Summary
Denne protokol beskriver en metode til at isolere, udvide og omprogrammere humane og ikke-humane primaturinafledte celler til inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) samt instruktioner til feederfri vedligeholdelse af de nyligt genererede iPSC'er.
Abstract
Tilgange på tværs af arter, der studerer primatpluripotente stamceller og deres derivater, er afgørende for bedre at forstå de molekylære og cellulære mekanismer for sygdom, udvikling og evolution. For at gøre primatinducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) mere tilgængelige præsenterer dette papir en ikke-invasiv metode til at generere humane og ikke-menneskelige primat-iPSC'er fra urinafledte celler og deres vedligeholdelse ved hjælp af en feederfri dyrkningsmetode.
Urinen kan udtages fra et ikke-sterilt miljø (f.eks. dyrets bur) og behandles med en bredspektret antibiotikacocktail under primær cellekultur for effektivt at reducere forureningen. Efter formering af de urinafledte celler genereres iPSC'er ved en modificeret transduktionsmetode af et kommercielt tilgængeligt Sendai-virusvektorsystem. Første iPSC-kolonier kan allerede være synlige efter 5 dage og kan tidligst plukkes efter 10 dage. Rutinemæssig klumppasning med enzymfri dissociationsbuffer understøtter pluripotens af de genererede iPSC'er i mere end 50 passager.
Introduction
Genomiske sammenligninger af menneskelige og ikke-menneskelige primater (NHP'er) er afgørende for at forstå vores evolutionære historie og udviklingen af menneskespecifikke træk1. Derudover giver disse sammenligninger mulighed for slutning af funktion ved at identificere konserverede DNA-sekvenser2, f.eks. for at prioritere sygdomsassocierede varianter3. Sammenligninger af molekylære fænotyper såsom genekspressionsniveauer er afgørende for bedre at fortolke genomiske sammenligninger og for at opdage for eksempel cellulære fænotypiske forskelle. Desuden har de - i lighed med sammenligninger på DNA-niveau - potentialet til at udlede funktionel relevans og dermed bedre fortolke medicinsk relevant variation inden for mennesker4. Indarbejdelsen af omfattende molekylære fænotypiske data i disse komparative undersøgelser kræver passende biologiske ressourcer (dvs. ortologe celler på tværs af arter). Etiske og praktiske grunde gør det imidlertid vanskeligt eller umuligt at få adgang til sådanne sammenlignelige celler, især under udvikling. Inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) giver mulighed for generering af sådanne utilgængelige celletyper in vitro5,6, er eksperimentelt tilgængelige og er blevet anvendt til primatsammenligninger 6,7,8,9,10,11,12,13,14.
For at generere iPSC'er skal man erhverve de primære celler, der skal omprogrammeres. Celler, der er isoleret fra urinen, har den fordel, at de kan udtages ikke-invasivt fra primater, og at de let kan omprogrammeres, sandsynligvis på grund af deres stamcellelignende molekylære profiler15. Kulturbetingelserne for at opretholde primat-iPSC'er er lige så vigtige som omprogrammering; Klassisk krævede kulturen af humane pluripotente stamceller et ikke-defineret, serumbaseret medium og co-kultur af embryonale fibroblaster hos mus - såkaldte fødeceller - der leverer essentielle næringsstoffer og et stillads til embryonale stamceller (ESC'er)16. Siden udviklingen af kemisk definerede og føderfrie dyrkningssystemer17,18 er der nu forskellige muligheder for kommercielt tilgængelige iPSC-kulturmedier og matricer. Imidlertid er de fleste af disse kulturforhold optimeret til menneskelige ESC'er og iPSC'er og fungerer derfor muligvis mindre godt i NHP iPSC-kultur. I denne videoprotokol giver vi instruktioner til generering og vedligeholdelse af humane og NHP iPSC'er afledt af urincellekultur.
Siden den første rapport om iPSC-generering ved tvungen ekspression af definerede faktorer i fibroblaster i 2006 er denne metode blevet anvendt på mange forskellige celletyper af forskellig oprindelse 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. Blandt dem kan kun urinafledte celler opnås på en fuldstændig ikke-invasiv måde. Baseret på den tidligere beskrevne protokol af Zhou et al.33 kan man isolere og udvide celler fra primaturin, selv fra ikke-sterile prøver, ved at supplere bredspektret antibiotika15. Især urinafledte celler, der udtages prøver af denne protokol, udviser et stort potentiale for at producere iPSC'er inden for en kortere periode (kolonier bliver synlige på 5-15 dage) end den konventionelle omprogrammering af fibroblaster (20-30 dage, efter vores erfaring) og med en tilstrækkelig høj succesrate. Disse urinafledte celler blev klassificeret som den blandede population af mesenkymale stamcellelignende celler og blæreepitelceller, hvilket forårsagede den høje omprogrammeringseffektivitet15.
Ud over variationen i primære celler varierer omprogrammeringsmetoderne til generering af iPSC'er også alt efter anvendelsesformålet. Konventionelle omprogrammeringsprocedurer for humane somatiske celler blev udført ved overekspression af omprogrammeringsfaktorer med retrovirus- eller lentivirusvektorer, hvilket tillod integration af eksogent DNA i genomet 5,34,35. For at holde de genererede iPSC'er genomisk intakte har forskere udviklet en lang række ikke-integrationssystemer - excisable PiggyBac vector36,37, episomal vector38,39, ikke-integrerende virusvektorer såsom Sendai-virus40 og adenovirus 41, mRNA-transfektion 42, proteintransfektion 43,44 og kemisk forbindelsesbehandling 45. På grund af effektiviteten og letheden i håndteringen anvendes de Sendai-virusbaserede omprogrammeringsvektorer i denne protokol. Infektion af primære celler udføres i en 1 times suspensionskultur af celler og vira ved en mangfoldighed af infektion (MOI) på 5 før plettering. Dette modificerede trin kan øge sandsynligheden for kontakt mellem celleoverflader og vira sammenlignet med den konventionelle metode, hvor viraerne tilsættes direkte til den vedhængende cellekultur og dermed give flere iPSC-kolonier15.
Passaging af humane og NHP pluripotente stamceller kan ske ved klump passaging og single-cell passaging. Ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) er et omkostningseffektivt chelateringsmiddel, der binder calcium- og magnesiumioner og dermed forhindrer den klæbende aktivitet af cadherin og integrin. EDTA bruges også som et mildt, selektivt dissociationsreagens, da udifferentierede celler løsner sig før differentierede celler på grund af deres forskellige vedhæftningsmolekyler. Fuldstændig dissociation inducerer massiv celledød af primat-iPSC'er via den Rho/Rho-associerede spiral, der indeholder proteinkinase (Rho/Rock)-medieret myosinhyperaktivering. Derfor er det vigtigt at supplere dyrkningsmediet med en Rho/Rock-hæmmer til eksperimenter, der kræver enkeltceller i suspension46,47. I denne protokol anbefaler vi clump passaging som rutinemæssig passaging metode og anbefaler kun single-cell passaging, når det er nødvendigt, f.eks. når seeding af definerede cellenumre er påkrævet, eller under sub-kloning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne eksperimentelle procedure blev godkendt af det ansvarlige etiske udvalg for menneskelige eksperimenter (20-122, Ethikkommission LMU München). Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med relevante retningslinjer og regler.
