Summary
Het huidige protocol beschrijft een methode om menselijke en niet-menselijke van primaten urine-afgeleide cellen te isoleren, uit te breiden en te herprogrammeren tot geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's), evenals instructies voor feedervrij onderhoud van de nieuw gegenereerde iPSC's.
Abstract
Cross-species benaderingen die primaat pluripotente stamcellen en hun derivaten bestuderen, zijn cruciaal om de moleculaire en cellulaire mechanismen van ziekte, ontwikkeling en evolutie beter te begrijpen. Om primaat geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) toegankelijker te maken, presenteert dit artikel een niet-invasieve methode om menselijke en niet-menselijke primaat iPSC's te genereren uit urine-afgeleide cellen, en hun onderhoud met behulp van een feeder-vrije kweekmethode.
De urine kan worden bemonsterd vanuit een niet-steriele omgeving (bijvoorbeeld de kooi van het dier) en worden behandeld met een breedspectrum antibioticacocktail tijdens de primaire celkweek om besmetting efficiënt te verminderen. Na voortplanting van de van urine afgeleide cellen worden iPSC's gegenereerd door een aangepaste transductiemethode van een in de handel verkrijgbaar Sendai-virusvectorsysteem. Eerste iPSC-kolonies kunnen al na 5 dagen zichtbaar zijn en kunnen op zijn vroegst na 10 dagen worden geplukt. Routinematige klomppassage met enzymvrije dissociatiebuffer ondersteunt de pluripotentie van de gegenereerde iPSC's gedurende meer dan 50 passages.
Introduction
Genomische vergelijkingen van menselijke en niet-menselijke primaten (NHP's) zijn cruciaal om onze evolutionaire geschiedenis en de evolutie van mensspecifieke eigenschappente begrijpen 1. Bovendien maken deze vergelijkingen de gevolgtrekking van functie mogelijk door geconserveerde DNA-sequenties2 te identificeren, bijvoorbeeld om prioriteit te geven aan ziektegerelateerde varianten3. Vergelijkingen van moleculaire fenotypes zoals genexpressieniveaus zijn cruciaal om genomische vergelijkingen beter te interpreteren en om bijvoorbeeld cellulaire fenotypische verschillen te ontdekken. Bovendien hebben ze - vergelijkbaar met vergelijkingen op DNA-niveau - het potentieel om functionele relevantie af te leiden, en dus om medisch relevante variatie binnen mensen beter te interpreteren4. De opname van uitgebreide moleculaire fenotypische gegevens in deze vergelijkende studies vereist geschikte biologische middelen (d.w.z. orthologe cellen tussen soorten). Ethische en praktische redenen maken het echter moeilijk of onmogelijk om toegang te krijgen tot dergelijke vergelijkbare cellen, vooral tijdens de ontwikkeling. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) maken het mogelijk om dergelijke ontoegankelijke celtypen in vitro5,6 te genereren, zijn experimenteel toegankelijk en zijn gebruikt voor primatenvergelijkingen 6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Om iPSC's te genereren, moet men de primaire cellen verwerven die opnieuw moeten worden geprogrammeerd. Cellen geïsoleerd uit urine hebben het voordeel dat ze niet-invasief kunnen worden bemonsterd van primaten en dat ze gemakkelijk kunnen worden geherprogrammeerd, waarschijnlijk vanwege hun stamcelachtige moleculaire profielen15. De kweekomstandigheden om iPSC's van primaten in stand te houden zijn net zo belangrijk als herprogrammering; klassiek vereiste de kweek van menselijke pluripotente stamcellen een niet-gedefinieerd, op serum gebaseerd medium en co-cultuur van embryonale fibroblasten van muizen - zogenaamde feedercellen - die essentiële voedingsstoffen en een steiger voor embryonale stamcellen (SER's) leveren16. Sinds de ontwikkeling van chemisch gedefinieerde en feedervrije kweeksystemen17,18, zijn er nu verschillende opties van commercieel verkrijgbare iPSC-kweekmedia en -matrices. De meeste van deze kweekomstandigheden zijn echter geoptimaliseerd voor menselijke SER's en iPSC's en werken daarom mogelijk minder goed in de NHP iPSC-cultuur. In dit videoprotocol geven we instructies voor het genereren en onderhouden van menselijke en NHP iPSC's afgeleid van urinecelkweek.
Sinds het eerste rapport van iPSC-generatie door de geforceerde expressie van gedefinieerde factoren in fibroblasten in 2006, is deze methode toegepast op veel verschillende celtypen van verschillende oorsprong 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. Onder hen kunnen alleen van urine afgeleide cellen op een volledig niet-invasieve manier worden verkregen. Op basis van het eerder beschreven protocol van Zhou et al.33 kan men cellen isoleren en uitbreiden uit de urine van primaten, zelfs uit niet-steriele monsters, door breedspectrumantibiotica aan te vullen15. Met name urine-afgeleide cellen bemonsterd door dit protocol vertonen een hoog potentieel om iPSC's te produceren, binnen een kortere periode (kolonies worden zichtbaar in 5-15 dagen) dan de conventionele herprogrammering van fibroblasten (20-30 dagen, in onze ervaring), en met een voldoende hoog slagingspercentage. Deze van urine afgeleide cellen werden geclassificeerd als de gemengde populatie van mesenchymale stamcelachtige cellen en blaasepitheelcellen, waardoor de hoge herprogrammeringsefficiëntie werd veroorzaakt15.
Naast de variatie in primaire cellen, variëren de herprogrammeringsmethoden om iPSC's te genereren ook afhankelijk van het doel van het gebruik. Conventionele herprogrammeringsprocedures voor menselijke somatische cellen werden uitgevoerd door de overexpressie van herprogrammeringsfactoren met retrovirus- of lentivirusvectoren, waardoor de integratie van exogene DNA in het genoom 5,34,35 mogelijk werd. Om de gegenereerde iPSC's genomisch intact te houden, hebben onderzoekers een breed scala aan niet-integratiesystemen ontwikkeld - excisable PiggyBac-vector36,37, episomale vector38,39, niet-integrerende virusvectoren zoals Sendai-virus40 en adenovirus 41, mRNA-transfectie 42, eiwittransfectie 43,44 en behandeling met chemische verbindingen 45. Vanwege de efficiëntie en het gemak in de hantering, worden de Sendai-virusgebaseerde herprogrammeringsvectoren gebruikt in dit protocol. Infectie van primaire cellen wordt uitgevoerd in een 1 h suspensiecultuur van cellen en virussen met een multipliciteit van infectie (MOI) van 5 voorafgaand aan plating. Deze aangepaste stap zou de kans op contact tussen celoppervlakken en virussen kunnen vergroten, vergeleken met de conventionele methode waarbij de virussen rechtstreeks aan de aanhangende celcultuur worden toegevoegd en dus meer iPSC-kolonies opleveren15.
Passaging van menselijke en NHP pluripotente stamcellen kan worden gedaan door klonterpassing en eencellige passaging. Ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) is een kostenefficiënte chelaatvormer die calcium- en magnesiumionen bindt en zo de hechtende activiteit van cadherine en integrine voorkomt. EDTA wordt ook gebruikt als een mild, selectief dissociatiereagens, omdat ongedifferentieerde cellen zich losmaken voor gedifferentieerde cellen vanwege hun verschillende adhesiemoleculen. Volledige dissociatie induceert massale celdood van iPSC's van primaten via de Rho / Rho-geassocieerde coiled coil met eiwitkinase (Rho / Rock) -gemedieerde myosinehyperactivatie. Daarom is het aanvullen van het kweekmedium met een Rho/Rock-remmer essentieel voor experimenten waarbij enkele cellen in suspensie nodig zijn46,47. In dit protocol raden we clump passaging aan als de routinematige passaging-methode en bevelen we single-cell passaging alleen aan wanneer dit nodig is, bijvoorbeeld wanneer seeding van gedefinieerde celnummers vereist is, of tijdens sub-cloning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze experimentele procedure werd goedgekeurd door de verantwoordelijke ethische commissie voor menselijke experimenten (20-122, Ethikkommission LMU München). Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften.
OPMERKING: Goedkeuring moet worden verkregen van de juiste ethische commissie voordat wordt begonnen met experimenten met menselijke en NHP-monsters. Alle experimentele procedures moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften. Elk van de volgende stappen moet worden uitgevoerd met behulp van steriele techniek in een biologische veiligheidskast. Alle buffer- en mediasamenstellingen zijn te vinden in aanvullende tabel S1. Zorg ervoor dat alle media worden opgewarmd tot kamertemperatuur (22 °C) voordat ze aan de cellen worden toegevoegd. Elke centrifugatiestap moet bij kamertemperatuur worden uitgevoerd, tenzij anders vermeld.
1. Isolatie van cellen uit urinemonsters
LET OP: Zorg ervoor dat menselijke donoren vrij zijn van humaan immunodeficiëntievirus (HIV), hepatitis B-virus (HBV) en hepatitis C-virus (HCV). Voor NHP's, zorg ervoor dat de mogelijke donoren / cellen vrij zijn van specifieke pathogenen-B-virus (BV), Simian Immunodeficiency Virus (SIV), Simian Betaretrovirus (SRV) en Simian T Cell Lymphotropic Virus (STLV).
- Bereid een met gelatine gecoate 12-wells plaat door 500 μL 0,2% gelatine per put toe te voegen en verdeel de vloeistof door de plaat te verplaatsen. Plaats bij 37 °C gedurende ten minste 30 minuten voordat dit nodig is.
- Verzamel menselijke urinemonsters in conische buisjes van 50 ml. Voor primaten, verzamel urine van de vloer van de dierenfaciliteit met een spuit.
OPMERKING: Een volume van 5 ml urine bleek voldoende te zijn voor het isoleren van ten minste één kolonie in 42% van de pogingen. Het gebruik van een hoger volume van ~ 50 ml urine wordt echter aanbevolen om de kans op het isoleren van kolonies te vergroten. NHP-urine moet zo vers mogelijk worden bemonsterd, bij voorkeur onmiddellijk na het plassen. De opslag van urinemonsters bij 4 °C gedurende 4 uur had geen negatief effect op het slagingspercentage van het protocol, maar langere bewaartijden werden niet getest. - Centrifugeer de urinehoudende buis gedurende 10 minuten op 400 × g en zuig het supernatant voorzichtig op, waarbij ongeveer 1 ml in de buis achterblijft.
- Resuspendeerde de pellet in de resterende 1 ml vloeistof. Bundel de suspensies in één buis als meerdere buisjes urine zijn verzameld.
- Was de cellen door 10 ml urinewasbuffer (zie aanvullende tabel S1) met 2,5 μg/ml amfotericine aan de buis toe te voegen en meng de suspensie voorzichtig met een serologische pipet.
- Centrifugeer de buis gedurende 10 minuten op 200 × g en zuig het supernatant voorzichtig op, waarbij ongeveer <0,2 ml in de buis achterblijft.
- Resuspendie van de celkorrel in 1 ml primair urinemedium (zie aanvullende tabel S1) met 0,5 μg/ml amfotericine per 50 ml initieel verwerkte urine (resuspendien in 1 ml, zelfs als minder dan 50 ml urine werd verwerkt).
- Zuig gelatine uit de putjes (bereid in stap 1.1) en plaat 1 ml van de suspensie uit stap 1.7 in één put van een plaat met 12 putten. Herhaal dit voor zoveel putjes als gewenst, of voor zoveel mililiter suspensie beschikbaar.
Optioneel: Om besmetting als gevolg van onhygiënische monsterverzameling te voorkomen, voegt u vanaf hier, tot de eerste passage, 100 μg / ml antimicrobieel reagens toe aan de cellen. - Plaats de plaat in een 37 °C, 5% CO2 incubator.
- Voeg dagelijks 1 ml primair urinemedium per put toe tot dag 5, zonder het bestaande medium te verwijderen.
- Op dag 5 zuigt u 4 ml medium uit de plaat, waardoor ongeveer 1 ml medium overblijft. Voeg 1 ml REMC-medium (zie aanvullende tabel S1) per put toe om een mengsel van 1:1 met het nieuwe kweekmedium te krijgen.
- Vervang elke dag de helft van het medium door REMC-medium totdat de eerste kolonies verschijnen (figuur 1A, B). Verwijder daarom 1 ml oud medium en voeg 1 ml vers REMC-medium per put toe.
2. Uitbreiding van urinecellen
OPMERKING: Urinaire celdoorgifte moet worden uitgevoerd voordat de cultuur 90% confluentie bereikt.
- Bereid de gewenste hoeveelheid met gelatine gecoate 12-putplaten voor, zoals vermeld in stap 1.1.
- Zuig het oude medium op en was de cellen door 1 ml Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) toe te voegen.
- Zuig de DPBS aan en voeg 300 μL 0,5x dissociatie-enzym verdund met DPBS toe. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 5 min.
- Voeg 700 μL REMC-medium toe om de enzymatische reactie te stoppen. Pipetteer de suspensie voorzichtig met een P1000-pipet totdat de cellen zijn gedissocieerd in afzonderlijke cellen.
- Breng de celsuspensie over in een buis van 15 ml en centrifugeer de buis gedurende 5 minuten op 200 × g .
- Zuig het supernatant voorzichtig op en resuspensie van de pellet in 1 ml REMC-medium.
- Tel de cellen met behulp van een celteller (een hemocytometer of een geautomatiseerde celteller).
- Voor uitbreiding van de urinecellen, plaat 1,5 × 10 4 tot 3 × 104 cellen in 1 ml REMC-medium in één 12-well plaat bedekt met 0,2% gelatine.
- Voer om de dag volgende mediumveranderingen uit totdat de cultuur 80% -90% samenvloeiing bereikt. Zuig daarom het oude medium aan en voeg 1 ml vers REMC-medium toe.
3. Generatie van iPSC's door Sendai virus vector infectie
OPMERKING: Voor de workflow van de herprogrammeringsprocedure, zie Figuur 2A. Urinecellen die worden gebruikt voor herprogrammering moeten zo jong mogelijk zijn, maar een opmerkelijk verlies van herprogrammeringsefficiëntie wordt niet waargenomen vóór passage 4. De Sendai Virus Reprogramming Kit moet worden gebruikt in een BL-2-faciliteit. Behandel virussen onder een biologische veiligheidskast met laminaire stroming en gebruik altijd de juiste veiligheidsuitrusting om blootstelling aan slijmvliezen te voorkomen.
