Summary
Questo protocollo dimostra come isolare le piccole vescicole extracellulari derivate dal cordone ombelicale umano (hUC-MSC-sEV) con una semplice impostazione da banco su scala di laboratorio. La distribuzione dimensionale, la concentrazione proteica, i marcatori sEVs e la morfologia degli hUC-MSC-sEV isolati sono caratterizzati rispettivamente dall'analisi del tracciamento delle nanoparticelle, dal saggio della proteina BCA, dal western blot e dal microscopio elettronico a trasmissione.
Abstract
Il processo basato sull'ultracentrifugazione è considerato il metodo comune per l'isolamento di piccole vescicole extracellulari (sEV). Tuttavia, la resa di questo metodo di isolamento è relativamente inferiore e questi metodi sono inefficienti nel separare i sottotipi sEV. Questo studio dimostra un semplice metodo di filtrazione da banco per isolare le piccole vescicole extracellulari MSC derivate dal cordone ombelicale umano (hUC-MSC-sEVs), separate con successo mediante ultrafiltrazione dal mezzo condizionato di hUC-MSC. La distribuzione dimensionale, la concentrazione proteica, i marcatori esosomici (CD9, CD81, TSG101) e la morfologia degli hUC-MSC-sEV isolati sono stati caratterizzati rispettivamente con analisi di tracciamento delle nanoparticelle, saggio della proteina BCA, western blot e microscopio elettronico a trasmissione. La dimensione degli hUC-MSC-sEV isolati era di 30-200 nm, con una concentrazione di particelle di 7,75 × 10 10 particelle/ml e una concentrazione proteica di80 μg/mL. Sono state osservate bande positive per i marcatori esosomici CD9, CD81 e TSG101. Questo studio ha dimostrato che gli hUC-MSC-sEV sono stati isolati con successo dal mezzo condizionato da hUC-MSCs e la caratterizzazione ha mostrato che il prodotto isolato soddisfaceva i criteri menzionati da Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV 2018).
Introduction
Secondo MISEV 2018, le sEV sono particelle lipidiche a doppio strato non replicanti senza nucleo funzionale presente, con una dimensione di 30-200 nm1. Le sEV derivate da MSC contengono importanti molecole di segnalazione che svolgono un ruolo importante nella rigenerazione dei tessuti, come microRNA, citochine o proteine. Sono diventati sempre più un "hotspot" di ricerca nella medicina rigenerativa e nella terapia cell-free. Molti studi hanno dimostrato che le sEV derivate da MSC sono efficaci quanto le MSC nel trattamento di diverse condizioni, come l'immunomodulazione 2,3,4,5, il miglioramento dell'osteogenesi 6, il diabete mellito7,8 o la rigenerazione vascolare 9,10. Con il progredire degli studi di fase iniziale, sono state evidenziate tre questioni chiave principali in relazione alla traduzione clinica delle MSC-EV: la resa delle EV, la purezza delle EV (esenti da detriti cellulari e altri contaminanti biologici come proteine e citochine) e l'integrità della membrana fosfolipidica a doppio strato delle EV dopo l'isolamento.
Sono stati sviluppati vari metodi per isolare i sEV, sfruttando la densità, la forma, le dimensioni e le proteine di superficie dei sEV11. I due metodi più comuni nell'isolamento dei veicoli elettrici sono tecniche basate sull'ultracentrifugazione e sull'ultrafiltrazione.
