Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

توليد وصيانة الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بالرئيسيات المشتقة من البول

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/64922
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2,3
1Faculty of Biology, Ludwig Maximilian University of Munich, 2Institute for the Advanced Study of Human Biology, Kyoto University, 3Hakubi Center, Kyoto University

Summary

يصف البروتوكول الحالي طريقة لعزل وتوسيع وإعادة برمجة الخلايا المشتقة من بول الرئيسيات البشرية وغير البشرية إلى الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) ، بالإضافة إلى تعليمات للصيانة الخالية من المغذيات للخلايا الجذعية المستحثة حديثا.

Abstract

تعد الأساليب عبر الأنواع التي تدرس الخلايا الجذعية متعددة القدرات للرئيسيات ومشتقاتها ضرورية لفهم الآليات الجزيئية والخلوية للمرض والتطور والتطور بشكل أفضل. لجعل الوصول إلى الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الرئيسيات (iPSCs) أكثر سهولة ، تقدم هذه الورقة طريقة غير جراحية لتوليد iPSCs من الرئيسيات البشرية وغير البشرية من الخلايا المشتقة من البول ، وصيانتها باستخدام طريقة زراعة خالية من التغذية.

يمكن أخذ عينات من البول من بيئة غير معقمة (على سبيل المثال ، قفص الحيوان) ومعالجتها بكوكتيل مضاد حيوي واسع الطيف أثناء زراعة الخلايا الأولية لتقليل التلوث بكفاءة. بعد انتشار الخلايا المشتقة من البول ، يتم إنشاء iPSCs بواسطة طريقة نقل معدلة لنظام ناقل فيروس سينداي المتاح تجاريا. قد تكون مستعمرات iPSC الأولى مرئية بالفعل بعد 5 أيام ، ويمكن قطفها بعد 10 أيام على أقرب تقدير. يدعم تمرير التكتل الروتيني مع مخزن مؤقت للتفكك الخالي من الإنزيم تعدد قدرات iPSCs المتولدة لأكثر من 50 مقطعا.

Introduction

تعد المقارنات الجينومية للرئيسيات البشرية وغير البشرية (NHPs) ضرورية لفهم تاريخنا التطوري وتطور السمات الخاصة بالإنسان1. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح هذه المقارنات بالاستدلال على الوظيفة من خلال تحديد تسلسلات الحمض النووي المحفوظة2 ، على سبيل المثال ، لتحديد أولويات المتغيرات المرتبطة بالمرض3. تعد مقارنات الأنماط الظاهرية الجزيئية مثل مستويات التعبير الجيني ضرورية لتفسير المقارنات الجينومية بشكل أفضل واكتشاف ، على سبيل المثال ، اختلافات النمط الظاهري الخلوي. علاوة على ذلك ، لديهم - على غرار المقارنات على مستوى الحمض النووي - القدرة على استنتاج الأهمية الوظيفية ، وبالتالي تفسير التباين ذي الصلة طبيا بشكل أفضل داخل البشر4. يتطلب دمج بيانات النمط الظاهري الجزيئي الشاملة في هذه الدراسات المقارنة موارد بيولوجية مناسبة (أي خلايا متعامدة عبر الأنواع). ومع ذلك ، فإن الأسباب الأخلاقية والعملية تجعل من الصعب أو المستحيل الوصول إلى مثل هذه الخلايا المماثلة ، خاصة أثناء التطوير. تسمح الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) بتوليد أنواع الخلايا التي يتعذر الوصول إليها في المختبر 5,6 ، ويمكن الوصول إليها تجريبيا ، وقد تم استخدامها لمقارنات الرئيسيات 6،7،8،9،10،11،12،13،14.

لتوليد iPSCs ، يحتاج المرء إلى الحصول على الخلايا الأولية لإعادة برمجتها. تتمتع الخلايا المعزولة من البول بميزة أنه يمكن أخذ عينات منها بشكل غير جراحي من الرئيسيات ، وأنه يمكن إعادة برمجتها بسهولة ، ربما بسبب الملامح الجزيئية الشبيهة بالخلايا الجذعية15. ظروف الاستزراع للحفاظ على iPSCs الرئيسيات لا تقل أهمية عن إعادة البرمجة. من الناحية الكلاسيكية، تتطلب زراعة الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات وسيطا غير محدد قائم على المصل وزراعة مشتركة للخلايا الليفية الجنينية للفأر - ما يسمى بالخلايا المغذية - التي توفر العناصر الغذائية الأساسية وسقالة للخلايا الجذعية الجنينية (ESCs)16. منذ تطوير أنظمة الاستزراع المحددة كيميائيا والخالية من التغذية17,18 ، هناك الآن خيارات مختلفة لوسائط ومصفوفات الاستزراع iPSC المتاحة تجاريا. ومع ذلك ، فقد تم تحسين معظم ظروف الثقافة هذه ل ESCs البشرية و iPSCs ، وبالتالي قد تعمل بشكل أقل جودة في ثقافة NHP iPSC. في بروتوكول الفيديو هذا ، نقدم تعليمات لإنشاء وصيانة iPSCs البشرية و NHP المشتقة من زراعة الخلايا البولية.

منذ التقرير الأول لتوليد iPSC عن طريق التعبير القسري لعوامل محددة في الخلايا الليفية في عام 2006 ، تم تطبيق هذه الطريقة على العديد من أنواع الخلايا المختلفة من أصول مختلفة19،20،21،22،23،24،25،26،27،28،29،30،31، 32. من بينها ، يمكن الحصول على الخلايا المشتقة من البول فقط بطريقة غير جراحية تماما. استنادا إلى البروتوكول الموصوف سابقا من قبل Zhou et al.33 ، يمكن للمرء عزل وتوسيع الخلايا من بول الرئيسيات حتى من العينات غير المعقمة ، عن طريق استكمال المضادات الحيوية واسعة الطيف15. والجدير بالذكر أن الخلايا المشتقة من البول التي تم أخذ عينات منها بواسطة هذا البروتوكول تظهر إمكانات عالية لإنتاج iPSCs ، في غضون فترة زمنية أقصر (تصبح المستعمرات مرئية في 5-15 يوما) من إعادة البرمجة التقليدية للخلايا الليفية (20-30 يوما ، في تجربتنا) ، وبمعدل نجاح مرتفع بما فيه الكفاية. تم تصنيف هذه الخلايا المشتقة من البول على أنها مجموعة مختلطة من الخلايا الشبيهة بالخلايا الجذعية الوسيطة والخلايا الظهارية للمثانة ، مما تسبب في كفاءة إعادة برمجة عالية15.

بالإضافة إلى الاختلاف في الخلايا الأولية ، تختلف طرق إعادة البرمجة لإنشاء iPSCs أيضا وفقا للغرض من الاستخدام. تم تنفيذ إجراءات إعادة البرمجة التقليدية للخلايا الجسدية البشرية من خلال الإفراط في التعبير عن عوامل إعادة البرمجة مع ناقلات الفيروسات القهقرية أو الفيروسات العدسية ، مما سمح بدمج الحمض النووي الخارجي في الجينوم5،34،35. للحفاظ على iPSCs المتولدة سليمة جينيا ، طور الباحثون مجموعة متنوعة من الأنظمة غير التكاملية - ناقل PiggyBac القابل للاستئصال 36,37 ، الناقل العرضي38,39 ، نواقل الفيروسات غير المدمجة مثل فيروس سينداي 40 والفيروس الغدي 41 ، نقل mRNA 42 ، نقل البروتين 43,44 ، ومعالجة المركبات الكيميائية 45. نظرا للكفاءة وسهولة التعامل ، يتم استخدام ناقلات إعادة البرمجة المستندة إلى فيروس Sendai في هذا البروتوكول. يتم إجراء إصابة الخلايا الأولية في ثقافة تعليق 1 ساعة من الخلايا والفيروسات في تعدد العدوى (MOI) من 5 قبل الطلاء. يمكن أن تزيد هذه الخطوة المعدلة من احتمالية الاتصال بين أسطح الخلايا والفيروسات ، مقارنة بالطريقة التقليدية التي تضاف فيها الفيروسات مباشرة إلى ثقافة الخلايا الملتصقة ، وبالتالي تنتج المزيد من مستعمرات iPSC15.

