Summary
Le présent protocole décrit une méthode pour isoler, étendre et reprogrammer des cellules dérivées de l’urine de primates humains et non humains en cellules souches pluripotentes induites (CSPi), ainsi que des instructions pour le maintien sans alimentation des CSPi nouvellement générées.
Abstract
Les approches interspécifiques qui étudient les cellules souches pluripotentes des primates et leurs dérivés sont cruciales pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires de la maladie, du développement et de l’évolution. Pour rendre les cellules souches pluripotentes induites par les primates (CSPi) plus accessibles, cet article présente une méthode non invasive pour générer des CSPi de primates humains et non humains à partir de cellules dérivées de l’urine, et leur maintien à l’aide d’une méthode de culture sans nourrisseur.
L’urine peut être échantillonnée dans un environnement non stérile (p. ex. la cage de l’animal) et traitée avec un cocktail d’antibiotiques à large spectre pendant la culture cellulaire primaire afin de réduire efficacement la contamination. Après multiplication des cellules dérivées de l’urine, les CSPi sont générées par une méthode de transduction modifiée d’un système vectoriel du virus Sendai disponible dans le commerce. Les premières colonies d’iPSC peuvent déjà être visibles après 5 jours, et peuvent être cueillies après 10 jours au plus tôt. Le passage systématique d’amas avec tampon de dissociation sans enzyme soutient la pluripotence des CSPi générées pendant plus de 50 passages.
Introduction
Les comparaisons génomiques des primates humains et non humains (PNH) sont cruciales pour comprendre notre histoire évolutive et l’évolution des traits spécifiques à l’homme1. De plus, ces comparaisons permettent d’inférer la fonction en identifiant les séquences d’ADN conservées2, par exemple, pour prioriser les variantes associées à la maladie3. Les comparaisons de phénotypes moléculaires tels que les niveaux d’expression génique sont cruciales pour mieux interpréter les comparaisons génomiques et découvrir, par exemple, les différences phénotypiques cellulaires. En outre, ils ont - comme les comparaisons au niveau de l’ADN - le potentiel de déduire la pertinence fonctionnelle, et donc de mieux interpréter la variation médicalement pertinente chez l’homme4. L’incorporation de données phénotypiques moléculaires complètes dans ces études comparatives nécessite des ressources biologiques appropriées (c.-à-d. des cellules orthologues pour toutes les espèces). Cependant, des raisons éthiques et pratiques rendent difficile, voire impossible, l’accès à ces cellules comparables, en particulier pendant le développement. Les cellules souches pluripotentes induites (CSPi) permettent la génération de tels types de cellules inaccessibles in vitro5,6, sont expérimentalement accessibles et ont été utilisées pour des comparaisons avec les primates 6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Pour générer des CSPi, il faut acquérir les cellules primaires à reprogrammer. Les cellules isolées de l’urine ont l’avantage de pouvoir être prélevées de manière non invasive chez les primates et de pouvoir être facilement reprogrammées, probablement en raison de leurs profils moléculaires semblables à ceux des cellules souches15. Les conditions de culture pour maintenir les CSPi des primates sont aussi importantes que la reprogrammation; Classiquement, la culture de cellules souches pluripotentes humaines nécessitait un milieu non défini à base de sérum et une co-culture de fibroblastes embryonnaires de souris - appelés cellules nourricières - qui fournissent des nutriments essentiels et un échafaudage pour les cellules souches embryonnaires (CSE)16. Depuis la mise au point de systèmes de culture chimiquement définis et sans alimentation17,18, il existe maintenant diverses options de milieux et de matrices de culture iPSC disponibles dans le commerce. Cependant, la plupart de ces conditions de culture ont été optimisées pour les CSE et les CSPi humaines et, par conséquent, pourraient moins bien fonctionner dans la culture des CSPi des PSN. Dans ce protocole vidéo, nous fournissons des instructions pour générer et maintenir des CSPi humaines et de PSP de PSN dérivées de cultures de cellules urinaires.
Depuis le premier rapport de génération de CSPi par l’expression forcée de facteurs définis dans les fibroblastes en 2006, cette méthode a été appliquée à de nombreux types cellulaires différents d’origines diverses 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. Parmi eux, seules les cellules dérivées de l’urine peuvent être obtenues de manière totalement non invasive. Sur la base du protocole précédemment décrit par Zhou et al.33, on peut isoler et développer des cellules à partir d’urine de primates même à partir d’échantillons non stériles, en complétant des antibiotiques à large spectre15. Notamment, les cellules dérivées de l’urine échantillonnées par ce protocole présentent un potentiel élevé de production de CSPi, dans un laps de temps plus court (les colonies deviennent visibles en 5-15 jours) que la reprogrammation conventionnelle des fibroblastes (20-30 jours, selon notre expérience), et avec un taux de réussite suffisamment élevé. Ces cellules dérivées de l’urine ont été classées comme la population mixte de cellules souches mésenchymateuses et de cellules épithéliales de la vessie, provoquant une efficacité de reprogrammation élevée15.
En plus de la variation des cellules primaires, les méthodes de reprogrammation pour générer des CSPi varient également en fonction du but de l’utilisation. Les procédures conventionnelles de reprogrammation des cellules somatiques humaines ont été réalisées par la surexpression de facteurs de reprogrammation avec des vecteurs rétrovirus ou lentivirus, ce qui a permis l’intégration de l’ADN exogène dans le génome 5,34,35. Pour garder les CSPi générées génomiquement intactes, les chercheurs ont mis au point une grande variété de systèmes de non-intégration - vecteur PiggyBac36,37 excisable, vecteur épisomique38,39, vecteurs de virus non intégrateurs tels que le virus Sendai 40 et l’adénovirus 41, transfection d’ARNm 42, transfection de protéines 43,44 et traitement de composés chimiques 45. En raison de l’efficacité et de la facilité de manipulation, les vecteurs de reprogrammation basés sur le virus Sendai sont utilisés dans ce protocole. L’infection des cellules primaires est réalisée dans une culture en suspension de cellules et de virus de 1 h à une multiplicité d’infection (MOI) de 5 avant le placage. Cette étape modifiée pourrait augmenter la probabilité de contact entre les surfaces cellulaires et les virus, par rapport à la méthode conventionnelle dans laquelle les virus sont ajoutés directement à la culture cellulaire adhérente, et ainsi produire plus de colonies de CSPi15.