BEMÆRK: Der skal indhentes godkendelse fra det relevante etiske udvalg, inden forsøg med humane prøver og NHP-prøver påbegyndes. Alle eksperimentelle procedurer skal udføres i overensstemmelse med relevante retningslinjer og forskrifter. Hvert af følgende trin skal udføres ved hjælp af steril teknik i et biologisk sikkerhedsskab. Alle buffer- og mediesammensætninger findes i supplerende tabel S1. Sørg for, at alle medier opvarmes til stuetemperatur (22 °C), før de tilsættes cellerne. Hvert centrifugeringstrin skal udføres ved stuetemperatur, medmindre andet er nævnt.
1. Isolering af celler fra urinprøver
FORSIGTIG: Sørg for, at humane donorer er fri for human immundefektvirus (HIV), hepatitis B-virus (HBV) og hepatitis C-virus (HCV). For NHP'er skal du sørge for, at de mulige donorer / celler er fri for specifikke patogener-B-virus (BV), Simian immundefektvirus (SIV), Simian Betaretrovirus (SRV) og Simian T-celle lymfotrop virus (STLV).
- Forbered en gelatinebelagt 12-brønds plade ved at tilsætte 500 μL 0,2% gelatine pr. Brønd, og fordel væsken ved at flytte pladen. Anbring ved 37 °C i mindst 30 minutter før behov.
- Opsaml humane urinprøver i 50 ml koniske rør. For primater samles urin fra gulvet i dyreanlægget med en sprøjte.
BEMÆRK: Et volumen på 5 ml urin viste sig at være tilstrækkeligt til at isolere mindst en koloni i 42% af forsøgene. Det anbefales dog at bruge et højere volumen på ~ 50 ml urin for at øge chancen for at isolere kolonier. NHP-urin bør udtages så frisk som muligt, helst umiddelbart efter vandladning. Opbevaring af urinprøver ved 4 °C i 4 timer havde ingen negativ effekt på protokollens succesrate, men længere opbevaringstider blev ikke testet. - Det urinholdige glas centrifugeres ved 400 × g i 10 minutter, og supernatanten suges forsigtigt, så der efterlades ca. 1 ml i glasset.
- Resuspender pellet i den resterende 1 ml væske. Saml suspensionerne i et rør, hvis flere rør urin blev opsamlet.
- Cellerne vaskes ved at tilsætte 10 ml urinvaskebuffer (se supplerende tabel S1) indeholdende 2,5 μg/ml amphotericin til glasset, og suspensionen blandes forsigtigt med en serologisk pipette.
- Centrifuger glasset ved 200 × g i 10 minutter, og sug forsigtigt supernatanten op, så der efterlades ca. <0,2 ml i glasset.
- Resuspender cellepellet i 1 ml primært urinmedium (se supplerende tabel S1) indeholdende 0,5 μg/ml amphotericin pr. 50 ml oprindeligt behandlet urin (resuspender i 1 ml, selvom mindre end 50 ml urin blev behandlet).
- Opsug gelatine fra brøndene (forberedt i trin 1.1) og plade 1 ml af suspensionen fra trin 1.7 i en brønd i en 12-brøndplade. Gentag for så mange brønde som ønsket, eller for så mange mililiter affjedring til rådighed.
Valgfrit: For at undgå kontaminering, der stammer fra uhygiejnisk prøveindsamling, tilsættes 100 μg/ml antimikrobielt reagens til cellerne herfra og indtil den første passage. - Pladen anbringes i en 5 % CO2 -inkubator °C °C.
- Tilsæt 1 ml primært urinmedium pr. brønd dagligt indtil dag 5 uden at fjerne det eksisterende medium.
- På dag 5 aspireres 4 ml medium fra pladen, hvilket efterlader ca. 1 ml medium. Der tilsættes 1 ml REMC-substrat (se supplerende tabel S1) pr. hul for at få en 1:1-blanding med det nye dyrkningsmedium.
- Udskift halvdelen af mediet med REMC-medium hver dag, indtil de første kolonier vises (figur 1A, B). Fjern derfor 1 ml gammelt medium, og tilsæt 1 ml frisk REMC-medium pr. Hul.
2. Udvidelse af urinceller
BEMÆRK: Urincellepasning skal udføres, før kulturen når 90% sammenløb.
- Forbered den ønskede mængde gelatinebelagte plader med 12 brønde som angivet i trin 1.1.
- Opsug det gamle medium, og vask cellerne ved at tilsætte 1 ml Dulbeccos fosfatbufrede saltvand (DPBS).
- Opsug DPBS, og tilsæt 300 μL 0,5x dissociationsenzym fortyndet med DPBS. Pladen inkuberes ved 37 °C i 5 min.
- Der tilsættes 700 μL REMC-substrat for at stoppe den enzymatiske reaktion. Suspensionen pipetteres forsigtigt med en P1000-pipette, indtil cellerne dissocieres i enkeltceller.
- Overfør cellesuspensionen til et 15 ml rør, og centrifuger glasset ved 200 × g i 5 minutter.
- Supernatanten suges forsigtigt og pellets resuspenderes i 1 ml REMC-medium.
- Tæl cellerne ved hjælp af en celletæller (et hæmocytometer eller en automatiseret celletæller).
- Til udvidelse af urincellerne plades 1,5 × 10 4 til 3 × 104 celler i 1 ml REMC-medium til en 12-brønds plade belagt med 0,2% gelatine.
- Udfør efterfølgende medieskift hver anden dag, indtil kulturen når 80% -90% sammenløb. Aspirer derfor det gamle medium og tilsæt 1 ml frisk REMC-medium.
3. Generering af iPSC'er ved Sendai-virusvektorinfektion
BEMÆRK: For arbejdsgangen for omprogrammeringsproceduren, se figur 2A. Urinceller, der anvendes til omprogrammering, bør være så unge som muligt, men et bemærkelsesværdigt tab af omprogrammeringseffektivitet observeres ikke før passage 4. Sendai Virus Reprogramming Kit skal bruges i en BL-2-facilitet. Håndter vira under et biologisk sikkerhedsskab med laminært flow, og brug altid passende sikkerhedsudstyr for at forhindre slimhindeeksponering.
- Forbered en kældermembranmatrixbelagt 12-brøndsplade ved at tilføje 500 μL kældermembranmatrix pr. Brønd, og fordel væsken ved at flytte pladen. Pladen inkuberes ved 37 °C i mindst 1 time, og kældermembranmatrixen erstattes med 900 μL REMC-medium. Pladen opbevares ved 37 °C indtil brug.