يمكن إجراء تمرير الخلايا الجذعية البشرية و NHP متعددة القدرات عن طريق تمرير التكتل وتمرير الخلية الواحدة. حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) هو عامل مخلب فعال من حيث التكلفة يربط أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم ، وبالتالي يمنع النشاط الملتصق للكاديرين والانتغرين. يستخدم EDTA أيضا ككاشف تفكك انتقائي خفيف ، حيث تنفصل الخلايا غير المتمايزة قبل الخلايا المتمايزة بسبب جزيئات الالتصاق المختلفة. يؤدي التفكك الكامل إلى موت الخلايا الهائل ل iPSCs الرئيسيات عبر الملف الملفوف المرتبط ب Rho / Rho الذي يحتوي على بروتين كيناز (Rho / Rock) بوساطة فرط تنشيط الميوسين. لذلك ، فإن استكمال وسط الاستزراع بمثبط Rho / Rock ضروري للتجارب التي تتطلب خلايا مفردة في تعليق46,47. في هذا البروتوكول ، نوصي بتمرير التكتل كطريقة مرور روتينية ونوصي بتمرير خلية واحدة فقط عندما يكون ذلك ضروريا ، على سبيل المثال ، عندما يكون البذر لأرقام الخلايا المحددة مطلوبا ، أو أثناء الاستنساخ الفرعي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على هذا الإجراء التجريبي من قبل لجنة الأخلاقيات المسؤولة عن التجارب البشرية (20-122 ، Ethikkommission LMU München). تم إجراء جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة.
ملاحظة: يجب الحصول على الموافقة من اللجنة الأخلاقية المناسبة قبل البدء في التجارب التي تتعامل مع العينات البشرية و NHP. يجب تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية وفقا للإرشادات واللوائح ذات الصلة. يجب تنفيذ كل خطوة من الخطوات التالية باستخدام تقنية معقمة في خزانة السلامة البيولوجية. يمكن العثور على جميع المخزن المؤقت وتركيبات الوسائط في الجدول التكميلي S1. تأكد من تسخين جميع الوسائط إلى درجة حرارة الغرفة (22 درجة مئوية) قبل إضافتها إلى الخلايا. يجب إجراء كل خطوة من خطوات الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة ، ما لم يذكر خلاف ذلك.

1. عزل الخلايا من عينات البول

تنبيه: تأكد من خلو المتبرعين من البشر من فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) وفيروس التهاب الكبد B (HBV) وفيروس التهاب الكبد C (HCV). بالنسبة ل NHPs ، تأكد من خلو المتبرعين / الخلايا المحتملة من مسببات الأمراض المحددة - فيروس B (BV) وفيروس نقص المناعة Simian (SIV) وفيروس Simian Betaretrovirus (SRV) وفيروس Simian T Cell Lymphotropic (STLV).

  1. قم بإعداد صفيحة 12 بئرا مغلفة بالجيلاتين عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من الجيلاتين 0.2٪ لكل بئر ، وتوزيع السائل عن طريق تحريك اللوحة. ضعه على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الحاجة.
  2. جمع عينات البول البشري في أنابيب مخروطية سعة 50 مل. بالنسبة للقرود ، اجمع البول من أرضية المنشأة الحيوانية باستخدام حقنة.
    ملاحظة: ثبت أن حجم 5 مل من البول كاف لعزل مستعمرة واحدة على الأقل في 42٪ من المحاولات. ومع ذلك ، يوصى باستخدام حجم أكبر من ~ 50 مل من البول لزيادة فرصة عزل المستعمرات. يجب أخذ عينات من بول NHP طازجة قدر الإمكان ، ويفضل أن يكون ذلك بعد التبول مباشرة. لم يكن لتخزين عينات البول عند 4 درجات مئوية لمدة 4 ساعات أي تأثير سلبي على معدل نجاح البروتوكول ، ولكن لم يتم اختبار أوقات التخزين الأطول.
  3. جهاز طرد مركزي الأنبوب المحتوي على البول عند 400 × غرام لمدة 10 دقائق ، ونضح بعناية المادة الطافية ، وترك حوالي 1 مل في الأنبوب.
  4. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل المتبقية من السائل. قم بتجميع المعلقات في أنبوب واحد إذا تم جمع أنابيب متعددة من البول.
  5. اغسل الخلايا بإضافة 10 مل من محلول غسيل البول (انظر الجدول التكميلي S1) الذي يحتوي على 2.5 ميكروغرام / مل من الأمفوتريسين إلى الأنبوب ، واخلط المعلق بعناية باستخدام ماصة مصلية.
  6. قم بطرد الأنبوب عند 200 × جم لمدة 10 دقائق ، واستنشق بعناية المادة الطافية ، تاركا حوالي <0.2 مل في الأنبوب.
  7. إعادة تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسط البول الأولي (انظر الجدول التكميلي S1) الذي يحتوي على 0.5 ميكروغرام / مل من الأمفوتريسين لكل 50 مل من البول المعالج في البداية (يعاد تعليقه في 1 مل ، حتى لو تمت معالجة أقل من 50 مل من البول).
  8. نضح الجيلاتين من الآبار (أعدت في الخطوة 1.1) ، ولوحة 1 مل من التعليق من الخطوة 1.7 في بئر واحد من لوحة 12 بئر. كرر لأكبر عدد ممكن من الآبار حسب الرغبة ، أو لأكبر عدد ممكن من الملليلترات من التعليق المتاح.
    اختياري: لتجنب التلوث الناجم عن جمع العينات غير الصحية ، أضف 100 ميكروغرام / مل من الكاشف المضاد للميكروبات إلى الخلايا من الآن فصاعدا ، حتى الممر الأول.
  9. ضع اللوحةفي حاضنة CO 2 37 درجة مئوية ، 5٪.
  10. أضف 1 مل من وسط البول الأساسي لكل بئر يوميا حتى اليوم 5 ، دون إزالة الوسط الموجود.
  11. في اليوم 5 ، نضح 4 مل من الوسط من اللوحة ، تاركا حوالي 1 مل من الوسط. أضف 1 مل من وسط REMC (انظر الجدول التكميلي S1) لكل بئر للحصول على خليط 1: 1 مع وسط الاستزراع الجديد.
  12. استبدل نصف الوسط بوسط REMC كل يوم حتى تظهر المستعمرات الأولى (الشكل 1 أ ، ب). لذلك ، قم بإزالة 1 مل من الوسط القديم ، وأضف 1 مل من وسط REMC الطازج لكل بئر.

2. توسيع الخلايا البولية

ملاحظة: يجب إجراء مرور الخلايا البولية قبل أن تصل الثقافة إلى التقاء 90٪.

  1. قم بإعداد الكمية المطلوبة من ألواح 12 بئرا المطلية بالجيلاتين ، كما هو مذكور في الخطوة 1.1.
  2. نضح الوسط القديم ، وغسل الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات في Dulbecco (DPBS).
  3. نضح DPBS ، وإضافة 300 ميكرولتر من إنزيم التفكك 0.5x المخفف مع DPBS. احتضان الطبق على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  4. أضف 700 ميكرولتر من وسط REMC لإيقاف التفاعل الأنزيمي. ماصة التعليق برفق باستخدام ماصة P1000 حتى يتم فصل الخلايا إلى خلايا مفردة.
  5. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 مل ، والطرد المركزي الأنبوب في 200 × غرام لمدة 5 دقائق.
  6. قم بشفط المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من وسط REMC.
  7. عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا (مقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي).
  8. لتوسيع الخلايا البولية ، لوحة 1.5 × 10 4 إلى 3 × 104 خلايا في 1 مل من وسط REMC في لوحة واحدة ذات 12 بئرا مغطاة ب 0.2٪ جيلاتين.
  9. قم بإجراء تغييرات متوسطة لاحقة كل يوم حتى تصل الثقافة إلى التقاء 80٪ -90٪. لذلك ، قم بنضح الوسط القديم وأضف 1 مل من وسط REMC الطازج.

3. توليد iPSCs بواسطة عدوى ناقل فيروس سينداي

ملاحظة: للاطلاع على سير عمل إجراء إعادة البرمجة، انظر الشكل 2 أ. يجب أن تكون الخلايا البولية المستخدمة لإعادة البرمجة صغيرة قدر الإمكان ، ولكن لا يلاحظ فقدان ملحوظ في كفاءة إعادة البرمجة قبل المرور 4. يجب استخدام مجموعة أدوات إعادة برمجة فيروسات سينداي في منشأة BL-2. تعامل مع الفيروسات تحت خزانة السلامة البيولوجية مع التدفق الصفحي ، واستخدم دائما معدات السلامة المناسبة لمنع التعرض للغشاء المخاطي.

