Summary
Этот протокол демонстрирует, как изолировать небольшие внеклеточные везикулы мезенхимальных стволовых клеток, полученных из пуповины человека (hUC-MSC-sEVs), с помощью простой лабораторной настольной настройки. Распределение по размерам, концентрация белка, маркеры sEVs и морфология изолированных hUC-MSC-sEV характеризуются анализом отслеживания наночастиц, анализом белка BCA, вестерн-блоттингом и просвечивающим электронным микроскопом соответственно.
Abstract
Процесс, основанный на ультрацентрифугировании, считается распространенным методом выделения малых внеклеточных везикул (sEV). Однако выход от этого метода изоляции относительно ниже, и эти методы неэффективны при разделении подтипов sEV. Это исследование демонстрирует простой метод настольной фильтрации для выделения малых внеклеточных везикул МСК, полученных из пуповины человека (hUC-MSC-sEVs), успешно отделенных ультрафильтрацией от кондиционированной среды hUC-MSCs. Распределение по размерам, концентрация белка, экзосомальные маркеры (CD9, CD81, TSG101) и морфология выделенных hUC-MSC-sEV были охарактеризованы с помощью анализа отслеживания наночастиц, анализа белка BCA, вестерн-блоттинга и просвечивающего электронного микроскопа соответственно. Размер изолированных hUC-MSC-sEV составлял 30-200 нм, с концентрацией частиц 7,75 × 10 частиц /мл и концентрацией белка 80 мкг / мл. Наблюдались положительные полосы для экзосомальных маркеров CD9, CD81 и TSG101. Это исследование показало, что hUC-MSC-sEV были успешно выделены из кондиционированной среды hUC-MSCs, а характеристика показала, что выделенный продукт соответствует критериям, указанным в Минимальная информация для исследований внеклеточных везикул 2018 (MISEV 2018).
Introduction
Согласно MISEV 2018, sEV представляют собой нереплицирующиеся липидные бислойные частицы без функционального ядра размером 30-200нм 1. sEV, полученные из MSC, содержат важные сигнальные молекулы, которые играют важную роль в регенерации тканей, такие как микроРНК, цитокины или белки. Они все чаще становятся исследовательской «горячей точкой» в области регенеративной медицины и бесклеточной терапии. Многие исследования показали, что sEV, полученные из МСК, так же эффективны, как и МСК, при лечении различных состояний, таких как иммуномодуляция 2,3,4,5, усиление остеогенеза 6, сахарный диабет 7,8 или регенерация сосудов 9,10. По мере продвижения исследований на ранней стадии были выделены три основных ключевых вопроса, связанных с клинической трансляцией МСК-ЭВ: выход ВВ, чистота ВВ (свободные от клеточного мусора и других биологических загрязнителей, таких как белок и цитокины) и целостность фосфолипидной двухслойной мембраны ВВ после выделения.
Были разработаны различные методы выделения sEV с использованием плотности, формы, размера и поверхностного белка sEVs11. Двумя наиболее распространенными методами изоляции электромобилей являются методы на основе ультрацентрифугирования и ультрафильтрации.
Методы, основанные на ультрацентрифугировании, считаются золотым стандартом при выделении электромобилей. Два типа методов ультрацентрифугирования, которые обычно используются, - это дифференциальное ультрацентрифугирование и ультрацентрифугирование с градиентом плотности. Однако методы ультрацентрифугирования часто приводят к низкому выходу и требуют дорогостоящего оборудования для высокоскоростной ультрацентрифуги (100 000-200 000 × г)11. Кроме того, методы ультрацентрифугирования сами по себе неэффективны при разделении подтипов EV (sEV и больших EV), что приводит к образованию нечистого слояосадка 11. Наконец, ультрацентрифугирование градиента плотности также может занимать много времени и требовать дополнительных мер предосторожности, таких как добавление буфера сахарозы, чтобы предотвратить повреждение градиента на этапах12 ускорения и замедления. Следовательно, ультрацентрифугирование обычно приводит к относительно низкому выходу и не способно различать различные популяции ЭВ13, что ограничивает его применение для крупномасштабной подготовкиЭВ 11.