- Optø hurtigt komponenterne i Sendai-omprogrammeringssættet i et 37 °C vandbad. Bland Sendai-vira (polycistronisk KLF4-OCT3/4-SOX2, cMYC og KLF4) med en MOI på 5, og tilsæt REMC-medium op til 100 μL. Brug ligning (1):
BEMÆRK: Da virustitere varierer mellem partier, skal du altid kontrollere titeren i analysecertifikatet, der leveres af producenten.
Valgfrit: Brug desuden grønt fluorescerende protein (GFP) Sendai-virus som en positiv kontrol for transduktionseffektiviteten. Til dette skal du forberede yderligere 3,5 × 104 celler i et separat rør under trin 3.3. - Følg trin 2.2-2.4 for dissociation af urincellerne. Tæl cellerne ved hjælp af celletælleren, og overfør 7 × 104 urinceller til et 1,5 ml rør.
- Centrifuger glasset ved 200 × g i 5 min, og fjern forsigtigt supernatanten uden at forstyrre cellepellet. Pelletpellet resuspenderes i 100 μl af SeV-blandingen, der er fremstillet i trin 3.2. Reagensglasset inkuberes i 1 time ved 37 °C for suspension infektion.
- Plade suspensionen på kældermembranmatrixbelagte 12-brøndplader, der blev fremstillet i trin 3.1. Rutinemæssigt plade 1 × 10 4 og 2,5 × 104 celler pr. Brønd i duplikater.
- Cellerne inkuberes ved 37 °C og 5% CO2. Mediet udskiftes med 1 ml frisk REMC-medium 24 timer efter transduktion og på dag 3.
- På dag 5 efter transduktion ændres mediet til PSC-genereringsmediet (se supplerende tabel S1) med efterfølgende medieskift hver anden dag. Fjern derfor det gamle medium, og tilsæt 1 ml PSC-genereringsmedium pr. hul.
BEMÆRK: Det kan tage op til 15 dage, før de første kolonier vises. - Vælg individuelle iPSC-kolonier, når koloniens størrelse overstiger 1 mm. For at gøre dette skal du skrabe og omhyggeligt samle en enkelt koloni med en p10-pipette under et mikroskop. Overfør kolonien til en ny brønd af en 12-brønds plade belagt med en kældermembranmatrix indeholdende 750 μL PSC-dyrkningsmedium.
Valgfrit: Skylning af pladen med DPBS og behandling i 1 min med 0,5 mM EDTA inden plukning kan understøtte den robuste kultur af yderligere trin. Hvis cellerne skal dyrkes i længere tid for at vente på senere nye kolonier, skal du ikke udføre dette EDTA-behandlingstrin. - Cellerne dyrkes ved 37 °C og 5% CO2 med efterfølgende medieskift hver anden dag, som angivet i afsnit 4 i protokollen. Når den plukkede koloni når en diameter på 2 mm, fortsættes med den rutinemæssige iPSC-passaging, som forklaret i afsnit 5 i protokollen.
4. Middel ændring
BEMÆRK: Kulturmediet skal skiftes hver anden dag, indtil kolonierne vokser sig store nok til at passere.
- Opsug det gamle substrat, og tilsæt 750 μL af det friske substrat pr. plade med 12 huller. For at skifte til en anden type medium skal du udskifte mediet mindst 1 dag efter passering.
5. Aflevering
BEMÆRK: Cellerne skal passeres, når iPSC-kolonierne vokser sig store nok (diameter > 2 mm), eller kolonierne er ved at røre hinanden. Rutinemæssigt kan iPSC'er opdeles ca. hver 5. dag. Brug klump-passaging (trin 5.1) til rutinemæssig vedligeholdelse og enkeltcelle-passaging (trin 5.2) til eksperimenter, hvor der er behov for et defineret antal celler. Hvis iPSC'erne differentierer meget, kan koloniplukning (trin 5.3) hjælpe med at forbedre kulturernes renhed.
- Klump-passaging
- Forbered en kældermembranmatrixbelagt 12-brøndsplade ved at tilføje 500 μL kældermembranmatrix pr. Brønd, og fordel væsken ved at flytte pladen. Pladen inkuberes ved 37 °C i mindst 1 time. Kældermembranmatrixen udskiftes med 500 μL PSC-dyrkningsmedium, og pladen opbevares ved 37 °C indtil brug.
- Opsug mediet fra de dyrkede celler, og vask cellerne ved forsigtigt at tilsætte 500 μL DPBS. Fjern DPBS og tilsæt 500 μL 0,5 mM EDTA til brønden.
- Inkuber pladen ved RT i 2-5 min, indtil kolonierne begynder at løsne sig. Overhold omhyggeligt cellerne under mikroskopet.
- Når koloniernes kanter begynder at skrælle af, og mellemrum mellem cellerne bliver synlige (figur 3A), fjernes EDTA, og der tilsættes forsigtigt 500 μL DPBS.
BEMÆRK: Pipette altid mod brøndens sidevæg og aldrig direkte på cellerne for ikke at løsne cellerne fra pladen. - DPBS suges, og brønden skylles med 500 μL PSC-dyrkningsmedium ved hjælp af en p1000-pipette. Pipetten pipetteres op og ned 1x-5x for at sprede kolonierne i klumper af passende størrelse (figur 3A). Pipette ikke for meget.
BEMÆRK: Hvis iPSC'erne ved et uheld pipetteres for meget, tilsættes 10 μM Rock-hæmmer Y-27632 til mediet. Dette kan forbedre overlevelsen, da iPSC'er ikke er i stand til at overleve som enkeltceller. - Overfør 1/10-1/50 af celleklumpsuspensionen til de nye brønde. Forholdet afhænger af brøndens sammenløb før opdeling, den ønskede tæthed af de frøede celler og iPSC klonal præference.
- Fordel klumperne jævnt i brønden ved forsigtigt at bevæge pladen frem og tilbage flere gange. Pladen inkuberes i mindst 30 minutter ved 37 °C for at lade klumperne sætte sig fast.
- Substratet erstattes med 750 μL PSC-dyrkningsmedium, hvis der observeres mange flydende døde celler; I modsat fald tilsættes 250 μL PSC-dyrkningsmedium. Pladen anbringes ved 37 °C og 5% CO2 i en inkubator.
BEMÆRK: Medium udskiftning efter 30 minutter er kritisk, især for ustabile cellelinjer (f.eks. NHP'er). - Skift mediet hver 2-3 dage, indtil kolonierne vokser sig store nok til at passere. For mellemstore ændringer skal du følge trin 4 i protokollen.
- Enkeltcelle passaging
- Basismembranmatrixbelagt kulturplade klargøres som angivet i trin 5.1.1 med tilsætning af 10 μM Y-27632 til PSC-dyrkningsmediet.