  1. قم بإعداد صفيحة 12 بئرا مغلفة بمصفوفة الغشاء القاعدي عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي لكل بئر ، وتوزيع السائل عن طريق تحريك اللوحة. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل ، واستبدل مصفوفة الغشاء القاعدي ب 900 ميكرولتر من وسط REMC. يخزن الطبق على حرارة 37 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. قم بإذابة مكونات مجموعة Sendai Reprogramming Kit بسرعة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. امزج فيروسات سينداي (polycistronic KLF4-OCT3 / 4-SOX2 و cMYC و KLF4) مع MOI من 5 ، وأضف وسيط REMC حتى 100 ميكرولتر. استخدم المعادلة (1):
    Equation 1
    ملاحظة: نظرا لاختلاف عيار الفيروس بين الدفعات ، تحقق دائما من العيار في شهادة التحليل التي توفرها الشركة المصنعة.
    اختياري: استخدم بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) فيروس سينداي بالإضافة إلى ذلك كعنصر تحكم إيجابي لكفاءة النقل. لهذا ، قم بإعداد 3.5 × 104 خلايا إضافية في أنبوب منفصل خلال الخطوة 3.3.
  3. لتفكك الخلايا البولية ، اتبع الخطوات 2.2-2.4. عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا ، وانقل 7 × 104 خلايا بولية إلى أنبوب سعة 1.5 مل.
  4. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 200 × جم لمدة 5 دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية بعناية دون تعطيل حبيبات الخلية. أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من خليط SeV المحضر في الخطوة 3.2. احتضان الأنبوب لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية لعدوى التعليق.
  5. لوحة التعليق على لوحة الغشاء القاعدي المغلفة بمصفوفة 12 بئرا التي تم إعدادها في الخطوة 3.1. بشكل روتيني ، اللوحة 1 × 10 4 و 2.5 × 104 خلايا لكل بئر في التكرارات.
  6. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. استبدل الوسط ب 1 مل من وسط REMC الطازج بعد 24 ساعة من النقل وفي اليوم 3.
  7. في اليوم 5 بعد التحويل ، قم بتغيير الوسيط إلى وسيط توليد PSC (انظر الجدول التكميلي S1) ، مع تغييرات وسيطة لاحقة كل يومين. لذلك ، قم بإزالة الوسط القديم وإضافة 1 مل من وسيط توليد PSC لكل بئر.
    ملاحظة: قد يستغرق الأمر ما يصل إلى 15 يوما حتى تظهر المستعمرات الأولى.
  8. اختر مستعمرات iPSC الفردية عندما يتجاوز حجم المستعمرة 1 مم. للقيام بذلك ، كشط وجمع بعناية مستعمرة واحدة مع ماصة p10 تحت المجهر. نقل المستعمرة إلى بئر جديد من صفيحة 12 بئرا مغطاة بمصفوفة غشاء قاعدي تحتوي على 750 ميكرولتر من وسط زراعة PSC.
    اختياري: شطف اللوحة باستخدام DPBS ومعالجتها لمدة 1 دقيقة باستخدام 0.5 mM EDTA قبل الانتقاء يمكن أن يدعم الثقافة القوية لمزيد من الخطوات. إذا كان سيتم استزراع الخلايا لفترة أطول لانتظار المستعمرات الناشئة لاحقا ، فلا تقم بإجراء خطوة علاج EDTA هذه.
  9. تنمو الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 مع تغييرات متوسطة لاحقة كل يوم ، كما هو مذكور في القسم 4 من البروتوكول. عندما تصل المستعمرة المنتقاة إلى قطر 2 مم ، استمر في المرور الروتيني iPSC ، كما هو موضح في القسم 5 من البروتوكول.

4. تغيير متوسط

ملاحظة: يجب تغيير وسط الاستزراع كل يوم حتى تنمو المستعمرات بشكل كبير بما يكفي للمرور.

  1. نضح الوسط القديم وأضف 750 ميكرولتر من الوسط الطازج لكل طبق من 12 بئرا. للتبديل إلى نوع مختلف من الوسائط ، استبدل الوسيط بعد 1 يوم على الأقل من المرور.

5. المرور

ملاحظة: يجب تمرير الخلايا عندما تنمو مستعمرات iPSC كبيرة بما يكفي (قطرها > 2 مم) ، أو عندما تكون المستعمرات على وشك لمس بعضها البعض. بشكل روتيني ، يمكن تقسيم iPSCs كل 5 أيام تقريبا. استخدم تمرير التكتل (الخطوة 5.1) للصيانة الروتينية ، وتمرير الخلية الواحدة (الخطوة 5.2) للتجارب التي تتطلب عددا محددا من الخلايا. في حالة اختلاف iPSCs كثيرا ، يمكن أن يساعد قطف المستعمرات (الخطوة 5.3) في تحسين نقاء الثقافات.