- Bereid een keldermembraanmatrix gecoate 12-well plaat voor door 500 μL keldermembraanmatrix per put toe te voegen en verdeel de vloeistof door de plaat te verplaatsen. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende ten minste 1 uur en vervang de keldermembraanmatrix door 900 μL REMC-medium. Bewaar de plaat bij 37 °C tot gebruik.
- Ontdooi de componenten van de Sendai Reprogramming Kit snel in een waterbad van 37 °C. Meng de Sendai-virussen (polycistronic KLF4-OCT3/4-SOX2, cMYC en KLF4) met een MOI van 5 en voeg REMC-medium toe tot 100 μL. Gebruik vergelijking (1):
OPMERKING: Aangezien virustiters per partij verschillen, moet u altijd de titer controleren in het analysecertificaat dat door de fabrikant wordt verstrekt.
Optioneel: Gebruik groen fluorescerend eiwit (GFP) Sendai-virus daarnaast als een positieve controle voor de transductie-efficiëntie. Bereid hiervoor een extra 3,5 × 104 cellen voor in een aparte buis tijdens stap 3.3. - Voor dissociatie van de urinecellen volgt u de stappen 2.2-2.4. Tel de cellen met behulp van de celteller en breng 7 × 104 urinecellen over naar een buis van 1,5 ml.
- Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten op 200 × g en verwijder het supernatant voorzichtig zonder de celkorrel te verstoren. Suspendeerde de pellet in 100 μL van het in stap 3.2 bereide SeV-mengsel. Incubeer de buis gedurende 1 uur bij 37 °C voor suspensie-infectie.
- Plaat de ophanging op de keldermembraan matrix-gecoate 12-well platen die werden voorbereid in stap 3.1. Routinematig worden plaat 1 × 10 4 en 2,5 × 104 cellen per put in duplicaten geplaatst.
- Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2. Vervang het medium door 1 ml vers REMC-medium 24 uur na transductie en op dag 3.
- Verander op dag 5 na transductie het medium in PSC-generatiemedium (zie aanvullende tabel S1), met daaropvolgende mediumwisselingen om de andere dag. Verwijder daarom het oude medium en voeg 1 ml PSC-generatiemedium per put toe.
OPMERKING: Het kan tot 15 dagen duren voordat de eerste kolonies verschijnen. - Kies individuele iPSC-kolonies wanneer de grootte van de kolonie groter is dan 1 mm. Om dit te doen, schraap en verzamel voorzichtig een enkele kolonie met een p10-pipet onder een microscoop. Breng de kolonie over in een nieuwe put van een 12-putplaat bedekt met een keldermembraanmatrix met 750 μL PSC-kweekmedium.
Optioneel: Het spoelen van de plaat met DPBS en het behandelen gedurende 1 minuut met 0,5 mM EDTA voorafgaand aan het plukken kan de robuuste cultuur van verdere stappen ondersteunen. Als de cellen langer moeten worden gekweekt om te wachten op later opkomende kolonies, voer deze EDTA-behandelingsstap dan niet uit. - Kweek de cellen bij 37 °C en 5% CO2 met daaropvolgende mediumwisselingen om de andere dag, zoals vermeld in sectie 4 van het protocol. Wanneer de geplukte kolonie een diameter van 2 mm bereikt, gaat u verder met de routinematige iPSC-passaging, zoals uitgelegd in sectie 5 van het protocol.
4. Gemiddelde verandering
OPMERKING: Het kweekmedium moet om de dag worden vervangen totdat de kolonies groot genoeg worden om te passeren.
- Zuig het oude medium aan en voeg 750 μL van het verse medium per 12-well plaat toe. Om over te schakelen naar een ander type medium, vervangt u het medium ten minste 1 dag na het passeren.
5. Passaging
OPMERKING: De cellen moeten worden gepasseerd wanneer de iPSC-kolonies groot genoeg worden (diameter > 2 mm), of wanneer de kolonies op het punt staan elkaar te raken. Routinematig kunnen iPSC's ongeveer elke 5 dagen worden gesplitst. Gebruik clump-passaging (stap 5.1) voor routineonderhoud en single-cell passaging (stap 5.2) voor experimenten waarbij een bepaald aantal cellen nodig is. In het geval dat de iPSC's veel differentiëren, kan kolonieplukken (stap 5.3) helpen de zuiverheid van de culturen te verbeteren.
- Clump-passaging
- Bereid een keldermembraanmatrix gecoate 12-well plaat voor door 500 μL keldermembraanmatrix per put toe te voegen en verdeel de vloeistof door de plaat te verplaatsen. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende ten minste 1 uur. Vervang de keldermembraanmatrix door 500 μL PSC-kweekmedium en bewaar de plaat bij 37 °C tot gebruik.
- Zuig het medium uit de gekweekte cellen en was de cellen door voorzichtig 500 μL DPBS toe te voegen. Verwijder de DPBS en voeg 500 μL 0,5 mM EDTA toe aan de put.
- Incubeer de plaat op RT gedurende 2-5 minuten, totdat de kolonies beginnen los te komen. Observeer de cellen zorgvuldig onder de microscoop.
- Wanneer de randen van de kolonies beginnen af te pellen en openingen tussen de cellen zichtbaar worden (figuur 3A), verwijdert u de EDTA en voegt u voorzichtig 500 μL DPBS toe.
OPMERKING: Pipet altijd tegen de zijwand van de put en nooit rechtstreeks op de cellen, om de cellen niet los te maken van de plaat. - Zuig de DPBS aan en spoel de put met 500 μL PSC-kweekmedium met behulp van een p1000-pipet. Pipetteer 1x-5x op en neer om de kolonies te verspreiden in klonten van de juiste grootte (figuur 3A). Pipet niet te veel.
OPMERKING: Als de iPSC's per ongeluk te veel worden gepipetteerd, voeg dan 10 μM Rock-remmer Y-27632 toe aan het medium. Dit kan de overleving verbeteren, omdat iPSC's niet in staat zijn om te overleven als afzonderlijke cellen. - Breng 1/10-1/50 van de celklompsuspensie over naar de nieuwe putten. De verhouding hangt af van de samenvloeiing van de put vóór het splitsen, de gewenste dichtheid van de gezaaide cellen en iPSC-klonale voorkeur.
- Verdeel de klonten gelijkmatig in de put door de plaat meerdere keren voorzichtig heen en weer te bewegen. Incubeer de plaat gedurende ten minste 30 minuten bij 37 °C om de klonten te laten hechten.
- Vervang het medium door 750 μL PSC-kweekmedium als er veel zwevende dode cellen worden waargenomen; voeg anders 250 μL PSC-kweekmedium toe. Plaats de plaat bij 37 °C en 5% CO2 in een incubator.
OPMERKING: Mediumvervanging na 30 minuten is van cruciaal belang, vooral voor onstabiele cellijnen (bijv. NHP's). - Verander het medium om de 2-3 dagen totdat de kolonies groot genoeg worden om te passeren. Voor gemiddelde verandering volgt u stap 4 van het protocol.
- Eencellige passaging
- Bereid de met een keldermembraan matrix gecoate kweekplaat voor, zoals vermeld in stap 5.1.1, met toevoeging van 10 μM Y-27632 aan het PSC-kweekmedium.