I metodi basati sull'ultracentrifugazione sono considerati metodi gold standard nell'isolamento dei sEV. Due tipi di tecniche di ultracentrifugazione che vengono solitamente impiegate sono l'ultracentrifugazione differenziale e l'ultracentrifugazione a gradiente di densità. Tuttavia, i metodi di ultracentrifugazione spesso comportano una bassa resa e richiedono costose attrezzature per l'ultracentrifuga ad alta velocità (100.000-200.000 × g)11. Inoltre, le tecniche di ultracentrifugazione da sole sono inefficienti nel separare i sottotipi di EV (sEV e grandi EV), risultando in uno strato di sedimenti impuri11. Infine, l'ultracentrifugazione del gradiente di densità potrebbe anche richiedere molto tempo e richiedere ulteriori misure precauzionali come l'aggiunta di tampone di saccarosio per inibire il danno del gradiente durante le fasi di accelerazione e decelerazione12. Pertanto, l'ultracentrifugazione di solito porta a una resa relativamente bassa e non è in grado di discriminare tra diverse popolazioni di EV13, il che limita la sua applicazione per la preparazione di EV su larga scala11.
Il secondo metodo di isolamento EV è tramite ultrafiltrazione, che si basa sulla filtrazione dimensionale. L'ultrafiltrazione è relativamente efficiente in termini di tempo e costi rispetto all'ultracentrifugazione, in quanto non comporta attrezzature costose o lunghi tempi di lavorazione14. Quindi, l'ultrafiltrazione sembra essere una tecnica di isolamento più efficace di entrambi i suddetti metodi di ultracentrifugazione. I prodotti isolati possono essere più specifici in base alle dimensioni dei pori e alla maggiore resa15. Tuttavia, la forza aggiuntiva sostenuta durante il processo di filtrazione può provocare la deformazione o l'eruzione dei veicoli elettrici16.
Il presente documento ha proposto un protocollo da banco economico e tempestivo per isolare i sEV derivati da MSC per l'analisi a valle e scopi terapeutici. Il metodo descritto in questo documento ha combinato un semplice metodo di filtrazione con centrifugazione da banco per isolare EV ad alto rendimento e di buona qualità da hUC-MSC per l'analisi a valle, compresa l'analisi delle dimensioni delle particelle, il saggio dei biomarcatori e l'imaging al microscopio elettronico.
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Protocol
NOTA: vedere la tabella dei materiali per informazioni dettagliate su tutti i materiali, le attrezzature e il software utilizzati in questo protocollo.
1. Cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale umano e coltura
- Coltura delle hUC-MSC ad una densità di semina di 5 × 103/cm2 in DMEM, integrata con lisato piastrinico umano all'8% e penna strep all'1%. Incubare le cellule a 37 °C in 5% di CO2. Sostituire il terreno di coltura cellulare ogni 3 giorni per garantire una corretta crescita cellulare.
- Espandere le celle fino al passaggio 5 nei palloni T175 per l'isolamento sEV.
NOTA: Sono necessari molti palloni per raccogliere un'alta resa di sEV (la resa aumenta con il numero di celle).
2. Isolamento di piccole vescicole extracellulari da hUC - MSCs
- Sostituire il terreno di coltura con DMEM fresco privo di rosso fenolo integrato con 1% Pen-Strep [Terreno condizionato (CM)] quando la coltura raggiunge il 70% -80% di confluenza al passaggio 5.
ATTENZIONE: Utilizzare solo supporti basali; evitare FBS e integratori di lisato piastrinico umano per evitare la contaminazione da sEV esterni. - Dopo 24 ore, centrifugare il CM a 200 × g per 5 minuti a 4 °C per rimuovere i residui cellulari. Raccogliere e filtrare il surnatante attraverso un filtro da 0,22 μm per rimuovere particelle più grandi di 220 nm.
- Riempire l'unità filtrante centrifuga con 30 ml di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) filtrata attraverso un filtro da 0,2 μm. Centrifugare l'unità filtrante centrifuga a 3.500 × g per 5 minuti a 4 °C.
- Riempire il CM filtrato nell'unità filtrante centrifuga (il volume massimo di ciascuna unità è di 70 ml). Centrifugare il CM a 3.500 × g a 4 °C.
