Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kvantifisering av myeloperoksidase-DNA og nøytrofile elastase-DNA-komplekser fra nøytrofile ekstracellulære feller ved hjelp av en modifisert Sandwich ELISA

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/64644
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2
1Department of Biochemistry and Biotechnology, University of Science and Technology Chittagong (USTC), 2Department of Emergency and Critical Care Medicine, Aichi Medical University

Summary

Vi presenterer en protokoll for en modifisert sandwichenzymbundet immunosorbentanalyseteknikk for kvantitativt å måle to komponenter av nøytrofile ekstracellulære fellerestere, myeloperoksidase konjugert-DNA og nøytrofile elastase konjugerte DNA-komplekser, avledet fra aktiverte nøytrofiler.

Abstract

Visse stimuli, som mikroorganismer, forårsaker at nøytrofiler frigjør nøytrofile ekstracellulære feller (NET), som i utgangspunktet er nettlignende strukturer sammensatt av DNA med granulproteiner, som myeloperoksidase (MPO) og nøytrofil elastase (NE), og cytoplasmatiske og cytoskeletale proteiner. Selv om interessen for NET har økt den siste tiden, finnes det ingen sensitiv og pålitelig analysemetode for måling av NET i kliniske settinger. Denne artikkelen beskriver en modifisert sandwichenzymbundet immunosorbentanalyse for kvantitativt å måle to komponenter av sirkulerende NET, MPO-DNA og NE-DNA-komplekser, som er spesifikke komponenter i NET og slippes ut i det ekstracellulære rommet som nedbrytningsprodukter fra NET. Analysen bruker spesifikke monoklonale antistoffer for MPO eller NE som fangstantistoffer og et DNA-spesifikt deteksjonsantistoff. MPO eller NE binder seg til ett sted av fangstantistoffet under den første inkubasjonen av prøver som inneholder MPO-DNA- eller NE-DNA-komplekser. Denne analysen viser god linearitet og høy inter-assay og intra-assay presisjon. Vi brukte det hos 16 pasienter med COVID-19 med tilhørende akutt lungesviktsyndrom og fant at plasmakonsentrasjonene av MPO-DNA og NE-DNA var signifikant høyere enn i plasma oppnådd fra friske kontroller. Denne deteksjonsanalysen er en pålitelig, svært sensitiv og nyttig metode for å undersøke egenskapene til NET i humane plasma- og kultursupernatanter.

Introduction

Denne artikkelen skisserer en metode for å kvantifisere dannelse av nøytrofil ekstracellulær felle (NET) i biologiske væsker ved å bruke sandwichenzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) for å oppdage komplekser av myeloperoksidase (MPO) og nøytrofil elastase (NE) med DNA 1,2. NET er sammensatt av en DNA-ryggrad dekorert med antimikrobielle proteaser som stammer fra nøytrofile granulater 3,4. Både MPO-DNA- og NE-DNA-komplekser er viktige og spesifikke komponenter i NET og slippes ut i det ekstracellulære rommet som nedbrytningsprodukter fra NET 3,4.

I tillegg til deres viktige fysiologiske rolle i antimikrobielt forsvar3, har NET også forskjellige patologiske effekter4,5, inkludert fremme av trombogenese6 og forverring av sepsis7. Følgelig har NET fått oppmerksomhet nylig. Likevel har in vivo-kvantifiseringen av NET vist seg utfordrende på grunn av mangelen på en sensitiv, pålitelig kvantitativ analysemetode.

Noen få metoder er tilgjengelige, inkludert direkte måling av NET ved fluorescensmikroskopi8,9 og flowcytometri 10 og indirekte måling av sirkulerende cellefritt DNA, nukleosomer og citrullinert histon H3, men hver metode har sine egne fordeler og begrensninger11. Selv om immunfluorescensmikroskopisk metode er spesifikk for NET og tydelig viser lokalisering og grad av NET-dannelse, er prøvene begrenset til biopsivev og utskilte materialer. Dessuten må denne metoden utføres av dyktige forskere og krever lang tid for at resultatene skal oppnås. Måling av sirkulerende nivåer av NET-relaterte komponenter ved flowcytometri er enkelt og gir resultater raskt; Metoden er imidlertid ikke spesifikk for NET12.