Valgfrit: Tilføj 10 μM Y-27632 til cellerne 1-3 timer før passage for at forbedre overlevelsen af følsomme cellelinjer. - Opsug mediet og vask cellerne ved at tilsætte 500 μL DPBS. Fjern DPBS og tilsæt 300 μL løsrivelsesopløsning til brøndene.
- Pladen inkuberes ved 37 °C i 5-10 min. Når der observeres tilstrækkelig frigørelse af cellerne under mikroskopet, tilsættes 700 μL PSC-dyrkningsmedium eller DPBS.
- Pipette op og ned 5-10x ved hjælp af en p1000-pipette, indtil cellerne er dissocieret i enkeltceller. Pipette ikke for meget for at forhindre celleskader.
- Cellesuspensionen overføres til et 15 ml rør indeholdende mindst 2 ml DPBS for at fortynde løsrivelsesopløsningen.
- Centrifuger røret ved 200 × g i 5 minutter og aspirer opløsningen fuldstændigt uden at forstyrre cellepellet.
- Pellet resuspenderes i 500 μL PSC-dyrkningsmedium suppleret med 10 μM Y-27632.
- Cellerne og frø 5.000-7.000 celler pr. kældermembranmatrixbelagt 12-brøndsplade, forberedt i trin 5.2.1.
BEMÆRK: Hvis der er behov for et andet cellenummer, skal du skifte til en større eller mindre brønd i overensstemmelse hermed. - Pladen inkuberes i mindst 30 minutter ved 37 °C og 5 % CO2 for at lade cellerne sætte sig fast.
- Substratet erstattes med 750 μL PSC-dyrkningsmedium + 10 μM Y-27632, hvis der observeres mange døde celler; Ellers tilsættes 250 μL + 10 μM Y-27632.
BEMÆRK: Dette trin er kritisk, især for de ustabile cellelinjer (f.eks. NHP'er). - Pladen anbringes ved 37 °C og 5% CO2 i en inkubator.
- Skift mediet til PSC-kulturmediet uden Y-27632 1 til 2 dage efter opdeling, så cellerne kan vise den klassiske kolonimorfologi igen (figur 3B).
- Skift mediet hver 2. dag, indtil kolonierne vokser sig store nok. For medium ændring, følg afsnit 4 i protokollen.
- Basismembranmatrixbelagt kulturplade klargøres som angivet i trin 5.1.1 med tilsætning af 10 μM Y-27632 til PSC-dyrkningsmediet.
- Overførsel af iPSC'er ved koloniplukning
- Forbered 12-brønde med kældermembranmatrixbelagte 12 brønde som angivet i trin 5.1.1.
- Opsug mediet og vask cellerne ved forsigtigt at tilsætte 500 μL DPBS. Fjern DPBS og tilsæt 500 μL 0,5 mM EDTA til brønden.
- Inkuber pladen ved RT i 1-3 minutter og observer cellerne under mikroskopet, indtil koloniens løsrivelse er synlig på grænserne.
- EDTA fjernes, og der tilsættes forsigtigt 500 μL DPBS. Opsug væsken, før der langsomt tilsættes 500 μL PSC-dyrkningsmedium til brønden uden at løsne cellerne.
- Brug en p200-pipette til at vælge den ønskede koloni under mikroskopet uden at samle de differentierede celler. For at gøre dette skal du forsigtigt ridse over kolonien, mens du optager mediet indeholdende celler.
- Hver plukket koloni overføres til en kældermembranmatrixbelagt brønd som beskrevet i trin 5.3.1. Dissocier cellerne i små klumper ved hjælp af en p1000-pipette ved at pipettere cellerne 2-5x.
- Pladen inkuberes i 30 minutter ved 37 °C og 5% CO2, så klumperne kan sætte sig fast.
- Substratet erstattes med 750 μL PSC-dyrkningsmedium, hvis der observeres mange flydende døde celler; I modsat fald tilsættes 250 μL PSC-dyrkningsmedium.
BEMÆRK: Medium udskiftning efter 30 minutter er kritisk, især for de ustabile cellelinjer (f.eks. NHP'er). - Pladen anbringes ved 37 °C og 5% CO2 i en inkubator.
- Skift mediet hver 2-3 dage, indtil kolonierne vokser sig store nok til at passere. For at gøre dette skal du følge afsnit 4 i protokollen.
6. Frysning af urinceller og iPSC'er til langtidsopbevaring
BEMÆRK: Rutinemæssigt fryses iPSC'er som klumper i cellefrysemedium uden at tælle. Pipettering bør være minimal for at undgå dissociation i enkeltceller. For urinceller fryses rutinemæssigt 1,5 × 10 4 til 3 × 104 celler pr. Rør, så brugeren kan optø et rør direkte i en brønd i en 12-brøndplade uden behov for et andet tælletrin.
- Forbered 5 ml DPBS i et 15 ml rør.
- For frysning af urinceller skal du følge trin 2.2-2.4 i protokollen. For frysning af iPSC'er skal du følge trin 5.1.2-5.1.5 fra clump passaging-protokollen.
- Overfør suspensionen til det 15 ml rør, der er fremstillet i trin 6.1. Til frysning af urinceller tælles 10 μL af cellesuspensionen ved hjælp af et hæmocytometer. Cellerne centrifugeres i 5 minutter ved 200 × g, og supernatanten suges fuldstændigt.
- Resuspender cellepillen i 400 μL cellefrysemedium pr. rør, og fordel cellerne til den ønskede mængde kryorør.
- Kryorørene overføres straks til -80 °C. Overfør de frosne rør til en -150 °C fryser eller flydende nitrogen 1 dag efter frysning ved -80 °C til langtidsopbevaring.
7. Optøning af urinceller og iPSC'er
- Til optøning af urinceller fremstilles den ønskede mængde gelatinebelagte 12-brønde som angivet i trin 1.1 i protokollen. For iPSC'er skal du forberede de 12-brøndede plader med kældermembranmatrix som angivet i trin 5.1.1. I begge tilfælde må du ikke udveksle matrixen med medium.
- Forbered et 15 ml glas indeholdende 4 ml DPBS, og opbevar det ved 37 °C.
- Et frosset hætteglas med celler anbringes hurtigt i et 37 °C vandbad til optøning, indtil et stykke flydende is bliver synligt.
BEMÆRK: Tør kryorøret af med ethanol før og efter inkubation i vandbadet for at undgå kontaminering. - Der tilsættes 500 μL REMC-substrat til urinceller eller 500 μL PSC-dyrkningsmedium til iPSC'er til den isholdige suspension, og suspensionen overføres straks til det forvarmede 15 ml rør, der er fremstillet i trin 7.2.
- Centrifuger glasset ved 200 × g i 5 min, og supernatanten kasseres helt.