  1. التكتل العابر
    1. قم بإعداد صفيحة 12 بئرا مغلفة بمصفوفة الغشاء القاعدي عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي لكل بئر ، وتوزيع السائل عن طريق تحريك اللوحة. احتضان اللوحة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل. استبدل مصفوفة الغشاء القاعدي ب 500 ميكرولتر من وسط زراعة PSC وقم بتخزين اللوحة عند 37 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    2. نضح الوسط من الخلايا المستزرعة ، واغسل الخلايا بإضافة 500 ميكرولتر من DPBS بعناية. قم بإزالة DPBS وإضافة 500 ميكرولتر من 0.5 mM EDTA إلى البئر.
    3. احتضان اللوحة في RT لمدة 2-5 دقائق ، حتى تبدأ المستعمرات في الانفصال. مراقبة بعناية الخلايا تحت المجهر.
    4. عندما تبدأ حواف المستعمرات في التقشر وتصبح الفجوات بين الخلايا مرئية (الشكل 3 أ) ، قم بإزالة EDTA وأضف بعناية 500 ميكرولتر من DPBS.
      ملاحظة: دائما ماصة على الجدار الجانبي للبئر وليس مباشرة على الخلايا ، حتى لا تفصل الخلايا عن اللوحة.
    5. نضح DPBS واغسل البئر ب 500 ميكرولتر من وسط زراعة PSC باستخدام ماصة p1000. ماصة لأعلى ولأسفل 1x-5x لتفريق المستعمرات إلى كتل ذات حجم مناسب (الشكل 3 أ). لا ماصة أكثر من اللازم.
      ملاحظة: إذا تم سحب iPSCs عن طريق الخطأ أكثر من اللازم ، أضف 10 ميكرومتر من مثبط الصخور Y-27632 إلى الوسط. هذا يمكن أن يعزز البقاء على قيد الحياة ، حيث أن iPSCs غير قادرة على البقاء على قيد الحياة كخلايا مفردة.
    6. نقل 1 / 10-1 / 50 من تعليق كتلة الخلية إلى الآبار الجديدة. تعتمد النسبة على التقاء البئر قبل الانقسام ، والكثافة المطلوبة للخلايا المصنفة ، وتفضيل iPSC النسيلي.
    7. وزع الكتل بالتساوي في البئر عن طريق تحريك اللوحة برفق ذهابا وإيابا عدة مرات. احتضن الطبق لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية للسماح للكتل بالالتصاق.
    8. استبدل الوسط ب 750 ميكرولتر من وسط زراعة PSC إذا لوحظت العديد من الخلايا الميتة العائمة ؛ خلاف ذلك ، أضف 250 ميكرولتر من وسط ثقافة PSC. ضع اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في حاضنة.
      ملاحظة: يعد الاستبدال المتوسط بعد 30 دقيقة أمرا بالغ الأهمية ، خاصة بالنسبة لخطوط الخلايا غير المستقرة (مثل NHPs).
    9. قم بتغيير الوسط كل 2-3 أيام حتى تنمو المستعمرات بشكل كبير بما يكفي للمرور. للتغيير المتوسط ، اتبع الخطوة 4 من البروتوكول.
  2. تمرير خلية واحدة
    1. قم بإعداد لوحة الاستزراع المغلفة بمصفوفة الغشاء القاعدي ، كما هو مذكور في الخطوة 5.1.1 ، مع إضافة 10 ميكرومتر Y-27632 إلى وسط الاستزراع PSC.
      اختياري: أضف 10 ميكرومتر Y-27632 إلى الخلايا 1-3 ساعات قبل المرور لتعزيز بقاء خطوط الخلايا الحساسة.
    2. نضح الوسط وغسل الخلايا بإضافة 500 ميكرولتر من DPBS. قم بإزالة DPBS وإضافة 300 ميكرولتر من محلول الانفصال إلى الآبار.
    3. احتضان الطبق على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق. عندما يلاحظ انفصال كاف للخلايا تحت المجهر ، أضف 700 ميكرولتر من وسط زراعة PSC أو DPBS.
    4. ماصة صعودا وهبوطا 5-10x باستخدام ماصة p1000 حتى يتم فصل الخلايا إلى خلايا واحدة. لا ماصة أكثر من اللازم ، من أجل منع تلف الخلايا.
    5. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 2 مل على الأقل من DPBS لتخفيف محلول الانفصال.
    6. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 200 × جم لمدة 5 دقائق ونضح المحلول تماما ، دون تعطيل حبيبات الخلية.
    7. أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من وسط الاستزراع PSC المكمل ب 10 ميكرومتر Y-27632.
    8. عد الخلايا والبذور 5000-7000 خلية لكل صفيحة 12 بئرا مغلفة بمصفوفة غشاء القاعدية ، محضرة في الخطوة 5.2.1.
      ملاحظة: إذا كانت هناك حاجة إلى رقم خلية مختلف ، فقم بالتغيير إلى بئر أكبر أو أصغر وفقا لذلك.
    9. احتضن اللوحة لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 للسماح للخلايا بالتعلق.
    10. استبدل الوسط ب 750 ميكرولتر من وسط زراعة PSC + 10 ميكرومتر Y-27632 إذا لوحظت العديد من الخلايا الميتة ؛ خلاف ذلك ، أضف 250 ميكرولتر + 10 ميكرومتر Y-27632.
      ملاحظة: هذه الخطوة بالغة الأهمية ، خاصة بالنسبة لخطوط الخلايا غير المستقرة (مثل NHPs).
    11. ضع اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في حاضنة.
    12. قم بتغيير الوسيط إلى وسط ثقافة PSC بدون Y-27632 بعد 1 إلى 2 أيام من الانقسام ، للسماح للخلايا بعرض مورفولوجيا المستعمرة الكلاسيكية مرة أخرى (الشكل 3 ب).
    13. تغيير المتوسطة كل 2 أيام حتى تنمو المستعمرات كبيرة بما فيه الكفاية. للتغيير المتوسط ، اتبع القسم 4 من البروتوكول.
  3. تمرير iPSCs عن طريق قطف المستعمرة
    1. تحضير مصفوفة الغشاء القاعدي المغلفة ب 12 بئرا كما هو مذكور في الخطوة 5.1.1.
    2. نضح الوسط وغسل الخلايا عن طريق إضافة 500 ميكرولتر بعناية من DPBS. قم بإزالة DPBS وإضافة 500 ميكرولتر من 0.5 mM EDTA إلى البئر.
    3. احتضان اللوحة في RT لمدة 1-3 دقائق ومراقبة الخلايا تحت المجهر ، حتى يكون انفصال المستعمرة مرئيا على الحدود.
    4. قم بإزالة EDTA وأضف بعناية 500 ميكرولتر من DPBS. قم بشفط السائل قبل إضافة 500 ميكرولتر ببطء من وسط زراعة PSC إلى البئر ، دون فصل الخلايا.
    5. استخدم ماصة p200 لاختيار المستعمرة المطلوبة تحت المجهر ، دون جمع الخلايا المتمايزة. للقيام بذلك ، خدش بلطف على المستعمرة أثناء تناول الخلايا التي تحتوي على الوسط.
    6. نقل كل مستعمرة منتقاة إلى بئر واحد مغطى بمصفوفة غشاء قاعدي ، كما هو معد في الخطوة 5.3.1. افصل الخلايا إلى كتل صغيرة باستخدام ماصة p1000 ، عن طريق سحب الخلايا 2-5x.
    7. احتضن اللوحة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 ، مما يسمح للكتل بالالتصاق.
    8. استبدل الوسط ب 750 ميكرولتر من وسط زراعة PSC إذا لوحظت العديد من الخلايا الميتة العائمة ؛ خلاف ذلك ، أضف 250 ميكرولتر من وسط ثقافة PSC.
      ملاحظة: يعد الاستبدال المتوسط بعد 30 دقيقة أمرا بالغ الأهمية ، خاصة بالنسبة لخطوط الخلايا غير المستقرة (على سبيل المثال ، NHPs).
    9. ضع اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في حاضنة.
    10. قم بتغيير الوسط كل 2-3 أيام حتى تنمو المستعمرات بشكل كبير بما يكفي للمرور. للقيام بذلك ، اتبع القسم 4 من البروتوكول.

6. تجميد الخلايا البولية و iPSCs للتخزين على المدى الطويل

ملاحظة: بشكل روتيني ، يتم تجميد iPSCs ككتل في وسط تجميد الخلية دون عد. يجب أن يكون السحب ضئيلا ، لتجنب التفكك إلى خلايا مفردة. بالنسبة للخلايا البولية ، بشكل روتيني ، يتم تجميد 1.5 × 104 إلى 3 × 104 خلايا لكل أنبوب ، مما يسمح للمستخدم بإذابة أنبوب واحد مباشرة في بئر واحد من صفيحة 12 بئرا دون الحاجة إلى خطوة عد أخرى.

  1. تحضير 5 مل من DPBS في أنبوب 15 مل.
  2. لتجميد الخلايا البولية ، اتبع الخطوات 2.2-2.4 من البروتوكول. لتجميد iPSCs ، اتبع الخطوات 5.1.2-5.1.5 من بروتوكول تمرير التكتل.
  3. انقل التعليق إلى الأنبوب سعة 15 مل المحضر في الخطوة 6.1. لتجميد الخلايا البولية ، عد 10 ميكرولتر من تعليق الخلية باستخدام مقياس الدم. أجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 200 × غرام ، ونضح طاف طاف تماما.
  4. أعد تعليق حبيبات الخلية في 400 ميكرولتر من وسط تجميد الخلية لكل أنبوب ، وقم بتوزيع الخلايا على الكمية المطلوبة من أنابيب التبريد.
  5. انقل أنابيب التبريد على الفور إلى -80 درجة مئوية. انقل الأنابيب المجمدة إلى فريزر -150 درجة مئوية أو النيتروجين السائل بعد يوم واحد من التجميد عند -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.

7. إذابة الخلايا البولية و iPSCs

  1. لإذابة الخلايا البولية ، قم بإعداد الكمية المطلوبة من 12 بئرا مغلفة بالجيلاتين ، كما هو مذكور في الخطوة 1.1 من البروتوكول. بالنسبة ل iPSCs ، قم بإعداد ألواح 12 بئرا المغلفة بمصفوفة الغشاء القاعدي ، كما هو مذكور في الخطوة 5.1.1. في كلتا الحالتين ، لا تبادل المصفوفة مع المتوسطة.
  2. قم بإعداد أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 4 مل من DPBS ، وقم بتخزينه عند 37 درجة مئوية.
  3. ضع قارورة مجمدة من الخلايا بسرعة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية للذوبان ، حتى تصبح قطعة من الثلج العائم مرئية.
    ملاحظة: امسح أنبوب التبريد بالإيثانول قبل وبعد الحضانة في حمام مائي لتجنب التلوث.
  4. أضف 500 ميكرولتر من وسط REMC للخلايا البولية ، أو 500 ميكرولتر من وسط زراعة PSC ل iPSCs إلى التعليق المحتوي على الجليد ، وانقل المعلق على الفور إلى أنبوب 15 مل الذي تم تسخينه مسبقا والمحضر في الخطوة 7.2.
  5. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 200 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية تماما.
  6. بالنسبة للخلايا البولية ، أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من وسط REMC. بالنسبة إلى iPSCs ، أعد تعليق الحبيبات بعناية في 750 ميكرولتر من وسط زراعة PSC. تجنب سحب الكتل أكثر من اللازم ، من أجل الحفاظ على الكتل سليمة.
    اختياري: يمكن أن يدعم استكمال الوسط ب 10 ميكرومتر Y-27632 بقاء iPSCs بعد الذوبان.
  7. قم بنضح المصفوفة من لوحات 12 بئرا المحضرة في الخطوة 7.1 ، وانقل تعليق الخلية بعناية إلى البئر.
  8. ضع اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في حاضنة.
  9. في اليوم التالي ، استبدل الوسيط بوسط زراعة PSC ، بدون Y-27632 ل iPSCs ومع REMC للخلايا البولية.
  10. تنمو الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في حاضنة.
  11. قم بتغيير الوسط كل 2-3 أيام حتى تنمو الخلايا بشكل كبير بما يكفي للمرور. للتغيير المتوسط ، اتبع القسم 4 من البروتوكول.