Vi13 og andre1,2 har utviklet en svært sensitiv og pålitelig analyse for å måle de sirkulerende NET-komponentene, MPO-konjugert eller NE-konjugert DNA, i humant plasma med en modifisert ELISA-teknikk som bruker spesifikke antistoffer for MPO eller NE som fangstantistoffer og et DNA-spesifikt deteksjonsantistoff. Denne analysen kan også brukes ex vivo for å identifisere NET-komponenter i cellekultursupernatanter frigjort av aktiverte nøytrofiler som respons på phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) stimulering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne studien ble utført i samsvar med Helsinkideklarasjonen og ble godkjent av institusjonelle gjennomgangsnemnder ved Aichi Medical University (2017-H341, 2019-H137). Det ble innhentet skriftlig informert samtykke fra hver enkelt deltaker.

1. Forberedelse av reagens

MERK: For å utføre sandwich ELISA-analysen, fremstilles reagensene som beskrevet nedenfor.

  1. Belegg buffer:
    1. For å lage en 0,1 mol/l karbonat-bikarbonatbuffer, veier du 10,6 g vannfritt natriumkarbonat (molekylvekt, 106 g/mol) og 8,4 g natriumbikarbonat (molekylvekt, 84 g/mol).
    2. Legg det til ca 900 ml destillert vann i et beger.
    3. Juster bufferens pH til 9,6 ved å tilsette den nødvendige mengden fortynnet saltsyre eller natriumhydroksid.
    4. Kontroller pH-verdien med en pH-måler.
    5. Deretter tilsettes det nødvendige volumet destillert vann for å oppnå et totalt volum på 1,000 ml.
    6. Oppbevar denne 0,1 mol/l karbonat-bikarbonatbufferen i kjøleskap ved 4 °C.
  2. Blokkering av buffer:
    1. Tilsett ca. 250 μL natriumazid og 1 g bovint serumalbumin (BSA) til 70 ml fosfatbufret saltvann (PBS) sammensatt av 137 mmol / L NaCl, 8,1 mmol / L Na 2 HPO 4, 2,68 mmol / L KCl og 1,47 mol / L KH2PO 4(pH7,4), og bland forsiktig.
    2. Tilsett destillert vann for å oppnå et totalt volum på 100 ml. De endelige konsentrasjonene av bovint serumalbumin og natriumazid er henholdsvis 1 % og 0,05 %. Vent i 10 minutter, og så er løsningen klar til bruk.
  3. Vaskeløsning: Tilbered 0,5% t-oktylfenoksypolyetoksyetanol, polyetylenglykol tert-oktylfenyleter (Triton X-100) i destillert vann.
    1. Fortynn 100% Triton X-100 til 10% med destillert vann, og la 10% løsningen stå i 1 dag før bruk.
    2. Deretter fortynnes 10% Triton X-100-løsningen 20 ganger med destillert vann for å oppnå en konsentrasjon på 0,5%.
  4. Fortynning av antistoff:
    1. Fortynn fangstantistoffet (anti-MPO-antistoff [1 mg/ml] eller anti-NE-antistoff [1 mg/ml]) til 1:2 000 i beleggbufferen (pH 9,6) før bruk på dag 1 av analysen (se nedenfor) og deteksjonsantistoffet (peroksidase-konjugert anti-DNA-antistoff) til 1:40 med PBS før bruk på dag 3 av analysen (se nedenfor).
      MERK: For det foreløpige eksperimentet, fortynn iso-type antistoffene (IgG-kanin [5 mg / ml] og IgG1 museklon Ci4 [0,5 mg / ml]) til 1: 10,000 og 1: 1,000 i beleggbufferen (pH 9,6).
  5. ABTS substratløsning: Avhengig av antall prøver, oppløs en, to eller tre 2,2'-azino-bis(3 etylbenzotiazolin-6-sulfonsyre (ABTS) tabletter i 5 ml, 10 ml eller 15 ml ABTS-buffer (inneholdende natriumperborat, sitronsyre og dinatriumhydrogenfosfat); 100 μL er nødvendig per prøve. Oppbevar den tilberedte oppløsningen ved 2-8 °C, beskyttet mot lys. Løsningen er stabil i opptil 3 måneder.