Optioneel: Voeg 10 μM Y-27632 toe aan de cellen 1-3 uur voorafgaand aan het passeren om de overleving van gevoelige cellijnen te verbeteren. - Zuig het medium aan en was de cellen door 500 μL DPBS toe te voegen. Verwijder de DPBS en voeg 300 μL loskoppelingsoplossing toe aan de putjes.
- Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 5-10 min. Wanneer voldoende loslating van de cellen onder de microscoop wordt waargenomen, voegt u 700 μL PSC-kweekmedium of DPBS toe.
- Pipetteer 5-10x op en neer met behulp van een p1000-pipet totdat de cellen zijn gedissocieerd in afzonderlijke cellen. Pipet niet te veel, om celbeschadiging te voorkomen.
- Breng de celsuspensie over in een buis van 15 ml met ten minste 2 ml DPBS om de loslatingsoplossing te verdunnen.
- Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten op 200 × g en zuig de oplossing volledig op, zonder de celkorrel te verstoren.
- Resuspendie van de pellet in 500 μL PSC kweekmedium aangevuld met 10 μM Y-27632.
- Tel de cellen en zaai 5.000-7.000 cellen per keldermembraan matrix-gecoate 12-well plaat, voorbereid in stap 5.2.1.
OPMERKING: Als een ander celnummer nodig is, verander dan dienovereenkomstig naar een grotere of kleinere put. - Incubeer de plaat gedurende ten minste 30 minuten bij 37 °C en 5% CO2 om de cellen te laten hechten.
- Vervang het medium door 750 μL PSC-kweekmedium + 10 μM Y-27632 als er veel dode cellen worden waargenomen; voeg anders 250 μL + 10 μM Y-27632 toe.
OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang, vooral voor de onstabiele cellijnen (bijv. NHP's). - Plaats de plaat bij 37 °C en 5% CO2 in een incubator.
- Verander het medium 1 tot 2 dagen na het splitsen in PSC-kweekmedium zonder Y-27632, zodat de cellen de klassieke koloniemorfologie weer kunnen vertonen (figuur 3B).
- Verander het medium om de 2 dagen totdat de kolonies groot genoeg worden. Voor gemiddelde verandering, volg sectie 4 van het protocol.
- Bereid de met een keldermembraan matrix gecoate kweekplaat voor, zoals vermeld in stap 5.1.1, met toevoeging van 10 μM Y-27632 aan het PSC-kweekmedium.
- Doorgeven van iPSC's door kolonieplukken
- Bereid keldermembraan matrix-gecoate 12-putten voor zoals vermeld in stap 5.1.1.
- Zuig het medium aan en was de cellen door voorzichtig 500 μL DPBS toe te voegen. Verwijder de DPBS en voeg 500 μL 0,5 mM EDTA toe aan de put.
- Incubeer de plaat bij RT gedurende 1-3 minuten en observeer de cellen onder de microscoop, totdat loslating van de kolonie zichtbaar is aan de randen.
- Verwijder de EDTA en voeg voorzichtig 500 μL DPBS toe. Zuig de vloeistof op voordat u langzaam 500 μL PSC-kweekmedium aan de put toevoegt, zonder de cellen los te maken.
- Gebruik een p200-pipet om de gewenste kolonie onder de microscoop te kiezen, zonder de gedifferentieerde cellen te verzamelen. Om dit te doen, krab je voorzichtig over de kolonie terwijl je het medium met cellen opneemt.
- Breng elke geplukte kolonie over in één keldermembraanmatrix-gecoate put, zoals voorbereid in stap 5.3.1. Dissocieer de cellen in kleine klontjes met behulp van een p1000-pipet, door de cellen 2-5x te pipetteren.
- Incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij 37 °C en 5% CO2, zodat de klonten kunnen hechten.
- Vervang het medium door 750 μL PSC-kweekmedium als er veel zwevende dode cellen worden waargenomen; voeg anders 250 μL PSC-kweekmedium toe.
OPMERKING: Mediumvervanging na 30 minuten is van cruciaal belang, vooral voor de onstabiele cellijnen (bijv. NHP's). - Plaats de plaat bij 37 °C en 5% CO2 in een incubator.
- Verander het medium om de 2-3 dagen totdat de kolonies groot genoeg worden om te passeren. Volg hiervoor sectie 4 van het protocol.
6. Invriezen van urinecellen en iPSC's voor langdurige opslag
OPMERKING: Routinematig worden iPSC's ingevroren als klonten in celvriesmedium zonder te tellen. Pipetteren moet minimaal zijn, om dissociatie in afzonderlijke cellen te voorkomen. Voor urinecellen worden routinematig 1,5 × 10 4 tot 3 × 104 cellen per buis bevroren, waardoor de gebruiker één buis direct in één put van een 12-putplaat kan ontdooien zonder dat een andere telstap nodig is.
- Bereid 5 ml DPBS in een buis van 15 ml.
- Voor het bevriezen van urinecellen volgt u de stappen 2.2-2.4 van het protocol. Voor het bevriezen van iPSC's volgt u de stappen 5.1.2-5.1.5 van het clump passaging-protocol.
- Breng de suspensie over in de buis van 15 ml die is voorbereid in stap 6.1. Tel voor het bevriezen van urinecellen 10 μL van de celsuspensie met behulp van een hemocytometer. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 200 × g en zuig het supernatant volledig op.
- Resuspendeer de celkorrel in 400 μL celvriesmedium per buis en verdeel de cellen over de gewenste hoeveelheid cryobuizen.
- Breng de cryobuizen onmiddellijk over tot -80 °C. Breng de bevroren buizen 1 dag na het invriezen bij -80 °C over naar een vriezer van -150 °C of vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
7. Ontdooien van urinecellen en iPSC's
- Bereid voor het ontdooien van urinecellen de gewenste hoeveelheid met gelatine gecoate 12-putjes voor, zoals vermeld in stap 1.1 van het protocol. Voor iPSC's bereidt u de 12-putplaten met matrixcoating van het keldermembraan voor, zoals vermeld in stap 5.1.1. Wissel in beide gevallen de matrix niet uit met medium.
- Bereid een buis van 15 ml met 4 ml DPBS en bewaar deze bij 37 °C.
- Plaats een bevroren injectieflacon met cellen snel in een waterbad van 37 °C om te ontdooien, totdat een stuk drijvend ijs zichtbaar wordt.
OPMERKING: Veeg de cryobuis af met ethanol voor en na de incubatie in het waterbad om verontreinigingen te voorkomen. - Voeg 500 μl REMC-medium voor urinecellen of 500 μl PSC-kweekmedium voor iPSC's toe aan de ijshoudende suspensie en breng de suspensie onmiddellijk over naar de voorverwarmde buis van 15 ml die is voorbereid in stap 7.2.
- Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten op 200 × g en gooi het supernatant volledig weg.
- Voor urinecellen, resuspendeerde de pellet in 1 ml REMC-medium. Voor iPSC's, resuspendeerde de pellet voorzichtig in 750 μL PSC-kweekmedium. Vermijd te veel pipetteren, om de klonten intact te houden.
Optioneel: Aanvulling van het medium met 10 μM Y-27632 kan de overleving van iPSC's na ontdooien ondersteunen. - Zuig de matrix op van de 12-putplaten die in stap 7.1 zijn voorbereid en breng de celsuspensie voorzichtig over naar de put.