8. الكيمياء المناعية

ملاحظة: يعد التلوين المناعي بالأجسام المضادة التي تستهدف العلامات المرتبطة بتعدد القدرات مثل NANOG و OCT3 / 4 و SOX2 و TRA-1-60 و EpCAM أحد أكثر عمليات التحقق استخداما على نطاق واسع من iPSCs التي تم إنشاؤها حديثا. يمكن العثور على مزيد من المعلومات حول الأجسام المضادة والتخفيفات في جدول المواد.

  1. لوحة iPSCs 1-3 أيام قبل الاستخدام في عدد مناسب من 12 لوحة بئر. نضح الوسط ، وغسل الخلايا بإضافة 500 ميكرولتر من DPBS ، وإزالة DPBS. أضف 400 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) لكل بئر ، وقم بإصلاح الخلايا لمدة 15 دقيقة في RT.
  2. قم بإزالة 4٪ PFA ، واغسل الخلايا 3x باستخدام DPBS. أضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للانسداد لكل بئر ، واحتضن اللوحة لمدة 30 دقيقة في RT.
  3. قم بنضح المخزن المؤقت المانع ، وأضف الأجسام المضادة المخففة في 400 ميكرولتر من محلول تخفيف الأجسام المضادة (ADB) إلى كل بئر. احتضن الطبق على حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل.
  4. قم بإزالة ADB الذي يحتوي على الأجسام المضادة الأولية ، واغسل الخلايا 3x باستخدام DPBS.
  5. نضح DPBS ، وإضافة 400 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المخففة في ADB لكل بئر. احتضان اللوحة لمدة 1 ساعة في RT في الظلام.
  6. قم بإزالة ADB ، واغسل الخلايا 3x باستخدام DPBS. أضف 1 ميكروغرام / مل 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI) مخفف في DPBS لكل بئر ، واحتضانه لمدة 3 دقائق في RT.
  7. نضح محلول DAPI ، واغسل الخلية 3x باستخدام DPBS. أضف 500 ميكرولتر من DPBS للتصوير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

عند عزل الخلايا عن بول الإنسان و NHP ، يمكن تحديد أنواع مختلفة من الخلايا مباشرة بعد العزل. تفرز الخلايا الحرشفية ، وكذلك الخلايا المستديرة الأصغر ، مع البول. يحتوي بول الإناث على خلايا حرشفية أكثر بكثير من بول الذكور (الشكل 1B - اليوم 0 ؛ الشكل التكميلي S1). بعد 5 أيام من المزرعة في وسط البول الأولي ، يمكن رؤية أول خلايا متكاثرة ملتصقة (الشكل 1 أ ، ب - اليوم 5). في هذه المرحلة ، يتم استبدال نصف الوسط بوسط انتشار REMC كل يوم ، حتى تظهر المستعمرات الأولى. في اليوم 13 تقريبا ، تنمو الخلايا الملتصقة إلى مستعمرات كبيرة يمكن مرورها (الشكل 1 ب - اليوم 13). يمكن تشكيل هذه المستعمرات من نوعين مختلفين من الخلايا شكليا - أحدهما له نمط ظاهري أكثر شبها بالظهارة مع نمو الخلايا بشكل وثيق ، والآخر يظهر مورفولوجيا أكثر شبها باللحمة المتوسطة مع شكل ممدود وقدرة هجرة أعلى (الشكل 1C). بعد الممر الأول ، تنمو الخلايا البولية كطبقة أحادية ، ويمكن تمريرها عندما تصل الثقافة إلى التقاء 80٪ (الشكل 1 ب - اليوم 17).

Figure 1
الشكل 1: عزل الخلايا البولية وزراعتها. أ: سير العمل لتكوين الخلايا البولية من عينات الرئيسيات البشرية وغير البشرية. (ب) صور تباين الطور توضح نمو الخلايا البولية وتكوين مستعمرتها حتى الممر الأول (p1). (ج) يمكن تمييز نوعين مختلفين من الخلايا المعزولة من عينات البول بعد 2 أسابيع من الثقافة. قضبان المقياس = 250 ميكرومتر (B ، C). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

لتوليد iPSCs من الخلايا البولية ، يتم استخدام نقل مع فيروسات سينداي التي تقدم عوامل ياماناكا OCT3 / 4 و SOX2 و KLF4 و c-MYC. لزيادة كفاءة النقل ، يتم تحضين الخلايا البولية بالفيروس لمدة 1 ساعة في التعليق ، قبل البذر في آبار مغلفة بمصفوفة الغشاء القاعدي (الشكل 2 أ). يمكن رؤية بعض الخلايا الملتصقة في الآبار بعد يوم واحد من النقل (الشكل 2B - اليوم 1). بعد 5-10 أيام ، تبدأ هذه الخلايا في تكوين مستعمرات ، ويمكن ملاحظة التغيرات المورفولوجية المبكرة ، مما يشير إلى إعادة برمجة الخلايا (الشكل 2B - اليوم 14). تظهر العديد من هذه المستعمرات تدريجيا مورفولوجيا شبيهة ب ESC ، ويمكن قطفها في وسط ثقافة PSC عندما يتجاوز القطر 1 مم. بعد الانتقاء ، تشكل الخلايا مستعمرات تعرض مورفولوجيا ESC النموذجية في غضون 4 أيام تقريبا (الشكل 2 ب - الأيام 21 و 24). عندما تنمو مستعمرات iPSC بشكل كبير بما فيه الكفاية ، يمكن تمرير الخلايا لأول مرة باستخدام بروتوكول تمرير التكتل (بروتوكول الخطوة 5.1).

تم استخدام نهج إعادة البرمجة هذا لتوليد iPSCs من البشر ، غوريلا الغوريلا (الغوريلا ) ، وبونغو أبيلي (إنسان الغاب)15. في حين أن احتمال الحصول على الخلايا البولية متغير تماما ، وأقل بمرتين إلى ثلاث مرات على الأقل بالنسبة للشمبانزي مقارنة بالبشر15 ، فإن إعادة برمجة الخلايا البولية التي تم الحصول عليها كانت ناجحة في الغالب في تجربتنا. بشكل عام ، تؤدي 0.19٪ من الخلايا البولية المصابة إلى ظهور مستعمرات ذات مورفولوجيا تشبه ESC ، مما يؤدي إلى مستعمرة واحدة على الأقل في 87٪ من محاولات إعادة البرمجة15. تشترك جميع iPSCs التي تم إنشاؤها في نفس الخصائص وتظهر مورفولوجيا مستعمرة نموذجية تشبه ESC ، تتميز بخلايا معبأة بإحكام مع حواف محددة بوضوح (الشكل 2C). بالإضافة إلى ذلك ، تعرض جميع iPSCs نمطا نوويا عاديا ، وتم التحقق من عدم وجود متجهات إعادة برمجة SeV بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل بعد خمسة مقاطع على الأقل ، على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة لمجموعة إعادة برمجة SeV (البيانات غير معروضة) 15. تستخدم الكيمياء المناعية لاختبار التعبير عن البروتينات المرتبطة بتعدد القدرات في النواة ، مثل NANOG و OCT3 / 4 و SOX2. يمكن أيضا استخدام علامات السطح مثل TRA-1-60 و EpCAM و SSEA4 (الشكل 2D) ؛ ومع ذلك ، يتم التعبير عن SSEA4 أيضا في الخلايا البولية15. علاوة على ذلك ، يمكن إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي باستخدام هذه العلامات السطحية لتوفير معلومات كمية عن حالة تعدد القدرات ل iPSCs (الطريقة التي وصفها Ohnuki et al.48). يستخدم هذا النهج لإظهار أن 95.3٪ من iPSCs إنسان الغاب التي تم تحليلها إيجابية ل TRA-1-60 (الشكل 2E). علاوة على ذلك ، يمكن إثبات قدرة التمايز ل NHP iPSCs من خلال تمايز الجسم الجنيني في المختبر (EB) (الطريقة التي وصفها Geuder et al.15). كما هو موضح في الشكل 2F ، فإن iPSCs الغوريلا قادرة على التمايز إلى سلالات الأديم الباطن (ɑ-fetoprotein) ، والأديم المتوسط (ɑ-Smooth عضلي أكتين) ، والأديم الظاهر (β-III tubulin).