Второй метод изоляции электромобилей - это ультрафильтрация, основанная на фильтрации по размеру. Ультрафильтрация относительно эффективна по времени и затратам по сравнению с ультрацентрифугированием, поскольку она не требует дорогостоящего оборудования или длительного времени обработки14. Следовательно, ультрафильтрация, по-видимому, является более эффективным методом изоляции, чем оба вышеупомянутых метода ультрацентрифугирования. Изолированные продукты могут быть более конкретными в зависимости от размеров пор и более высокого выхода15. Однако дополнительная сила, возникающая в процессе фильтрации, может привести к деформации или извержению EV16.
В настоящем документе предложен экономичный и эффективный по времени настольный протокол для выделения sEV, полученных из MSC, для последующего анализа и терапевтических целей. Метод, описанный в этой статье, сочетал в себе простой метод фильтрации с настольным центрифугированием для выделения высокопродуктивных и качественных EV из hUC-MSC для последующего анализа, включая анализ размера частиц, анализ биомаркеров и электронно-микроскопическую визуализацию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах, оборудовании и программном обеспечении, используемых в этом протоколе.
1. Мезенхимальные стволовые клетки пуповины человека и культура
- Культивируйте hUC-MSCs при плотности высева 5 × 103/см2 в DMEM, дополненный 8% лизатом тромбоцитов человека и 1% Pen-стрептококком. Инкубируйте клетки при 37 ° C в 5% CO2. Заменяйте среду для культивирования клеток каждые 3 дня, чтобы обеспечить правильный рост клеток.
- Расширьте ячейки до прохода 5 в колбах T175 для изоляции sEV.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения высокого выхода sEV требуется много колб (выход увеличивается с увеличением количества ячеек).
2. Выделение малых внеклеточных везикул из hUC - МСК
- Замените культуральную среду свежим ДМЭМ, не содержащим фенол-красного, с добавлением 1% Pen-Strep [кондиционированная среда (CM)], когда культура достигнет 70-80% слияния при прохождении 5.
ВНИМАНИЕ: Используйте только базальные среды; избегайте добавок FBS и лизата тромбоцитов человека, чтобы избежать загрязнения внешними sEV. - Через 24 ч центрифугируют КМ при 200 × г в течение 5 мин при 4 °С для удаления клеточного мусора. Соберите и отфильтруйте надосадочную жидкость через фильтр 0,22 мкм для удаления частиц размером более 220 нм.
- Заполните центробежный фильтрующий блок 30 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), отфильтрованного через фильтр 0,2 мкм. Центрифугу центробежного фильтрующего блока при 3 500 × г в течение 5 мин при 4 °C.
- Залейте отфильтрованный CM в центробежный фильтрующий блок (максимальный объем каждого блока составляет 70 мл). Центрифугу КМ при 3 500 × г при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность центрифугирования следует контролировать время от времени, пока раствор не достигнет поверхности фильтра. - Вылейте раствор в чашку с раствором фильтрата. Обратная центрифуга пробоотборника с чашкой для сбора концентрата при 1 000 x g при 4 °C в течение 2 мин.
- Переведите концентрированный CM обратно в центробежный фильтрующий блок. Добавьте 30 мл отфильтрованного PBS в центробежный фильтрующий блок и центрифугируйте установку при 3,500 × г при 4 °C.
- Вылейте раствор в чашку с раствором фильтрата. Установите чашку для сбора концентрата на фильтрующий блок и проведите реверсивную центрифугу при 1 000 × г в течение 2 мин при 4 ° C для получения очищенных электромобилей.
- Отфильтруйте sEV через шприцевой фильтр 0,22 мкм.
