Summary
यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि एक सरल प्रयोगशाला-स्केल बेंचटॉप सेटिंग के साथ मानव गर्भनाल-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं के छोटे बाह्य पुटिकाओं (एचयूसी-एमएससी-एसईवी) को कैसे अलग किया जाए। पृथक एचयूसी-एमएससी-एसईवी के आकार वितरण, प्रोटीन एकाग्रता, एसईवी मार्कर और आकृति विज्ञान क्रमशः नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण, बीसीए प्रोटीन परख, पश्चिमी धब्बा और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप द्वारा विशेषता है।
Abstract
अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन-आधारित प्रक्रिया को छोटे बाह्य पुटिकाओं (एसईवी) अलगाव के लिए सामान्य विधि माना जाता है। हालांकि, इस अलगाव विधि से उपज अपेक्षाकृत कम है, और ये विधियां एसईवी उपप्रकारों को अलग करने में अक्षम हैं। यह अध्ययन मानव गर्भनाल-व्युत्पन्न एमएससी छोटे बाह्य पुटिकाओं (एचयूसी-एमएससी-एसईवी) को अलग करने के लिए एक सरल बेंचटॉप निस्पंदन विधि को प्रदर्शित करता है, जो एचयूसी-एमएससी के वातानुकूलित माध्यम से अल्ट्राफिल्ट्रेशन द्वारा सफलतापूर्वक अलग किया जाता है। आकार वितरण, प्रोटीन एकाग्रता, एक्सोसोमल मार्कर (सीडी 9, सीडी 81, टीएसजी 101), और पृथक एचयूसी-एमएससी-एसईवी की आकृति विज्ञान को क्रमशः नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण, बीसीए प्रोटीन परख, पश्चिमी धब्बा और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ चित्रित किया गया था। पृथक एचयूसी-एमएससी-एसईवी का आकार 30-200 एनएम था, जिसमें 7.75 × 10 10 कण / एमएल की कण एकाग्रता और80 μg / mL की प्रोटीन एकाग्रता थी। एक्सोसोमल मार्कर सीडी 9, सीडी 81 और टीएसजी 101 के लिए सकारात्मक बैंड देखे गए। इस अध्ययन से पता चला है कि एचयूसी-एमएससी-एसईवी को सफलतापूर्वक एचयूसी-एमएससी वातानुकूलित माध्यम से अलग किया गया था, और लक्षण वर्णन से पता चला है कि पृथक उत्पाद एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स 2018 (एमआईएसईवी 2018) के अध्ययन के लिए न्यूनतम जानकारी द्वारा उल्लिखित मानदंडों को पूरा करता है।
Introduction
एमआईएसईवी 2018 के अनुसार, एसईवी गैर-प्रतिकृति लिपिड बाइलेयर कण हैं जिनमें कोई कार्यात्मक नाभिक मौजूद नहीं है, जिसका आकार 30-200 एनएम1 है। एमएससी-व्युत्पन्न एसईवी में महत्वपूर्ण सिग्नलिंग अणु होते हैं जो ऊतक पुनर्जनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जैसे कि माइक्रोआरएनए, साइटोकिन्स या प्रोटीन। वे पुनर्योजी चिकित्सा और सेल-मुक्त चिकित्सा में तेजी से एक शोध "हॉटस्पॉट" बन गए हैं। कई अध्ययनों से पता चला है कि एमएससी-व्युत्पन्न एसईवी विभिन्न स्थितियों के इलाज में एमएससी के रूप में प्रभावी हैं, जैसे कि इम्यूनोमॉड्यूलेशन 2,3,4,5, ओस्टियोजेनेसिस6 को बढ़ाना, मधुमेह मेलेटस 7,8, या संवहनी पुनर्जनन 9,10। जैसे-जैसे शुरुआती चरण के परीक्षण आगे बढ़ते हैं, एमएससी-ईवी के नैदानिक अनुवाद के संबंध में तीन मुख्य प्रमुख मुद्दों पर प्रकाश डाला गया है: ईवी की उपज, ईवी की शुद्धता (सेल मलबे और प्रोटीन और साइटोकिन्स जैसे अन्य जैविक दूषित पदार्थों से मुक्त), और अलगाव के बाद ईवी के फॉस्फोलिपिड बाइलेयर झिल्ली की अखंडता।
एसईवी11 के घनत्व, आकार, आकार और सतह प्रोटीन का दोहन करते हुए एसईवी को अलग करने के लिए विभिन्न तरीके विकसित किए गए हैं। एसईवी अलगाव में दो सबसे आम तरीके अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन-आधारित और अल्ट्राफिल्ट्रेशन-आधारित तकनीकहैं।
अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन-आधारित विधियों को एसईवी अलगाव में स्वर्ण मानक तरीके माना जाता है। आमतौर पर नियोजित दो प्रकार की अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन तकनीकें अंतर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन और घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन हैं। हालांकि, अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन विधियों के परिणामस्वरूप अक्सर कम उपज होती है और उच्च गति अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज (100,000-200,000 × ग्राम) के लिए महंगे उपकरणों की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन तकनीक अकेले ईवी उपप्रकारों (एसईवी और बड़े ईवी) को अलग करने में अक्षम हैं, जिसके परिणामस्वरूप एक अशुद्ध तलछट परत11 होती है। अंत में, घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन भी समय लेने वाला हो सकता है और त्वरण औरमंदी के चरणों के दौरान ढाल क्षति को रोकने के लिए सुक्रोज बफर एडिशन जैसे अतिरिक्त एहतियाती कदमों की आवश्यकता होती है। इसलिए, अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन आमतौर पर अपेक्षाकृत कम उपज की ओर जाता है और ईवी13 की विभिन्न आबादी के बीच भेदभाव करने में सक्षम नहीं है, जो बड़े पैमाने पर ईवी तैयारीके लिए इसके आवेदन को सीमित करता है।
ईवी अलगाव की दूसरी विधि अल्ट्राफिल्ट्रेशन के माध्यम से है, जो आकार निस्पंदन पर आधारित है। अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन की तुलना में अल्ट्राफिल्ट्रेशन अपेक्षाकृत समय और लागत प्रभावी है, क्योंकि इसमें महंगे उपकरण या लंबे प्रसंस्करण समयशामिल नहीं हैं। इसलिए, अल्ट्राफिल्ट्रेशन उपरोक्त दोनों अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन विधियों की तुलना में एक अधिक प्रभावी अलगाव तकनीक प्रतीत होती है। पृथक उत्पाद छिद्र आकार और उच्च उपजके आधार पर अधिक विशिष्ट हो सकते हैं। हालांकि, निस्पंदन प्रक्रिया के दौरान किए गए अतिरिक्त बल के परिणामस्वरूप ईवी16 का विरूपण या विस्फोट हो सकता है।
वर्तमान पेपर ने डाउनस्ट्रीम विश्लेषण और चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए एमएससी-व्युत्पन्न एसईवी को अलग करने के लिए एक लागत और समय प्रभावी बेंचटॉप प्रोटोकॉल का प्रस्ताव दिया। इस पेपर में वर्णित विधि ने कण आकार विश्लेषण, बायोमार्कर परख और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग सहित डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए एचयूसी-एमएससी से उच्च उपज और अच्छी गुणवत्ता वाले ईवी को अलग करने के लिए बेंच टॉप सेंट्रीफ्यूजेशन के साथ एक सरल निस्पंदन विधि को जोड़ा।
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Protocol
नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्री, उपकरण और सॉफ़्टवेयर के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।
1. मानव गर्भनाल मेसेनकाइमल स्टेम सेल और संस्कृति
- डीएमईएम में 5 × 103/सेमी2 के सीडिंग घनत्व पर एचयूसी-एमएससी को कल्चर करें, 8% मानव प्लेटलेट लाइसेट और 1% पेन-स्ट्रेप के साथ पूरक। कोशिकाओं को 5%CO2 में 37 °C पर इनक्यूबेट करें। उचित सेल विकास सुनिश्चित करने के लिए हर 3 दिनों में सेल कल्चर माध्यम को बदलें।
- एसईवी अलगाव के लिए टी 175 फ्लास्क में 5 मार्ग तक कोशिकाओं का विस्तार करें।
नोट: एसईवी की उच्च उपज की कटाई के लिए कई फ्लास्क की आवश्यकता होती है (उपज कोशिकाओं की संख्या के साथ बढ़ती है)।
2. एचयूसी - एमएससी से छोटे बाह्य पुटिका अलगाव
- संस्कृति माध्यम को ताजा फिनोल-लाल मुक्त डीएमईएम के साथ प्रतिस्थापित करें जो 1% पेन-स्ट्रेप [वातानुकूलित माध्यम (सीएम)] के साथ पूरक हो, जब संस्कृति मार्ग 5 पर 70% -80% प्रवाह तक पहुंच जाती है।