2. Prøveinnsamling og lagring

  1. Plasma isolasjon:
    1. Samle 4 ml perifere blodprøver i et litium heparin blodoppsamlingsrør ved venepunktur med en 22 G sprøyte, og sentrifuge ved 1,600 x g i 10 minutter ved 4 ° C.
    2. Overfør supernatanten til et 2 ml sikkert låst prøverør.
    3. Resentrifuger supernatanten ved 16 000 x g i 10 minutter ved 4 °C for å fjerne eventuelle gjenværende celler.
    4. Samle supernatanten i et nytt prøverør for sikker lås uten å forstyrre pelleten i bunnen av røret.
    5. Oppbevar det oppnådde plasmaet ved -80 °C inntil videre bruk.
      MERK: For å oppnå resultater med høy gjennomstrømning med denne analysen, kreves prøver av god kvalitet. Hvis plasmaprøver brukes, utfør en andre sentrifugering for å fjerne eventuelle gjenværende celler. Unngå gjentatt tining av prøvene. Bruk heparin som antikoagulant fordi EDTA påvirker DNase-aktiviteten.
  2. Isolering av polymorfonukleære nøytrofiler
    1. Samle perifere blodprøver i et litium heparin blodoppsamlingsrør ved venepunktur med en 22 G sprøyte.
    2. Lag 6 ml blod på 6 ml ett-trinns polymorfer, og sentrifuge rørene ved 1000 x g i 45 minutter ved romtemperatur (RT).
    3. Høst det tredje buffy pelslaget som inneholder nøytrofiler, og vask det tre ganger i fenol rødfri RPMI-1640 ved 400 x g i 10 minutter ved RT.
    4. Resuspender nøytrofilene i fenolfri RPMI-1640 inneholdende 2 mM L-glutamin supplert med 6% varmeinaktivert føtalt bovint serum, og telle cellene i mikroskopfeltet med et hemocytometer.
      MERK: Denne metoden gir 96% til 98% renhet med større enn 95% levedyktighet, som vurdert av trypan blå fargestoff ekskludering.
  3. Aktivering av polymorfonukleære nøytrofiler og NETosis in vitro
    1. Fortynn nylig isolerte polymorfonukleære nøytrofiler til 1 × 105 celler/ml i fenolfri RPMI-1640 inneholdende 2 mM L-glutamin supplert med 6% varmeinaktivert føtalt bovint serum, og frø dem i 35 mm kulturretter.
    2. For å indusere NET stimulerer polymorfonukleære nøytrofiler med 25 nM PMA i 4 timer ved 37 °C i 5 % CO2/95 % luft.
    3. Etter 4 timers inkubasjon, fordøy NET delvis ved å tilsette 0,6 μg / ml DNase I direkte til kulturrettene i 15 minutter ved RT, og stopp DNase I-aktiviteten ved å legge til 5 mM EDTA.
    4. Samle mediet som inneholder de syntetiserte NET-ene, og sentrifuger ved 400 x g i 10 minutter ved 4 °C for å fjerne celleavfallet.
    5. Få supernatantene fra fire friske kontroller, bland og oppbevar ved -80 °C til bruk.
      MERK: DNase-fordøyd PMA-stimulert nøytrofiler hentet fra fire friske kontroller brukes som NET-standard 1,14,15. Generere en kalibreringskurve fra en serielt fortynnet NET-standard med PBS, og tilordne den optiske tettheten (OD) verdier hentet fra en ufortynnet NET-standard som 100% NET.

3. Analysemetode

MERK: Trinnene for å utføre analysen er beskrevet i detalj nedenfor.