- Переложите образцы в новые пробирки и храните их при температуре -80 °C для дальнейшего анализа.
3. Характеристика hUC-MSC-sEV
- Анализ отслеживания наночастиц
- Разбавьте изолированные hUC-MSC-sEV в отфильтрованном PBS до 20-100 частиц в кадре.
- Введите 1 мл разбавленного образца в камеру NTA с помощью одноразовых шприцев объемом 1 мл.
- Установите соответствующие настройки измерения: отрегулируйте уровень камеры до уровня 14, определите порог обнаружения , чтобы включить как можно больше частиц с ограничением, что подсчитывается 10-100 красных крестов , а количество синих крестиков ограничено пятью.
- Для каждого измерения запишите пять видеороликов продолжительностью 1 минута и проанализируйте их с помощью программного обеспечения NanoSight с порогом обнаружения пять.
- Сделайте измерения в трех экземплярах для каждого образца.
- Анализ вестерн-блоттинга
- Лизируют hUC-MSC-sEV с помощью ледяного буфера для лизиса методом радиоиммунопреципитации (RIPA), инкубируют в течение 30 мин при 4 °C и центрифугу при 200 × г в течение 5 мин при 4 °C. Соберите надосадочную жидкость.
- Количественно определите белок с помощью набора для анализа белка бицинхониновой кислоты (BCA). Соберите набор для гель-электрофореза соответствующим образом и выполняйте гель-электрофорез при 90 В, пока белок не достигнет конца геля для укладки. Измените напряжение на 200 В, чтобы отделить белки до конца рассасывающегося геля.
- Выполняйте полусухой перенос для переноса белков из геля в мембрану из поливинилидендифторида (PVDF) при 15 В в течение 1 ч.
- Заблокируйте мембрану PVDF 3% бычьим сывороточным альбумином (BSA)/трис-буферным физиологическим раствором-0,1% v/v Tween 20 (TBS-T) в течение 1 ч на шейкере при комнатной температуре. Инкубируют мембрану PVDF с первичными антителами следующим образом: моноклональное антитело мыши против CD 9 (1:500), моноклональное антитело против CD 81 мыши (1:500), моноклональное антитело мыши против GRP 94 моноклональное антитело мыши против TSG 101 (1:500) при 4 ° C в течение ночи с постоянным встряхиванием.
- На следующий день мембрану PVDF промывают 5 х 5 мин TBS-T и далее инкубируют с вторичным антителом: конъюгированным с пероксидазой хрена мышиным каппа-белком (m-IgGκ BP-HRP) (1:5000) в течение 1 ч с перемешиванием при комнатной температуре.
- Опять же, промойте мембрану PVDF TBS-T пять раз и визуализируйте мембрану в тепловизоре с зарядовой связью (CCD) с помощью реагента для обнаружения хемилюминесценции. Проанализируйте уровень экспрессии белков с помощью программного обеспечения ImageJ. Сначала откройте файл изображения в ImageJ (File | Открыть...). Повысьте качество изображения, отрегулировав яркость и контрастность (Изображение | Отрегулируйте | Яркость/контрастность). Отрегулируйте изображение до тех пор, пока кляксы не станут хорошо видны, нажмите кнопку «Применить », а затем сохраните изображения в формате TIFF (Файл | Сохранить как | ТИФФ...).
- Просвечивающий электронный микроскоп
- Разбавьте одну часть образца hUC-MSC-sEVs четырьмя частями отфильтрованного PBS до общего объема 10 мкл и инкубируйте на медной сетке с углеродным покрытием в течение 15 мин.
- Удалите излишки образца с помощью лабораторной салфетки и дайте ему высохнуть на воздухе в течение 3 минут.
- Инкубировать 10 мкл 1% раствора фосфовольфрамовой кислоты (ПТА) для окрашивания образца в течение 3 мин.
- Удалите излишки 1% раствора PTA с помощью лабораторной салфетки и дайте ему высохнуть на воздухе в течение 3 минут.
- Используйте образец для визуализации просвечивающим электронным микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 приведены обобщенные этапы схематического эксперимента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 2 показано, что hUC-MSC-sEV имеют режим размера частиц на длине волны 53 нм, в то время как другие значимые пики размера частиц составляли 96 и 115 нм. Концентрация hUC-MSC-sEV, измеренная NTA, составляла 7,75 × 10 частиц /мл . Концентрация белка hUC-MSC-sEV, измеренная с помощью анализа BCA, составляла приблизительно 80 мкг / мл.
При анализе вестерн-блоттинга hUC-MSC-sEV продемонстрировали положительные полосы для экзосомальных маркеров CD9, CD81 и TSG101, но были отрицательными для GRP94 (рис. 3). GRP94 является маркером эндоплазматического ретикулума, обычно используемым в качестве отрицательного маркера для sEV. Изолированные hUC-MSC-sEV визуализировали в рамках ПЭМ для определения их размера и морфологии. hUC-MSCs-sEVs размером ~ 100 нм и демонстрировали чашеобразную двухслойную мембранную структуру (рис. 4).
Рисунок 1: Рабочая схема изоляции, очистки и определения характеристик электромобилей. Кондиционированную среду собирали из культуры МСК и фильтровали через фильтр 0,22 мкм для удаления крупных частиц. Отфильтрованная среда была передана в центробежную фильтрующую установку для концентрирования sEV и обратного центрифугирования для сбора концентрированных sEV. Затем концентрированные sEV ресуспендировали с помощью холодного отфильтрованного PBS, и этапы повторяли с центробежным фильтрующим блоком для этапов промывки. Наконец, sEV стерилизовали фильтрацией 0,22 мкм, а затем охарактеризовали с помощью анализа отслеживания наночастиц, анализа вестерн-блоттинга и просвечивающей электронной микроскопии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Анализ отслеживания наночастиц изолированных hUC-MSC-sEV. hUC-MSC-sEV были в 100-1000 раз разбавлены осветленным PBS и измерены с помощью Nanosight NS300, оснащенного CMOS-камерой, 20-кратным объективом, синим лазерным модулем (488 нм) и программным обеспечением NTA. Рисунок представляет собой представление NTA в трех экземплярах. Сокращения: hUC-MSC-sEVs = малые внеклеточные везикулы МСК, полученные из пуповины человека; NTA = анализ отслеживания наночастиц; КМОП = комплементарный металл-оксидный полупроводник. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Экспрессия биомаркеров hUC-MSC-sEVs . (A) Вестерн-блоттинг-анализ экзосомального положительного маркера CD9. (B) Вестерн-блоттинг-анализ экзосомального положительного маркера CD81. (C) Вестерн-блоттинг-анализ экзосомального положительного маркера TSG101. (D) Вестерн-блоттинг-анализ отрицательного маркера GRP94. Все четыре маркера сравнивали с клеточным лизатом в качестве контроля. Слева направо: лестница, клеточный лизат, hUC-MSC-sEVs (A, B); Лестница, hUC-MSC-sEVs, клеточный лизат, hUC-MSC-sEVs, клеточный лизат (C); Лестница, клеточный лизат, hUC-MSC-sEVs (D). Пары клеточного лизата взяты из двух реплик, и эти изображения являются репрезентативными изображениями из экспериментов, проведенных в трех экземплярах. Аббревиатура: hUC-MSC-sEVs = малые внеклеточные везикулы МСК, полученные из пуповины человека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Морфология одиночных hUC-MSC-sEV при просвечивающей электронной микроскопии. hUC-MSC-sEV инкубировали на медной сетке с углеродным покрытием и окрашивали 1% фосфовольфрамовой кислотой перед просмотром под просвечивающим электронным микроскопом. hUC-MSC-sEV размером около 100 нм показали чашеобразную двухслойную мембранную структуру. Масштабная линейка = 100 нм. Изображение является представителем трех независимых снимков. Аббревиатура: hUC-MSC-sEVs = малые внеклеточные везикулы МСК, полученные из пуповины человека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ЭВ являются одним из важных подмножеств секретома в МСК, которые играют решающую роль во время нормальных и патологических процессов. Тем не менее, в последнее десятилетие sEV с диапазоном размеров от 30 до 200 нм стали потенциальным инструментом для бесклеточной терапии. Были разработаны различные методы для выделения sEV из MSC. Однако дифференциальное ультрацентрифугирование, ультрафильтрация, осаждение на основе полимеров, иммуноаффинный захват и осаждение на основе микрофлюидики обладают различными преимуществами и недостатками17. Ни один из этих методов изоляции не может достичь высокой скорости восстановления и специфичности. Таким образом, исследователи должны выбрать подходящие методы в соответствии со своими предпочтениями, основанными на высокой скорости восстановления или высокой специфичности.