चेतावनी: केवल बेसल मीडिया का उपयोग करें; बाहरी एसईवी द्वारा संदूषण से बचने के लिए एफबीएस और मानव प्लेटलेट लाइसेट पूरक से बचें। - 24 घंटे के बाद, सेल मलबे को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर सीएम को सेंट्रीफ्यूज करें। 220 एनएम से बड़े कणों को हटाने के लिए 0.22 μm फ़िल्टर के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला को इकट्ठा और फ़िल्टर करें।
- केन्द्रापसारक फ़िल्टर इकाई को 0.2 μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किए गए फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (PBS) के 30 मिलीलीटर के साथ भरें। केन्द्रापसारक फ़िल्टर इकाई को 3,500 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
- फ़िल्टर किए गए सीएम को केन्द्रापसारक फ़िल्टर इकाई में भरें (प्रत्येक इकाई की अधिकतम मात्रा 70 एमएल है)। 4 डिग्री सेल्सियस पर 3,500 × ग्राम पर सीएम को सेंट्रीफ्यूज करें।
नोट: सेंट्रीफ्यूजेशन की अवधि की समय-समय पर निगरानी की जानी चाहिए जब तक कि समाधान फिल्टर की सतह तक नहीं पहुंच जाता। - छानने वाले घोल को छानने वाले कप में फेंक दें। नमूना फिल्टर कप को 2 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,000 x g पर केंद्रित संग्रह कप के साथ रिवर्स सेंट्रीफ्यूज करें।
- केंद्रित सीएम को केन्द्रापसारक फ़िल्टर इकाई में वापस स्थानांतरित करें। केन्द्रापसारक फ़िल्टर इकाई में फ़िल्टर किए गए पीबीएस के 30 एमएल जोड़ें और यूनिट को 4 डिग्री सेल्सियस पर 3,500 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
- छानने वाले घोल को छानने वाले कप में फेंक दें। फ़िल्टर यूनिट पर एक केंद्रित संग्रह कप स्थापित करें और शुद्ध एसईवी प्राप्त करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 1,000 × ग्राम पर रिवर्स-सेंट्रीफ्यूज करें।
- एक 0.22 μm सिरिंज फ़िल्टर के माध्यम से SEV को फ़िल्टर करें।
- नमूनों को नए ट्यूबों में स्थानांतरित करें और उन्हें आगे के विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
3. एचयूसी-एमएससी-एसईवी का लक्षण वर्णन
- नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण
- फ़िल्टर किए गए पीबीएस में पृथक एचयूसी-एमएससी-एसईवी को 20-100 कणों / फ्रेम तक पतला करें।
- 1 एमएल डिस्पोजेबल सिरिंज का उपयोग करके एनटीए कक्ष में पतला नमूना के 1 एमएल पेश करें।
- तदनुसार माप सेटिंग्स सेट करें: कैमरा स्तर को स्तर 14 पर समायोजित करें, इस प्रतिबंध के साथ जितना संभव हो उतने कणों को शामिल करने के लिए पहचान सीमा निर्धारित करें कि 10-100 लाल क्रॉस गिने जाते हैं, और ब्लू क्रॉस गिनती पांच तक सीमित है।
- प्रत्येक माप के लिए, पांच 1 मिनट वीडियो रिकॉर्ड करें और पांच की पहचान सीमा के साथ नैनोसाइट सॉफ्टवेयर का उपयोग करके उनका विश्लेषण करें।
- प्रत्येक नमूने के लिए तीन प्रतियों में माप लें।
- पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण
- आइस-कोल्ड रेडियोइम्यूनोप्रेसिपेशन परख (आरआईपीए) लाइसिस बफर के साथ एचयूसी-एमएससी-एसईवी को लाइज़ करें, 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाला इकट्ठा करें।
- एक बिसिनकोनिक एसिड (बीसीए) प्रोटीन परख किट का उपयोग करके प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करें। तदनुसार सेट किए गए जेल वैद्युतकणसंचलन को इकट्ठा करें और 90 वी पर जेल वैद्युतकणसंचलन करें जब तक कि प्रोटीन स्टैकिंग जेल के अंत तक नहीं पहुंच जाता। समाधान जेल के अंत तक प्रोटीन को अलग करने के लिए वोल्टेज को 200 वी में बदलें।
- 1 घंटे के लिए 15 वी पर जेल से पॉलीविनाइलिडेन डाइफ्लोराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली में प्रोटीन को स्थानांतरित करने के लिए अर्धशुष्क स्थानांतरण करें।