NOTA: La durata della centrifugazione deve essere monitorata di volta in volta fino a quando la soluzione non ha raggiunto la superficie del filtro. - Gettare la soluzione nella tazza della soluzione filtrata. Centrifugare inversamente il bicchiere filtrante del campione con il bicchiere di raccolta del concentrato a 1.000 x g a 4 °C per 2 minuti.
- Trasferire nuovamente la CM concentrata nell'unità filtrante centrifuga. Aggiungere 30 mL di PBS filtrato nell'unità filtrante centrifuga e centrifugare l'unità a 3.500 × g a 4 °C.
- Gettare la soluzione nella tazza della soluzione filtrata. Installare un bicchiere di raccolta del concentrato sull'unità filtrante e centrifugare inversamente a 1.000 × g per 2 minuti a 4 °C per ottenere i sEV purificati.
- Filtrare i sEV attraverso un filtro a siringa da 0,22 μm.
- Trasferire i campioni in nuove provette e conservarli a -80 °C per ulteriori analisi.
3. Caratterizzazione degli hUC-MSC-sEVs
- Analisi di tracciamento delle nanoparticelle
- Diluire gli hUC-MSC-sEV isolati in PBS filtrati a 20-100 particelle/frame.
- Introdurre 1 mL del campione diluito nella camera NTA utilizzando siringhe monouso da 1 ml.
- Impostare le impostazioni di misurazione di conseguenza: regolare il livello della telecamera al livello 14, determinare la soglia di rilevamento per includere il maggior numero possibile di particelle con la limitazione che vengano contate 10-100 croci rosse e il conteggio delle croci blu è limitato a cinque.
- Per ogni misurazione, registrare cinque video di 1 minuto e analizzarli utilizzando il software NanoSight con una soglia di rilevamento di cinque.
- Effettuare misurazioni in triplice copia per ogni campione.
- Analisi Western blotting
- Lisare gli hUC-MSC-sEV con tampone di lisi RIPA (ice-cold radioimmunoprecipitation assay), incubare per 30 min a 4 °C e centrifugare a 200 × g per 5 min a 4 °C. Raccogli il surnatante.
- Quantificare la proteina utilizzando un kit di dosaggio delle proteine dell'acido bicinconinico (BCA). Assemblare il set di elettroforesi su gel di conseguenza ed eseguire l'elettroforesi su gel a 90 V fino a quando la proteina raggiunge l'estremità del gel impilabile. Cambiare la tensione a 200 V per separare le proteine fino alla fine del gel risolutivo.
- Eseguire il trasferimento semisecco per trasferire le proteine dal gel a una membrana di polivinilidendifluoruro (PVDF) a 15 V per 1 ora.
- Bloccare la membrana PVDF con albumina sierica bovina al 3% (BSA)/soluzione salina tamponata Tris-0,1% v/v Tween 20 (TBS-T) per 1 ora su uno shaker a temperatura ambiente. Incubare la membrana PVDF con anticorpi primari come segue: anticorpo monoclonale anti-CD 9 di topo (1:500), anticorpo monoclonale anti-CD 81 di topo (1:500), anticorpo monoclonale di topo anti-GRP 94 monoclonale di topo anti-TSG 101 (1:500) a 4 °C durante la notte con agitazione costante.
- Il giorno successivo, lavare la membrana PVDF 5 x 5 min con TBS-T e incubare ulteriormente con un anticorpo secondario: proteina legante IgG kappa del topo coniugata con perossidasi di rafano (m-IgGκ BP-HRP) (1:5.000) per 1 ora agitazione a temperatura ambiente.
- Ancora una volta, lavare la membrana PVDF con TBS-T cinque volte e visualizzare la membrana in un imager ad accoppiamento di carica (CCD) utilizzando un reagente di rilevamento a chemiluminescenza. Analizzare il livello di espressione delle proteine utilizzando il software ImageJ. Innanzitutto, apri il file immagine in ImageJ (File | Aperto...). Migliorare la qualità dell'immagine regolando la luminosità e il contrasto (Immagine | Regola | Luminosità/Contrasto). Regolare l'immagine fino a quando le macchie sono chiaramente visibili, fare clic sul pulsante Applica , quindi salvare le immagini in formato TIFF (File | Salva con nome | TIFF...).
- Microscopio elettronico a trasmissione
- Diluire una parte del campione hUC-MSC-sEVs con quattro parti di PBS filtrato per un volume totale di 10 μL e incubare su una griglia di rame rivestita di carbonio per 15 minuti.
- Rimuovere il campione in eccesso con una salvietta da laboratorio e lasciarlo asciugare all'aria per 3 minuti.
- Incubare 10 μL di soluzione di acido fosfotungstico (PTA) all'1% per colorare il campione per 3 minuti.
- Rimuovere la soluzione di PTA all'1% in eccesso utilizzando una salvietta da laboratorio e lasciarla asciugare all'aria per 3 minuti.
- Utilizzare il campione per l'imaging al microscopio elettronico a trasmissione.
NOTA: fare riferimento alla Figura 1 per i passaggi schematici dell'esperimento riepilogati.
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Representative Results
La Figura 2 mostra che gli hUC-MSC-sEV hanno una modalità di dimensione delle particelle a 53 nm, mentre altri picchi significativi di dimensione delle particelle erano 96 e 115 nm. La concentrazione di hUC-MSC-sEV misurata da NTA era 7,75 × 1010 particelle/ml. La concentrazione proteica di hUC-MSC-sEVs misurata con il test BCA era di circa 80 μg/ml.
Nell'analisi western blotting, gli hUC-MSC-sEV hanno dimostrato bande positive per i marcatori esosomici CD9, CD81 e TSG101, ma erano negativi per GRP94 (Figura 3). GRP94 è un marcatore del reticolo endoplasmatico comunemente usato come marcatore negativo per i sEV. Gli hUC-MSC-sEV isolati sono stati visualizzati sotto TEM per determinarne le dimensioni e la morfologia. hUC-MSCs-sEVs dimensioni ~100 nm e ha mostrato una struttura a membrana a doppio strato simile a una coppa (Figura 4).
Figura 1: Schema di lavoro dell'isolamento, della pulizia e della caratterizzazione dei sEV. Il mezzo condizionato è stato raccolto dalla coltura MSC e filtrato attraverso un filtro da 0,22 μm per rimuovere particelle di grandi dimensioni. Il mezzo filtrato è stato trasferito in un'unità filtrante centrifuga per concentrare i sEV e centrifugato inverso per raccogliere i sEV concentrati. I sEV concentrati sono stati quindi risospesi con PBS filtrato a freddo e i passaggi sono stati ripetuti con un'unità filtrante centrifuga per le fasi di lavaggio. Infine, i sEV sono stati sterilizzati mediante filtrazione da 0,22 μm prima di essere caratterizzati utilizzando l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle, l'analisi western blotting e la microscopia elettronica a trasmissione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Analisi del tracciamento delle nanoparticelle di hUC-MSC-sEV isolati. Gli hUC-MSC-sEV erano 100-1.000x diluiti con PBS chiarificato e misurati utilizzando Nanosight NS300 dotato di una fotocamera CMOS, un obiettivo 20x, un modulo laser blu (488 nm) e software NTA. La figura è una rappresentazione di NTA in triplice copia. Abbreviazioni: hUC-MSC-sEVs = piccole vescicole extracellulari MSC derivate dal cordone ombelicale umano; NTA = analisi di tracciamento delle nanoparticelle; CMOS = semiconduttore complementare metallo-ossido. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: L'espressione dei biomarcatori di hUC-MSC-sEVs . (A) Analisi Western blot del marcatore CD9 esosomicamente positivo. (B) Western blot analysis del marcatore CD81 esosomale positivo. (C) Western blot analysis del marcatore positivo esosomiale TSG101. (D) Analisi Western blot del marcatore negativo GRP94. Tutti e quattro i marcatori sono stati confrontati con il lisato cellulare come controllo. Da sinistra a destra, Ladder, Cell lysate, hUC-MSC-sEVs (A,B); Ladder, hUC-MSC-sEVs, Lisato cellulare, hUC-MSC-sEVs, Lisato cellulare (C); Ladder, Cell lysate, hUC-MSC-sEVs (D). Le coppie di lisato cellulare provengono da due repliche e queste immagini sono immagini rappresentative di esperimenti eseguiti in triplice copia. Abbreviazione: hUC-MSC-sEVs = piccole vescicole extracellulari MSC derivate dal cordone ombelicale umano. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Morfologia di singoli hUC-MSC-sEV al microscopio elettronico a trasmissione. Gli hUC-MSC-sEV sono stati incubati su una griglia di rame rivestita di carbonio e colorati con acido fosfotungstico all'1% prima di essere visualizzati al microscopio elettronico a trasmissione. Gli hUC-MSC-sEV, di dimensioni intorno ai 100 nm, hanno mostrato una struttura a membrana a doppio strato simile a una coppa. Barra di scala = 100 nm. L'immagine è rappresentativa di tre acquisizioni indipendenti. Abbreviazione: hUC-MSC-sEVs = piccole vescicole extracellulari MSC derivate dal cordone ombelicale umano. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Le EV sono uno dei sottoinsiemi importanti del secretoma nelle MSC che svolgono un ruolo cruciale durante i processi normali e patologici. Tuttavia, le sEV, con un intervallo di dimensioni comprese tra 30 e 200 nm, sono aumentate come potenziale strumento per la terapia senza cellule negli ultimi dieci anni. Sono state sviluppate varie tecniche per isolare i sEV dalle MSC. Tuttavia, l'ultracentrifugazione differenziale, l'ultrafiltrazione, la precipitazione a base di polimeri, la cattura di immunoaffinità e la precipitazione basata sulla microfluidica presentano vantaggi e svantaggi diversi17. Nessuna di queste tecniche di isolamento può raggiungere un alto tasso di recupero e specificità. Pertanto, i ricercatori devono selezionare i metodi appropriati in base alle loro preferenze in base a un alto tasso di recupero o ad un'elevata specificità.
Prima dell'isolamento delle MSCs sEVs, le MSC sono state valutate per marcatori di superficie positivi (CD90, CD105, CD73) e marcatori negativi (CD34, CD11b, CD19, CD45 e HLA-DR) mediante citometria a flusso come descritto in precedenza18. Il vantaggio tecnico di questo studio sui veicoli elettrici potrebbe fornire una soluzione alla situazione attuale. Richiede solo una configurazione di base da banco in laboratorio per evitare l'uso di apparecchiature di fascia alta per isolare i veicoli elettrici. Le MSC sono state affamate di terreni di coltura nel protocollo descritto senza aggiungere alcun siero. Questo è fondamentale per prevenire qualsiasi contaminazione di EV originata dall'integrazione di siero. Tuttavia, considerando che gli integratori sierici sono inevitabili in alcuni casi, gli integratori sierici impoveriti di esosomi possono essere considerati nella formulazione di terreni di coltura completi. Inoltre, i terreni privi di rosso fenolo potrebbero essere utilizzati come sostituto dei terreni di coltura standard, poiché questo indicatore di pH comune potrebbe potenzialmente causare problemi con le misurazioni colorimetriche15. Il protocollo può essere migliorato utilizzando un filtro a pompa da 0,22 μm invece di un filtro a siringa convenzionale durante la rimozione di particelle più grandi di 220 nm. Devono essere prese precauzioni per migliorare la resa dei sEV. Nell'ultima centrifugazione di CM attraverso un'unità filtrante centrifuga, deve essere evitata una centrifugazione prolungata per garantire che vi sia un volume sufficiente di soluzione per eluire i sEV dal filtro. Trascurare questo può ridurre la resa dei sEV raccolti durante la fase di centrifugazione inversa.
Questo protocollo è limitato alla scala di laboratorio e, come tale, potrebbe non essere adatto per l'isolamento su larga scala nell'industria. Ciò è dovuto all'elevato costo dell'uso una tantum di un'unità filtrante centrifuga, che non è fattibile per l'isolamento su larga scala, che generalmente comporta un volume fino a migliaia di litri di CM. In sintesi, forniamo un semplice protocollo di filtrazione su scala da banco per isolare i veicoli elettrici derivati da MSC. Questo protocollo è adatto anche per purificare i veicoli elettrici isolati per ulteriori analisi a valle. Sebbene questo protocollo sia progettato specificamente per i sEV derivati da MSC, una parte del protocollo descritto può essere utilizzata per isolare i sEV da diverse fonti, come fluidi corporei, linee cellulari o altre fonti di tipo liquido.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
La pubblicazione di questo video è stata supportata da My CytoHealth Sdn. Bhd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Nacalai Tesque | 06121-95 | Western blot |
| 95% ethanol | Nacalai Tesque | 14710-25 | Disinfectants |
| Absolute Methanol | Chemiz | 45081 | To activate PVDF membrane (Western blot) |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell dissociation enzyme |
| ammonium persulfate | Chemiz | 14475 | catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis |
| anti-CD 81 (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | Antibody for sEVs marker |
| anti-TSG 101 (C-2) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7964 | Antibody for sEVs marker |
| Bovine serum albumin | Nacalai Tesque | 00653-31 | PVDF membrane blocking |
| bromophenol blue | Nacalai Tesque | 05808-61 | electrophoretic color marker |
| Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL) | Millipore | UFC710008 | sEVs isolation |
| ChemiLumi One L | Nacalai Tesque | 7880 | chemiluminescence detection reagent |
| CryoStor Freezing Media | Sigma-Aldrich | C3124-100ML | Cell cryopreserve |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Nacalai Tesque | 08458-45 | Cell culture media |
| ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker | SMOBIO | PM2610 | Protein molecular weight markers |
| Extra thick blotting paper | ATTO | buffer reservior (Western blot) | |
| Glycerol | Merck | G5516 | Chemicals for western blot |
| Glycine | 1st Base | BIO-2085-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP) | Santa Cruz Biotechnology | sc-516102 | Secondary antibody (Western Blot) |
| Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia | ||
| mouse antibodies anti-CD 9 (C-4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13118 | Antibody for sEVs marker |
| Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2 | Malvern Panalytical, UK | ||
| paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 02890-45 | Sample Fixation during TEM |
| penicillin–streptomycin | Nacalai Tesque | 26253-84 | Antibiotic for media |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Nacalai Tesque | 27327-81 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Washing, sample dilution |
| polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size |
ATTO | To hold protein during protein transfer (Western blot) | |
| protease inhibitor cocktail | Nacalai Tesque | 25955-11 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| Protein Assay Bicinchoninate Kit | Nacalai Tesque | 06385-00 | Protein measurement |
| sample buffer solution with 2-ME | Nacalai Tesque | 30566-22 | Reducing agent for western blot |
| sodium chloride | Nacalai Tesque | 15266-64 | Chemicals for western blot |
| sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31606-62 | ionic surfactant during gel electrophoresis |
| Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope | FEI, USA | ||
| tetramethylethylenediamine | Nacalai Tesque | 33401-72 | chemicals to prepare gel |
| tris-base | 1st Base | BIO-1400-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| Tween 20 | GeneTex | GTX30962 | Chemicals for western blot |
| UVP (Ultra Vision Product) CCD imager | CCD imager for western blot signal detection |
References
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