До выделения МСК sEV МСК оценивали на наличие положительных поверхностных маркеров (CD90, CD105, CD73) и отрицательных маркеров (CD34, CD11b, CD19, CD45 и HLA-DR) с помощью проточной цитометрии, как описано ранее18. Техническое преимущество этого исследования электромобилей может обеспечить решение текущей ситуации. Для этого требуется только базовая лабораторная установка, чтобы избежать использования высокотехнологичного оборудования для изоляции электромобилей. МСК голодали питательными средами в описанном протоколе без добавления сыворотки. Это имеет решающее значение для предотвращения любого загрязнения электромобилей, происходящих от сывороточных добавок. Однако, учитывая, что сывороточные добавки неизбежны в некоторых случаях, сывороточные добавки, обедненные экзосомами, могут быть рассмотрены при составлении полных питательных сред. Кроме того, в качестве замены стандартных культуральных сред можно использовать среды, не содержащие фенола, поскольку этот общий индикатор рН потенциально может вызвать проблемы с колориметрическими измерениями15. Протокол может быть улучшен за счет использования помпового фильтра 0,22 мкм вместо обычного шприцевого фильтра при удалении частиц размером более 220 нм. Следует принять меры предосторожности для повышения выхода sEV. При последнем центрифугировании CM через центробежный фильтрующий блок следует избегать длительного центрифугирования, чтобы обеспечить достаточный объем раствора для выведения sEV из фильтра. Игнорирование этого может привести к снижению выхода sEV, собранных на этапе обратного центрифугирования.
Этот протокол ограничен лабораторным масштабом и, как таковой, может не подходить для крупномасштабной изоляции в промышленности. Это связано с высокой стоимостью одноразового использования центробежного фильтрующего блока, что неосуществимо для крупномасштабной изоляции, которая обычно предполагает объем до тысячи литров СМ. Таким образом, мы предлагаем простой настольный протокол фильтрации для выделения sEV, полученных из MSC. Этот протокол также подходит для очистки изолированных электромобилей для дальнейшего последующего анализа. Несмотря на то, что этот протокол разработан специально для sEV, полученных из MSC, часть описанного протокола может быть использована для выделения sEV из различных источников, таких как жидкость организма, клеточные линии или другие источники жидкого типа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Публикация этого видео была поддержана My CytoHealth Sdn. Bhd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Nacalai Tesque | 06121-95 | Western blot |
| 95% ethanol | Nacalai Tesque | 14710-25 | Disinfectants |
| Absolute Methanol | Chemiz | 45081 | To activate PVDF membrane (Western blot) |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell dissociation enzyme |
| ammonium persulfate | Chemiz | 14475 | catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis |
| anti-CD 81 (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | Antibody for sEVs marker |
| anti-TSG 101 (C-2) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7964 | Antibody for sEVs marker |
| Bovine serum albumin | Nacalai Tesque | 00653-31 | PVDF membrane blocking |
| bromophenol blue | Nacalai Tesque | 05808-61 | electrophoretic color marker |
| Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL) | Millipore | UFC710008 | sEVs isolation |
| ChemiLumi One L | Nacalai Tesque | 7880 | chemiluminescence detection reagent |
| CryoStor Freezing Media | Sigma-Aldrich | C3124-100ML | Cell cryopreserve |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Nacalai Tesque | 08458-45 | Cell culture media |
| ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker | SMOBIO | PM2610 | Protein molecular weight markers |
| Extra thick blotting paper | ATTO | buffer reservior (Western blot) | |
| Glycerol | Merck | G5516 | Chemicals for western blot |