  1. Dag 1
    1. Påfør totalt 100 μL fortynnet anti-MPO eller anti-NE antistoff inneholdende 0,05 μg antistoff til hver brønn på platen, inkludert den tomme brønnen.
      MERK: Beleggbufferen må ikke inneholde noen form for vaskemiddel fordi antistoffene ellers ikke binder seg likt og jevnt til veggene i hver brønn. For å forhindre krokeffekten må beleggproteinkonsentrasjonen ikke være mer enn 20 μg / ml, fordi konsentrasjoner over dette nivået vil mette de fleste tilgjengelige steder på mikrotiterplaten. Det typiske konsentrasjonsområdet for proteinbeleggsløsninger er 2-10 μg / ml. For det foreløpige forsøket, bruk fortynnet iso-type kontroll antistoff IgG kanin for belegg i stedet for spesifikke monoklonale antistoffer mot MPO. Bruk fortynnet iso-type kontroll antistoff IgG1 mus for belegg i stedet for spesifikke monoklonale antistoffer mot NE.
    2. Dekk platen med et klebende plastdeksel for å forhindre fordampning av prøven, og inkuber over natten ved 4 °C for å tillate binding av fangantistoffene.
  2. Dag 2
    1. Kast den fortynnede antistoffoppløsningen fra brønnene, og pipett deretter 300 μL vaskeoppløsning per brønn, og gjenta denne vaskeprosedyren tre til fire ganger.
    2. Fjern overflødig PBS ved å banke tallerkenen tørr på et papirhåndkle.
    3. Blokker hver brønn på ELISA-platen med 200 μL av blokkeringsbufferen.
    4. Dekk platen tett med et klebende plastdeksel, og inkuber det i 1,5-2 timer ved RT for å hindre brønnene.
    5. Kast blokkeringsløsningen helt fra brønnene, og pipett deretter 300 μL vaskeoppløsning per brønn, og gjenta denne vaskeprosedyren tre til fire ganger.
    6. Fjern overflødig PBS ved å banke tallerkenen tørr på et papirhåndkle.
    7. Påfør totalt 25 μL plasma eller medium til hver brønn unntatt den tomme brønnen, og tilsett 75 μL PBS som fortynningsmiddel for å gjøre det endelige volumet 100 μL; tilsett 100 μL PBS til den tomme brønnen.
    8. Bland deretter prøvene ved RT i 10 s ved å plassere platen på en shaker ved 250 o / min.
    9. Påfør 2 μL 100 ganger fortynnet DNase I (0,03 mg/ml) på hver brønn, inkludert den tomme brønnen (endelig konsentrasjon av DNase I i reaksjonsblandingen: 0,6 μg/ml).
    10. Forsegl platen med et selvklebende plastdeksel, og bland prøvene grundig ved RT i 10 s ved å plassere platen på en shaker ved 250 o / min.
      MERK: For å vurdere de optimale forholdene for DNA-fordøyelse, inkuberte vi prøver som inneholder MPO-assosiert DNA fra pasienter med COVID-19 med 0-0.9 μg / ml DNase I i 15 minutter ved RT og brukte plater belagt med spesifikt fangstantistoff for MPO eller et artsmatchet iso-type kontrollantistoff.
    11. Inkuber prøvene i 15 min ved RT.
    12. Fjern det selvklebende plastdekselet, og påfør 1 μL 0,5 M EDTA på hver brønn for å stoppe DNase-reaksjonen.
    13. Forsegle platen med et selvklebende plastdeksel, og rist den ved RT i 15 s ved å plassere den på en shaker ved 250 o / min.
    14. Deretter inkuberer du platen over natten ved 4 °C for å la proteinkomponentene i NET feste seg til fangeantistoffene.
  3. Dag 3
    1. Fjern det selvklebende plastdekselet, og kast oppløsningen fra brønnene.
    2. Kast løsningen helt fra brønnene, og deretter pipett 300 μL av vaskeoppløsningen per brønn, og gjenta denne vaskeprosedyren tre til fire ganger.
    3. Påfør totalt 100 μL av det fortynnede peroksidase-konjugerte anti-DNA-deteksjonsantistoffet til hver brønn.
    4. Forsegl platen tett med et klebende plastdeksel, og inkuber det i 1,5 time ved RT.
    5. Kast løsningen helt fra brønnene, og pipett deretter 300 μL vaskeoppløsning per brønn, og gjenta denne vaskeprosedyren tre til fire ganger.
    6. Fjern den resterende løsningen forsiktig.
    7. Påfør totalt 100 μL ABTS-substratløsning på hver brønn, og dekk platen med et klebende plastdeksel.
    8. Inkuber platen i mørket ved RT i 20-30 min på en shaker ved 250 o / min.
      MERK: Overvåk platen med 5 minutters mellomrom til de ønskede OD-avlesningene er oppnådd.
    9. Tilsett totalt 50 μL 2 M svovelsyre for å stoppe reaksjonen.
    10. Bland væskeinnholdet i brønnene ved å banke forsiktig på siden av platen.
    11. Slå på mikroplateleseren, og koble den til datamaskinen.
    12. Åpne programvaren på datamaskinen.
    13. Opprett et nytt eksperiment på statuslinjen, og gi det et navn.
    14. Angi alle følgende parametere for plateavlesning: Lesetype, Absorbans; lesemodus, endepunkt; Bølgelengder, 2; Lm-1, 405 nm; Lm-2, 490 nm; Automatisk miksing og blanking før, av; Forhåndslest plate, Av; Automatisk kalibrering, På; Strimler, Les hele tallerkenen; Kolonnebølgelengdeprioritet, kolonneprioritet; Vognhastighet, Normal; og Auto lese, Av.
    15. Legg deretter platen med 96 brønner som inneholder prøvene i skuffen og lukk den.
    16. Til slutt velger du Les-knappen slik at platen leses umiddelbart.
    17. Les absorbansen til hver brønn ved en bølgelengde på 405 nm ved å bruke en mikroplateleser (bruk på dette stadiet en bølgelengde på 490 nm som referanse).
    18. Utfør automatisk subtraksjon av absorbansverdien til analysemediet alene fra alle ukjente prøver, og lagre dataene.
      MERK: Bruk en standardkurve hentet fra serielt fortynnet NET-standard for å beregne den relative konsentrasjonen av NET i prøven 1,14,15. Her presenteres de endelige resultatene som "MPO- eller NE-DNA-komplekser (% av NET-standard)." Deteksjonsgrensen (LOD) ble beregnet ut fra standardavviket (SD) og helningen på kalibreringskurven (S) på følgende måte: LOD = 3,3(SD/S).

