一种简易台式过滤法从人源间充质干细胞分离小细胞外囊泡

摘要

本方案展示了如何在简单的实验室台式条件下分离人脐带来源的间充质干细胞小细胞外囊泡（hUC-MSC-sEVs）。通过纳米颗粒追踪分析、BCA蛋白定量检测、蛋白质印迹以及透射电子显微镜，分别对分离得到的hUC-MSC-sEVs的粒径分布、蛋白浓度、sEVs标志物及形态进行表征。

摘要

基于超速离心的方法被认为是分离小细胞外囊泡（sEVs）的常用方法。然而，该分离方法的得率相对较低，且在分离sEV亚型方面效率不高。本研究展示了一种简单的台式过滤方法，用于分离人脐带来源的间充质干细胞小细胞外囊泡（hUC-MSC-sEVs），通过超滤法从hUC-MSCs的条件培养基中成功分离出sEVs。采用纳米颗粒追踪分析、BCA蛋白定量、蛋白质印迹以及透射电子显微镜分别对所分离的hUC-MSC-sEVs的粒径分布、蛋白浓度、外泌体标志物（CD9、CD81、TSG101）及形态特征进行了表征。所分离的hUC-MSC-sEVs粒径为30–200 nm，颗粒浓度为7.75 × 10¹⁰ 个/mL，蛋白浓度为80 µg/mL。外泌体标志物CD9、CD81和TSG101均检测到阳性条带。本研究表明，hUC-MSC-sEVs可从hUC-MSCs条件培养基中成功分离，且表征结果显示所获得的产物符合2018年细胞外囊泡研究最低信息标准（MISEV 2018）的要求。

引言

根据 MISEV 2018 标准，小细胞外囊泡（sEVs）是不具有功能性细胞核的非复制性脂质双层颗粒，大小为 30–200 nm¹。间充质干细胞（MSC）来源的 sEVs 含有多种重要的信号分子，在组织再生中发挥关键作用，例如 microRNA、细胞因子或蛋白质。它们在再生医学和无细胞治疗领域正日益成为研究"热点"。大量研究表明，MSC 来源的 sEVs 在治疗多种疾病方面具有与 MSCs 相当的疗效，例如免疫调节^2,3,4,5、促进成骨⁶、糖尿病^7,8或血管再生^9,10。随着早期临床试验的推进，MSC 来源细胞外囊泡（MSCs-EVs）在临床转化过程中凸显出三个主要关键问题：囊泡的产量、囊泡的纯度（无细胞碎片及其他生物污染物如蛋白质和细胞因子），以及分离后囊泡磷脂双分子层膜的完整性。

方案

注意：有关本实验方案中使用的所有材料、设备和软件的详细信息，请参见材料表。

1. 人脐带间充质干细胞及其培养

1. 将hUC-MSCs以5 × 10³/cm²的接种密度接种于DMEM培养基中，培养基中添加8%人血小板裂解液和1%青霉素-链霉素溶液。在37 °C、5% CO₂条件下培养细胞。每3天更换一次培养基，以保证细胞正常生长。
2. 将细胞扩增至第5代，用于sEV的分离。
   ​注意：需要大量培养瓶才能获得较高产量的sEV（产量随细胞数量增加而增加）。

2. 人脐带间充质干细胞来源的小细胞外囊泡的分离

1. 当第5代细胞培养至70%-80%融合度时，更换为新鲜的无酚红DMEM培养基，添加1%青霉素-链霉素[条件培养基（CM）]。
   注意：仅使用基础培养基；避免使用胎牛血清（FBS）和人血小板裂解液补充剂，以防止外源性小细胞外囊泡（sEVs）污染。
2. 24 h后，以200 × g离心CM g 在4 °C下离心5分钟以去除细胞碎片。收集上清液，并通过0.22 µm滤膜过滤，以去除大于220 nm的颗粒。
3. ....

结果

图2 显示，hUC-MSC-sEVs 的粒子尺寸主峰为 53 nm，其他显著的粒子尺寸峰分别为 96 nm 和 115 nm。通过 NTA 测定的 hUC-MSC-sEVs 浓度为 7.75 × 10¹⁰ 粒子/mL。采用 BCA 法测定的 hUC-MSC-sEVs 蛋白质浓度约为 80 µg/mL。

在蛋白质印迹分析中，hUC-MSC-sEVs 对外泌体标志物 CD9、CD81 和 TSG101 呈阳性条带，但对 GRP94 呈阴性（图3）。GRP94 是一种内质网标志物，通常用作 sEVs 的阴性标志物。通过透射电子显微镜（TEM）观察分离得到的 hUC-MSC-sEVs，以确定其大小和形态。hUC-MSC-sEVs 大小约为 100 nm，呈杯状双层膜结构（图4）。

讨论

细胞外囊泡（EVs）是间充质干细胞（MSCs）分泌组中的一个重要亚群，在正常和病理过程中发挥关键作用。然而，在过去十年中，直径在30至200 nm之间的sEVs已逐渐成为无细胞治疗的一种潜在工具。目前已有多种技术用于从MSCs中分离sEVs。但是，差速超速离心法、超滤法、基于聚合物的沉淀法、免疫亲和捕获法以及基于微流控的分离法各自具有不同的优缺点¹⁷。这些分离技术中，尚无任何一种方法能够同时实现高回收率和高特异性。因此，研究人员必须根据自身需求，在高回收率或高特异性之间权衡，选择合适的方法。

在分离MSCs的sEVs之前，采用流式细胞术对MSCs进行表面标志物检测，包括阳性标志物（CD90、CD105、CD73）和阴性标志物（CD34、CD11b、CD19、CD45和HLA-DR），具体方法如前所述¹⁸。本研究在sEVs技术方面的优势可能为当前情况提供一种解决方案。该方法仅需实验室常规台面设备即可完成sEVs的分离，无需使用高端仪器。在所述方案中，MSCs采用无血清培养基进行饥饿处理，这.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
40% 丙烯酰胺	Nacalai Tesque	06121-95	蛋白质印迹法
95% 乙醇	Nacalai Tesque	14710-25	消毒剂
绝对甲醇	Chemiz	45081	活化PVDF膜（Western blot）
Accutase	STEMCELL Technologies	7920	细胞解离酶
过硫酸铵	Chemiz	14475	催化凝胶聚合（凝胶电泳）
抗 CD81（B-11）	Santa Cruz Biotechnology	sc-166029	sEVs标志物抗体
抗TSG101（C-2）	Santa Cruz Biotechnology	sc-7964	sEVs标志物抗体
牛血清白蛋白	Nacalai Tesque	00653-31	PVDF膜封闭
溴酚蓝	Nacalai Tesque	05808-61	电泳彩色标记物
Centricon Plus-70（100 kDa NMWL）	Millipore	UFC710008	sEVs 分离
ChemiLumi One L	Nacalai Tesque	7880	化学发光检测试剂
CryoStor 冻存培养基	Sigma-Aldrich	C3124-100ML	细胞冻存
杜尔贝科’s 改良伊格尔’s 培养基	Nacalai Tesque	08458-45	细胞培养基
ExcelBand增强型三色高分子量蛋白Marker	SMOBIO	PM2610	蛋白质分子量标准品
超厚印迹滤纸	ATTO		缓冲液储液槽（Western blot）
甘油	默克	G5516	Western blot 化学试剂
甘氨酸	1st Base	BIO-2085-500g	缓冲液（Western Blot）用化学品
辣根过氧化物酶标记的小鼠 IgG kappa 结合蛋白（m-IgG）κBP-HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-516102	二抗（Western Blot）
人类华通胶’源自果冻状物质的间充质干细胞（MSCs）	马来西亚国民大学医学院组织工程与再生医学中心
小鼠抗-CD9抗体（C-4）	Santa Cruz Biotechnology	sc-13118	sEVs 标志物抗体
配备CMOS相机和20 mW 488 nm激光器的Nanosight NS300 × 物镜，蓝色激光模块（488 纳米米），NTA 软件 v3.2	英国马尔文帕纳科
甲醛	Nacalai Tesque	02890-45	透射电镜样品固定
青霉素–链霉素	Nacalai Tesque	26253-84	培养基用抗生素
苯甲基磺酰氟	Nacalai Tesque	27327-81	在加入裂解缓冲液后抑制sEVs样本中的蛋白酶活性
磷酸盐缓冲液	Gibco	10010023	洗涤，样品稀释
聚偏二氟乙烯（PVDF）膜 0.45 mm 孔径	ATTO		用于蛋白质转膜（Western blot）过程中固定蛋白质
蛋白酶抑制剂混合物	Nacalai Tesque	25955-11	在sEVs样本中加入裂解缓冲液后，抑制蛋白酶活性
蛋白定量BCA试剂盒	Nacalai Tesque	06385-00	蛋白质浓度测定
含2-ME的样品缓冲液	Nacalai Tesque	30566-22	Western blot 还原剂
氯化钠	Nacalai Tesque	15266-64	Western blot 试剂
十二烷基硫酸钠	Nacalai Tesque	31606-62	凝胶电泳中的离子型表面活性剂
Tecnai G2 F20 S-TWIN 透射电子显微镜	FEI，美国
四甲基乙二胺	Nacalai Tesque	33401-72	制备凝胶所用化学品
tris碱	1st Base	BIO-1400-500g	缓冲液（Western Blot）用化学品
Tween 20	GeneTex	GTX30962	Western 印迹试剂
UVP（Ultra Vision Product）CCD 成像仪			用于 Western 印迹信号检测的 CCD 成像仪