- For urinceller resuspenderes pelleten i 1 ml REMC-medium. For iPSC'er resuspenderes pellet forsigtigt i 750 μL PSC-dyrkningsmedium. Undgå pipettering for meget for at holde klumperne intakte.
Valgfrit: Supplering af mediet med 10 μM Y-27632 kan understøtte iPSC'ers overlevelse efter optøning. - Opsug matrixen fra de 12-brøndplader, der er fremstillet i trin 7.1, og overfør forsigtigt cellesuspensionen til brønden.
- Pladen anbringes natten over ved 37 °C og 5% CO2 i en inkubator.
- Næste dag udskiftes mediet med PSC-dyrkningsmedium uden Y-27632 for iPSC'er og med REMC for urinceller.
- Dyrk cellerne ved 37 °C og 5% CO2 i en inkubator.
- Skift mediet hver 2-3 dage, indtil cellerne vokser sig store nok til at passere. For medium ændring, følg afsnit 4 i protokollen.
8. Immuncytokemi
BEMÆRK: Immunfarvning med antistoffer rettet mod pluripotensrelaterede markører såsom NANOG, OCT3/4, SOX2, TRA-1-60 og EpCAM er en af de mest anvendte valideringer af nygenererede iPSC'er. Yderligere oplysninger om antistoffer og fortyndinger findes i materialefortegnelsen.
- Plade iPSC'er 1-3 dage før brug i et passende antal plader med 12 huller. Opsug mediet, vask cellerne ved at tilsætte 500 μL DPBS, og fjern DPBS. Tilsæt 400 μL 4% paraformaldehyd (PFA) pr. hul, og fastgør cellerne i 15 minutter ved RT.
- Fjern 4% PFA, og vask cellerne 3x med DPBS. Der tilsættes 400 μL blokerende buffer pr. hul, og pladen inkuberes i 30 minutter ved RT.
- Den blokerende buffer suges op, og antistofferne fortyndes i 400 μL antistoffortyndingsbuffer (ADB) til hvert hul. Pladen inkuberes ved 4 °C natten over.
- Fjern ADB'en, der indeholder de primære antistoffer, og vask cellerne 3x med DPBS.
- DPBS suges op, og der tilsættes 400 μL sekundære antistoffer fortyndet i ADB pr. Brønd. Pladen inkuberes i 1 time ved RT i mørke.
- Fjern ADB, og vask cellerne 3x med DPBS. Der tilsættes 1 μg/ml 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) fortyndet i DPBS pr. hul, og der inkuberes i 3 minutter ved RT.
- Opsug DAPI-opløsningen, og vask cellen 3x med DPBS. Tilføj 500 μL DPBS til billeddannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved isolering af celler fra human og NHP-urin kan forskellige typer celler identificeres direkte efter isolering. Planocellulære celler såvel som forskellige mindre runde celler udskilles med urinen; kvindelig urin indeholder langt flere pladeceller end mandlig urin (figur 1B - dag 0; Supplerende figur S1). Efter 5 dages dyrkning i primært urinmedium kan de første vedhængende prolifererende celler ses (figur 1A, B - dag 5). På dette tidspunkt erstattes halvdelen af mediet med REMC-spredningsmedium hver dag, indtil de første kolonier vises. På ca. dag 13 vokser de klæbende celler til store kolonier, der kan passeres (figur 1B - dag 13). Disse kolonier kan dannes ud af to morfologisk forskellige celletyper - den ene har en mere epitellignende fænotype med celler, der vokser tæt sammen, og den anden viser en mere mesenkymallignende morfologi med langstrakt form og højere migrationsevne (figur 1C). Efter den første passage vokser urinceller som et monolag og kan passeres, når kulturen når 80% sammenløb (figur 1B - dag 17).
Figur 1: Isolering og dyrkning af urinceller. A) Arbejdsproces til bestemmelse af urinceller fra primatprøver fra mennesker og ikke-mennesker. (B) Fasekontrastbilleder, der viser vækst og kolonidannelse af urinceller indtil den første passage (p1). (C) To forskellige celletyper isoleret fra urinprøver kan skelnes efter 2 ugers dyrkning. Skalastænger = 250 μm (B,C). Klik her for at se en større version af denne figur.
For at generere iPSC'er fra urinceller anvendes en transduktion med Sendai-vira, der introducerer Yamanaka-faktorerne OCT3/4, SOX2, KLF4 og c-MYC. For at øge transduktionseffektiviteten inkuberes urinceller med virussen i 1 time i suspension, før de sås på kældermembranmatrixbelagte brønde (figur 2A). Nogle vedhængende celler kan ses i brøndene 1 dag efter transduktion (figur 2B - dag 1). Efter 5-10 dage begynder disse celler at danne kolonier, og tidlige morfologiske ændringer kan observeres, hvilket indikerer omprogrammering af cellerne (figur 2B - dag 14). Mange af disse kolonier viser gradvist en ESC-lignende morfologi og kan plukkes i PSC-kulturmedium, når diameteren overstiger 1 mm. Efter plukning danner cellerne kolonier, der viser den typiske ESC-morfologi inden for ca. 4 dage (figur 2B - dag 21 &; 24). Når iPSC-kolonierne vokser sig store nok, kan cellerne passeres for første gang ved hjælp af clump passaging-protokollen (protokoltrin 5.1).
Denne omprogrammeringsmetode er blevet brugt til at generere iPSC'er fra mennesker, gorillagorilla (gorilla ) og pongo abelii (orangutang)15. Mens sandsynligheden for at få urinceller er ret variabel og mindst to til tre gange lavere for chimpanser end for mennesker15, var omprogrammering af de opnåede urinceller for det meste vellykket efter vores erfaring. Generelt giver 0,19% af de inficerede urinceller anledning til kolonier med ESC-lignende morfologi, hvilket resulterer i mindst en koloni i 87% af omprogrammeringsforsøgene15. Alle genererede iPSC'er deler de samme egenskaber og viser den typiske ESC-lignende kolonimorfologi, der er kendetegnet ved tæt pakkede celler med klart definerede kanter (figur 2C). Derudover viser alle iPSC'er en normal karyotype, og fraværet af SeV-omprogrammeringsvektorer blev verificeret af PCR efter mindst fem passager, som anbefalet af producenten af SeV-omprogrammeringssættet (data ikke vist)15. Immunocytokemi bruges til at teste ekspressionen af pluripotensassocierede proteiner i kernen, såsom NANOG, OCT3/4 og SOX2. Overflademarkører som TRA-1-60, EpCAM og SSEA4 kan også bruges (figur 2D); SSEA4 udtrykkes dog også i urincellerne15. Desuden kan flowcytometrianalyse udføres ved hjælp af disse overflademarkører for at give kvantitativ information om pluripotensstatus for iPSC'erne (metode beskrevet af Ohnuki et al.48). Denne tilgang bruges til at vise, at 95,3% af de analyserede orangutang-iPSC'er er positive for TRA-1-60 (figur 2E). Desuden kan differentieringskapaciteten af NHP iPSC'er påvises via in vitro embryoid body (EB) differentiering (metode beskrevet af Geuder et al.15). Som vist i figur 2F er gorilla iPSC'er i stand til at differentiere sig i endoderm (ɑ-fetoprotein), mesoderm (ɑ-glat muskelactin) og ectoderm (β-III tubulin) slægter.