Figure 2
الشكل 2: توليد وتوصيف iPSCs المشتقة من البول. (أ) إعادة برمجة سير عمل الخلايا المشتقة من البول. (ب) صور تباين الطور التي توضح التغيرات المورفولوجية للخلايا البولية للغوريلا أثناء إعادة البرمجة حتى إنشاء مستعمرات iPSC. قضبان المقياس = 500 ميكرومتر. (ج) مورفولوجيا مستعمرات iPSC المنشأة من مزارع الخلايا البشرية والغوريلا وإنسان الغاب. قضبان المقياس = 500 ميكرومتر. (د) تلطيخ التألق المناعي ل iPSCs الغوريلا مع علامات مرتبطة بتعدد القدرات في المقطع 8: NANOG و OCT3 / 4 و SSEA4 و SOX2 و EpCAM و TRA-1-60. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. (ه) تحليل التدفق الخلوي لإنسان الغاب iPSCs الملطخة بمضاد TRA-1-60-PE. تم استخدام الخلايا غير الملوثة كعنصر تحكم. (F) تحليل التألق المناعي للأديم الباطن (AFP) والأديم المتوسط (ɑ-SMA) والأديم الظاهر (β-III TUB) بعد تمايز الجسم الجنيني ل iPSCs الغوريلا. تم تلطيخ النوى ب DAPI. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: iPSCs = الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات. PE = فيكوريثرين. AFP = α فيتوبروتين ؛ ɑ-SMA = أكتين العضلات الملساء ألفا ؛ β-III TUB = بيتا الثالث توبولين ؛ DAPI = 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

عندما تصل مستعمرات iPSC إلى قطر يبلغ حوالي 2 مم ، أو على وشك لمس بعضها البعض ، يجب تقسيم الخلايا. نقترح استخدام بروتوكول تمرير التكتل للصيانة الروتينية. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام 0.5 mM EDTA لفصل الخلايا لمدة 3-5 دقائق ، اعتمادا على حجم المستعمرة. أثناء حضانة EDTA ، تبدأ حدود المستعمرات في التقشر ، وتظهر فجوات مرئية بين الخلايا (الشكل 3 أ). يجب إزالة EDTA عند ملاحظة انفصال مناسب تحت المجهر. الحضانة المطولة مع EDTA يؤدي إلى جزء أعلى من الخلايا المفردة غير القادرة على البقاء على قيد الحياة. بعد ذلك، يجب فصل الخلايا إلى كتل ذات حجم مماثل، كما هو موضح في الشكل 3 أ. لا ينبغي فصل الخلايا إلى كتل صغيرة ، لأن هذا يقلل من البقاء على قيد الحياة ويمكن أن يؤدي إلى خلايا أكثر تمايزا.

عندما تتطلب التجربة بذر عدد محدد من الخلايا ، يجب استخدام بروتوكول تمرير الخلية الواحدة. يتضمن هذا البروتوكول استكمال الوسط بمثبط الصخور ، والذي يمكن الخلايا المفردة من البقاء على قيد الحياة. من المتوقع أن تظهر الخلايا المفردة المرفقة مورفولوجيا مختلفة ، مقارنة بالخلايا التي تنمو في مستعمرة بعد بذر التكتل (الشكل 3B - اليوم 0). بعد 1-2 أيام من المزرعة ، تبدأ الخلايا المفردة في النمو لتصبح مستعمرات مرة أخرى ، مع الحفاظ على مورفولوجيتها بالإضافة إلى ملامسة الخلية والخلية السائبة ، إذا تمت إضافة مثبط الصخور إلى الوسط (الشكل 3 ب - اليوم 2). عند ملاحظة هذه المستعمرات الصغيرة ، يجب إزالة مثبط الصخور من الوسط ، مما يسمح للخلايا بعرض التشكل النموذجي الشبيه ب ESC مرة أخرى (الشكل 3B - اليوم 4).

للحكم على ما إذا كانت مستعمرة iPSC ذات جودة عالية ، يجب مراعاة العديد من الجوانب. أولا ، من الطبيعي ألا تظهر المستعمرات الصحية أي تمايز تلقائي أو كمية صغيرة منه. ومع ذلك ، فإن زيادة عدد الخلايا المتمايزة (>10٪) يدل على ضعف جودة iPSC. الخصائص الإضافية لجودة iPSC المنخفضة هي فقدان سلامة الحدود وتوحيدها (الشكل 3C: يمين) ، بالإضافة إلى التغليف الخلوي الفضفاض مع وجود فجوات مرئية بين الخلايا (الشكل 3D: يمين). في المقابل ، تتميز iPSCs عالية الجودة بحدود محددة ، وتغليف خلوي محكم ، ونواة بارزة (الشكل 3C ، D: الصور اليسرى).

Figure 3
الشكل 3: ثقافة iPSC الرئيسيات . (أ) صور تباين الطور التي تظهر انفصال مستعمرات iPSC أثناء حضانة EDTA بعد بروتوكول تمرير التكتل وحجم التكتل الأمثل بعد التفكك. أشرطة المقياس = 250 ميكرومتر. (B) الجدول الزمني لاستعادة iPSC بعد مرور خلية واحدة. تمت إزالة مثبط الصخور Y-27632 من اليوم 2 فصاعدا. قضبان المقياس = 250 ميكرومتر. (C) اليسار: مثال على مستعمرة iPSC بشرية عالية الجودة ذات حدود محددة. على اليمين: مثال على مستعمرة ذات نوعية رديئة تظهر تكاملا أقل للحدود وخلايا متباينة. أشرطة المقياس = 500 ميكرومتر. (د) أمثلة على صور لمستعمرة iPSC بشرية عالية الجودة (يسار) مقارنة بمستعمرة منخفضة الجودة بها خلايا معبأة بشكل فضفاض (يمين). قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. اختصار: iPSCs = الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي S1: نظرة عامة على أنواع الخلايا الموجودة في بول الإنسان. أ: الخلايا المعزولة من بول الأنثى. ب: الخلايا المعزولة من بول الذكور. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي S1: المخزن المؤقت والتراكيب الإعلامية المستخدمة في هذه الدراسة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تعد iPSCs أنواعا قيمة من الخلايا لأنها تسمح بتوليد أنواع الخلايا التي يتعذر الوصول إليها في المختبر. كمواد أولية لإعادة البرمجة ، على سبيل المثال ، لا تتوفر الخلايا الليفية بسهولة من جميع أنواع الرئيسيات ، تقدم هذه الورقة بروتوكولا لتوليد iPSCs من الخلايا المشتقة من البول. يمكن الحصول على هذه الخلايا بطريقة غير جراحية ، حتى من عينات بول الرئيسيات غير المعقمة ، عن طريق استكمال وسط الاستزراع بالمضادات الحيوية واسعة الطيف.

هناك العديد من الخطوات الحاسمة في البروتوكول تستحق بعض المناقشة الإضافية. أولا ، عند عزل الخلايا عن البول غير المعقم ، من المهم استكمال الوسط بكاشف مضاد للميكروبات واسع الطيف لتقليل خطر التلوث. إذا أصبح نمو التلوث الميكروبيولوجي واضحا على الرغم من استخدام المضادات الحيوية ، فمن المستحسن التخلص من الثقافة بأكملها وتطهير المنطقة ؛ بالإضافة إلى ذلك ، في تجربتنا ، لا ينتج عن الزراعة المستمرة خلايا بولية صحية متنامية. ثانيا ، عند البدء في إعادة برمجة الخلايا ، يوصى بشدة بإعداد عدة أطباق بأعداد مختلفة من الخلايا المنقولة ب SeV ، لتجنب خطر انفصال جميع الخلايا عن طريق الالتقاء الزائد وزيادة احتمالية اكتساب iPSC. بشكل عام ، من المتوقع أن يؤدي طلاء كثافة أعلى من الخلايا المحولة إلى SeV إلى إنتاج المزيد من مستعمرات iPSC المعاد برمجتها ، في حين أن زراعة خلايا إعادة البرمجة لمدة ~ 20 يوما غالبا ما يؤدي إلى فرط الالتقاء ، يليه انفصال البئر بأكمله. ثالثا ، في كل خطوة تتطلب تفكك iPSCs ، من الأهمية بمكان تجنب السحب المكثف ، مما يؤدي إلى موت الخلايا بشكل كبير. خاصة عند إجراء مرور التكتل ، من المهم الحفاظ على الكتل بحجم مناسب (الشكل 3 أ). قد تؤدي الكتل الكبيرة جدا إلى تمايز سريع ، في حين أن الكتل الصغيرة جدا يمكن أن تقلل من البقاء على قيد الحياة.