- कमरे के तापमान पर शेकर पर 1 घंटे के लिए 3% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए)/ट्रिस-बफर्ड सेलाइन-0.1% वी/वी ट्वीन 20 (टीबीएस-टी) के साथ पीवीडीएफ झिल्ली को अवरुद्ध करें। प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ पीवीडीएफ झिल्ली को निम्नानुसार इनक्यूबेट करें: माउस एंटी-सीडी 9 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (1:500), माउस एंटी-सीडी 81 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (1:500), माउस एंटी-जीआरपी 94 मोनोक्लोनल माउस एंटी-टीएसजी 101 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (1:500) लगातार झटकों के साथ रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर।
- अगले दिन, पीवीडीएफ झिल्ली को टीबीएस-टी के साथ 5 x 5 मिनट धो लें और आगे एक द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें: हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज-संयुग्मित माउस आईजीजी कप्पा बाइंडिंग प्रोटीन (एम-आईजीजीयू बीपी-एचआरपी) (1: 5,000) कमरे के तापमान पर आंदोलन के साथ 1 घंटे के लिए।
- फिर, पीवीडीएफ झिल्ली को टीबीएस-टी के साथ पांच बार धोएं, और एक केमिलुमिनेसेंस डिटेक्शन अभिकर्मक का उपयोग करके चार्ज-युग्मित (सीसीडी) इमेजर में झिल्ली की कल्पना करें। इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रोटीन के अभिव्यक्ति स्तर का विश्लेषण करें। सबसे पहले, छवि फ़ाइल को इमेजजे (फाइल ) में खोलें। खुला ...)। चमक और कंट्रास्ट को समायोजित करके छवि की गुणवत्ता बढ़ाएं (छवि | समायोजित करें | चमक / कंट्रास्ट)। छवि को तब तक समायोजित करें जब तक कि धब्बे स्पष्ट रूप से दिखाई न दें, लागू करें बटन पर क्लिक करें , और फिर छवियों को टीआईएफएफ प्रारूप में सहेजें (फ़ाइल | इस रूप में सहेजें | TIFF...)।
- ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप
- फ़िल्टर किए गए पीबीएस के चार भागों के साथ एचयूसी-एमएससी-एसईवी नमूने के एक हिस्से को 10 μL की कुल मात्रा में पतला करें और 15 मिनट के लिए कार्बन-लेपित तांबा ग्रिड पर इनक्यूबेट करें।
- प्रयोगशाला पोंछे का उपयोग करके अतिरिक्त नमूने को हटा दें और इसे 3 मिनट के लिए हवा में सूखने दें।
- नमूने को 3 मिनट के लिए दागने के लिए 1% फॉस्फोटुंगस्टिक एसिड (पीटीए) समाधान के 10 μL को इनक्यूबेट करें।
- प्रयोगशाला पोंछे का उपयोग करके अतिरिक्त 1% पीटीए समाधान निकालें और इसे 3 मिनट के लिए हवा में सूखने दें।
- ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप इमेजिंग के लिए नमूने का उपयोग करें।
नोट: संक्षेप में योजनाबद्ध प्रयोग चरणों के लिए चित्रा 1 देखें।
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Representative Results
चित्र 2 से पता चलता है कि एचयूसी-एमएससी-एसईवी में 53 एनएम पर एक कण आकार मोड है, जबकि कण आकार की अन्य महत्वपूर्ण चोटियां 96 और 115 एनएम थीं। एनटीए द्वारा मापा गया एचयूसी-एमएससी-एसईवी की सांद्रता 7.75 × 1010 कण / एमएल थी। बीसीए परख के साथ मापा गया एचयूसी-एमएससी-एसईवी की प्रोटीन एकाग्रता लगभग 80 μg / mL थी।
पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण में, एचयूसी-एमएससी-एसईवी ने एक्सोसोमल मार्कर सीडी 9, सीडी 81 और टीएसजी 101 के लिए सकारात्मक बैंड का प्रदर्शन किया, लेकिन जीआरपी 94 (चित्रा 3) के लिए नकारात्मक थे। जीआरपी 94 एक एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम मार्कर है जिसे आमतौर पर एसईवी के लिए नकारात्मक मार्कर के रूप में उपयोग किया जाता है। पृथक एचयूसी-एमएससी-एसईवी को उनके आकार और आकृति विज्ञान को निर्धारित करने के लिए टीईएम के तहत कल्पना की गई थी। एचयूसी-एमएससी-एसईवी का आकार ~ 100 एनएम था और एक कप जैसी बाईलेयर झिल्ली संरचना दिखाई गई (चित्रा 4)।
चित्रा 1: एसईवी के अलगाव, सफाई और लक्षण वर्णन के योजनाबद्ध कार्य। वातानुकूलित माध्यम एमएससी संस्कृति से एकत्र किया गया था और बड़े कणों को हटाने के लिए 0.22 μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किया गया था। फ़िल्टर किए गए माध्यम को सेवी को केंद्रित करने के लिए एक केन्द्रापसारक फ़िल्टर इकाई में स्थानांतरित किया गया था और केंद्रित एसईवी को इकट्ठा करने के लिए रिवर्स-सेंट्रीफ्यूज किया गया था। केंद्रित एसईवी को तब ठंडे, फ़िल्टर किए गए पीबीएस के साथ फिर से निलंबित कर दिया गया था, और चरणों को धोने के चरणों के लिए केन्द्रापसारक फ़िल्टर इकाई के साथ दोहराया गया था। अंत में, नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण, पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके विशेषता होने से पहले एसईवी को 0.22 μm निस्पंदन द्वारा निष्फल किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: पृथक एचयूसी-एमएससी-एसईवी का नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण। एचयूसी-एमएससी-एसईवी को स्पष्ट पीबीएस के साथ 100-1,000 एक्स पतला किया गया था और सीएमओएस कैमरा, 20 एक्स ऑब्जेक्टिव लेंस, ब्लू लेजर मॉड्यूल (488 एनएम) और एनटीए सॉफ्टवेयर से लैस नैनोसाइट एनएस 300 का उपयोग करके मापा गया था। यह आंकड़ा तीन प्रतियों में एनटीए का प्रतिनिधित्व करता है। संक्षेप: एचयूसी-एमएससी-एसईवी = मानव गर्भनाल-व्युत्पन्न एमएससी छोटे बाह्य पुटिका; एनटीए = नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण; CMOS = पूरक धातु-ऑक्साइड अर्धचालक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: एचयूसी-एमएससी-एसईवी की बायोमार्कर अभिव्यक्ति(ए) सीडी 9 एक्सोसोमल पॉजिटिव मार्कर का पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। (बी) सीडी 81 एक्सोसोमल पॉजिटिव मार्कर का पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। (सी) टीएसजी 101 एक्सोसोमल पॉजिटिव मार्कर का पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। (डी) जीआरपी 94 नकारात्मक मार्कर का पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। सभी चार मार्करों की तुलना एक नियंत्रण के रूप में सेल लाइसेट के साथ की गई थी। बाएं से दाएं, सीढ़ी, सेल लाइसेट, एचयूसी-एमएससी-एसईवी (ए, बी); सीढ़ी, एचयूसी-एमएससी-एसईवी, सेल लाइसेट, एचयूसी-एमएससी-एसईवी, सेल लाइसेट (सी); सीढ़ी, सेल लाइसेट, एचयूसी-एमएससी-एसईवी (डी)। सेल लाइसेट जोड़े दो प्रतिकृतियों से हैं, और ये छवियां तीन प्रतियों में किए गए प्रयोगों से प्रतिनिधि छवियां हैं। संक्षिप्त नाम: एचयूसी-एमएससी-एसईवी = मानव गर्भनाल-व्युत्पन्न एमएससी छोटे बाह्य पुटिकाओं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के तहत एकल एचयूसी-एमएससी-एसईवी की आकृति विज्ञान। एचयूसी-एमएससी-एसईवी को कार्बन-लेपित तांबा ग्रिड पर इनक्यूबेट किया गया था और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत देखे जाने से पहले 1% फॉस्फोटंगस्टिक एसिड से सना हुआ था। एचयूसी-एमएससी-एसईवी, जिसका आकार लगभग 100 एनएम था, ने एक कप जैसी बाईलेयर झिल्ली संरचना दिखाई। स्केल बार = 100 एनएम। छवि तीन स्वतंत्र कैप्चर का प्रतिनिधि है। संक्षिप्त नाम: एचयूसी-एमएससी-एसईवी = मानव गर्भनाल-व्युत्पन्न एमएससी छोटे बाह्य पुटिकाओं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