Figur 2: Generering og karakterisering af urinafledte iPSC'er . (A) Omprogrammering af arbejdsgang af urinafledte celler. (B) Fasekontrastbilleder, der viser de morfologiske ændringer i gorillaurinceller under omprogrammering indtil etableringen af iPSC-kolonier. Skalastænger = 500 μm. (C) Morfologi af etablerede iPSC-kolonier fra menneske-, gorilla- og orangutangcellekulturer. Skalastænger = 500 μm. (D) Immunofluorescensfarvning af gorilla iPSC'er med pluripotensassocierede markører ved passage 8: NANOG, OCT3/4, SSEA4, SOX2, EpCAM og TRA-1-60. Skalastænger = 100 μm. (E) Flowcytometrianalyse af orangutang-iPSC'er farvet med anti-TRA-1-60-PE. Ufarvede celler blev brugt som kontrol. (F) Immunofluorescensanalyse af endoderm (AFP), mesoderm (ɑ-SMA) og ectoderm (β-III TUB) efter embryoid kropsdifferentiering af gorilla iPSC'er. Kerner blev modfarvet med DAPI. Skalastænger = 100 μm. Forkortelser: iPSC'er = inducerede pluripotente stamceller; PE = phycoerythrin; AFP = α-fetoprotein; ɑ-SMA = alfa glat muskelaktin; β-III TUB = beta III Tubulin; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Når iPSC-kolonierne når en diameter på ca. 2 mm eller er ved at røre hinanden, skal cellerne deles. Vi foreslår, at du bruger clump passaging-protokollen til rutinemæssig vedligeholdelse. I denne protokol bruges 0,5 mM EDTA til at løsne cellerne i 3-5 minutter afhængigt af kolonistørrelsen. Under EDTA-inkubation begynder koloniernes grænser at skrælle af, og der vises synlige huller mellem cellerne (figur 3A). EDTA skal fjernes, når der observeres en passende løsrivelse under mikroskopet. Langvarig inkubation med EDTA fører til en højere brøkdel af enkeltceller, der ikke er i stand til at overleve. Dernæst skal cellerne adskilles til klumper af samme størrelse, som vist i figur 3A. Cellerne bør ikke adskilles i små klumper, da dette reducerer overlevelsen og kan føre til mere differentierende celler.
Når et forsøg kræver såning af et defineret antal celler, bør enkeltcellepasseringsprotokollen anvendes. Denne protokol inkluderer supplering af mediet med en Rock-hæmmer, som gør det muligt for de enkelte celler at overleve. Det forventes, at vedhæftede enkeltceller viser en anden morfologi sammenlignet med celler, der vokser i en koloni efter klumpsåning (figur 3B - dag 0). Efter 1-2 dages dyrkning begynder enkeltcellerne at vokse til kolonier igen, samtidig med at deres morfologi såvel som deres løse celle-cellekontakt bevares, hvis der tilsættes en Rock-hæmmer til mediet (figur 3B - dag 2). Når disse små kolonier observeres, skal Rock-hæmmeren fjernes fra mediet, så cellerne igen kan vise den typiske ESC-lignende morfologi (figur 3B - dag 4).
For at bedømme, om en iPSC-koloni er af høj kvalitet, skal flere aspekter tages i betragtning. For det første er det normalt, at sunde kolonier viser ingen eller en lille mængde spontan differentiering; Et øget antal differentierede celler (>10%) er imidlertid tegn på dårlig iPSC-kvalitet. Yderligere egenskaber ved lav iPSC-kvalitet er et tab af grænseintegritet og ensartethed (figur 3C: højre) samt løs cellulær emballage med synlige huller mellem cellerne (figur 3D: højre). I modsætning hertil er iPSC'er af høj kvalitet kendetegnet ved definerede grænser, tæt cellulær emballage og fremtrædende nukleoler (figur 3C, D: venstre billeder).
Figur 3: Primat-iPSC-kultur . (A) Fasekontrastbilleder, der viser løsrivelsen af iPSC-kolonier under EDTA-inkubation efter koblingspasseringsprotokollen og den optimale klumpstørrelse efter dissociation. Skalabjælker = 250 μm. (B) Tidslinje for iPSC-gendannelse efter enkeltcellepassage. Rock-hæmmeren Y-27632 blev fjernet fra dag 2 og fremefter. Skalastænger = 250 μm. (C) Til venstre: eksempel på en human iPSC-koloni af høj kvalitet med definerede grænser. Til højre: eksempel på en koloni af dårlig kvalitet, der viser mindre grænseintegritet og differentierede celler. Skalabjælker = 500 μm. (D) Eksempelbilleder for en human iPSC-koloni af høj kvalitet (venstre) sammenlignet med en koloni af lav kvalitet med løst pakkede celler (højre). Skalastænger = 100 μm. Forkortelse: iPSC'er = inducerede pluripotente stamceller. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur S1: Oversigt over celletyper fundet i human urin. (A) Celler isoleret fra kvindelig urin. (B) Celler isoleret fra mandlig urin. Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel S1: Buffer- og mediesammensætninger anvendt i denne undersøgelse. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
iPSC'er er værdifulde celletyper, da de tillader generering af ellers utilgængelige celletyper in vitro. Da udgangsmaterialerne til omprogrammering, for eksempel, fibroblaster ikke er let tilgængelige fra alle primatarter, præsenterer dette papir en protokol til generering af iPSC'er fra urinafledte celler. Disse celler kan opnås på en ikke-invasiv måde, selv fra ikke-sterile primaturinprøver, ved at supplere dyrkningsmediet med bredspektret antibiotika.
Flere kritiske trin i protokollen er værd at diskutere yderligere. For det første er det vigtigt at supplere mediet med et bredspektret antimikrobielt reagens for at reducere risikoen for kontaminering, når celler isoleres fra ikke-steril urin. Hvis væksten af mikrobiologisk kontaminering bliver tydelig på trods af brug af antibiotika, anbefales det at kassere hele kulturen og desinficere området; Derudover er det vores erfaring, at fortsat dyrkning ikke producerer sunde voksende urinceller. For det andet, når man begynder at omprogrammere celler, anbefales det stærkt at forberede flere retter med forskellige antal SeV-transducerede celler for at undgå risikoen for løsrivelse af alle celler ved oversammenløb og for at øge sandsynligheden for iPSC-erhvervelse. Generelt forventes plettering af en højere tæthed af SeV-transducerede celler at give mere omprogrammerede iPSC-kolonier, mens dyrkning af omprogrammeringscellerne i en periode på ~ 20 dage ofte resulterer i oversammenløb efterfulgt af løsrivelse af hele brønden. For det tredje er det på hvert trin, der kræver dissociation af iPSC'er, afgørende at undgå omfattende pipettering, hvilket fører til betydelig celledød. Især når klumpen passeres, er det vigtigt at holde klumperne i en passende størrelse (figur 3A). Klumper, der er for store, kan føre til hurtig differentiering, mens klumper, der er for små, kan mindske overlevelsen.