لاحظنا أن احتمال الحصول على الخلايا البولية متغير تماما بين العينات والقسامة، لكننا لم نجد أي دليل على أن الكميات الأصغر لها معدل نجاح أقل في الحصول على المستعمرات. بشكل عام ، قمنا بعزل ما معدله 7.6 مستعمرة من 100 مل من البول البشري. بافتراض هذا المعدل المتوسط وتوزيع بواسون ، فإن الحصول على مستعمرة واحدة على الأقل له احتمال ~ 98٪ ل 50 مل و ~ 30٪ ل 5 مل من المواد الأولية. في حالتنا ، كان من الممكن عزل مستعمرة واحدة على الأقل من 5 مل من البول البشري في 42 ٪ من المحاولات15. بناء على ذلك ، لا يزال عزل المستعمرات يستحق المحاولة ، حتى لو كانت كميات صغيرة فقط من البول متاحة. في حالة فشل إعادة برمجة الخلايا البولية ، ولا يمكن ملاحظة أي مستعمرات iPSC ، يمكن أن يؤدي طلاء أعداد مختلفة من الخلايا المنقولة إلى إعادة برمجة الخلايا المشتقة من البول. يمكن أيضا تحديد مستعمرات iPSC الناشئة على أنها iPSCs عن طريق التلوين الحي باستخدام علامات السطح (على سبيل المثال ، TRA-1-60 أو الفوسفاتيز القلوي [AP] ؛ البيانات غير معروضة). من المعروف أن نشاط AP يتم تنظيمه في الخلايا الجذعية متعددة القدرات ، ويمكن استخدامه لتلطيخ الخلايا الجذعية بشكل عابر أثناء عملية الاستزراع. مأزق آخر محتمل للبروتوكول هو الثقافة المثلى ل NHP iPSCs. باستخدام هذا البروتوكول ، أكدنا أن الإنسان و NHP iPSCs يحافظان على حالتهما متعددة القدرات لأكثر من 50 مقطعا باستخدام وسيط متاح تجاريا. ومع ذلك ، بالمقارنة مع iPSCs البشرية ، فإن NHP iPSCs أكثر عرضة للتمييز التلقائي في تجربتنا ، ربما بسبب ظروف الثقافة التي تم تحسينها للإنسان وليس لثقافات NHP. بالإضافة إلى ذلك ، هناك تباين كبير بين استنساخ iPSC في معدلات البقاء على قيد الحياة بعد الطلاء ، وسرعة النمو ، وميل التمايز. لذلك ، يحتاج المرء غالبا إلى تحديد نسبة التقسيم المثلى وتوقيت المرور وحجم التكتل لكل نسخة على حدة.

لقد أثبتنا أنه حتى حجم 5 مل يمكن أن يكون كافيا لعزل الخلايا البولية من NHPs15. ومع ذلك ، بينما لم نجد فروقا ذات دلالة إحصائية في عدد الخلايا البولية المعزولة في البشر والغوريلا وإنسان الغاب ، كان لدى الشمبانزي نسبة أقل ، حيث لم نتمكن من عزل الخلايا البولية من إجمالي 87 مل. وبالتالي ، بالنسبة لبعض الأنواع ، قد يكون من الضروري جمع بول أكثر بكثير من غيرها. يمكن أن يكون جمع كميات كبيرة من الرئيسيات الصغيرة أمرا صعبا بشكل خاص ، ولكن نظرا لأن عزل الخلايا البولية فعال من حيث التكلفة إلى حد ما ، فمن العملي تجربته على أنواع معينة وكميات متاحة من البول. لسوء الحظ ، لا يمكن تجميد عينات البول ، مما يحد من نصف القطر الذي يمكن جمع العينات فوقه. ومع ذلك ، فقد أظهرنا أن وقت التخزين البالغ 4 ساعات عند 4 درجات مئوية لم يكن له أي تأثير على عدد المستعمرات المعزولة15 ، وقد يكون من الممكن وقت تخزين أطول أو تحسين ظروف التخزين. لقد أدخلنا عدة أنواع من اختبارات مراقبة الجودة للتحقق من الصحة. ومع ذلك ، حتى إذا كان خط iPSC يفي بهذه المعايير ، فإن عدم التجانس النسيلي لا يزال كبيرا ، وهو ما تم تفسيره من خلال الخلفية الجينية49 والحالة اللاجينية 50،51،52،53،54. لتطبيق iPSCs الرئيسيات على التحليل المقارن في المستقبل ، ينبغي للمرء أن ينظر في عدم التجانس واستخدام ما يكفي من الحيوانات المستنسخة لمتوسط الاختلاف النسيلي ، وبالتالي تجنب سوء تفسير النتيجة.

ومع ذلك ، فإن استخدام البول كمصدر للخلايا الأولية له ميزة كبيرة على الطرق التقليدية باستخدام ، على سبيل المثال ، الخلايا الليفية لإعادة البرمجة ، حيث يمكن الحصول عليها بشكل غير جراحي تماما. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح هذا البروتوكول بتوليد iPSCs من الخلايا المشتقة من البول مع فترة أقصر من إعادة البرمجة التقليدية. باستخدام هذه الطريقة ، تصبح المستعمرات مرئية في غضون 5-15 يوما ، بينما وجدنا أن المستعمرات من الخلايا الليفية الرئيسية (ريسوس ، بابون) تميل إلى الظهور لاحقا ، بعد 20-30 يوما. بالإضافة إلى ذلك ، مع استخدام طريقة العدوى المعلقة هذه ، أدى 0.19٪ من الخلايا المنقولة بالفيروس إلى ظهور مستعمرات ذات مورفولوجيا شبيهة بالخلايا متعددة القدرات. أدى ذلك إلى مستعمرة واحدة على الأقل في 87٪ من المحاولات15. وبالمقارنة ، تبين أن طريقة النقل التقليدية ل SeV مع الخلايا المرفقة و lipofection مع البلازميدات العرضية لها كفاءة إعادة برمجة أقل بكثير ، مع 0.09٪ و 0.009٪ من الخلايا تشكل مستعمرة متعددة القدرات ، على التوالي15.

باختصار ، تسمح هذه الطريقة بعزل الخلايا البولية بشكل غير جراحي وتوليد iPSCs خالية من التغذية من أي متبرع بشري تقريبا والعديد من NHPs. هذا يزيد من إمكانية الوصول إلى أنواع الخلايا الثمينة التي يمكن تمييزها عن هذه iPSCs. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة لإنتاج iPSCs الخاصة بالمريض والتي يمكن استخدامها لنمذجة المرض أو العلاجات المستقبلية القائمة على الخلايا. أخيرا ، نظرا لأنه يمكن إنشاء iPSCs من كميات صغيرة فقط من البول ، يمكن تطبيق هذه الطريقة على العديد من أنواع الرئيسيات المختلفة أو حتى الثدييات. وبالتالي ، يمكن أن تكون هذه الطريقة أداة قوية للمقارنة بين الأنواع ، والتي قد تسمح بفهم أفضل لتطور السمات الخاصة بالإنسان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل DFG EN 1093 / 5-1 (رقم المشروع 458247426). تم دعم M.O. من قبل زمالة JSPS للأبحاث الخارجية. تم إنشاء جميع الأرقام مع BioRender.com. تم إجراء قياس التدفق الخلوي بمساعدة قياس التدفق الخلوي للمرفق الأساسي في المركز الطبي الحيوي في ميونيخ. نود أن نشكر ماكوتو شيدا وتومويو موتو من ASHBi ، جامعة كيوتو ، لدعم تصوير الفيديو.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accumax™ cell detachment solution (Detachment solution) Sigma-Aldrich SCR006
Amphotericin B-Solution Merck A2941-100ML
Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody  Stem Cell Technologies 60064 Dilution: 1/200
Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody  Miltenyi Biotec 130-122-965 Dilution: 1/50
Bambanker™ (Cell freezing medium) Nippon Genetics BB01
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3059-100G
Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR Greiner BIO-ONE 665180
Countess™ II automated cell counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes) Sued-Laborbedarf 52 95-0213 Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information.
CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus) Thermo Fisher Scientific A16519
CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit) Thermo Fisher Scientific A16518
DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride Sigma-Aldrich 10236276001
DMEM High Glucose TH.Geyer L0102
DMEM/F12 w L-glutamine Fisher Scientific 15373541
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 Thermo Fisher Scientific A-21202 Dilution: 1/500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594 Thermo Fisher Scientific A-21207 Dilution: 1/500
DPBS w/o Calcium w/o Magnesium TH.Geyer L0615-500
EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC) Thermo Fisher Scientific 710524 Dilution: 1/500
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Carl Roth CN06.3
Falcon Tube 15 mL conical bottom Greiner BIO-ONE 188271-N
Falcon Tube 50 mL conical bottom Greiner BIO-ONE 227261
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS) Thermo Fisher Scientific 10500064
FlowJo V10.8.2 FlowJo  663441
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich G1890-1KG
Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413301
GlutaMAX™ Supplement Thermo Fisher Scientific 35050038
Heracell™ 240i CO2 incubator Fisher Scientific 16416639
Heraeus HeraSafe safety cabinet Kendro 51017905
Human EGF, premium grade Miltenyi Biotec 130-097-749
ImageJ  Fiji Version 2.9.0
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Thermo Fisher Scientific 11140035
Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL Nerbe Plus 04-212-1000
Microscope Nikon eclipse TE2000-S Nikon TE2000-S
Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody R&D Systems MAB1368 Dilution: 1/100
Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody R&D Systems MAB1420 Dilution: 1/100
Mouse anti-beta-III Tubulin antibody R&D Systems MAB1195 Dilution: 1/100
mTeSR™ 1 STEMCELL Technolgies 85850
Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb  Cell Signaling Technology 4903S Dilution: 1/400
Normocure™ (Antimicrobial Reagent) Invivogen ant-noc
Oct-4 Rabbit Antibody  Cell Signaling Technology 2750S Dilution: 1/400
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 441244-1KG
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS) Thermo Fisher Scientific 15140122 Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 µg/mL Streptomycin.
Recombinant Human FGF-basic PeproTech 100-18B
Recombinant Human PDGF-AB PeproTech 100-00AB
Refrigerated benchtop centrifuge SIGMA  4-16KS
Renal Epithelial Cell Basal Medium ATCC PCS-400-030
Renal Epithelial Cell Growth Kit ATCC PCS-400-040
Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900 Cell Signaling Technology 4900S Dilution: 1/400
SSEA4 (MC813) Mouse mAb NEB 4755S Dilution: 1/500
StemFit® Basic02 Nippon Genetics 3821.00 The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead.
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787-50ML
TrypLE™ Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme) Thermo Fisher Scientific 12563011
Waterbath Precision GP 05 Thermo Fisher Scientific TSGP05
Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor) Biozol BYT-ORB153635
Antibody dilution buffer For composition see the supplementary table S1
Blocking buffer For composition see the supplementary table S1
REMC medium For composition see the supplementary table S1
Primary urine medium For composition see the supplementary table S1
PSC culture medium For composition see the supplementary table S1
PSC generation medium For composition see the supplementary table S1
Urine wash buffer For composition see the supplementary table S1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pääbo, S. The human condition-a molecular approach. Cell. 157 (1), 216-226 (2014).
  2. Zoonomia Consortium, A comparative genomics multitool for scientific discovery and conservation. Nature. 587 (7833), 240-245 (2020).
  3. Kircher, M., et al. A general framework for estimating the relative pathogenicity of human genetic variants. Nature Genetics. 46 (3), 310-315 (2014).
  4. Enard, W. Functional primate genomics-leveraging the medical potential. Journal of Molecular Medicine. 90 (5), 471-480 (2012).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Wunderlich, S., et al. Primate iPS cells as tools for evolutionary analyses. Stem Cell Research. 12 (3), 622-629 (2014).
  7. Denli, A. M., et al. Primate-specific ORF0 contributes to retrotransposon-mediated diversity. Cell. 163 (3), 583-593 (2015).
  8. Ramsay, L., et al. Conserved expression of transposon-derived non-coding transcripts in primate stem cells. BMC Genomics. 18 (1), 214 (2017).
  9. Marchetto, M. C. N., et al. Differential L1 regulation in pluripotent stem cells of humans and apes. Nature. 503 (7477), 525-529 (2013).
  10. Gallego Romero,, I,, et al. A panel of induced pluripotent stem cells from chimpanzees: a resource for comparative functional genomics. eLife. 4, 07103 (2015).
  11. Pavlovic, B. J., Blake, L. E., Roux, J., Chavarria, C., Gilad, Y. A comparative assessment of human and chimpanzee iPSC-derived cardiomyocytes with primary heart tissues. Scientific Reports. 8 (1), 15312 (2018).
  12. Rhodes, K., et al. Human embryoid bodies as a novel system for genomic studies of functionally diverse cell types. eLife. 11, 71361 (2022).
  13. Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
  14. Dannemann, M., Gallego Romero,, I, Harnessing pluripotent stem cells as models to decipher human evolution. The FEBS Journal. 289 (11), 2992-3010 (2022).
  15. Geuder, J., et al. A non-invasive method to generate induced pluripotent stem cells from primate urine. Scientific Reports. 11 (1), 3516 (2021).
  16. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  17. Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nature Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
  18. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  19. Aoi, T., et al. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science. 321 (5889), 699-702 (2008).
  20. Kim, J. B., et al. Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors. Nature. 454 (7204), 646-650 (2008).
  21. Ruiz, S., et al. High-efficient generation of induced pluripotent stem cells from human astrocytes. PloS One. 5 (12), (2010).
  22. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  23. Park, I. -H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  24. Loh, Y. -H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).
  25. Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Human Molecular Genetics. 18 (22), 4340-4349 (2009).
  26. Sun, N., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15720-15725 (2009).
  27. Giorgetti, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood using. OCT4 and SOX2. Cell Stem Cell. 5 (4), 353-357 (2009).
  28. Eminli, S., et al. Differentiation stage determines potential of hematopoietic cells for reprogramming into induced pluripotent stem cells. Nature Genetics. 41 (9), 968-976 (2009).
  29. Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
  30. Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
  31. Zhou, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from urine. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1221-1228 (2011).
  32. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  33. Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nature Protocols. 7 (12), 2080-2089 (2012).
  34. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  35. Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448 (7151), 318-324 (2007).
  36. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  37. Kaji, K., et al. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature. 458 (7239), 771-775 (2009).
  38. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
  39. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  40. Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 11-14 (2010).
  41. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
  42. Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
  43. Zhou, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell. 4 (5), 381-384 (2009).
  44. Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
  45. Guan, J., et al. Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells. Nature. 605 (7909), 325-331 (2022).
  46. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  47. Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
  48. Ohnuki, M., et al. Dynamic regulation of human endogenous retroviruses mediates factor-induced reprogramming and differentiation potential. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (34), 12426-12431 (2014).
  49. Rouhani, F., et al. Genetic background drives transcriptional variation in human induced pluripotent stem cells. PLoS Genetics. 10 (6), 1004432 (2014).
  50. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  51. Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 28 (8), 848-855 (2010).
  52. Koyanagi-Aoi, M., et al. Differentiation-defective phenotypes revealed by large-scale analyses of human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (51), 20569-20574 (2013).
  53. Nishizawa, M., et al. Epigenetic variation between human induced pluripotent stem cell lines is an indicator of differentiation capacity. Cell Stem Cell. 19 (3), 341-354 (2016).
  54. Yokobayashi, S., et al. Inherent genomic properties underlie the epigenomic heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Cell Reports. 37 (5), 109909 (2021).

Tags

علم الأحياء ، العدد 197 ، الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ، iPSCs ، iPSCs الرئيسيات ، غير الغازية ، إعادة البرمجة ، فيروس سينداي ، الرئيسيات ، الخلايا المشتقة من البول ، صيانة iPSC ، تمرير iPSC ، زراعة الخلايا ، خالية من التغذية
توليد وصيانة الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بالرئيسيات المشتقة من البول
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Radmer, J., Geuder, J., Edenhofer,… More

Radmer, J., Geuder, J., Edenhofer, F. C., Enard, W., Ohnuki, M. Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine. J. Vis. Exp. (197), e64922, doi:10.3791/64922 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter