل تتبع الجسيمات النانوية ، ومقايسة بروتين BCA ، واللطخة الغربية ، والمجهر الإلكتروني النافذ ، على التوالي.
Abstract
تعتبر العملية القائمة على الطرد المركزي الفائق الطريقة الشائعة لعزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs). ومع ذلك ، فإن العائد من طريقة العزل هذه أقل نسبيا ، وهذه الطرق غير فعالة في فصل الأنواع الفرعية sEV. توضح هذه الدراسة طريقة ترشيح بسيطة على الطاولة لعزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية MSC المشتقة من الحبل السري البشري (hUC-MSC-sEVs) ، والتي تم فصلها بنجاح عن طريق الترشيح الفائق من الوسط المشروط ل hUC-MSCs. تم تمييز توزيع الحجم وتركيز البروتين والعلامات الخارجية (CD9 و CD81 و TSG101) ومورفولوجيا hUC-MSC-sEVs المعزولة بتحليل تتبع الجسيمات النانوية ، ومقايسة بروتين BCA ، واللطخة الغربية ، والمجهر الإلكتروني النافذ ، على التوالي. كان حجم hUC-MSC-sEVs المعزول 30-200 نانومتر ، مع تركيز جسيم 7.75 × 10 10 جسيمات / مل وتركيز بروتين80 ميكروغرام / مل. لوحظت نطاقات إيجابية للعلامات الخارجية CD9 و CD81 و TSG101. أظهرت هذه الدراسة أن hUC-MSC-sEVs تم عزلها بنجاح من الوسط المكيف hUC-MSCs ، وأظهر التوصيف أن المنتج المعزول استوفى المعايير المذكورة في الحد الأدنى من المعلومات لدراسات الحويصلات خارج الخلية 2018 (MISEV 2018).
Introduction
وفقا ل MISEV 2018 ، فإن sEVs عبارة عن جسيمات ثنائية الطبقة دهنية غير قابلة للتكرار مع عدم وجود نواة وظيفية ، بحجم 30-200 نانومتر1. تحتوي sEVs المشتقة من MSC على جزيئات إشارات مهمة تلعب أدوارا مهمة في تجديد الأنسجة ، مثل microRNA أو السيتوكينات أو البروتينات. لقد أصبحوا بشكل متزايد "نقطة ساخنة" بحثية في الطب التجديدي والعلاج الخالي من الخلايا. أظهرت العديد من الدراسات أن sEVs المشتقة من MSC فعالة مثل MSCs في علاج الحالات المختلفة ، مثل التعديل المناعي2،3،4،5 ، وتعزيز تكوين العظم6 ، ومرض السكري7،8 ، أو تجديد الأوعية الدموية9،10. مع تقدم تجارب المرحلة المبكرة ، تم تسليط الضوء على ثلاث قضايا رئيسية رئيسية فيما يتعلق بالترجمة السريرية ل MSCs-EVs: إنتاجية EVs ، ونقاء EVs (خالية من حطام الخلايا والملوثات البيولوجية الأخرى مثل البروتين والسيتوكينات) ، وسلامة غشاء الطبقة المزدوجة الفوسفوليبيد للمركبات الكهربائية بعد العزل.
تم تطوير طرق مختلفة لعزل sEVs ، واستغلال الكثافة والشكل والحجم والبروتين السطحي ل sEVs11. الطريقتان الأكثر شيوعا في عزلات sEVs هما التقنيات القائمة على الطرد المركزي الفائق والتقنيات القائمة على الترشيح الفائق.
تعتبر الطرق القائمة على الطرد المركزي الفائق طرقا قياسية ذهبية في عزل المركبات الكهربائية. هناك نوعان من تقنيات الطرد المركزي الفائق التي يتم استخدامها عادة وهما الطرد المركزي التفاضلي والطرد المركزي الفائق التدرج الكثاف. ومع ذلك ، غالبا ما تؤدي طرق الطرد المركزي الفائق إلى انخفاض العائد وتتطلب معدات باهظة الثمن لأجهزة الطرد المركزي فائقة السرعة (100000-200000 × جم)11. علاوة على ذلك ، فإن تقنيات الطرد المركزي الفائق وحدها غير فعالة في فصل الأنواع الفرعية للمركبات الكهربائية (sEVs والمركبات الكهربائية الكبيرة) ، مما يؤدي إلى طبقة رواسب غير نقية11. أخيرا ، يمكن أن يستغرق الطرد المركزي الفائق التدرج الكثافي وقتا طويلا ويتطلب خطوات احترازية إضافية مثل إضافة المخزن المؤقت للسكروز لمنع تلف التدرج أثناء خطوات التسارع والتباطؤ12. وبالتالي ، فإن الطرد المركزي الفائق عادة ما يؤدي إلى عائد منخفض نسبيا وغير قادر على التمييز بين مجموعات مختلفة من المركبات الكهربائية13 ، مما يحد من تطبيقه لإعداد المركبات الكهربائية على نطاق واسع11.
الطريقة الثانية لعزل EV هي عن طريق الترشيح الفائق ، والذي يعتمد على ترشيح الحجم. يعتبر الترشيح الفائق فعالا نسبيا من حيث الوقت والتكلفة مقارنة بالطرد المركزي الفائق ، لأنه لا يتضمن معدات باهظة الثمن أو أوقات معالجة طويلة14. وبالتالي ، يبدو أن الترشيح الفائق هو تقنية عزل أكثر فعالية من طريقتي الطرد المركزي الفائق المذكورتين أعلاه. يمكن أن تكون المنتجات المعزولة أكثر تحديدا بناء على أحجام المسام والعائد الأعلى15. ومع ذلك ، قد تؤدي القوة الإضافية المتكبدة أثناء عملية الترشيح إلى تشوه أو ثوران المركبات الكهربائية16.
اقترحت الورقة الحالية بروتوكولا فعالا من حيث التكلفة والوقت لعزل المركبات الكهربائية المشتقة من MSC للتحليل النهائي والأغراض العلاجية. جمعت الطريقة الموصوفة في هذه الورقة بين طريقة ترشيح بسيطة مع الطرد المركزي على مقاعد البدلاء لعزل المركبات الكهربائية عالية الإنتاجية وذات الجودة العالية من hUC-MSCs لتحليل المصب ، بما في ذلك تحليل حجم الجسيمات ، وفحص العلامات الحيوية ، والتصوير المجهري الإلكتروني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والمعدات والبرامج المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. الخلايا الجذعية الوسيطة للحبل السري البشري والثقافة
- استزراع hUC-MSCs بكثافة بذر 5 × 103 / سم2 في DMEM ، مكملة ب 8٪ تحلل الصفائح الدموية البشرية و 1٪ Pen-Strep. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2. استبدل وسط زراعة الخلايا كل 3 أيام لضمان نمو الخلايا بشكل صحيح.
- قم بتوسيع الخلايا لتمرير 5 في قوارير T175 لعزل sEV.
ملاحظة: هناك حاجة إلى العديد من القوارير لحصاد غلة عالية من sEVs (يزداد العائد مع عدد الخلايا).
2. عزل حويصلة صغيرة خارج الخلية من hUC - MSCs
- استبدل وسط الاستزراع ب DMEM الطازج الخالي من الفينول الأحمر المكمل ب 1٪ Pen-Strep [وسط مكيف (CM)] عندما تصل الثقافة إلى التقاء 70٪ -80٪ عند الممر 5.
تنبيه: استخدم الوسائط القاعدية فقط ؛ تجنب FBS ومكمل تحلل الصفائح الدموية البشرية لتجنب التلوث بواسطة sEVs الخارجية. - بعد 24 ساعة ، قم بطرد مركزي CM عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة حطام الخلية. جمع وتصفية المادة الطافية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر لإزالة الجسيمات التي يزيد حجمها عن 220 نانومتر.
- املأ وحدة مرشح الطرد المركزي ب 30 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) تمت تصفيته من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر. جهاز الطرد المركزي وحدة مرشح الطرد المركزي عند 3500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- املأ CM المصفى في وحدة مرشح الطرد المركزي (الحد الأقصى لحجم كل وحدة هو 70 مل). أجهزة الطرد المركزي CM عند 3500 × جم عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: يجب مراقبة مدة الطرد المركزي من وقت لآخر حتى يصل المحلول إلى سطح المرشح. - تخلص من المحلول في كوب محلول الترشيح. عكس الطرد المركزي كوب مرشح العينة مع كوب جمع التركيز عند 1000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 2 دقيقة.
- انقل CM المركز مرة أخرى إلى وحدة مرشح الطرد المركزي. أضف 30 مل من PBS المصفى إلى وحدة مرشح الطرد المركزي وطرد مركزي الوحدة عند 3500 × جم عند 4 درجات مئوية.
- تخلص من المحلول في كوب محلول الترشيح. قم بتركيب كوب تجميع مركز على وحدة المرشح وأجهزة طرد مركزي عكسية عند 1000 × جم لمدة 2 دقيقة عند 4 درجات مئوية للحصول على sEVs المنقى.
- قم بتصفية sEVs من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر.
- نقل العينات إلى أنابيب جديدة وتخزينها في -80 درجة مئوية لمزيد من التحليل.
3. توصيف hUC-MSC-sEVs
- تحليل تتبع الجسيمات النانوية
- قم بتخفيف hUC-MSC-sEVs المعزولة في PBS المصفى إلى 20-100 جسيم / إطار.
- أدخل 1 مل من العينة المخففة في غرفة NTA باستخدام محاقن 1 مل يمكن التخلص منها.
- اضبط إعدادات القياس وفقا لذلك: اضبط مستوى الكاميرا على المستوى 14 ، وحدد عتبة الكشف لتشمل أكبر عدد ممكن من الجسيمات مع تقييد حساب 10-100 صليب أحمر ، ويقتصر عدد الصليب الأزرق على خمسة.
- لكل قياس ، سجل خمسة مقاطع فيديو مدتها 1 دقيقة وقم بتحليلها باستخدام برنامج NanoSight مع حد اكتشاف يبلغ خمسة.
- خذ القياسات في ثلاث نسخ لكل عينة.
- تحليل النشاف الغربي
- تحلل محلول تحلل hUC-MSC-sEVs باستخدام محلول تحلل الترسيب المناعي الإشعاعي البارد (RIPA) ، واحتضانه لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، وأجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. جمع طاف .
- قم بقياس البروتين باستخدام مجموعة فحص البروتين بحمض Bicinchoninic (BCA). قم بتجميع مجموعة الرحلان الكهربائي للهلام وفقا لذلك وقم بإجراء الرحلان الكهربائي للهلام عند 90 فولت حتى يصل البروتين إلى نهاية جل التراص. قم بتغيير الجهد إلى 200 فولت لفصل البروتينات حتى نهاية هلام الحل.
- قم بإجراء نقل شبه جاف لنقل البروتينات من الجل إلى غشاء ثنائي فلوريد البولي فينيليدين (PVDF) عند 15 فولت لمدة 1 ساعة.
- سد غشاء PVDF مع 3٪ ألبومين مصل البقر (BSA) / محلول ملحي مخزن Tris-0.1٪ v / v Tween 20 (TBS-T) لمدة 1 ساعة على شاكر في درجة حرارة الغرفة. احتضان غشاء PVDF بالأجسام المضادة الأولية على النحو التالي: الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد للفأر CD 9 (1: 500) ، الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد للفأر CD 81 (1: 500) ، الفأر المضاد ل GRP 94 الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر TSG 101 (1: 500) عند 4 درجات مئوية طوال الليل مع الاهتزاز المستمر.
- في اليوم التالي ، اغسل غشاء PVDF 5 × 5 دقائق باستخدام TBS-T واحتضان المزيد بجسم مضاد ثانوي: الفجل الفجل بيروكسيديز الفأر المترافق IgG kappa ملزمة البروتين (m-IgGκ BP-HRP) (1: 5000) لمدة 1 ساعة مع التحريض في درجة حرارة الغرفة.
- مرة أخرى ، اغسل غشاء PVDF باستخدام TBS-T خمس مرات ، وتصور الغشاء في جهاز تصوير مقترن بالشحنة (CCD) باستخدام كاشف الكشف عن التلألؤ الكيميائي. تحليل مستوى التعبير عن البروتينات باستخدام برنامج ImageJ. أولا ، افتح ملف الصورة في ImageJ (ملف | فتح...). تحسين جودة الصورة عن طريق ضبط السطوع والتباين (صورة | ضبط | السطوع / التباين). اضبط الصورة حتى تصبح البقع مرئية بوضوح ، وانقر فوق الزر "تطبيق" ، ثم احفظ الصور بتنسيق TIFF (ملف | حفظ باسم | TIFF...).
- المجهر الإلكتروني النافذ
- قم بتخفيف جزء واحد من عينة hUC-MSC-sEVs بأربعة أجزاء من PBS المصفى إلى حجم إجمالي قدره 10 ميكرولتر واحتضانه على شبكة نحاسية مطلية بالكربون لمدة 15 دقيقة.
- قم بإزالة العينة الزائدة باستخدام منديل المختبر واتركها تجف في الهواء لمدة 3 دقائق.
- احتضان 10 ميكرولتر من محلول حمض الفوسفوتونجستيك 1٪ (PTA) لتلطيخ العينة لمدة 3 دقائق.
- قم بإزالة محلول PTA الزائد بنسبة 1٪ باستخدام مناديل معملية واتركه يجف في الهواء لمدة 3 دقائق.
- استخدم العينة للتصوير بالمجهر الإلكتروني النافذ.
ملاحظة: راجع الشكل 1 للاطلاع على خطوات التجربة التخطيطية الملخصة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح الشكل 2 أن hUC-MSC-sEVs لها وضع حجم جسيم عند 53 نانومتر ، في حين أن القمم المهمة الأخرى لحجم الجسيمات كانت 96 و 115 نانومتر. كان تركيز hUC-MSC-sEVs المقاسة بواسطة NTA 7.75 × 1010 جسيمات / مل. كان تركيز البروتين في hUC-MSC-sEVs المقاسة باستخدام مقايسة BCA حوالي 80 ميكروغرام / مل.
في تحليل النشاف الغربي ، أظهرت hUC-MSC-sEVs نطاقات إيجابية للعلامات الخارجية CD9 و CD81 و TSG101 ، لكنها كانت سلبية ل GRP94 (الشكل 3). GRP94 هي علامة شبكية إندوبلازمية تستخدم عادة كعلامة سلبية ل sEVs. تم تصور hUC-MSC-sEVs المعزولة تحت TEM لتحديد حجمها ومورفولوجيتها. hUC-MSCs-sEVs بحجم ~ 100 نانومتر وأظهر بنية غشاء ثنائية الطبقة تشبه الكوب (الشكل 4).
الشكل 1: مخطط عمل لعزل وتنظيف وتوصيف sEVs. تم جمع الوسط المكيف من ثقافة MSC وتصفيته من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر لإزالة الجسيمات الكبيرة. تم نقل الوسط المرشح إلى وحدة مرشح بالطرد المركزي لتركيز sEVs والطرد المركزي العكسي لجمع sEVs المركزة. ثم تم إعادة تعليق sEVs المركزة باستخدام PBS البارد والمصفى ، وتكررت الخطوات باستخدام وحدة مرشح بالطرد المركزي لخطوات الغسيل. أخيرا ، تم تعقيم sEVs بواسطة ترشيح 0.22 ميكرومتر قبل توصيفها باستخدام تحليل تتبع الجسيمات النانوية ، وتحليل النشاف الغربي ، والمجهر الإلكتروني النافذ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحليل تتبع الجسيمات النانوية ل hUC-MSC-sEVs المعزولة. تم تخفيف hUC-MSC-sEVs 100-1000x باستخدام PBS واضح وقياسها باستخدام Nanosight NS300 المجهز بكاميرا CMOS وعدسة موضوعية 20x ووحدة ليزر زرقاء (488 نانومتر) وبرنامج NTA. هذا الرقم هو تمثيل NTA في ثلاث نسخ. الاختصارات: hUC-MSC-sEVs = حويصلات MSC صغيرة خارج الخلية مشتقة من الحبل السري البشري. NTA = تحليل تتبع الجسيمات النانوية ؛ CMOS = أشباه الموصلات التكميلية لأكسيد المعادن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تعبير العلامات الحيوية ل hUC-MSC-sEVs . (أ) تحليل اللطخة الغربية للعلامة الإيجابية الخارجية CD9. (ب) تحليل اللطخة الغربية للعلامة الإيجابية الخارجية CD81. (ج) تحليل اللطخة الغربية للعلامة الإيجابية الخارجية TSG101. (د) تحليل اللطخة الغربية للعلامة السلبية GRP94. تمت مقارنة جميع العلامات الأربعة مع محللات الخلية كعنصر تحكم. من اليسار إلى اليمين ، سلم ، خلية محللة ، hUC-MSC-sEVs (A ، B) ؛ سلم ، hUC-MSC-sEVs ، تحلل الخلية ، hUC-MSC-sEVs ، تحلل الخلية (C) ؛ سلم ، خلية محللة ، hUC-MSC-sEVs (D). أزواج محللات الخلايا مأخوذة من نسختين متماثلتين، وهذه الصور هي صور تمثيلية من تجارب أجريت على ثلاث نسخ. اختصار: hUC-MSC-sEVs = حويصلات صغيرة خارج الخلية مشتقة من الحبل السري البشري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مورفولوجيا hUC-MSC-sEVs المفردة تحت المجهر الإلكتروني النافذ. تم تحضين hUC-MSC-sEVs على شبكة نحاسية مغلفة بالكربون وملطخة بحمض الفوسفوتونجستيك بنسبة 1٪ قبل عرضها تحت المجهر الإلكتروني النافذ. أظهرت hUC-MSC-sEVs ، التي يبلغ حجمها حوالي 100 نانومتر ، بنية غشاء ثنائية الطبقة تشبه الكوب. شريط المقياس = 100 نانومتر. الصورة هي ممثل لثلاث لقطات مستقلة. اختصار: hUC-MSC-sEVs = حويصلات صغيرة خارج الخلية مشتقة من الحبل السري البشري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EVs هي واحدة من المجموعات الفرعية المهمة للإفراز في MSCs التي تلعب دورا حاسما أثناء العمليات الطبيعية والمرضية. ومع ذلك ، فقد ارتفعت sEVs ، التي يتراوح حجمها بين 30 إلى 200 نانومتر ، كأداة محتملة للعلاج الخالي من الخلايا في العقد الماضي. تم تطوير تقنيات مختلفة لعزل المركبات الكهربائية من MSCs. ومع ذلك ، فإن الطرد المركزي الفائق التفاضلي ، والترشيح الفائق ، والترسيب القائم على البوليمر ، والتقاط التقارب المناعي ، والترسيب القائم على الموائع الدقيقة لها مزايا وعيوب مختلفة17. لا يمكن لأي من تقنيات العزل هذه تحقيق معدل استرداد وخصوصية عالية. وبالتالي ، يجب على الباحثين اختيار الطرق المناسبة وفقا لتفضيلاتهم بناء على معدل استرداد مرتفع أو خصوصية عالية.
قبل عزل MSCs sEVs ، تم تقييم MSCs لعلامات السطح الإيجابية (CD90 و CD105 و CD73) والعلامات السلبية (CD34 و CD11b و CD19 و CD45 و HLA-DR) عن طريق قياس التدفق الخلوي كما هو موضح سابقا18. قد توفر الميزة التقنية لهذه الدراسة للمركبات الكهربائية حلا للوضع الحالي. لا يتطلب الأمر سوى إعداد سطح طاولة أساسي في المختبر لتجنب استخدام المعدات المتطورة لعزل المركبات الكهربائية. تم تجويع MSCs مع وسائط الثقافة في البروتوكول الموصوف دون إضافة أي مصل. هذا أمر بالغ الأهمية لمنع أي تلوث للمركبات الكهربائية الناشئة عن مكملات المصل. ومع ذلك ، بالنظر إلى أن مكملات المصل لا مفر منها في بعض الحالات ، يمكن اعتبار مكملات المصل المستنفدة للإكسوسوم في صياغة وسائط استزراع كاملة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الوسائط الخالية من الفينول الأحمر كبديل لوسائط الثقافة القياسية لأن مؤشر الأس الهيدروجيني الشائع هذا يمكن أن يسبب مشكلات في القياسات اللونية15. يمكن تحسين البروتوكول باستخدام مرشح مضخة 0.22 ميكرومتر بدلا من مرشح حقنة تقليدي أثناء إزالة الجسيمات التي يزيد حجمها عن 220 نانومتر. يجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة لتحسين إنتاجية sEVs. في الطرد المركزي الأخير ل CM من خلال وحدة مرشح الطرد المركزي ، يجب تجنب الطرد المركزي المطول لضمان وجود حجم كاف من المحلول لإزالة sEVs من المرشح. قد يؤدي التغاضي عن هذا إلى تقليل إنتاجية المركبات الكهربائية التي تم جمعها أثناء خطوة الطرد المركزي العكسي.
يقتصر هذا البروتوكول على نطاق المختبر ، وعلى هذا النحو ، قد لا يكون مناسبا للعزل على نطاق واسع في الصناعة. ويرجع ذلك إلى التكلفة العالية لاستخدام وحدة مرشح الطرد المركزي لمرة واحدة ، وهو أمر غير ممكن للعزل على نطاق واسع ، والذي يتضمن عموما حجما يصل إلى آلاف اللترات من CM. باختصار ، نحن نقدم بروتوكول ترشيح بسيط على نطاق الطاولة لعزل sEVs المشتقة من MSCs. هذا البروتوكول مناسب أيضا لتنقية sEVs المعزولة لمزيد من التحليل النهائي. على الرغم من أن هذا البروتوكول مصمم خصيصا ل sEVs المشتقة من MSCs ، يمكن استخدام جزء من البروتوكول الموصوف لعزل sEVs من مصادر مختلفة ، مثل سوائل الجسم أو خطوط الخلايا أو مصادر أخرى من النوع السائل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم نشر هذا الفيديو من قبل My CytoHealth Sdn. Bhd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Nacalai Tesque | 06121-95 | Western blot |
| 95% ethanol | Nacalai Tesque | 14710-25 | Disinfectants |
| Absolute Methanol | Chemiz | 45081 | To activate PVDF membrane (Western blot) |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell dissociation enzyme |
| ammonium persulfate | Chemiz | 14475 | catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis |
| anti-CD 81 (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | Antibody for sEVs marker |
| anti-TSG 101 (C-2) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7964 | Antibody for sEVs marker |
| Bovine serum albumin | Nacalai Tesque | 00653-31 | PVDF membrane blocking |
| bromophenol blue | Nacalai Tesque | 05808-61 | electrophoretic color marker |
| Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL) | Millipore | UFC710008 | sEVs isolation |
| ChemiLumi One L | Nacalai Tesque | 7880 | chemiluminescence detection reagent |
| CryoStor Freezing Media | Sigma-Aldrich | C3124-100ML | Cell cryopreserve |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Nacalai Tesque | 08458-45 | Cell culture media |
| ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker | SMOBIO | PM2610 | Protein molecular weight markers |
| Extra thick blotting paper | ATTO | buffer reservior (Western blot) | |
| Glycerol | Merck | G5516 | Chemicals for western blot |
| Glycine | 1st Base | BIO-2085-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP) | Santa Cruz Biotechnology | sc-516102 | Secondary antibody (Western Blot) |
| Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia | ||
| mouse antibodies anti-CD 9 (C-4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13118 | Antibody for sEVs marker |
| Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2 | Malvern Panalytical, UK | ||
| paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 02890-45 | Sample Fixation during TEM |
| penicillin–streptomycin | Nacalai Tesque | 26253-84 | Antibiotic for media |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Nacalai Tesque | 27327-81 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Washing, sample dilution |
| polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size |
ATTO | To hold protein during protein transfer (Western blot) | |
| protease inhibitor cocktail | Nacalai Tesque | 25955-11 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| Protein Assay Bicinchoninate Kit | Nacalai Tesque | 06385-00 | Protein measurement |
| sample buffer solution with 2-ME | Nacalai Tesque | 30566-22 | Reducing agent for western blot |
| sodium chloride | Nacalai Tesque | 15266-64 | Chemicals for western blot |
| sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31606-62 | ionic surfactant during gel electrophoresis |
| Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope | FEI, USA | ||
| tetramethylethylenediamine | Nacalai Tesque | 33401-72 | chemicals to prepare gel |
| tris-base | 1st Base | BIO-1400-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| Tween 20 | GeneTex | GTX30962 | Chemicals for western blot |
| UVP (Ultra Vision Product) CCD imager | CCD imager for western blot signal detection |
References
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Jayabalan, N., et al. Cross talk between adipose tissue and placenta in obese and gestational diabetes mellitus pregnancies via exosomes. Frontiers in Endocrinology. 8, 239 (2017).
- Li, T., et al. Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis. Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).
- Wang, C., et al. Mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles induce ischemic neuroprotection by modulating leukocytes and specifically neutrophils. Stroke. 51 (6), 1825-1834 (2020).
- Wei, Y., et al. MSC-derived sEVs enhance patency and inhibit calcification of synthetic vascular grafts by immunomodulation in a rat model of hyperlipidemia. Biomaterials. 204, 13-24 (2019).
- Liu, W., et al. MSC-derived small extracellular vesicles overexpressing miR-20a promoted the osteointegration of porous titanium alloy by enhancing osteogenesis via targeting BAMBI. Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 1-16 (2021).
- Li, F. X. Z., et al. The role of mesenchymal stromal cells-derived small extracellular vesicles in diabetes and its chronic complications. Frontiers in Endocrinology. 12, 1741 (2021).
- Jayabalan, N., et al. Frontiers in Endocrinology. 8, Front Endocrinol. Lausanne. (2017).
- Wei, Y., et al. Biomaterials. 204, Biomaterials. 13-24 (2019).
- Du, W., et al. Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer. Biomaterials. 133, 70-81 (2017).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z.
- Nicolas, R. H., Goodwin, G. H. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V.
- Kırbaş, O. K., et al. Optimized isolation of extracellular vesicles from various organic sources using aqueous two-phase system. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
- Ev, B., Ms, K. Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 219, 396-405 (2015).
- Dragovic, R. A., et al. Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Methods. 87, San Diego, Calif. 64-74 (2015).
- Tan, K. L., et al. Benchtop isolation and characterisation of small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells. Molecular Biotechnology. 63 (9), 780-791 (2021).