Vi observerede, at sandsynligheden for at opnå urinceller er ret variabel mellem prøver og alikvoter, men fandt ingen beviser for, at mindre volumener har en lavere succesrate ved opnåelse af kolonier. Generelt isolerede vi i gennemsnit 7,6 kolonier fra 100 ml human urin. Hvis man antager denne gennemsnitshastighed og en Poisson-fordeling, har opnåelse af mindst en koloni en sandsynlighed på ~ 98% for 50 ml og ~ 30% for 5 ml udgangsmateriale. I vores tilfælde var det muligt at isolere mindst en koloni fra 5 ml human urin i 42% af forsøgene15. Baseret på dette kan isolering af kolonier stadig være værd at prøve, selvom kun små mængder urin er tilgængelige. Hvis omprogrammeringen af urinceller mislykkes, og der ikke kan observeres nogen iPSC-kolonier, kan plettering af forskellige antal transfekterede celler resultere i omprogrammering af de urinafledte celler. De nye iPSC-kolonier kan også identificeres som iPSC'er ved levende farvning ved hjælp af overflademarkører (f.eks. TRA-1-60 eller alkalisk fosfatase [AP]; data ikke vist). Det er kendt, at AP-aktivitet opreguleres i pluripotente stamceller, og det kan bruges til forbigående at plette stamceller under dyrkningsprocessen. En anden mulig faldgrube ved protokollen er den optimale kultur af NHP iPSC'er. Ved hjælp af denne protokol bekræftede vi, at menneskelige og NHP iPSC'er opretholder deres pluripotente tilstand i mere end 50 passager ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt medium. Sammenlignet med humane iPSC'er er NHP iPSC'er imidlertid mere tilbøjelige til spontant at differentiere sig efter vores erfaring, potentielt på grund af de kulturforhold, der blev optimeret til mennesker og ikke til NHP-kulturer. Derudover er der stor variation blandt iPSC-kloner i overlevelsesrater efter plettering, stigende hastighed og tendens til differentiering. Derfor skal man ofte bestemme det optimale opdelingsforhold, passagetiming og klumpstørrelse for hver klon individuelt.
Vi har vist, at selv et volumen på 5 ml kan være tilstrækkeligt til at isolere urinceller fra NHP'er15. Men mens vi ikke fandt nogen signifikante forskelle i antallet af isolerede urinceller hos mennesker, gorillaer og orangutanger, havde chimpanser et lavere forhold, da vi ikke kunne isolere urinceller fra i alt 87 ml. Derfor kan det for nogle arter være nødvendigt at indsamle meget mere urin end for andre. Indsamling af store mængder fra små primater kan være særligt udfordrende, men da isolering af urinceller er ret omkostningseffektiv, er det praktisk at bare prøve det for bestemte arter og tilgængelige mængder urin. Desværre kan urinprøverne ikke fryses ned, hvilket begrænser den radius, over hvilken prøver kan udsamles. Vi viste imidlertid, at en opbevaringstid på 4 timer ved 4 °C ikke havde nogen indflydelse på antallet af isolerede kolonier15, og en længere opbevaringstid eller forbedrede opbevaringsforhold kunne meget vel være mulig. Vi har introduceret flere typer kvalitetskontroltest til validering. Men selvom en iPSC-linje opfylder disse kriterier, er klonal heterogenitet stadig betydelig, hvilket er blevet forklaret ved genetisk baggrund49 og epigenetisk status 50,51,52,53,54. For at anvende primat-iPSC'er til fremtidig komparativ analyse bør man overveje heterogeniteten og bruge nok kloner til at udligne den klonale variation og dermed undgå fejlfortolkning af resultatet.
Ikke desto mindre har brugen af urin som kilde til primære celler en stor fordel i forhold til konventionelle metoder, der for eksempel anvender fibroblaster til omprogrammering, da de kan opnås fuldstændigt ikke-invasivt. Derudover giver denne protokol mulighed for generering af iPSC'er fra urinafledte celler med en kortere periode end konventionel omprogrammering. Med denne metode bliver kolonier synlige inden for 5-15 dage, mens vi har fundet ud af, at kolonier fra primatfibroblaster (rhesus, bavian) har tendens til at dukke op senere efter 20-30 dage. Derudover gav 0, 19% af virustransducerede celler ved anvendelse af denne suspensionsinfektionsmetode anledning til kolonier med pluripotent cellelignende morfologi. Dette resulterede i mindst en koloni i 87% af forsøgene15. Til sammenligning viste den konventionelle transduktionsmetode for SeV med vedhæftede celler og lipofektion med episomale plasmider sig at have en signifikant lavere omprogrammeringseffektivitet, hvor henholdsvis 0,09% og 0,009% af cellerne dannede en pluripotent koloni15.
Sammenfattende giver denne metode mulighed for isolering af urinceller ikke-invasivt og generering af feeder-fri iPSC'er fra næsten enhver menneskelig donor og mange NHP'er. Dette øger tilgængeligheden til dyrebare celletyper, der kan differentieres fra disse iPSC'er. Desuden kan denne metode bruges til at producere patientspecifikke iPSC'er, der kan bruges til sygdomsmodellering eller fremtidige cellebaserede terapier. Endelig, da iPSC'er kun kan genereres fra små mængder urin, kan denne metode anvendes på mange flere forskellige primater eller endda pattedyrarter. Denne metode kan således være et kraftfuldt værktøj til sammenligning på tværs af arter, der kan give mulighed for bedre forståelse af udviklingen af menneskespecifikke træk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af DFG EN 1093/5-1 (projektnummer 458247426). M.O. blev støttet af JSPS Overseas Research Fellowship. Alle figurer blev oprettet med BioRender.com. Flowcytometri blev udført ved hjælp af Core Facility Flow Cytometry på Biomedical Center Munich. Vi vil gerne takke Makoto Shida og Tomoyo Muto fra ASHBi, Kyoto University, for støtte til videografi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accumax™ cell detachment solution (Detachment solution) | Sigma-Aldrich | SCR006 | |
| Amphotericin B-Solution | Merck | A2941-100ML | |
| Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody | Stem Cell Technologies | 60064 | Dilution: 1/200 |
| Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody | Miltenyi Biotec | 130-122-965 | Dilution: 1/50 |
| Bambanker™ (Cell freezing medium) | Nippon Genetics | BB01 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
| Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR | Greiner BIO-ONE | 665180 | |
| Countess™ II automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes) | Sued-Laborbedarf | 52 95-0213 | Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information. |
| CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus) | Thermo Fisher Scientific | A16519 | |
| CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit) | Thermo Fisher Scientific | A16518 | |
| DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | 10236276001 | |
| DMEM High Glucose | TH.Geyer | L0102 | |
| DMEM/F12 w L-glutamine | Fisher Scientific | 15373541 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Dilution: 1/500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21207 | Dilution: 1/500 |
| DPBS w/o Calcium w/o Magnesium | TH.Geyer | L0615-500 | |
| EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC) | Thermo Fisher Scientific | 710524 | Dilution: 1/500 |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Carl Roth | CN06.3 | |
| Falcon Tube 15 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 188271-N | |
| Falcon Tube 50 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
| FlowJo V10.8.2 | FlowJo | 663441 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-1KG | |
| Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413301 | |
| GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Heracell™ 240i CO2 incubator | Fisher Scientific | 16416639 | |
| Heraeus HeraSafe safety cabinet | Kendro | 51017905 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-749 | |
| ImageJ | Fiji | Version 2.9.0 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL | Nerbe Plus | 04-212-1000 | |
| Microscope Nikon eclipse TE2000-S | Nikon | TE2000-S | |
| Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody | R&D Systems | MAB1368 | Dilution: 1/100 |
| Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody | R&D Systems | MAB1420 | Dilution: 1/100 |
| Mouse anti-beta-III Tubulin antibody | R&D Systems | MAB1195 | Dilution: 1/100 |
| mTeSR™ 1 | STEMCELL Technolgies | 85850 | |
| Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4903S | Dilution: 1/400 |
| Normocure™ (Antimicrobial Reagent) | Invivogen | ant-noc | |
| Oct-4 Rabbit Antibody | Cell Signaling Technology | 2750S | Dilution: 1/400 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 µg/mL Streptomycin. |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Recombinant Human PDGF-AB | PeproTech | 100-00AB | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SIGMA | 4-16KS | |
| Renal Epithelial Cell Basal Medium | ATCC | PCS-400-030 | |
| Renal Epithelial Cell Growth Kit | ATCC | PCS-400-040 | |
| Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900 | Cell Signaling Technology | 4900S | Dilution: 1/400 |
| SSEA4 (MC813) Mouse mAb | NEB | 4755S | Dilution: 1/500 |
| StemFit® Basic02 | Nippon Genetics | 3821.00 | The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
| TrypLE™ Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12563011 | |
| Waterbath Precision GP 05 | Thermo Fisher Scientific | TSGP05 | |
| Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor) | Biozol | BYT-ORB153635 | |
| Antibody dilution buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Blocking buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
| REMC medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Primary urine medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| PSC culture medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| PSC generation medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Urine wash buffer | For composition see the supplementary table S1 |
References
- Pääbo, S. The human condition-a molecular approach. Cell. 157 (1), 216-226 (2014).
- Zoonomia Consortium, A comparative genomics multitool for scientific discovery and conservation. Nature. 587 (7833), 240-245 (2020).
- Kircher, M., et al. A general framework for estimating the relative pathogenicity of human genetic variants. Nature Genetics. 46 (3), 310-315 (2014).
- Enard, W. Functional primate genomics-leveraging the medical potential. Journal of Molecular Medicine. 90 (5), 471-480 (2012).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Wunderlich, S., et al. Primate iPS cells as tools for evolutionary analyses. Stem Cell Research. 12 (3), 622-629 (2014).
- Denli, A. M., et al. Primate-specific ORF0 contributes to retrotransposon-mediated diversity. Cell. 163 (3), 583-593 (2015).
- Ramsay, L., et al. Conserved expression of transposon-derived non-coding transcripts in primate stem cells. BMC Genomics. 18 (1), 214 (2017).
- Marchetto, M. C. N., et al. Differential L1 regulation in pluripotent stem cells of humans and apes. Nature. 503 (7477), 525-529 (2013).
- Gallego Romero,, I,, et al. A panel of induced pluripotent stem cells from chimpanzees: a resource for comparative functional genomics. eLife. 4, 07103 (2015).
- Pavlovic, B. J., Blake, L. E., Roux, J., Chavarria, C., Gilad, Y. A comparative assessment of human and chimpanzee iPSC-derived cardiomyocytes with primary heart tissues. Scientific Reports. 8 (1), 15312 (2018).
- Rhodes, K., et al. Human embryoid bodies as a novel system for genomic studies of functionally diverse cell types. eLife. 11, 71361 (2022).
- Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
- Dannemann, M., Gallego Romero,, I, Harnessing pluripotent stem cells as models to decipher human evolution. The FEBS Journal. 289 (11), 2992-3010 (2022).
- Geuder, J., et al. A non-invasive method to generate induced pluripotent stem cells from primate urine. Scientific Reports. 11 (1), 3516 (2021).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nature Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Aoi, T., et al. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science. 321 (5889), 699-702 (2008).
- Kim, J. B., et al. Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors. Nature. 454 (7204), 646-650 (2008).
- Ruiz, S., et al. High-efficient generation of induced pluripotent stem cells from human astrocytes. PloS One. 5 (12), (2010).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Park, I. -H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Loh, Y. -H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).
- Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Human Molecular Genetics. 18 (22), 4340-4349 (2009).
- Sun, N., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15720-15725 (2009).
- Giorgetti, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood using. OCT4 and SOX2. Cell Stem Cell. 5 (4), 353-357 (2009).
- Eminli, S., et al. Differentiation stage determines potential of hematopoietic cells for reprogramming into induced pluripotent stem cells. Nature Genetics. 41 (9), 968-976 (2009).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
- Zhou, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from urine. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1221-1228 (2011).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nature Protocols. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448 (7151), 318-324 (2007).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
- Kaji, K., et al. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature. 458 (7239), 771-775 (2009).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 11-14 (2010).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
- Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
- Zhou, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell. 4 (5), 381-384 (2009).
- Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
- Guan, J., et al. Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells. Nature. 605 (7909), 325-331 (2022).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
- Ohnuki, M., et al. Dynamic regulation of human endogenous retroviruses mediates factor-induced reprogramming and differentiation potential. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (34), 12426-12431 (2014).
- Rouhani, F., et al. Genetic background drives transcriptional variation in human induced pluripotent stem cells. PLoS Genetics. 10 (6), 1004432 (2014).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 28 (8), 848-855 (2010).
- Koyanagi-Aoi, M., et al. Differentiation-defective phenotypes revealed by large-scale analyses of human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (51), 20569-20574 (2013).
- Nishizawa, M., et al. Epigenetic variation between human induced pluripotent stem cell lines is an indicator of differentiation capacity. Cell Stem Cell. 19 (3), 341-354 (2016).
- Yokobayashi, S., et al. Inherent genomic properties underlie the epigenomic heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Cell Reports. 37 (5), 109909 (2021).