La transmission des cellules souches pluripotentes humaines et des PSN peut se faire par passage d’agglomérats et par passage unicellulaire. L’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) est un agent chélatant rentable qui lie les ions calcium et magnésium et empêche ainsi l’activité adhérente de la cadhérine et de l’intégrine. L’EDTA est également utilisé comme réactif de dissociation sélectif et léger, car les cellules indifférenciées se détachent devant les cellules différenciées en raison de leurs différentes molécules d’adhésion. La dissociation complète induit la mort cellulaire massive des CSPi des primates via l’hyperactivation de la myosine médiée par la bobine enroulée associée à Rho / Rho contenant la protéine kinase (Rho / Rock). Par conséquent, la supplémentation du milieu de culture avec un inhibiteur de Rho/Rock est essentielle pour les expériences qui nécessitent des cellules individuelles en suspension46,47. Dans ce protocole, nous recommandons le passage par agrégats comme méthode de passage de routine et recommandons le passage d’une seule cellule uniquement lorsque cela est nécessaire, par exemple lorsque l’ensemencement de numéros de cellules définis est nécessaire, ou pendant le sous-clonage.
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Protocol
Cette procédure expérimentale a été approuvée par le comité d’éthique responsable de l’expérimentation humaine (20-122, Ethikkommission LMU München). Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives et réglementations pertinentes.
REMARQUE : L’approbation du comité d’éthique approprié doit être obtenue avant d’entreprendre des expériences portant sur des échantillons humains et des échantillons de PSN. Toutes les procédures expérimentales doivent être effectuées conformément aux lignes directrices et aux règlements pertinents. Chacune des étapes suivantes doit être effectuée en utilisant une technique stérile dans une enceinte de sécurité biologique. Toutes les compositions de tampons et de supports se trouvent dans le tableau supplémentaire S1. Assurez-vous que tous les fluides sont chauffés à température ambiante (22 °C) avant d’être ajoutés aux cellules. Chaque étape de centrifugation doit être effectuée à température ambiante, sauf indication contraire.
1. Isolement de cellules à partir d’échantillons d’urine
MISE EN GARDE : S’assurer que les donneurs humains sont exempts du virus de l’immunodéficience humaine (VIH), du virus de l’hépatite B (VHB) et du virus de l’hépatite C (VHC). Dans le cas des PSN, assurez-vous que les donneurs ou cellules possibles sont exempts d’agents pathogènes spécifiques : le virus B (VB), le virus de l’immunodéficience simienne (SIV), le bêtarétrovirus simien (VRS) et le virus lymphotrope à cellules T simiennes (VLV).
- Préparez une plaque de 12 puits recouverte de gélatine en ajoutant 500 μL de gélatine à 0,2 % par puits, et répartissez le liquide en déplaçant la plaque. Placer à 37 °C pendant au moins 30 minutes avant d’être nécessaire.
- Prélever des échantillons d’urine humaine dans des tubes coniques de 50 mL. Pour les primates, prélevez l’urine du sol de l’animalerie avec une seringue.
REMARQUE : Un volume de 5 mL d’urine s’est avéré suffisant pour isoler au moins une colonie dans 42 % des tentatives. Cependant, l’utilisation d’un volume plus élevé de ~50 mL d’urine est recommandée pour augmenter les chances d’isoler les colonies. L’urine des PSN doit être échantillonnée aussi fraîche que possible, de préférence immédiatement après la miction. Le stockage des échantillons d’urine à 4 °C pendant 4 h n’a pas eu d’effet négatif sur le taux de réussite du protocole, mais des temps de conservation plus longs n’ont pas été testés. - Centrifuger le tube contenant de l’urine à 400 × g pendant 10 minutes et aspirer soigneusement le surnageant, en laissant environ 1 mL dans le tube.
- Remettez la pastille en suspension dans le résidu de 1 mL de liquide. Regroupez les suspensions dans un tube si plusieurs tubes d’urine ont été recueillis.
- Laver les cellules en ajoutant 10 mL de tampon de lavage d’urine (voir le tableau supplémentaire S1) contenant 2,5 μg/mL d’amphotéricine dans le tube, et mélanger soigneusement la suspension à l’aide d’une pipette sérologique.
- Centrifuger le tube à 200 × g pendant 10 minutes et aspirer soigneusement le surnageant, en laissant environ <0,2 mL dans le tube.
- Resuspendre la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu urinaire primaire (voir le tableau supplémentaire S1) contenant 0,5 μg/mL d’amphotéricine par 50 mL d’urine initialement traitée (remise en suspension dans 1 mL, même si moins de 50 mL d’urine ont été traitées).
- Aspirer la gélatine des puits (préparée à l’étape 1.1) et plaquer 1 mL de la suspension de l’étape 1.7 dans un puits d’une plaque de 12 puits. Répéter pour autant de puits que désiré, ou pour autant de mililitres de suspension disponibles.
Facultatif : Pour éviter la contamination provenant du prélèvement d’échantillons insalubres, ajouter 100 μg/mL de réactif antimicrobien aux cellules à partir de maintenant, jusqu’au premier passage. - Placer la plaque dans un incubateur à 37 °C, 5% de CO2 .
- Ajouter 1 mL de milieu urinaire primaire par puits par jour jusqu’au jour 5, sans enlever le milieu existant.
- Le jour 5, aspirer 4 mL de milieu de la plaque, ce qui laisse environ 1 mL de milieu. Ajouter 1 mL de milieu REMC (voir le tableau supplémentaire S1) par puits pour obtenir un mélange 1:1 avec le nouveau milieu de culture.
- Remplacer la moitié du milieu par un milieu REMC tous les jours jusqu’à l’apparition des premières colonies (Figure 1A, B). Par conséquent, retirez 1 mL d’ancien milieu et ajoutez 1 mL de milieu REMC frais par puits.
2. Expansion des cellules urinaires
REMARQUE: Le passage des cellules urinaires doit être effectué avant que la culture n’atteigne 90% de confluence.
- Préparer la quantité désirée de plaques à 12 puits recouvertes de gélatine, comme indiqué à l’étape 1.1.
- Aspirer l’ancien milieu et laver les cellules en ajoutant 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS).
- Aspirer le DPBS et ajouter 300 μL d’enzyme de dissociation 0,5x diluée avec DPBS. Incuber la plaque à 37 °C pendant 5 min.
- Ajouter 700 μL de milieu REMC pour arrêter la réaction enzymatique. Pipeter doucement la suspension à l’aide d’une pipette P1000 jusqu’à ce que les cellules soient dissociées en cellules individuelles.
- Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml et centrifuger le tube à 200 × g pendant 5 min.
- Aspirer délicatement le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 1 mL de milieu REMC.
- Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules (un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatisé).
- Pour l’expansion des cellules urinaires, plaquer 1,5 × 10 4 à 3 × 104 cellules dans 1 mL de milieu REMC dans une plaque de 12 puits recouverte de gélatine à 0,2 %.
- Effectuez les changements de milieu suivants tous les deux jours jusqu’à ce que la culture atteigne 80% à 90% de confluence. Par conséquent, aspirez l’ancien milieu et ajoutez 1 mL de milieu REMC frais.
3. Génération de CSPi par infection par le vecteur du virus Sendai
Remarque : Pour le flux de travail de la procédure de reprogrammation, voir la figure 2A. Les cellules urinaires utilisées pour la reprogrammation doivent être aussi jeunes que possible, mais une perte remarquable d’efficacité de reprogrammation n’est pas observée avant le passage 4. Le kit de reprogrammation du virus Sendai doit être utilisé dans une installation BL-2. Manipulez les virus sous une enceinte de sécurité biologique à flux laminaire et utilisez toujours l’équipement de sécurité approprié pour prévenir l’exposition des muqueuses.
- Préparer une plaque de 12 puits revêtue d’une matrice de membrane basale en ajoutant 500 μL de matrice membranaire basale par puits, et distribuer le liquide en déplaçant la plaque. Incuber la plaque à 37 °C pendant au moins 1 h et remplacer la matrice membranaire basale par 900 μL de milieu REMC. Conserver la plaque à 37 °C jusqu’à utilisation.
- Décongelez rapidement les composants du kit de reprogrammation Sendai au bain-marie à 37 °C. Mélanger les virus Sendai (polycistronique KLF4-OCT3/4-SOX2, cMYC et KLF4) avec un MOI de 5 et ajouter un milieu REMC jusqu’à 100 μL. Utilisez l’équation (1) :
REMARQUE : Comme les titres de virus diffèrent d’un lot à l’autre, vérifiez toujours le titre dans le certificat d’analyse fourni par le fabricant.
Facultatif : Utiliser le virus Sendai de la protéine fluorescente verte (GFP) en plus comme témoin positif de l’efficacité de la transduction. Pour cela, préparez 3,5 × 104 cellules supplémentaires dans un tube séparé à l’étape 3.3. - Pour la dissociation des cellules urinaires, suivez les étapes 2.2-2.4. Compter les cellules à l’aide du compteur de cellules et transférer 7 × 104 cellules urinaires dans un tube de 1,5 mL.
- Centrifuger le tube à 200 × g pendant 5 min, et retirer délicatement le surnageant sans perturber la pastille de cellule. Remettez la pastille en suspension dans 100 μL du mélange SeV préparé à l’étape 3.2. Incuber le tube pendant 1 h à 37 °C pour l’infection en suspension.
- Plaquer la suspension sur les plaques à 12 puits revêtues de matrice de membrane basale qui ont été préparées à l’étape 3.1. Habituellement, la plaque 1 × 10 4 et 2,5 × 104 cellules par puits en double.
- Incuber les cellules à 37 °C et 5% de CO2. Remplacer le milieu par 1 mL de milieu REMC frais 24 h après la transduction et le jour 3.
- Le jour 5 après la transduction, remplacer le milieu par le milieu de génération de CSP (voir le tableau supplémentaire S1), puis changer de milieu tous les deux jours. Par conséquent, retirez l’ancien milieu et ajoutez 1 mL de milieu de génération de CSP par puits.
REMARQUE: Cela peut prendre jusqu’à 15 jours jusqu’à ce que les premières colonies apparaissent. - Choisissez des colonies individuelles de CSPi lorsque la taille de la colonie dépasse 1 mm. Pour ce faire, grattez et collectez soigneusement une seule colonie avec une pipette p10 au microscope. Transférer la colonie dans un nouveau puits d’une plaque de 12 puits recouverte d’une matrice membranaire basale contenant 750 μL de milieu de culture PSC.
Facultatif : Le rinçage de la plaque avec du DPBS et le traitement pendant 1 min avec 0,5 mM d’EDTA avant la cueillette pourraient soutenir la culture robuste des étapes ultérieures. Si les cellules doivent être cultivées plus longtemps pour attendre l’émergence ultérieure de colonies, n’effectuez pas cette étape de traitement à l’EDTA. - Faire pousser les cellules à 37 °C et 5 % de CO2 avec des changements de milieu subséquents tous les deux jours, comme indiqué dans la section 4 du protocole. Lorsque la colonie prélevée atteint un diamètre de 2 mm, poursuivre le passage de routine des CSPi, comme expliqué à la section 5 du protocole.
4. Changement moyen
NOTE: Le milieu de culture doit être changé tous les deux jours jusqu’à ce que les colonies deviennent assez grandes pour passer.
- Aspirer l’ancien milieu et ajouter 750 μL du milieu frais par plaque de 12 puits. Pour passer à un autre type de milieu, remplacez le milieu au moins 1 jour après le passage.
5. Passage
NOTE: Les cellules doivent être traversées lorsque les colonies d’iPSC deviennent suffisamment grandes (diamètre > 2 mm) ou que les colonies sont sur le point de se toucher. Habituellement, les CSPi peuvent être fractionnées environ tous les 5 jours. Utiliser le passage en agrumeaux (étape 5.1) pour l’entretien de routine et le passage à cellule unique (étape 5.2) pour les expériences où un nombre défini de cellules est nécessaire. Dans le cas où les CSPi se différencient beaucoup, la cueillette des colonies (étape 5.3) peut aider à améliorer la pureté des cultures.
- Passage en groupe
- Préparer une plaque de 12 puits revêtue d’une matrice de membrane basale en ajoutant 500 μL de matrice membranaire basale par puits, et distribuer le liquide en déplaçant la plaque. Incuber la plaque à 37 °C pendant au moins 1 h. Remplacer la matrice membranaire basale par 500 μL de milieu de culture PSC et entreposer la plaque à 37 °C jusqu’à utilisation.
- Aspirer le milieu des cellules cultivées et laver les cellules en ajoutant soigneusement 500 μL de DPBS. Retirez le DPBS et ajoutez 500 μL d’EDTA 0,5 mM dans le puits.
- Incuber la plaque à TA pendant 2-5 min, jusqu’à ce que les colonies commencent à se détacher. Observez attentivement les cellules au microscope.
- Lorsque les bords des colonies commencent à se décoller et que les espaces entre les cellules deviennent visibles (Figure 3A), retirez l’EDTA et ajoutez soigneusement 500 μL de DPBS.
REMARQUE: Toujours pipeter contre la paroi latérale du puits et jamais directement sur les cellules, afin de ne pas détacher les cellules de la plaque. - Aspirer le DPBS et rincer le puits avec 500 μL de milieu de culture PSC à l’aide d’une pipette p1000. Pipeter de haut en bas de 1x-5x pour disperser les colonies en touffes de taille appropriée (figure 3A). Ne pipette pas trop.
REMARQUE: Si les CSPi sont accidentellement trop pipetées, ajouter 10 μM d’inhibiteur de roche Y-27632 au milieu. Cela peut améliorer la survie, car les CSPi ne sont pas capables de survivre en tant que cellules uniques. - Transférer 1/10-1/50 de la suspension de l’amas de cellules dans les nouveaux puits. Le rapport dépend de la confluence du puits avant la division, de la densité souhaitée des cellules ensemencées et de la préférence clonale iPSC.
- Répartir les touffes uniformément dans le puits en déplaçant doucement la plaque d’avant en arrière plusieurs fois. Incuber la plaque pendant au moins 30 min à 37 °C pour laisser les touffes se fixer.
- Remplacer le milieu par 750 μL de milieu de culture PSC si de nombreuses cellules mortes flottantes sont observées; sinon, ajouter 250 μL de milieu de culture PSC. Placer la plaque à 37 °C et 5% de CO2 dans un incubateur.
REMARQUE : Le remplacement du milieu après 30 minutes est essentiel, en particulier pour les lignées cellulaires instables (p. ex. PSN). - Changez le milieu tous les 2-3 jours jusqu’à ce que les colonies deviennent assez grandes pour passer. Pour un changement moyen, suivez l’étape 4 du protocole.
- Passage unicellulaire
- Préparer la plaque de culture recouverte de matrice membranaire basale, comme indiqué à l’étape 5.1.1, en ajoutant 10 μM Y-27632 au milieu de culture PSC.
Facultatif : Ajouter 10 μM Y-27632 aux cellules 1 à 3 h avant le passage pour améliorer la survie des lignées cellulaires sensibles. - Aspirer le milieu et laver les cellules en ajoutant 500 μL de DPBS. Retirez le DPBS et ajoutez 300 μL de solution de détachement dans les puits.
- Incuber la plaque à 37 °C pendant 5-10 min. Lorsque le détachement suffisant des cellules est observé au microscope, ajouter 700 μL de milieu de culture PSC ou DPBS.
- Pipeter de haut en bas 5-10x à l’aide d’une pipette p1000 jusqu’à ce que les cellules soient dissociées en cellules individuelles. Ne pas trop pipetter, afin d’éviter les dommages cellulaires.
- Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL contenant au moins 2 mL de DPBS pour diluer la solution de détachement.
- Centrifuger le tube à 200 × g pendant 5 min et aspirer complètement la solution, sans perturber la pastille cellulaire.
- Resuspendre la pastille dans 500 μL de milieu de culture PSC complété par 10 μM Y-27632.
- Compter les cellules et ensemencer 5 000 à 7 000 cellules par plaque à 12 puits revêtue d’une matrice basale à membrane, préparée à l’étape 5.2.1.
REMARQUE: Si un numéro de cellule différent est nécessaire, changez pour un puits plus grand ou plus petit en conséquence. - Incuber la plaque pendant au moins 30 min à 37 °C et 5% de CO2 pour laisser les cellules se fixer.
- Remplacer le milieu par 750 μL de milieu de culture PSC + 10 μM Y-27632 si de nombreuses cellules mortes sont observées; sinon, ajouter 250 μL + 10 μM Y-27632.
REMARQUE : Cette étape est essentielle, en particulier pour les lignées cellulaires instables (p. ex. PSN). - Placer la plaque à 37 °C et 5% de CO2 dans un incubateur.
- Changer le milieu en milieu de culture PSC sans Y-27632 1 à 2 jours après la division, pour permettre aux cellules d’afficher à nouveau la morphologie classique de la colonie (Figure 3B).
- Changez le milieu tous les 2 jours jusqu’à ce que les colonies deviennent assez grandes. Pour un changement moyen, suivez la section 4 du protocole.
- Préparer la plaque de culture recouverte de matrice membranaire basale, comme indiqué à l’étape 5.1.1, en ajoutant 10 μM Y-27632 au milieu de culture PSC.
- Transmission des CSPi par prélèvement de colonies
- Préparer les 12 puits revêtus de matrice de membrane basale comme indiqué à l’étape 5.1.1.
- Aspirer le milieu et laver les cellules en ajoutant soigneusement 500 μL de DPBS. Retirez le DPBS et ajoutez 500 μL d’EDTA 0,5 mM dans le puits.
- Incuber la plaque à TA pendant 1-3 min et observer les cellules au microscope, jusqu’à ce que le détachement de la colonie soit visible sur les bords.
- Retirez l’EDTA et ajoutez délicatement 500 μL de DPBS. Aspirer le liquide avant d’ajouter lentement 500 μL de milieu de culture PSC au puits, sans détacher les cellules.
- Utilisez une pipette p200 pour prélever la colonie souhaitée au microscope, sans collecter les cellules différenciées. Pour ce faire, grattez doucement la colonie tout en reprenant le milieu contenant les cellules.
- Transférer chaque colonie prélevée dans un puits recouvert d’une matrice membranaire basale, tel que préparé à l’étape 5.3.1. Dissocier les cellules en petits amas à l’aide d’une pipette p1000, en pipetant les cellules 2-5x.
- Incuber la plaque pendant 30 min à 37 °C et 5% de CO2, en laissant les touffes se fixer.
- Remplacer le milieu par 750 μL de milieu de culture PSC si de nombreuses cellules mortes flottantes sont observées; sinon, ajouter 250 μL de milieu de culture PSC.
REMARQUE : Le remplacement du milieu après 30 minutes est essentiel, en particulier pour les lignées cellulaires instables (p. ex. PSN). - Placer la plaque à 37 °C et 5% de CO2 dans un incubateur.
- Changez le milieu tous les 2-3 jours jusqu’à ce que les colonies deviennent assez grandes pour passer. Pour ce faire, suivez la section 4 du protocole.
6. Congélation des cellules urinaires et des CSPi pour stockage à long terme
REMARQUE : Habituellement, les CSPi sont congelées sous forme de touffes dans un milieu de congélation cellulaire sans compter. Le pipetage doit être minime, pour éviter la dissociation en cellules individuelles. Pour les cellules urinaires, 1,5 × 104 à 3 × 104 cellules sont congelées par tube, ce qui permet à l’utilisateur de décongeler un tube directement dans un puits d’une plaque de 12 puits sans avoir besoin d’une autre étape de comptage.
- Préparer 5 mL de DPBS dans un tube de 15 mL.
- Pour la congélation des cellules urinaires, suivez les étapes 2.2-2.4 du protocole. Pour la congélation des CSPi, suivez les étapes 5.1.2 à 5.1.5 du protocole de passage en aggloméré.
- Transférer la suspension dans le tube de 15 mL préparé à l’étape 6.1. Pour la congélation des cellules urinaires, comptez 10 μL de la suspension cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 200 × g et aspirer complètement le surnageant.
- Remettez en suspension la pastille de cellule dans 400 μL de milieu de congélation cellulaire par tube et distribuez les cellules à la quantité souhaitée de cryotubes.
- Transférer immédiatement les cryotubes à -80 °C. Transférer les tubes congelés dans un congélateur à -150 °C ou de l’azote liquide 1 jour après la congélation à -80 °C pour un stockage à long terme.
7. Décongélation des cellules urinaires et des CSPi
- Pour la décongélation des cellules urinaires, préparer la quantité souhaitée de 12 puits recouverts de gélatine, comme indiqué à l’étape 1.1 du protocole. Pour les CSPi, préparer les plaques à 12 puits revêtues d’une matrice de membrane basale, comme indiqué à l’étape 5.1.1. Dans les deux cas, n’échangez pas la matrice avec le support.
- Préparez un tube de 15 mL contenant 4 mL de DPBS et conservez-le à 37 °C.
- Placez rapidement un flacon congelé de cellules dans un bain-marie à 37 °C pour la décongélation, jusqu’à ce qu’un morceau de glace flottante devienne visible.
REMARQUE: Essuyez le cryotube avec de l’éthanol avant et après l’incubation au bain-marie pour éviter les contaminations. - Ajouter 500 μL de milieu REMC pour les cellules urinaires, ou 500 μL de milieu de culture PSC pour CSPi à la suspension contenant de la glace, et transférer immédiatement la suspension dans le tube préchauffé de 15 mL préparé à l’étape 7.2.
- Centrifuger le tube à 200 × g pendant 5 min et jeter complètement le surnageant.
- Pour les cellules urinaires, remettre en suspension la pastille dans 1 mL de milieu REMC. Pour les CSPi, remettre soigneusement la pastille en suspension dans 750 μL de milieu de culture PSC. Évitez de trop pipeter, afin de garder les touffes intactes.
Facultatif : La supplémentation du milieu avec 10 μM Y-27632 peut favoriser la survie des CSPi après décongélation. - Aspirer la matrice des plaques de 12 puits préparées à l’étape 7.1 et transférer délicatement la suspension cellulaire dans le puits.
- Placer la plaque pendant la nuit à 37 °C et 5% de CO2 dans un incubateur.
- Le lendemain, remplacer le milieu par un milieu de culture PSC, sans Y-27632 pour les CSPi et par REMC pour les cellules urinaires.
- Cultiver les cellules à 37 °C et 5% de CO2 dans un incubateur.
- Changez le milieu tous les 2-3 jours jusqu’à ce que les cellules deviennent assez grandes pour passer. Pour un changement moyen, suivez la section 4 du protocole.
8. Immunocytochimie
REMARQUE : L’immunomarquage avec des anticorps ciblant des marqueurs liés à la pluripotence tels que NANOG, OCT3/4, SOX2, TRA-1-60 et EpCAM est l’une des validations les plus largement utilisées des CSPi nouvellement générées. De plus amples informations sur les anticorps et les dilutions peuvent être trouvées dans le tableau des matériaux.
- Plaquer les CSPi 1 à 3 jours avant l’utilisation dans un nombre approprié de plaques à 12 puits. Aspirer le milieu, laver les cellules en ajoutant 500 μL de DPBS et retirer le DPBS. Ajouter 400 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % par puits, et fixer les cellules pendant 15 min à TA.
- Retirez le PFA à 4% et lavez les cellules 3x avec DPBS. Ajouter 400 μL de tampon de blocage par puits, et incuber la plaque pendant 30 min à TA.
- Aspirer le tampon de blocage et ajouter les anticorps dilués dans 400 μL de tampon de dilution d’anticorps (ADB) à chaque puits. Incuber la plaque à 4 °C pendant une nuit.
- Retirer l’ADB contenant les anticorps primaires et laver les cellules 3x avec DPBS.
- Aspirer le DPBS et ajouter 400 μL d’anticorps secondaires dilués dans l’ADB par puits. Incuber la plaque pendant 1 h à TA dans l’obscurité.
- Retirez l’ADB et lavez les cellules 3x avec DPBS. Ajouter 1 μg/mL de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dilué dans du DPBS par puits, et incuber pendant 3 min à TA.
- Aspirez la solution DAPI et lavez la cellule 3x avec DPBS. Ajouter 500 μL de DPBS pour l’imagerie.
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Representative Results
Lors de l’isolement de cellules de l’urine humaine et de l’urine de PSN, différents types de cellules peuvent être identifiés directement après l’isolement. Les cellules squameuses, ainsi que diverses cellules rondes plus petites, sont excrétées avec l’urine; l’urine féminine contient beaucoup plus de cellules malpighiennes que l’urine masculine (Figure 1B - Jour 0; Figure supplémentaire S1). Après 5 jours de culture dans un milieu urinaire primaire, les premières cellules adhérentes proliférant peuvent être observées (Figure 1A,B - Jour 5). À ce stade, la moitié du milieu est remplacée par un milieu de prolifération REMC tous les jours, jusqu’à l’apparition des premières colonies. Vers le jour 13, les cellules adhérentes se développent en grandes colonies qui peuvent être traversées (Figure 1B - Jour 13). Ces colonies peuvent être formées à partir de deux types de cellules morphologiquement distinctes - l’une ayant un phénotype plus épithélial avec des cellules se développant étroitement attachées, et l’autre montrant une morphologie plus mésenchymateuse avec une forme allongée et une capacité de migration plus élevée (Figure 1C). Après le premier passage, les cellules urinaires se développent comme une monocouche et peuvent être traversées lorsque la culture atteint 80% de confluence (Figure 1B - Jour 17).
Figure 1 : Isolement et culture des cellules urinaires. (A) Flux de travail pour l’établissement de cellules urinaires à partir d’échantillons de primates humains et non humains. (B) Images à contraste de phase montrant la croissance et la formation de colonies de cellules urinaires jusqu’au premier passage (p1). (C) Deux types de cellules différentes isolées à partir d’échantillons d’urine peuvent être distingués après 2 semaines de culture. Barres d’échelle = 250 μm (B,C). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Pour générer des CSPi à partir de cellules urinaires, une transduction avec les virus Sendai introduisant les facteurs Yamanaka OCT3/4, SOX2, KLF4 et c-MYC est utilisée. Pour augmenter l’efficacité de la transduction, les cellules urinaires sont incubées avec le virus pendant 1 h en suspension, avant d’être ensemencées sur des puits recouverts de matrice membranaire basale (Figure 2A). Certaines cellules adhérentes peuvent être observées dans les puits 1 jour après la transduction (Figure 2B - Jour 1). Après 5 à 10 jours, ces cellules commencent à former des colonies et des changements morphologiques précoces peuvent être observés, indiquant une reprogrammation des cellules (Figure 2B - Jour 14). Beaucoup de ces colonies présentent progressivement une morphologie semblable à celle de l’ESC et peuvent être cueillies dans un milieu de culture PSC lorsque le diamètre dépasse 1 mm. Après la cueillette, les cellules forment des colonies présentant la morphologie typique de l’ESC dans un délai d’environ 4 jours (Figure 2B - Jours 21 et 24). Lorsque les colonies iPSC deviennent suffisamment grandes, les cellules peuvent être passées pour la première fois en utilisant le protocole de passage d’agrégats (étape de protocole 5.1).
Cette approche de reprogrammation a été utilisée pour générer des CSPi à partir d’humains, de gorilles (gorille) et de Pongo abelii (orang-outan)15. Alors que la probabilité d’obtenir des cellules urinaires est assez variable, et au moins deux à trois fois plus faible pour les chimpanzés que pour les humains15, la reprogrammation des cellules urinaires obtenues a été généralement réussie selon notre expérience. En général, 0,19% des cellules urinaires infectées donnent naissance à des colonies de morphologie de type ESC, ce qui donne au moins une colonie dans 87% des tentatives de reprogrammation15. Tous les CSPi générés partagent les mêmes propriétés et présentent la morphologie typique des colonies de type ESC, caractérisées par des cellules serrées avec des bords clairement définis (Figure 2C). De plus, tous les CSPi présentent un caryotype normal, et l’absence de vecteurs de reprogrammation SeV a été vérifiée par PCR après un minimum de cinq passages, comme recommandé par le fabricant du kit de reprogrammation SeV (données non présentées)15. L’immunocytochimie est utilisée pour tester l’expression de protéines associées à la pluripotence dans le noyau, telles que NANOG, OCT3/4 et SOX2. Des marqueurs de surface tels que TRA-1-60, EpCAM et SSEA4 peuvent également être utilisés (Figure 2D); cependant, SSEA4 est également exprimé dans les cellules urinaires15. De plus, l’analyse par cytométrie en flux peut être effectuée à l’aide de ces marqueurs de surface pour fournir des informations quantitatives sur le statut de pluripotence des CSPi (méthode décrite par Ohnuki et al.48). Cette approche est utilisée pour montrer que 95,3 % des CSPi analysées pour les orangs-outans sont positives pour le TRA-1-60 (figure 2E). De plus, la capacité de différenciation des CSPi des PSP des PSN peut être prouvée par la différenciation in vitro du corps embryoïde (méthode décrite par Geuder et coll.15). Comme le montre la figure 2F, les CSPi des gorilles sont capables de se différencier en lignées endodermique (ɑ-fœtoprotéine), mésoderme (actine musculaire ɑ-lisse) et ectoderme (tubuline β-III).
Figure 2 : Génération et caractérisation des CSPi dérivées de l’urine. (A) Reprogrammation du flux de travail des cellules dérivées de l’urine. (B) Images à contraste de phase montrant les changements morphologiques des cellules urinaires des gorilles pendant la reprogrammation jusqu’à l’établissement de colonies de CSPi. Barres d’échelle = 500 μm. (C) Morphologie des colonies établies de CSPi à partir de cultures de cellules humaines, de gorilles et d’orangs-outans. Barres d’échelle = 500 μm. (D) Coloration par immunofluorescence des CSPi des gorilles avec des marqueurs associés à la pluripotence au passage 8 : NANOG, OCT3/4, SSEA4, SOX2, EpCAM et TRA-1-60. Barres d’échelle = 100 μm. (E) Analyse par cytométrie en flux des CSPi des orangs-outans colorés à l’anti-TRA-1-60-PE. Des cellules non colorées ont été utilisées comme témoin. (F) Analyse par immunofluorescence de l’endoderme (AFP), du mésoderme (ɑ-SMA) et de l’ectoderme (β-III TUB) après différenciation du corps embryoïde des CSPi des gorilles. Les noyaux ont été contre-colorés avec DAPI. Barres d’échelle = 100 μm. Abréviations : CSPi = cellules souches pluripotentes induites; PE = phycoérythrine; AFP = α-fœtoprotéine; ɑ-SMA = actine du muscle lisse alpha; β-III TUB = tubline bêta III; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Lorsque les colonies d’iPSC atteignent un diamètre d’environ 2 mm ou sont sur le point de se toucher, les cellules doivent être divisées. Nous suggérons d’utiliser le protocole de passage de grumeaux pour l’entretien de routine. Dans ce protocole, 0,5 mM d’EDTA est utilisé pour détacher les cellules pendant 3 à 5 minutes, selon la taille de la colonie. Pendant l’incubation de l’EDTA, les frontières des colonies commencent à se détacher et des espaces visibles apparaissent entre les cellules (Figure 3A). L’EDTA doit être retiré lorsqu’un détachement approprié est observé au microscope. Une incubation prolongée avec de l’EDTA conduit à une fraction plus élevée de cellules individuelles qui ne sont pas capables de survivre. Ensuite, les cellules doivent être dissociées en amas de taille similaire, comme le montre la figure 3A. Les cellules ne doivent pas être dissociées en petits amas car cela réduit la survie et peut conduire à des cellules plus différenciantes.
Lorsqu’une expérience nécessite l’ensemencement d’un nombre défini de cellules, le protocole de passage d’une seule cellule doit être utilisé. Ce protocole comprend la supplémentation du milieu avec un inhibiteur de Roche, ce qui permet aux cellules individuelles de survivre. On s’attend à ce que les cellules individuelles attachées présentent une morphologie différente de celle des cellules qui poussent en colonie après l’ensemencement en touffes (Figure 3B - Jour 0). Après 1-2 jours de culture, les cellules individuelles recommencent à se développer en colonies, tout en préservant leur morphologie ainsi que leur contact cellule-cellule lâche, si un inhibiteur de Rock est ajouté au milieu (Figure 3B - Jour 2). Lorsque ces petites colonies sont observées, l’inhibiteur de Rock doit être retiré du milieu, ce qui permet aux cellules de présenter à nouveau la morphologie typique de type ESC (Figure 3B - Jour 4).
Pour juger si une colonie de CSPi est de haute qualité, plusieurs aspects doivent être pris en considération. Premièrement, il est normal que les colonies saines ne présentent pas ou peu de différenciation spontanée; cependant, un nombre accru de cellules différenciées (>10%) indique une mauvaise qualité des CSPi. D’autres caractéristiques de la faible qualité des CSPi sont une perte d’intégrité et d’uniformité de la frontière (Figure 3C : à droite), ainsi qu’un emballage cellulaire lâche avec des espaces visibles entre les cellules (Figure 3D : à droite). En revanche, les CSPi de haute qualité sont caractérisées par des bordures définies, un emballage cellulaire serré et des nucléoles proéminents (Figure 3C, D : images de gauche).
Figure 3 : Culture de CSPi chez les primates. (A) Images à contraste de phase montrant le détachement des colonies d’iPSC pendant l’incubation de l’EDTA suivant le protocole de passage de la touffe et la taille optimale de la touffe après dissociation. Barres d’échelle = 250 μm. (B) Chronologie de la récupération des CSPi après le passage d’une seule cellule. L’inhibiteur de roche Y-27632 a été retiré à partir du jour 2. Barres d’échelle = 250 μm. (C) À gauche : exemple d’une colonie humaine de CSPi de haute qualité avec des bordures définies. À droite : exemple d’une colonie de mauvaise qualité montrant moins d’intégrité des frontières et des cellules différenciées. Barres d’échelle = 500 μm. (D) Exemples d’images pour une colonie de CSPi humaine de haute qualité (à gauche) par rapport à une colonie de faible qualité avec des cellules peu emballées (à droite). Barres d’échelle = 100 μm. Abréviation : CSPi = cellules souches pluripotentes induites. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire S1 : Vue d’ensemble des types de cellules trouvées dans l’urine humaine. (A) Cellules isolées de l’urine féminine. (B) Cellules isolées de l’urine masculine. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire S1 : Compositions tampons et milieux utilisées dans cette étude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Les CSPi sont des types cellulaires précieux car ils permettent la génération de types cellulaires autrement inaccessibles in vitro. Comme les matériaux de départ pour la reprogrammation, par exemple, les fibroblastes ne sont pas facilement disponibles chez toutes les espèces de primates, cet article présente un protocole pour la génération de CSPi à partir de cellules dérivées de l’urine. Ces cellules peuvent être obtenues de manière non invasive, même à partir d’échantillons d’urine de primates non stériles, en complétant le milieu de culture avec des antibiotiques à large spectre.
Plusieurs étapes critiques du protocole méritent d’être discutées plus avant. Tout d’abord, lors de l’isolement de cellules d’urine non stérile, il est important de compléter le milieu avec un réactif antimicrobien à large spectre pour réduire le risque de contamination. Si la croissance de la contamination microbiologique devient apparente malgré l’utilisation d’antibiotiques, il est recommandé de jeter toute la culture et de désinfecter la zone; De plus, selon notre expérience, la culture continue ne produit pas de cellules urinaires saines en croissance. Deuxièmement, lorsque vous commencez à reprogrammer des cellules, il est fortement recommandé de préparer plusieurs plats avec différents nombres de cellules transduites par le SeV, afin d’éviter le risque de détachement de toutes les cellules par excès de confluence et d’augmenter la probabilité d’acquisition de CSPi. En général, le placage d’une densité plus élevée de cellules transduites par le SeV devrait donner plus de colonies de CSPi reprogrammées, alors que la culture des cellules de reprogrammation pendant une période de ~20 jours entraîne souvent une surconfluence, suivie d’un détachement de l’ensemble du puits. Troisièmement, à chaque étape nécessitant la dissociation des CSPi, il est essentiel d’éviter un pipetage étendu, qui entraîne une mort cellulaire importante. Surtout lorsque le passage de la touffe est effectué, il est important de maintenir les touffes à une taille appropriée (Figure 3A). Les amas trop gros peuvent entraîner une différenciation rapide, tandis que les touffes trop petites peuvent diminuer la survie.
Nous avons observé que la probabilité d’obtenir des cellules urinaires est assez variable entre les échantillons et les aliquotes, mais nous n’avons trouvé aucune preuve que des volumes plus petits ont un taux de réussite plus faible dans l’obtention de colonies. En général, nous avons isolé en moyenne 7,6 colonies à partir de 100 ml d’urine humaine. En supposant ce taux moyen et une distribution de Poisson, l’obtention d’au moins une colonie a une probabilité de ~98 % pour 50 mL et de ~30 % pour 5 mL de matière première. Dans notre cas, il a été possible d’isoler au moins une colonie de 5 mL d’urine humaine dans 42% des tentatives15. Sur cette base, l’isolement des colonies peut encore valoir la peine d’être essayé, même si seuls de petits volumes d’urine sont disponibles. Dans le cas où la reprogrammation des cellules urinaires échoue et qu’aucune colonie de CSPi ne peut être observée, le placage d’un nombre différent de cellules transfectées peut entraîner une reprogrammation des cellules dérivées de l’urine. Les colonies émergentes de CSPi peuvent également être identifiées comme des CSPi par coloration vivante à l’aide de marqueurs de surface (p. ex. TRA-1-60 ou phosphatase alcaline [AP]; données non présentées). On sait que l’activité de l’AP est régulée à la hausse dans les cellules souches pluripotentes, et il peut être utilisé pour colorer transitoirement les cellules souches pendant le processus de culture. Un autre piège possible du protocole est la culture optimale des CSPi des PSN. À l’aide de ce protocole, nous avons confirmé que les CSPi humaines et PSN maintiennent leur état pluripotent pendant plus de 50 passages en utilisant un milieu disponible sur le marché. Cependant, comparativement aux CSPi humaines, les CSPi des PSN sont plus susceptibles de se différencier spontanément selon notre expérience, peut-être en raison des conditions de culture qui ont été optimisées pour les cultures humaines et non pour les cultures de PSN. En outre, il existe une grande variabilité entre les clones d’iPSC dans les taux de survie après placage, la vitesse de croissance et la tendance à la différenciation. Par conséquent, il est souvent nécessaire de déterminer le taux de fractionnement optimal, le temps de passage et la taille de l’agrégat pour chaque clone individuellement.
Nous avons démontré que même un volume de 5 mL peut être suffisant pour isoler les cellules urinaires des PSN15. Cependant, bien que nous n’ayons trouvé aucune différence significative dans le nombre de cellules urinaires isolées chez les humains, les gorilles et les orangs-outans, les chimpanzés avaient un ratio plus faible, car nous ne pouvions pas isoler les cellules urinaires d’un total de 87 mL. Par conséquent, pour certaines espèces, il pourrait être nécessaire de recueillir beaucoup plus d’urine que pour d’autres. La collecte de grands volumes de petits primates peut être particulièrement difficile, mais comme l’isolement des cellules urinaires est assez rentable, il est pratique de l’essayer pour des espèces particulières et des volumes d’urine disponibles. Malheureusement, les échantillons d’urine ne peuvent pas être congelés, ce qui limite le rayon sur lequel les échantillons peuvent être prélevés. Cependant, nous avons montré qu’un temps de stockage de 4 h à 4 °C n’avait aucune influence sur le nombre de colonies isolées15, et qu’un temps de stockage plus long ou une amélioration des conditions de stockage pourraient bien être possibles. Nous avons introduit plusieurs types de tests de contrôle de la qualité pour la validation. Cependant, même si une lignée iPSC répond à ces critères, l’hétérogénéité clonale est encore importante, ce qui s’explique par le fond génétique49 et le statut épigénétique 50,51,52,53,54. Pour appliquer les CSPi aux primates à l’analyse comparative future, il faut tenir compte de l’hétérogénéité et utiliser suffisamment de clones pour calculer la moyenne de la variation clonale, évitant ainsi une mauvaise interprétation du résultat.
Néanmoins, l’utilisation de l’urine comme source de cellules primaires présente un avantage majeur par rapport aux méthodes conventionnelles utilisant, par exemple, des fibroblastes pour la reprogrammation, car ils peuvent être obtenus de manière totalement non invasive. De plus, ce protocole permet la génération de CSPi à partir de cellules dérivées de l’urine avec une période plus courte que la reprogrammation conventionnelle. Avec cette méthode, les colonies deviennent visibles dans les 5-15 jours, alors que nous avons constaté que les colonies de fibroblastes de primates (rhésus, babouin) ont tendance à apparaître plus tard, après 20-30 jours. De plus, avec l’utilisation de cette méthode d’infection en suspension, 0,19% des cellules transduites par le virus ont donné naissance à des colonies avec une morphologie pluripotente de type cellulaire. Cela a abouti à au moins une colonie dans 87% des tentatives15. En comparaison, la méthode conventionnelle de transduction de SeV avec des cellules attachées et de lipofection avec des plasmides épisomiques s’est avérée avoir une efficacité de reprogrammation significativement inférieure, avec 0,09% et 0,009% des cellules formant une colonie pluripotente, respectivement15.
En résumé, cette méthode permet d’isoler les cellules urinaires de façon non invasive et de générer des CSPi sans alimentation à partir de presque tous les donneurs humains et de nombreux PSN. Cela augmente l’accessibilité aux types de cellules précieuses qui peuvent être différenciés de ces CSPi. De plus, cette méthode peut être utilisée pour produire des CSPi spécifiques au patient qui peuvent être utilisées pour la modélisation de la maladie ou de futures thérapies cellulaires. Enfin, comme les CSPi ne peuvent être générées qu’à partir de petits volumes d’urine, cette méthode peut être appliquée à de nombreuses autres espèces de primates ou même de mammifères. Ainsi, cette méthode peut être un outil puissant pour la comparaison inter-espèces, qui peut permettre une meilleure compréhension de l’évolution des traits spécifiques à l’homme.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par DFG EN 1093/5-1 (numéro de projet 458247426). M.O. a été soutenu par JSPS Overseas Research Fellowship. Toutes les figurines ont été créées avec BioRender.com. La cytométrie en flux a été réalisée avec l’aide de la cytométrie en flux de l’installation centrale du centre biomédical de Munich. Nous tenons à remercier Makoto Shida et Tomoyo Muto de l’ASHBi, Université de Kyoto, pour leur soutien à la vidéographie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accumax™ cell detachment solution (Detachment solution) | Sigma-Aldrich | SCR006 | |
| Amphotericin B-Solution | Merck | A2941-100ML | |
| Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody | Stem Cell Technologies | 60064 | Dilution: 1/200 |
| Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody | Miltenyi Biotec | 130-122-965 | Dilution: 1/50 |
| Bambanker™ (Cell freezing medium) | Nippon Genetics | BB01 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
| Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR | Greiner BIO-ONE | 665180 | |
| Countess™ II automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes) | Sued-Laborbedarf | 52 95-0213 | Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information. |
| CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus) | Thermo Fisher Scientific | A16519 | |
| CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit) | Thermo Fisher Scientific | A16518 | |
| DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | 10236276001 | |
| DMEM High Glucose | TH.Geyer | L0102 | |
| DMEM/F12 w L-glutamine | Fisher Scientific | 15373541 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Dilution: 1/500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21207 | Dilution: 1/500 |
| DPBS w/o Calcium w/o Magnesium | TH.Geyer | L0615-500 | |
| EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC) | Thermo Fisher Scientific | 710524 | Dilution: 1/500 |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Carl Roth | CN06.3 | |
| Falcon Tube 15 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 188271-N | |
| Falcon Tube 50 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
| FlowJo V10.8.2 | FlowJo | 663441 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-1KG | |
| Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413301 | |
| GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Heracell™ 240i CO2 incubator | Fisher Scientific | 16416639 | |
| Heraeus HeraSafe safety cabinet | Kendro | 51017905 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-749 | |
| ImageJ | Fiji | Version 2.9.0 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL | Nerbe Plus | 04-212-1000 | |
| Microscope Nikon eclipse TE2000-S | Nikon | TE2000-S | |
| Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody | R&D Systems | MAB1368 | Dilution: 1/100 |
| Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody | R&D Systems | MAB1420 | Dilution: 1/100 |
| Mouse anti-beta-III Tubulin antibody | R&D Systems | MAB1195 | Dilution: 1/100 |
| mTeSR™ 1 | STEMCELL Technolgies | 85850 | |
| Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4903S | Dilution: 1/400 |
| Normocure™ (Antimicrobial Reagent) | Invivogen | ant-noc | |
| Oct-4 Rabbit Antibody | Cell Signaling Technology | 2750S | Dilution: 1/400 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 µg/mL Streptomycin. |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Recombinant Human PDGF-AB | PeproTech | 100-00AB | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SIGMA | 4-16KS | |
| Renal Epithelial Cell Basal Medium | ATCC | PCS-400-030 | |
| Renal Epithelial Cell Growth Kit | ATCC | PCS-400-040 | |
| Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900 | Cell Signaling Technology | 4900S | Dilution: 1/400 |
| SSEA4 (MC813) Mouse mAb | NEB | 4755S | Dilution: 1/500 |
| StemFit® Basic02 | Nippon Genetics | 3821.00 | The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
| TrypLE™ Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12563011 | |
| Waterbath Precision GP 05 | Thermo Fisher Scientific | TSGP05 | |
| Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor) | Biozol | BYT-ORB153635 | |
| Antibody dilution buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Blocking buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
| REMC medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Primary urine medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| PSC culture medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| PSC generation medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Urine wash buffer | For composition see the supplementary table S1 |
References
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