| Glycine | 1st Base | BIO-2085-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP) | Santa Cruz Biotechnology | sc-516102 | Secondary antibody (Western Blot) |
| Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia | ||
| mouse antibodies anti-CD 9 (C-4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13118 | Antibody for sEVs marker |
| Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2 | Malvern Panalytical, UK | ||
| paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 02890-45 | Sample Fixation during TEM |
| penicillin–streptomycin | Nacalai Tesque | 26253-84 | Antibiotic for media |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Nacalai Tesque | 27327-81 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Washing, sample dilution |
| polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size |
ATTO | To hold protein during protein transfer (Western blot) | |
| protease inhibitor cocktail | Nacalai Tesque | 25955-11 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| Protein Assay Bicinchoninate Kit | Nacalai Tesque | 06385-00 | Protein measurement |
| sample buffer solution with 2-ME | Nacalai Tesque | 30566-22 | Reducing agent for western blot |
| sodium chloride | Nacalai Tesque | 15266-64 | Chemicals for western blot |
| sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31606-62 | ionic surfactant during gel electrophoresis |
| Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope | FEI, USA | ||
| tetramethylethylenediamine | Nacalai Tesque | 33401-72 | chemicals to prepare gel |
| tris-base | 1st Base | BIO-1400-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| Tween 20 | GeneTex | GTX30962 | Chemicals for western blot |
| UVP (Ultra Vision Product) CCD imager | CCD imager for western blot signal detection |
References
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Jayabalan, N., et al. Cross talk between adipose tissue and placenta in obese and gestational diabetes mellitus pregnancies via exosomes. Frontiers in Endocrinology. 8, 239 (2017).
- Li, T., et al. Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis. Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).
- Wang, C., et al. Mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles induce ischemic neuroprotection by modulating leukocytes and specifically neutrophils. Stroke. 51 (6), 1825-1834 (2020).
- Wei, Y., et al. MSC-derived sEVs enhance patency and inhibit calcification of synthetic vascular grafts by immunomodulation in a rat model of hyperlipidemia. Biomaterials. 204, 13-24 (2019).
- Liu, W., et al. MSC-derived small extracellular vesicles overexpressing miR-20a promoted the osteointegration of porous titanium alloy by enhancing osteogenesis via targeting BAMBI. Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 1-16 (2021).
- Li, F. X. Z., et al. The role of mesenchymal stromal cells-derived small extracellular vesicles in diabetes and its chronic complications. Frontiers in Endocrinology. 12, 1741 (2021).
- Jayabalan, N., et al. Frontiers in Endocrinology. 8, Front Endocrinol. Lausanne. (2017).
- Wei, Y., et al. Biomaterials. 204, Biomaterials. 13-24 (2019).
- Du, W., et al. Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer. Biomaterials. 133, 70-81 (2017).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z.
- Nicolas, R. H., Goodwin, G. H. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V.
- Kırbaş, O. K., et al. Optimized isolation of extracellular vesicles from various organic sources using aqueous two-phase system. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
- Ev, B., Ms, K. Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 219, 396-405 (2015).
- Dragovic, R. A., et al. Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Methods. 87, San Diego, Calif. 64-74 (2015).
- Tan, K. L., et al. Benchtop isolation and characterisation of small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells. Molecular Biotechnology. 63 (9), 780-791 (2021).