4. Statistikk

  1. Utfør alle statistiske analyser ved hjelp av passende statistisk analyse programvare. Her ble SigmaPlot v14.5 brukt. Andeler og kontinuerlige variabler vises som median med interkvartilbredde på grunn av skjevfordeling av de fleste parametrene.
  2. Sammenlign plasma MPO-DNA og NE-DNA nivåer mellom COVID-19 pasienter og friske kontroller ved hjelp av Wilcoxon rang sum test. Bruk korrelasjonsanalyse for å utforske forholdet mellom optisk tetthet og prosentandelen av NET-standard.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne metoden brukte en sandwich ELISA med anti-MPO, anti-NE og anti-DNA monoklonale antistoffer for å måle MPO-assosiert og NE-assosiert DNA (figur 1). I denne metoden ble brønnene til en mikrotiterplate belagt med et MPO-spesifikt eller NE-spesifikt monoklonalt antistoff for å fange DNA-assosiert MPO og DNA-assosiert NE, samt ikke-DNA-assosiert MPO og NE. For å beregne variabilitetskoeffisienten (CV) ble det utført dupliserte målinger innenfor samme plate for 30 prøver samlet inn fra pasienter med COVID-19 og friske kontroller, og %CV ble beregnet som gjennomsnittet av duplikatmålingene; for å beregne interanalyse-CV (dvs. plate-til-plate-konsistens), ble to typer prøver fra pasienter med COVID-19 og friske kontroller målt i firdoblet på 10 forskjellige plater; for å demonstrere spesifisiteten til denne analysen ble forskjellige konsentrasjoner av MPO-DNA- og NE-DNA-komplekser analysert ved å bruke plater belagt med iso-type kontrollantistoffer i stedet for spesifikke monoklonale antistoffer mot MPO og NE; og for å beregne sensitiviteten og lineariteten til analysen, ble en serielt fortynnet NET-standard laget ved å stimulere isolerte humane nøytrofiler med PMA og mild DNase-fordøyelse analysert, og korrelasjonskoeffisienten og deteksjonsgrensen (LOD) ble beregnet.

Kalibreringskurvene for MPO-DNA og NE-DNA hentet fra en serielt fortynnet NET-standard er vist i figur 2. Pålitelige standardkurver for MPO-DNA og NE-DNA (henholdsvis R2 = 0,958 og 0,963) oppnås når absorbansverdiene ikke overstiger konsentrasjoner på henholdsvis 0,93 og 0,90. LOD-verdiene beregnet ut fra SD og kalibreringskurvens helning var henholdsvis 0,132 % og 0,126 % for MPO-DNA og NE-DNA (%NET-standard).

Den høyeste OD ble oppnådd når 0,6 μg / ml DNase I ble påført (figur 3). Derfor var DNA-fordøyelsen begrenset til å tilsette en 0,6 μg / ml reaksjonsblanding av DNase I i 15 minutter ved romtemperatur. Når platene ble belagt med iso-type kontrollantistoff i stedet for det spesifikke monoklonale antistoffet mot MPO, ble det påvist svært lave OD-verdier (<0,09 absorbansenheter [AU]) ved forskjellige konsentrasjoner av DNase I.

For å beregne intraanalysekoeffisienten for variabilitet (CV) for MPO-DNA og NE-DNA ble det utført dupliserte målinger i 30 prøver fra pasienter med covid-19 og friske kontroller i samme plate; %CV ble beregnet ved hjelp av det dupliserte gjennomsnittet. Intraanalyse-CVene for MPO-DNA og NE-DNA var henholdsvis 1,871 og 0,987 hos friske kontroller og henholdsvis 2,532 og 2,010 hos covid-19-pasienter (tabell 1). Gjennomsnittlig intraanalyse-CV for MPO-DNA og NE-DNA var henholdsvis 2,202 ± 0,467 og 1,497 ± 0,723 (gjennomsnitt ± SD) (tabell 1).