- Plaats de plaat een nacht bij 37 °C en 5% CO2 in een incubator.
- Vervang het medium de volgende dag door PSC-kweekmedium, zonder Y-27632 voor iPSC's en door REMC voor urinecellen.
- Kweek de cellen bij 37 °C en 5% CO2 in een couveuse.
- Verander het medium elke 2-3 dagen totdat de cellen groot genoeg worden om te passeren. Voor gemiddelde verandering, volg sectie 4 van het protocol.
8. Immunocytochemie
OPMERKING: Immunostaining met antilichamen gericht op pluripotentie-gerelateerde markers zoals NANOG, OCT3/4, SOX2, TRA-1-60 en EpCAM is een van de meest gebruikte validaties van nieuw gegenereerde iPSC's. Meer informatie over de antilichamen en verdunningen is te vinden in de Materiaaltabel.
- Plaat iPSC's 1-3 dagen voor gebruik in een geschikt aantal 12-well platen. Zuig het medium op, was de cellen door 500 μL DPBS toe te voegen en verwijder de DPBS. Voeg 400 μL 4% paraformaldehyde (PFA) per put toe en fixeer de cellen gedurende 15 minuten bij RT.
- Verwijder de 4% PFA en was de cellen 3x met DPBS. Voeg 400 μL blokkeringsbuffer per put toe en incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij RT.
- Zuig de blokkeringsbuffer aan en voeg de antilichamen verdund in 400 μL antilichaamverdunningsbuffer (ADB) toe aan elk putje. Incubeer de plaat een nacht bij 4 °C.
- Verwijder de ADB die de primaire antilichamen bevat en was cellen 3x met DPBS.
- Zuig de DPBS op en voeg 400 μL secundaire antilichamen verdund in ADB per put toe. Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij RT in het donker.
- Verwijder de ADB en was cellen 3x met DPBS. Voeg 1 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) verdund in DPBS per put toe en incubeer gedurende 3 minuten bij RT.
- Zuig de DAPI-oplossing aan en was de cel 3x met DPBS. Voeg 500 μL DPBS toe voor beeldvorming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bij het isoleren van cellen uit menselijke en NHP-urine kunnen verschillende soorten cellen direct na isolatie worden geïdentificeerd. Plaveiselcellen, evenals verschillende kleinere ronde cellen, worden uitgescheiden met de urine; vrouwelijke urine bevat veel meer plaveiselcellen dan mannelijke urine (figuur 1B - dag 0; Aanvullende figuur S1). Na 5 dagen kweek in primair urinemedium zijn de eerste aanhangende prolifererende cellen te zien (figuur 1A,B - dag 5). Op dit punt wordt elke dag de helft van het medium vervangen door REMC-proliferatiemedium, totdat de eerste kolonies verschijnen. Op ongeveer dag 13 groeien de aanhangende cellen uit tot grote kolonies die kunnen worden gepasseerd (figuur 1B - dag 13). Deze kolonies kunnen worden gevormd uit twee morfologisch verschillende celtypen - een met een meer epitheliaal-achtig fenotype met cellen die nauw verbonden groeien, en de andere met een meer mesenchymale-achtige morfologie met langwerpige vorm en hoger migratievermogen (figuur 1C). Na de eerste passage groeien urinecellen als een monolaag en kunnen ze worden gepasseerd wanneer de cultuur 80% confluentie bereikt (figuur 1B - dag 17).
Figuur 1: Isolatie en kweek van urinecellen. (A) Workflow voor het vaststellen van urinecellen uit menselijke en niet-menselijke monsters van primaten. (B) Fasecontrastbeelden die de groei en kolonievorming van urinecellen tot de eerste passage (p1) tonen. (C) Twee verschillende celtypen geïsoleerd uit urinemonsters kunnen worden onderscheiden na 2 weken kweek. Schaalstaven = 250 μm (B,C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Om iPSC's uit urinecellen te genereren, wordt een transductie met Sendai-virussen gebruikt die de Yamanaka-factoren OCT3/4, SOX2, KLF4 en c-MYC introduceren. Om de transductie-efficiëntie te verhogen, worden urinecellen gedurende 1 uur in suspensie geïncubeerd met het virus, voordat ze op keldermembraanmatrix-gecoate putten worden gezaaid (figuur 2A). Sommige aanhangende cellen zijn 1 dag na transductie in de putjes te zien (figuur 2B - dag 1). Na 5-10 dagen beginnen deze cellen kolonies te vormen en kunnen vroege morfologische veranderingen worden waargenomen, wat wijst op herprogrammering van de cellen (figuur 2B - dag 14). Veel van deze kolonies vertonen geleidelijk een ESC-achtige morfologie en kunnen worden geplukt in PSC-kweekmedium wanneer de diameter groter is dan 1 mm. Na het plukken vormen de cellen kolonies met de typische ESC-morfologie binnen ongeveer 4 dagen (figuur 2B - dag 21 &; 24). Wanneer de iPSC-kolonies groot genoeg worden, kunnen de cellen voor het eerst worden gepasseerd met behulp van het clump passaging-protocol (protocolstap 5.1).
Deze herprogrammeringsaanpak is gebruikt om iPSC's te genereren van mensen, gorillagorilla's (gorilla's) en Pongo abelii (orang-oetan)15. Hoewel de kans om urinecellen te verkrijgen vrij variabel is, en minstens twee tot drie keer lager voor chimpansees dan voor mensen15, was herprogrammering van de verkregen urinecellen meestal succesvol in onze ervaring. Over het algemeen geeft 0,19% van de geïnfecteerde urinecellen aanleiding tot kolonies met ESC-achtige morfologie, wat resulteert in ten minste één kolonie in 87% van de herprogrammeringspogingen15. Alle gegenereerde iPSC's delen dezelfde eigenschappen en vertonen de typische ESC-achtige koloniemorfologie, gekenmerkt door dicht opeengepakte cellen met duidelijk gedefinieerde randen (figuur 2C). Bovendien vertonen alle iPSC's een normaal karyotype en werd de afwezigheid van SeV-herprogrammeringsvectoren geverifieerd door PCR na minimaal vijf passages, zoals aanbevolen door de fabrikant van de SeV-herprogrammeringskit (gegevens niet weergegeven)15. Immunocytochemie wordt gebruikt om de expressie van pluripotentie-geassocieerde eiwitten in de kern te testen, zoals NANOG, OCT3/4 en SOX2. Oppervlaktemarkeringen zoals TRA-1-60, EpCAM en SSEA4 kunnen ook worden gebruikt (figuur 2D); SSEA4 komt echter ook tot expressie in de urinecellen15. Bovendien kan flowcytometrie-analyse worden uitgevoerd met behulp van deze oppervlaktemarkers om kwantitatieve informatie te verschaffen over de pluripotentiestatus van de iPSC's (methode beschreven door Ohnuki et al.48). Deze benadering wordt gebruikt om aan te tonen dat 95,3% van de geanalyseerde orang-oetan iPSC's positief zijn voor TRA-1-60 (figuur 2E). Bovendien kan de differentiatiecapaciteit van NHP iPSC's worden bewezen via in vitro embryoïde lichaam (EB) differentiatie (methode beschreven door Geuder et al.15). Zoals te zien is in figuur 2F, kunnen gorilla iPSC's differentiëren in endoderm (ɑ-fetoproteïne), mesoderm (ɑ-gladde spieractine) en ectoderm (β-III tubuline) afstammingslijnen.
Figuur 2: Generatie en karakterisering van urine-afgeleide iPSC's . (A) Herprogrammeringsworkflow van urine-afgeleide cellen. (B) Fasecontrastbeelden die de morfologische veranderingen van gorilla-urinecellen tonen tijdens herprogrammering tot de oprichting van iPSC-kolonies. Schaalstaven = 500 μm. (C) Morfologie van gevestigde iPSC-kolonies uit menselijke, gorilla- en orang-oetancelculturen. Schaalstaven = 500 μm. (D) Immunofluorescentiekleuring van gorilla iPSC's met pluripotentie-geassocieerde markers bij passage 8: NANOG, OCT3/4, SSEA4, SOX2, EpCAM en TRA-1-60. Schaalstaven = 100 μm. (E) Flowcytometrie-analyse van orang-oetan iPSC's gekleurd met anti-TRA-1-60-PE. Onbevlekte cellen werden gebruikt als controle. (F) Immunofluorescentieanalyse van endoderm (AFP), mesoderm (ɑ-SMA) en ectoderm (β-III TUB) na embryoïde lichaamsdifferentiatie van gorilla iPSC's. Kernen werden tegengekleurd met DAPI. Schaalstaven = 100 μm. Afkortingen: iPSC's = geïnduceerde pluripotente stamcellen; PE = fycoerythrin; AFP = α-fetoproteïne; ɑ-SMA = alfa gladde spier actine; β-III TUB = bèta III Tubuline; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Wanneer de iPSC-kolonies een diameter van ongeveer 2 mm bereiken of op het punt staan elkaar te raken, moeten de cellen worden gesplitst. We raden u aan het clump passaging-protocol te gebruiken voor routineonderhoud. In dit protocol wordt 0,5 mM EDTA gebruikt om de cellen gedurende 3-5 minuten los te maken, afhankelijk van de koloniegrootte. Tijdens EDTA-incubatie beginnen de grenzen van de kolonies af te pellen en verschijnen er zichtbare openingen tussen de cellen (figuur 3A). De EDTA moet worden verwijderd wanneer een geschikte loslating onder de microscoop wordt waargenomen. Langdurige incubatie met EDTA leidt tot een hogere fractie van afzonderlijke cellen die niet in staat zijn om te overleven. Vervolgens moeten de cellen worden gedissocieerd tot klonten van vergelijkbare grootte, zoals weergegeven in figuur 3A. De cellen mogen niet worden gedissocieerd in kleine klontjes, omdat dit de overleving vermindert en kan leiden tot meer differentiërende cellen.
Wanneer een experiment het zaaien van een bepaald aantal cellen vereist, moet het protocol voor het passeren van één cel worden gebruikt. Dit protocol omvat het aanvullen van het medium met een Rock-remmer, waardoor de afzonderlijke cellen kunnen overleven. De verwachting is dat aangehechte afzonderlijke cellen een andere morfologie vertonen, vergeleken met cellen die in een kolonie groeien na klonterzaaien (figuur 3B - dag 0). Na 1-2 dagen kweek beginnen de afzonderlijke cellen weer uit te groeien tot kolonies, met behoud van hun morfologie en hun losse cel-celcontact, als een rotsremmer aan het medium wordt toegevoegd (figuur 3B - dag 2). Wanneer deze kleine kolonies worden waargenomen, moet de rotsremmer uit het medium worden verwijderd, zodat de cellen weer de typische ESC-achtige morfologie kunnen vertonen (figuur 3B - dag 4).
Om te beoordelen of een iPSC-kolonie van hoge kwaliteit is, moeten verschillende aspecten in overweging worden genomen. Ten eerste is het normaal dat gezonde kolonies geen of een kleine hoeveelheid spontane differentiatie vertonen; een verhoogd aantal gedifferentieerde cellen (>10%) wijst echter op een slechte iPSC-kwaliteit. Bijkomende kenmerken van een lage iPSC-kwaliteit zijn een verlies van randintegriteit en uniformiteit (figuur 3C: rechts), evenals losse cellulaire verpakkingen met zichtbare openingen tussen de cellen (figuur 3D: rechts). Hoogwaardige iPSC's worden daarentegen gekenmerkt door gedefinieerde randen, strakke cellulaire verpakkingen en prominente nucleoli (figuur 3C, D: linker afbeeldingen).
Figuur 3: IPSC-cultuur van primaten . (A) Fasecontrastbeelden die het loslaten van iPSC-kolonies tijdens EDTA-incubatie volgens het clump passaging-protocol en de optimale klompgrootte na dissociatie laten zien. Schaalbalken = 250 μm. (B) Tijdlijn van iPSC-herstel na single-cell passaging. De Rock-remmer Y-27632 werd vanaf dag 2 verwijderd. Schaalbalken = 250 μm. (C) Links: voorbeeld van een hoogwaardige menselijke iPSC-kolonie met gedefinieerde grenzen. Rechts: voorbeeld van een kolonie van slechte kwaliteit met minder grensintegriteit en gedifferentieerde cellen. Schaalbalken = 500 μm. (D) Voorbeeldafbeeldingen voor een menselijke iPSC-kolonie van hoge kwaliteit (links) in vergelijking met een kolonie van lage kwaliteit met los opeengepakte cellen (rechts). Schaalstaven = 100 μm. Afkorting: iPSC's = geïnduceerde pluripotente stamcellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur S1: Overzicht van celtypen in menselijke urine. (A) Cellen geïsoleerd uit vrouwelijke urine. (B) Cellen geïsoleerd uit mannelijke urine. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel S1: Buffer- en mediasamenstellingen die in dit onderzoek zijn gebruikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
iPSC's zijn waardevolle celtypen omdat ze het mogelijk maken om anders ontoegankelijke celtypen in vitro te genereren. Omdat de uitgangsmaterialen voor herprogrammering, bijvoorbeeld fibroblasten, niet gemakkelijk beschikbaar zijn van alle primatensoorten, presenteert dit artikel een protocol voor het genereren van iPSC's uit van urine afgeleide cellen. Deze cellen kunnen op een niet-invasieve manier worden verkregen, zelfs uit niet-steriele urinemonsters van primaten, door het kweekmedium aan te vullen met breedspectrumantibiotica.
Verschillende kritische stappen in het protocol zijn wat extra discussie waard. Ten eerste is het bij het isoleren van cellen uit niet-steriele urine belangrijk om het medium aan te vullen met een breedspectrum antimicrobieel reagens om het risico op besmetting te verminderen. Als de groei van microbiologische besmetting duidelijk wordt ondanks het gebruik van antibiotica, wordt aanbevolen om de hele cultuur weg te gooien en het gebied te desinfecteren; Bovendien is onze ervaring dat doorgaan met kweken geen gezond groeiende urinecellen produceert. Ten tweede, bij het beginnen met het herprogrammeren van cellen, wordt het bereiden van verschillende gerechten met verschillende aantallen SeV-getransduceerde cellen ten zeerste aanbevolen, om het risico van loslating van alle cellen door overconfluentie te voorkomen en om de kans op iPSC-acquisitie te vergroten. Over het algemeen wordt verwacht dat het plateren van een hogere dichtheid van SeV-getransduceerde cellen meer geherprogrammeerde iPSC-kolonies oplevert, terwijl het kweken van de herprogrammeringscellen gedurende een periode van ~ 20 dagen vaak resulteert in overconfluentie, gevolgd door loslating van de hele put. Ten derde is het bij elke stap die dissociatie van iPSC's vereist, van cruciaal belang om uitgebreid pipetteren te voorkomen, wat leidt tot aanzienlijke celdood. Vooral wanneer de klompdoorgang wordt uitgevoerd, is het belangrijk om de klonten op een geschikte grootte te houden (figuur 3A). Te grote klonten kunnen leiden tot snelle differentiatie, terwijl te kleine klonten de overleving kunnen verminderen.
We zagen dat de kans op het verkrijgen van urinecellen vrij variabel is tussen monsters en aliquots, maar vonden geen bewijs dat kleinere volumes een lager slagingspercentage hebben bij het verkrijgen van kolonies. Over het algemeen isoleerden we gemiddeld 7,6 kolonies uit 100 ml menselijke urine. Uitgaande van deze gemiddelde snelheid en een Poisson-verdeling, heeft het verkrijgen van ten minste één kolonie een kans van ~ 98% voor 50 ml en ~ 30% voor 5 ml uitgangsmateriaal. In ons geval was het mogelijk om ten minste één kolonie te isoleren van 5 ml menselijke urine in 42% van de pogingen15. Op basis hiervan kan de isolatie van kolonies nog steeds het proberen waard zijn, zelfs als er slechts kleine hoeveelheden urine beschikbaar zijn. In het geval dat de herprogrammering van urinecellen mislukt en er geen iPSC-kolonies kunnen worden waargenomen, kan het plateren van verschillende aantallen getransfecteerde cellen resulteren in herprogrammering van de van urine afgeleide cellen. De opkomende iPSC-kolonies kunnen ook worden geïdentificeerd als iPSC's door levende kleuring met behulp van oppervlaktemarkers (bijv. TRA-1-60 of alkalische fosfatase [AP]; gegevens niet getoond). Het is bekend dat AP-activiteit wordt geupreguleerd in pluripotente stamcellen en het kan worden gebruikt om stamcellen tijdelijk te kleuren tijdens het kweekproces. Een andere mogelijke valkuil van het protocol is de optimale cultuur van NHP iPSC's. Met behulp van dit protocol hebben we bevestigd dat menselijke en NHP iPSC's hun pluripotente toestand behouden gedurende meer dan 50 passages met behulp van een commercieel beschikbaar medium. In vergelijking met menselijke iPSC's zijn NHP iPSC's echter meer geneigd om spontaan te differentiëren in onze ervaring, mogelijk vanwege de kweekomstandigheden die zijn geoptimaliseerd voor menselijke en niet voor NHP-culturen. Bovendien is er een grote variabiliteit tussen iPSC-klonen in overlevingskansen na plating, groeisnelheid en neiging tot differentiatie. Daarom moet men vaak de optimale splitsingsverhouding, passagetiming en klompgrootte voor elke kloon afzonderlijk bepalen.
We hebben aangetoond dat zelfs een volume van 5 ml voldoende kan zijn om urinecellen te isoleren van NHPs15. Hoewel we geen significante verschillen vonden in het aantal geïsoleerde urinecellen bij mensen, gorilla's en orang-oetans, hadden chimpansees een lagere verhouding, omdat we urinecellen niet konden isoleren van een totaal van 87 ml. Daarom kan het voor sommige soorten nodig zijn om veel meer urine te verzamelen dan voor andere. Het verzamelen van grote volumes van kleine primaten kan bijzonder uitdagend zijn, maar omdat de isolatie van urinecellen redelijk kostenefficiënt is, is het praktisch om het gewoon uit te proberen voor bepaalde soorten en beschikbare hoeveelheden urine. Helaas kunnen de urinemonsters niet worden ingevroren, wat de straal waarover monsters kunnen worden verzameld, beperkt. We toonden echter aan dat een opslagtijd van 4 uur bij 4 °C geen invloed had op het aantal geïsoleerde kolonies15, en een langere opslagtijd of verbetering van de opslagomstandigheden zou wel eens mogelijk kunnen zijn. We hebben verschillende soorten kwaliteitscontroletests geïntroduceerd voor validatie. Maar zelfs als een iPSC-lijn aan deze criteria voldoet, is de klonale heterogeniteit nog steeds aanzienlijk, wat is verklaard door genetische achtergrond49 en epigenetische status 50,51,52,53,54. Om iPSC's van primaten toe te passen op toekomstige vergelijkende analyse, moet men rekening houden met de heterogeniteit en voldoende klonen gebruiken om de klonale variatie te gemiddelden, waardoor een verkeerde interpretatie van het resultaat wordt vermeden.
Niettemin heeft het gebruik van urine als bron voor primaire cellen een groot voordeel ten opzichte van conventionele methoden die bijvoorbeeld fibroblasten gebruiken voor herprogrammering, omdat ze volledig niet-invasief kunnen worden verkregen. Bovendien maakt dit protocol het mogelijk om iPSC's te genereren uit van urine afgeleide cellen met een kortere periode dan conventionele herprogrammering. Met deze methode worden kolonies binnen 5-15 dagen zichtbaar, terwijl we hebben ontdekt dat kolonies van primatenfibroblasten (rhesus, baviaan) de neiging hebben om later te verschijnen, na 20-30 dagen. Bovendien gaf met het gebruik van deze suspensie-infectiemethode 0,19% van de virusgetransduceerde cellen aanleiding tot kolonies met pluripotente celachtige morfologie. Dit resulteerde in ten minste één kolonie in 87% van de pogingen15. Ter vergelijking: de conventionele transductiemethode van SeV met aangehechte cellen en lipofectie met episomale plasmiden bleek een significant lagere herprogrammeringsefficiëntie te hebben, met respectievelijk 0,09% en 0,009% van de cellen die een pluripotente kolonie vormen15.
Samenvattend maakt deze methode de isolatie van urinecellen niet-invasief mogelijk en het genereren van feedervrije iPSC's van bijna elke menselijke donor en vele NHP's. Dit vergroot de toegankelijkheid tot kostbare celtypen die van deze iPSC's kunnen worden onderscheiden. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om patiëntspecifieke iPSC's te produceren die kunnen worden gebruikt voor ziektemodellering of toekomstige celgebaseerde therapieën. Ten slotte, omdat iPSC's kunnen worden gegenereerd uit slechts kleine hoeveelheden urine, kan deze methode worden toegepast op veel meer verschillende primaten- of zelfs zoogdiersoorten. Deze methode kan dus een krachtig hulpmiddel zijn voor vergelijking tussen soorten, waardoor de evolutie van mensspecifieke eigenschappen beter kan worden begrepen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door DFG EN 1093/5-1 (projectnummer 458247426). M.O. werd ondersteund door JSPS Overseas Research Fellowship. Alle figuren zijn gemaakt met BioRender.com. Flowcytometrie werd uitgevoerd met behulp van de Core Facility Flow Cytometry in het Biomedical Center München. We willen Makoto Shida en Tomoyo Muto van ASHBi, Kyoto University, bedanken voor hun steun aan videografie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accumax™ cell detachment solution (Detachment solution) | Sigma-Aldrich | SCR006 | |
| Amphotericin B-Solution | Merck | A2941-100ML | |
| Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody | Stem Cell Technologies | 60064 | Dilution: 1/200 |
| Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody | Miltenyi Biotec | 130-122-965 | Dilution: 1/50 |
| Bambanker™ (Cell freezing medium) | Nippon Genetics | BB01 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
| Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR | Greiner BIO-ONE | 665180 | |
| Countess™ II automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes) | Sued-Laborbedarf | 52 95-0213 | Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information. |
| CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus) | Thermo Fisher Scientific | A16519 | |
| CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit) | Thermo Fisher Scientific | A16518 | |
| DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | 10236276001 | |
| DMEM High Glucose | TH.Geyer | L0102 | |
| DMEM/F12 w L-glutamine | Fisher Scientific | 15373541 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Dilution: 1/500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21207 | Dilution: 1/500 |
| DPBS w/o Calcium w/o Magnesium | TH.Geyer | L0615-500 | |
| EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC) | Thermo Fisher Scientific | 710524 | Dilution: 1/500 |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Carl Roth | CN06.3 | |
| Falcon Tube 15 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 188271-N | |
| Falcon Tube 50 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
| FlowJo V10.8.2 | FlowJo | 663441 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-1KG | |
| Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413301 | |
| GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Heracell™ 240i CO2 incubator | Fisher Scientific | 16416639 | |
| Heraeus HeraSafe safety cabinet | Kendro | 51017905 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-749 | |
| ImageJ | Fiji | Version 2.9.0 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL | Nerbe Plus | 04-212-1000 | |
| Microscope Nikon eclipse TE2000-S | Nikon | TE2000-S | |
| Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody | R&D Systems | MAB1368 | Dilution: 1/100 |
| Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody | R&D Systems | MAB1420 | Dilution: 1/100 |
| Mouse anti-beta-III Tubulin antibody | R&D Systems | MAB1195 | Dilution: 1/100 |
| mTeSR™ 1 | STEMCELL Technolgies | 85850 | |
| Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4903S | Dilution: 1/400 |
| Normocure™ (Antimicrobial Reagent) | Invivogen | ant-noc | |
| Oct-4 Rabbit Antibody | Cell Signaling Technology | 2750S | Dilution: 1/400 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 µg/mL Streptomycin. |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Recombinant Human PDGF-AB | PeproTech | 100-00AB | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SIGMA | 4-16KS | |
| Renal Epithelial Cell Basal Medium | ATCC | PCS-400-030 | |
| Renal Epithelial Cell Growth Kit | ATCC | PCS-400-040 | |
| Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900 | Cell Signaling Technology | 4900S | Dilution: 1/400 |
| SSEA4 (MC813) Mouse mAb | NEB | 4755S | Dilution: 1/500 |
| StemFit® Basic02 | Nippon Genetics | 3821.00 | The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
| TrypLE™ Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12563011 | |
| Waterbath Precision GP 05 | Thermo Fisher Scientific | TSGP05 | |
| Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor) | Biozol | BYT-ORB153635 | |
| Antibody dilution buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Blocking buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
| REMC medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Primary urine medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| PSC culture medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| PSC generation medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Urine wash buffer | For composition see the supplementary table S1 |
References
- Pääbo, S. The human condition-a molecular approach. Cell. 157 (1), 216-226 (2014).
- Zoonomia Consortium, A comparative genomics multitool for scientific discovery and conservation. Nature. 587 (7833), 240-245 (2020).
- Kircher, M., et al. A general framework for estimating the relative pathogenicity of human genetic variants. Nature Genetics. 46 (3), 310-315 (2014).
- Enard, W. Functional primate genomics-leveraging the medical potential. Journal of Molecular Medicine. 90 (5), 471-480 (2012).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Wunderlich, S., et al. Primate iPS cells as tools for evolutionary analyses. Stem Cell Research. 12 (3), 622-629 (2014).
- Denli, A. M., et al. Primate-specific ORF0 contributes to retrotransposon-mediated diversity. Cell. 163 (3), 583-593 (2015).
- Ramsay, L., et al. Conserved expression of transposon-derived non-coding transcripts in primate stem cells. BMC Genomics. 18 (1), 214 (2017).
- Marchetto, M. C. N., et al. Differential L1 regulation in pluripotent stem cells of humans and apes. Nature. 503 (7477), 525-529 (2013).
- Gallego Romero,, I,, et al. A panel of induced pluripotent stem cells from chimpanzees: a resource for comparative functional genomics. eLife. 4, 07103 (2015).
- Pavlovic, B. J., Blake, L. E., Roux, J., Chavarria, C., Gilad, Y. A comparative assessment of human and chimpanzee iPSC-derived cardiomyocytes with primary heart tissues. Scientific Reports. 8 (1), 15312 (2018).
- Rhodes, K., et al. Human embryoid bodies as a novel system for genomic studies of functionally diverse cell types. eLife. 11, 71361 (2022).
- Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
- Dannemann, M., Gallego Romero,, I, Harnessing pluripotent stem cells as models to decipher human evolution. The FEBS Journal. 289 (11), 2992-3010 (2022).
- Geuder, J., et al. A non-invasive method to generate induced pluripotent stem cells from primate urine. Scientific Reports. 11 (1), 3516 (2021).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nature Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Aoi, T., et al. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science. 321 (5889), 699-702 (2008).
- Kim, J. B., et al. Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors. Nature. 454 (7204), 646-650 (2008).
- Ruiz, S., et al. High-efficient generation of induced pluripotent stem cells from human astrocytes. PloS One. 5 (12), (2010).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Park, I. -H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Loh, Y. -H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).
- Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Human Molecular Genetics. 18 (22), 4340-4349 (2009).
- Sun, N., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15720-15725 (2009).
- Giorgetti, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood using. OCT4 and SOX2. Cell Stem Cell. 5 (4), 353-357 (2009).
- Eminli, S., et al. Differentiation stage determines potential of hematopoietic cells for reprogramming into induced pluripotent stem cells. Nature Genetics. 41 (9), 968-976 (2009).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
- Zhou, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from urine. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1221-1228 (2011).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nature Protocols. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448 (7151), 318-324 (2007).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
- Kaji, K., et al. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature. 458 (7239), 771-775 (2009).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 11-14 (2010).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
- Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
- Zhou, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell. 4 (5), 381-384 (2009).
- Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
- Guan, J., et al. Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells. Nature. 605 (7909), 325-331 (2022).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
- Ohnuki, M., et al. Dynamic regulation of human endogenous retroviruses mediates factor-induced reprogramming and differentiation potential. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (34), 12426-12431 (2014).
- Rouhani, F., et al. Genetic background drives transcriptional variation in human induced pluripotent stem cells. PLoS Genetics. 10 (6), 1004432 (2014).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 28 (8), 848-855 (2010).
- Koyanagi-Aoi, M., et al. Differentiation-defective phenotypes revealed by large-scale analyses of human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (51), 20569-20574 (2013).
- Nishizawa, M., et al. Epigenetic variation between human induced pluripotent stem cell lines is an indicator of differentiation capacity. Cell Stem Cell. 19 (3), 341-354 (2016).
- Yokobayashi, S., et al. Inherent genomic properties underlie the epigenomic heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Cell Reports. 37 (5), 109909 (2021).