ईवी एमएससी में स्राव के महत्वपूर्ण उपसमुच्चय में से एक हैं जो सामान्य और रोग प्रक्रियाओं के दौरान महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हालांकि, 30 से 200 एनएम के बीच आकार सीमा वाले एसईवी, पिछले दशक में सेल-मुक्त चिकित्सा के लिए एक संभावित उपकरण के रूप में उभरे हैं। एमएससी से एसईवी को अलग करने के लिए विभिन्न तकनीकों का विकास किया गया था। हालांकि, अंतर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन, अल्ट्राफिल्ट्रेशन, बहुलक-आधारित वर्षा, इम्यूनोफिनिटी कैप्चर, और माइक्रोफ्लुइडिक्स-आधारित वर्षा के अलग-अलग फायदे और नुकसानहैं। इनमें से कोई भी अलगाव तकनीक उच्च वसूली दर और विशिष्टता प्राप्त नहीं कर सकती है। इस प्रकार, शोधकर्ताओं को उच्च वसूली दर या उच्च विशिष्टता के आधार पर अपनी प्राथमिकताओं के अनुसार उपयुक्त तरीकों का चयन करना चाहिए।
एमएससी एसईवी के अलगाव से पहले, एमएससी का मूल्यांकन प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा सकारात्मक सतह मार्करों (सीडी 90, सीडी 105, सीडी 73) और नकारात्मक मार्करों (सीडी 34, सीडी 11 बी, सीडी 1 9, सीडी 45 और एचएलए-डीआर) के लिए किया गयाथा। एसईवी के इस अध्ययन का तकनीकी लाभ वर्तमान स्थिति का समाधान प्रदान कर सकता है। एसईवी को अलग करने के लिए उच्च अंत उपकरणों का उपयोग करने से बचने के लिए केवल प्रयोगशाला में एक बुनियादी बेंचटॉप स्थापित करने की आवश्यकता होती है। एमएससी को किसी भी सीरम को जोड़े बिना वर्णित प्रोटोकॉल में संस्कृति मीडिया के साथ भूखा रखा गया था। यह सीरम पूरकता से उत्पन्न ईवी के किसी भी संदूषण को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, यह देखते हुए कि कुछ मामलों में सीरम की खुराक अपरिहार्य है, एक्सोसोम-क्षीण सीरम की खुराक को पूर्ण संस्कृति मीडिया तैयार करने में माना जा सकता है। इसके अलावा, फिनोल लाल-मुक्त मीडिया का उपयोग मानक संस्कृति मीडिया के विकल्प के रूप में किया जा सकता है क्योंकि यह सामान्य पीएच संकेतक संभावित रूप से वर्णमिति माप15 के साथ समस्याएं पैदा कर सकता है। प्रोटोकॉल को 220 एनएम से बड़े कणों को हटाने के दौरान पारंपरिक सिरिंज फिल्टर के बजाय 0.22 μm पंप फ़िल्टर का उपयोग करके सुधार किया जा सकता है। एसईवी की उपज में सुधार के लिए सावधानी बरतनी चाहिए। केन्द्रापसारक फिल्टर इकाई के माध्यम से सीएम के अंतिम सेंट्रीफ्यूजेशन में, लंबे समय तक सेंट्रीफ्यूजेशन से बचा जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि फिल्टर से एसईवी को निकालने के लिए पर्याप्त मात्रा में समाधान है। इसे अनदेखा करने से रिवर्स-सेंट्रीफ्यूजेशन चरण के दौरान एकत्र किए गए एसईवी की उपज कम हो सकती है।
यह प्रोटोकॉल प्रयोगशाला पैमाने तक सीमित है और, इस तरह, उद्योग में बड़े पैमाने पर अलगाव के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है। यह एक केन्द्रापसारक फिल्टर इकाई के एक बार के उपयोग की उच्च लागत के कारण है, जो बड़े पैमाने पर अलगाव के लिए संभव नहीं है, जिसमें आम तौर पर हजारों लीटर सीएम तक की मात्रा शामिल होती है। सारांश में, हम एमएससी से प्राप्त एसईवी को अलग करने के लिए एक सरल, बेंचटॉप-स्केल निस्पंदन प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। यह प्रोटोकॉल आगे डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए पृथक एसईवी को शुद्ध करने के लिए भी उपयुक्त है। यद्यपि यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से एमएससी से प्राप्त एसईवी के लिए डिज़ाइन किया गया है, वर्णित प्रोटोकॉल के एक हिस्से का उपयोग विभिन्न स्रोतों, जैसे शरीर के तरल पदार्थ, सेल लाइनों या अन्य तरल-प्रकार के स्रोतों से एसईवी को अलग करने के लिए किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
इस वीडियो के प्रकाशन को My CytoHealth Sdn. Bhd द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Nacalai Tesque | 06121-95 | Western blot |
| 95% ethanol | Nacalai Tesque | 14710-25 | Disinfectants |
| Absolute Methanol | Chemiz | 45081 | To activate PVDF membrane (Western blot) |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell dissociation enzyme |
| ammonium persulfate | Chemiz | 14475 | catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis |
| anti-CD 81 (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | Antibody for sEVs marker |
| anti-TSG 101 (C-2) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7964 | Antibody for sEVs marker |
| Bovine serum albumin | Nacalai Tesque | 00653-31 | PVDF membrane blocking |
| bromophenol blue | Nacalai Tesque | 05808-61 | electrophoretic color marker |
| Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL) | Millipore | UFC710008 | sEVs isolation |
| ChemiLumi One L | Nacalai Tesque | 7880 | chemiluminescence detection reagent |
| CryoStor Freezing Media | Sigma-Aldrich | C3124-100ML | Cell cryopreserve |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Nacalai Tesque | 08458-45 | Cell culture media |
| ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker | SMOBIO | PM2610 | Protein molecular weight markers |
| Extra thick blotting paper | ATTO | buffer reservior (Western blot) | |
| Glycerol | Merck | G5516 | Chemicals for western blot |
| Glycine | 1st Base | BIO-2085-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP) | Santa Cruz Biotechnology | sc-516102 | Secondary antibody (Western Blot) |
| Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia | ||
| mouse antibodies anti-CD 9 (C-4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13118 | Antibody for sEVs marker |
| Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2 | Malvern Panalytical, UK | ||
| paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 02890-45 | Sample Fixation during TEM |
| penicillin–streptomycin | Nacalai Tesque | 26253-84 | Antibiotic for media |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Nacalai Tesque | 27327-81 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Washing, sample dilution |
| polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size |
ATTO | To hold protein during protein transfer (Western blot) | |
| protease inhibitor cocktail | Nacalai Tesque | 25955-11 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| Protein Assay Bicinchoninate Kit | Nacalai Tesque | 06385-00 | Protein measurement |
| sample buffer solution with 2-ME | Nacalai Tesque | 30566-22 | Reducing agent for western blot |
| sodium chloride | Nacalai Tesque | 15266-64 | Chemicals for western blot |
| sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31606-62 | ionic surfactant during gel electrophoresis |
| Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope | FEI, USA | ||
| tetramethylethylenediamine | Nacalai Tesque | 33401-72 | chemicals to prepare gel |
| tris-base | 1st Base | BIO-1400-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| Tween 20 | GeneTex | GTX30962 | Chemicals for western blot |
| UVP (Ultra Vision Product) CCD imager | CCD imager for western blot signal detection |
References
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