For å beregne interanalyse-CV for MPO-DNA og NE-DNA, ble to typer prøver samlet inn fra pasienter med COVID-19 og friske kontroller målt i firkantet på 10 forskjellige plater for å overvåke plate-til-plate-konsistens. De gjennomsnittlige CVene for MPO-DNA og NE-DNA mellom analysene var henholdsvis 6,524 ± 2,672 og 4,389 ± 0,923 (gjennomsnitt ± SD) (tabell 2).

For å evaluere spesifisiteten til fangstantistoffene mot MPO-DNA- og NE-DNA-komplekser, analyserte vi forskjellige konsentrasjoner av MPO-DNA- og NE-DNA-komplekser ved å bruke plater belagt med iso-type kontrollantistoffer i stedet for spesifikke monoklonale antistoffer mot MPO og NE. Tabell 3 viser at iso-type kontrollantistoffene reagerte lite med MPO-DNA- og NE-DNA-kompleksene ved de ulike konsentrasjonene (0,035 AU til 0,078 AU og −0,007 AU til 0,096 AU, henholdsvis).

Nivåene av MPO-DNA og NE-DNA i supernatanten av DNase-fordøyde PMA-stimulerte nøytrofiler ble definert som 100% NET-standard, og plasmaprøvedataene ble uttrykt som %NET-standard. Nivåene av MPO-DNA (%NET-standard) var signifikant høyere i plasma fra pasienter med COVID-19 (n = 16; 29,1 % [IQR, 25,8, 41,5]) enn i plasma fra friske kontroller (n = 10; 13,4 % [IQR, 12,4, 14,8]), og det samme var nivåene av NE-DNA (%NET-standard) (46,4 % [IQR, 32,7, 53,7] vs. 12,1 % [IQR, 9,9, 14,7], henholdsvis P < 0,01; Figur 4).

Figure 1
Figur 1: Grunnleggende stadier av en sandwichenzymbundet immunosorbentanalysemetode for måling av myeloperoksidase-DNA eller nøytrofil elastase-DNA i prøver. (A) Brønnene er belagt med et anti-myeloperoksidase (MPO) eller anti-nøytrofil elastase (NE) fangstantistoff. (B) De gjenværende proteinbindingsstedene blokkeres av blokkerende midler. (C) Prøver som inneholder NE-konjugert og MPO-konjugert DNA tilsettes. (D) Begrenset DNase-fordøyelse utføres, og prøven inkuberes i brønnene for å binde seg med fangstantistoffet. (E) Et sekundært peroksidasemerket anti-DNA-antistoff tilsettes. (F) Ubundet sekundært peroksidasemerket anti-DNA-antistoff fjernes. (G) Substratet 2,2'-azino-bis (3-etylbenzotiazolin-6-sulfonsyre) tilsettes, og fargeutviklingen overvåkes. Forkortelser: ABTS = 2,2'-azino-bis(3-etylbenzotiazolin-6-sulfonsyre); MPO = myeloperoksidase; NE = nøytrofil elastase Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2 Linearitet av sammenhengene mellom intensitetsverdiene og de ulike fortynningene av den nøytrofile ekstracellulære fellestandarden. Supernatanten av DNase-fordøyd phorbol 12-myristat 13-acetatstimulerte nøytrofiler ble serielt fortynnet, og nivåene av myeloperoksidase-DNA og nøytrofilt elastase-DNA ble analysert for å generere en kalibreringskurve. Absorbansenhetene (AU) hentet fra den ufortynnede nøytrofile ekstracellulære fellestandarden (NET-standard) ble tildelt som 100 %NET, og plotting av intensitetsverdien ved 405 nm mot %NET-standarden viste et lineært forhold. Forkortelser: MPO = myeloperoksidase; NE = nøytrofil elastase; NET = nøytrofil ekstracellulær felle Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Dose-respons av DNase I ved nøytrofil ekstracellulær felle-DNA-fordøyelse. Prøven ble satt inn i myeloperoksidasebelagte brønner. Deretter ble DNase I (0 μg/ml, 0,3 μg/ml, 0,6 μg/ml eller 0,9 μg/ml) tilsatt. Etter 15 minutters fordøyelse ble enzymaktiviteten stoppet, og de resterende trinnene i sandwichenzymbundet immunosorbentanalyse ble utført tilsvarende. Dataene vises som gjennomsnitt ± SD. N = 12. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Plasmanivåer av myeloperoksidase-DNA og nøytrofile elastase-DNA-komplekser hos pasienter med covid-19. Dataene uttrykkes som prosentandeler av innholdet av nøytrofil ekstracellulær fellestandard (NET-standard) og presenteres som median og interkvartilbredde. Pasienter med covid-19, n = 16; friske kontroller, n = 10. ** P < 0,01 versus friske kontroller. Forkortelser: HC = friske kontroller; NET = nøytrofil ekstracellulær felle. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Intra-analysekoeffisient for variabilitet. Tretti prøver ble målt i duplikat for å overvåke individuelle variabilitetskoeffisienter og dermed bestemme variabilitetskoeffisienten intra-analysen. Forkortelser: AU = absorbansenheter; CV = variabilitetskoeffisienter Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Inter-analysekoeffisient for variabilitet. Prøvene ble målt i firkantet på 10 forskjellige plater for å overvåke plate-til-plate-variasjon og dermed bestemme variasjonskoeffisienten mellom analysene. Forkortelser: AU = absorbansenheter; CV = variabilitetskoeffisient. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 3: Spesifisitetstest for fangstantistoffer. Platene ble belagt med iso-type kontrollantistoffer for anti-myeloperoksidase (MPO) og anti-nøytrofil elastase (NE) for å evaluere spesifisiteten til fangstantistoffene for MPO-DNA- og NE-DNA-kompleksene. Forkortelser: AU = absorbansenheter; MPO = myeloperoksidase; NE = nøytrofil elastase Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har beskrevet en sandwich ELISA-metode der MPO eller NE binder seg til ett sted av fangstantistoffet under den første inkubasjonen av prøver som inneholder MPO-DNA- eller NE-DNA-komplekser. Etter vask blir "sandwich" fullført ved å inkubere prøvene med et peroksidase-assosiert anti-DNA monoklonalt antistoff. Etter fjerning av ubundet sekundært antistoff detekteres det bundne peroksidasekonjugatet ved tilsetning av et kromogent ABTS-peroksidasesubstrat, som gir et løselig sluttprodukt som kan leses spektrofotometrisk ved 405 nm. Den gode lineariteten og den høye interanalyse- og intraanalysepresisjonen indikerer at ELISA-analysen beskrevet i denne artikkelen og andre 1,2 er pålitelig og gjennomførbar for klinisk anvendelse. Videre, når supernatanten av DNase-behandlede PMA-stimulerte nøytrofiler er tildelt som et maksimalt signal for NET-standarden, kan denne ELISA-analysen brukes som en semi-kvantitativ metode 1,14,15.

De lange kromatintrådene til NET er dekorert med MPO- og NØ-proteiner. For å øke bindingen mellom fangstantistoffet og MPO-DNA- eller NE-DNA-kompleksene, kuttes trådene i kortere biter ved begrenset DNA-fordøyelse med enzymet DNase; Tilsetningen av en DNase-konsentrasjon som er for høy kan føre til overdreven fordøyelse av DNA og dermed en reduksjon i absorbansen. Resultatene av et foreløpig eksperiment (se figur 3) viste at en passende mengde DNase-tilsetning er nødvendig for å løsne restene avledet fra NET. Forsøkene som brukte iso-type kontrollantistoffer i stedet for spesifikke fangstantistoffer, viste at fangstantistoffene som ble brukt i denne analysen var spesifikke for MPO-DNA- og NE-DNA-komplekser.

Den tidlige fasen av NET-dannelse er preget av dekondensert kromatin og bevaring av intensiteten av plasmamembranen 9,16,17. Nøytrofile granulocytter med kondensert kjerne er identifisert som nøytrofile granulocytter som gjennomgår NET-dannelse og kan kvantifiseres ved flowcytometri10. Selv om flowcytometri kan analysere et stort antall bilder fra celler på kort tid, kan den ikke brukes til å evaluere de senere stadiene av NET-dannelse etter cellemembranbrudd og ekstrudering av kromatin. Citrullinerte histoner H3, som er kjent for å være NET-spesifikke markører, kan detekteres ved vestlig blotting18 og ELISA19; Disse metodene er imidlertid bare spesifikke for PAD4-relatert NET-dannelse og kan ikke brukes til å vurdere PAD4-uavhengige NET20.

Funnet om at nivåene av rester i serum NET var høyere hos pasienter med covid-19 enn hos friske kontrollpersoner, stemmer overens med tidligere rapporter21,22. Dette funnet tyder på at nøytrofil aktivering, inkludert NET-dannelse, kan spille en viktig rolle i patogenesen av COVID-19.

Denne analysen har en begrensning. Nylige rapporter har vist at immunrelaterte gener, inkludert MPO og ELANE, som koder for henholdsvis MPO og NE, er sterkt uttrykt under ukontrollerte inflammatoriske tilstander23 og er positivt korrelert med sykdommens alvorlighetsgrad og dødelighet24. Siden MPO og NE er involvert i dannelsen av NET uavhengig av disse enzymatiske aktivitetene15, kan økte proteinnivåer av NE og MPO i nøytrofiler påvirke resultatene av denne analysen.

Vi konkluderer med at denne sandwich ELISA-metoden direkte måler ekstracellulært DNA med granulatproteiner, inkludert NE og MPO, som er spesifikke for NET-dannelse. Denne deteksjonsanalysen er en pålitelig, svært sensitiv og nyttig metode for å undersøke egenskapene til NET i humane prøver og kultursupernatanter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle data generert og / eller analysert i løpet av denne studien er inkludert i denne publiserte artikkelen. Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Forfatterne takker Dr. Huq Muhammad Aminul for hjelp til å gjennomgå manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Step Polymorphs Accurate Chemical and Scientific Corporation AN221725 Isolation of PMN's from human blood.
96-well microtiter plate Thermo Fisher Scientific 467466 flat bottom
ABTS buffer solution Sigma-Aldrich Merck 11 204 530 001 Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate. 
ABTS tablets Sigma-Aldrich Merck 11 204 521 001  Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.
Adhesive plastic cover, Axygen Thermo Fisher Scientific 14222348
Anti-MPO antibody Sigma-Aldrich Merck  07-496-I Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit.
Anti-NE antibody, clone AHN-10 Sigma-Aldrich Merck MABS461 Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse.
Bovine serum albumin Biomedical Science BR-220700081 Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year.
DNase I New England BioLabs M0303M Store at -20 °C
IgG, rabbit, Isotype Control GENETEX, Inc. GTX35035 Store as concentrated solution at 2–8 °C.
IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4 Merck  MABC002 Store as concentrated solution at 2–8 °C.
Lithium heparin blood collection tube Becton Dickinson and Company
Microplate mixer As one corporation NS-P
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax 190  Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use.
Microplate reader application Molecular Devices SoftMax pro
Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA Roche Diagnostics 1154467500  bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year.
Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma-Aldrich Merck P8139 Activation of PMN's from human blood.
Phosphate buffered solution Takara Bio T9181 Store at room temperature. Stable for 6 months.
SigmaPlot v14.5  Systat Software Inc. San Jose, CA, USA
Sodium azide Fujifilm Wako Chemicals 190-14901 Store at room temperature.
t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether Fujifilm Wako Chemicals 9002-93-1 Store at room temperature.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro. Journal of Visualized Experiments. (112), e52779 (2016).
  2. Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).
  3. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  4. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).
  5. Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe. Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).
  6. Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases. World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).
  7. Sørensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps - The dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
  8. Abrams, S. T., et al. A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).
  9. Brinkmann, V., Goosmann, C., Kühn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
  10. Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).
  11. Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
  12. Rada, B. Neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).
  13. Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps. Advanced Techniques in Biology & Medicine. 5 (1), 1000196 (2016).
  14. Prevel, R., et al. Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients. Frontiers in Immunology. 13, 851497 (2022).
  15. Schechter, M. C., et al. et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB. PLoS One. 12, e0182587 (2017).
  16. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
  17. Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).
  18. Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps. Cancers. 12 (11), 3424 (2020).
  19. Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
  20. Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
  21. Zuo, Y., et al. Neutrophil extracellular traps in COVID-19. JCI Insight. 5 (11), e138999 (2020).
  22. Masso-Silva, J. A., et al. Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature. Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).
  23. Gong, F. C., et al. Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis. Mediators of Inflammation. 2020, 3432587 (2020).
  24. Almansa, R., et al. Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis. Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 195
Kvantifisering av myeloperoksidase-DNA og nøytrofile elastase-DNA-komplekser fra nøytrofile ekstracellulære feller ved hjelp av en modifisert Sandwich ELISA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Islam, M. M., Salma, U., Irahara,… More

Islam, M. M., Salma, U., Irahara, T., Watanabe, E., Takeyama, N. Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA. J. Vis. Exp. (195), e64644, doi:10.3791/64644 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter