Summary
O presente protocolo descreve um método para isolar, expandir e reprogramar células derivadas da urina de primatas humanos e não humanos para células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), bem como instruções para a manutenção livre de alimentadores das iPSCs recém-geradas.
Abstract
Abordagens entre espécies que estudam células-tronco pluripotentes de primatas e seus derivados são cruciais para entender melhor os mecanismos moleculares e celulares de doenças, desenvolvimento e evolução. Para tornar as células-tronco pluripotentes induzidas por primatas (iPSCs) mais acessíveis, este artigo apresenta um método não invasivo para gerar iPSCs de primatas humanos e não humanos a partir de células derivadas da urina, e sua manutenção usando um método de cultura livre de alimentadores.
A urina pode ser coletada de um ambiente não estéril (por exemplo, a gaiola do animal) e tratada com um coquetel antibiótico de amplo espectro durante a cultura de células primárias para reduzir a contaminação de forma eficiente. Após a propagação das células derivadas da urina, as iPSCs são geradas por um método de transdução modificado de um sistema vetorial do vírus Sendai comercialmente disponível. As primeiras colônias de iPSC podem já estar visíveis após 5 dias, e podem ser colhidas após 10 dias, no mínimo. A passagem de rotina de aglomerados com tampão de dissociação livre de enzimas suporta a pluripotência das iPSCs geradas por mais de 50 passagens.
Introduction
Comparações genômicas de primatas humanos e não humanos (NHPs) são cruciais para entender nossa história evolutiva e a evolução de características específicas do ser humano1. Além disso, essas comparações permitem inferir a função identificando sequências conservadas de DNA2, por exemplo, para priorizar variantes associadas à doença3. Comparações de fenótipos moleculares, como níveis de expressão gênica, são cruciais para melhor interpretar comparações genômicas e descobrir, por exemplo, diferenças fenotípicas celulares. Além disso, eles têm - semelhante a comparações no nível do DNA - o potencial de inferir relevância funcional e, portanto, interpretar melhor a variação clinicamente relevante em humanos4. A incorporação de dados fenotípicos moleculares abrangentes nesses estudos comparativos requer recursos biológicos apropriados (isto é, células ortológicas entre espécies). No entanto, razões éticas e práticas dificultam ou impossibilitam o acesso a essas células comparáveis, especialmente durante o desenvolvimento. As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) permitem a geração desses tipos celulares inacessíveis in vitro5,6, são experimentalmente acessíveis e têm sido utilizadas para comparações de primatas 6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Para gerar iPSCs, é preciso adquirir as células primárias a serem reprogramadas. As células isoladas da urina têm a vantagem de poderem ser amostradas de primatas de forma não invasiva e de poderem ser prontamente reprogramadas, provavelmente devido ao seu perfil molecular semelhante ao das células-tronco15. As condições de cultura para manter as iPSCs de primatas são tão importantes quanto a reprogramação; classicamente, a cultura de células-tronco pluripotentes humanas requer um meio não definido, baseado em soro, e co-cultura de fibroblastos embrionários de camundongos - as chamadas células alimentadoras - que fornecem nutrientes essenciais e um arcabouço para células-tronco embrionárias (CTEs)16. Desde o desenvolvimento de sistemas de cultura quimicamente definidos e livres de alimentadores17,18, existem atualmente várias opções de meios e matrizes de cultura iPSC comercialmente disponíveis. No entanto, a maioria dessas condições de cultura foi otimizada para CTEs e iPSCs humanas e, portanto, pode funcionar menos bem na cultura iPSC NHP. Neste protocolo de vídeo, fornecemos instruções para gerar e manter iPSCs humanas e NHP derivadas de cultura de células urinárias.
Desde o primeiro relato de geração de iPSC pela expressão forçada de fatores definidos em fibroblastos, em 2006, esse método tem sido aplicado a diversos tipos celulares de diversas origens19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32º. Entre elas, apenas células derivadas da urina podem ser obtidas de forma completamente não invasiva. Com base no protocolo previamente descrito por Zhou et al.33, pode-se isolar e expandir células da urina de primatas mesmo de amostras não estéreis, suplementando antibióticos de amplo espectro15. Notavelmente, as células derivadas da urina amostradas por este protocolo exibem um alto potencial para produzir iPSCs, dentro de um período de tempo mais curto (colônias tornam-se visíveis em 5-15 dias) do que a reprogramação convencional de fibroblastos (20-30 dias, em nossa experiência), e com uma taxa de sucesso suficientemente alta. Essas células derivadas da urina foram classificadas como a população mista de células-tronco mesenquimais e células epiteliais da bexiga, causando a alta eficiência da reprogramação15.
Além da variação nas células primárias, os métodos de reprogramação para gerar iPSCs também variam de acordo com a finalidade de uso. Os procedimentos convencionais de reprogramação de células somáticas humanas foram realizados pela superexpressão de fatores de reprogramação com vetores de retrovírus ou lentivírus, o que permitiu a integração do DNA exógeno no genoma 5,34,35. Para manter as iPSCs geradas genomicamente intactas, os pesquisadores desenvolveram uma ampla variedade de sistemas de não-integração - vetor PiggyBac excisável36,37, vetor epissomal38,39, vetores virais não integradores como o vírus Sendai 40 e adenovírus 41, transfecção de RNAm42, transfecção de proteínas 43,44 e tratamento de compostos químicos 45. Devido à eficiência e facilidade no manuseio, os vetores de reprogramação baseados no vírus de Sendai são utilizados neste protocolo. A infecção de células primárias é realizada em uma cultura de suspensão de 1 h de células e vírus em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 5 antes do plaqueamento. Essa etapa modificada poderia aumentar a probabilidade de contato entre superfícies celulares e vírus, em comparação com o método convencional, no qual os vírus são adicionados diretamente à cultura de células aderentes e, assim, produzir mais colônias de iPSC15.
A passagem de células-tronco pluripotentes humanas e NHP pode ser feita por passagem de aglomeração e passagem de célula única. O ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) é um agente quelante de baixo custo que se liga aos íons cálcio e magnésio e, assim, impede a atividade aderente da caderina e da integrina. O EDTA também é usado como um reagente de dissociação leve e seletivo, pois as células indiferenciadas se desprendem antes das células diferenciadas devido às suas diferentes moléculas de adesão. A dissociação completa induz a morte celular maciça de iPSCs de primatas através da hiperativação da miosina mediada pela proteína quinase (Rho/Rock) associada à bobina Rho/Rho. Portanto, a suplementação do meio de cultura com um inibidor de Rho/Rock é essencial para experimentos que necessitem de células isoladas em suspensão46,47. Neste protocolo, recomendamos a passagem de aglomeração como o método de passagem de rotina e recomendamos a passagem de célula única apenas quando for necessário, por exemplo, quando a semeadura de números de células definidos for necessária, ou durante a subclonagem.
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Protocol
Este procedimento experimental foi aprovado pelo comitê de ética responsável pela experimentação humana (20-122, Ethikkommission LMU München). Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos pertinentes.
NOTA: A aprovação deve ser obtida do comitê de ética apropriado antes de iniciar experimentos com amostras humanas e de NHP. Todos os procedimentos experimentais devem ser realizados de acordo com as diretrizes e regulamentações pertinentes. Cada uma das etapas a seguir deve ser realizada usando técnica estéril em um gabinete de segurança biológica. Todas as composições de buffer e mídia podem ser encontradas na Tabela Suplementar S1. Certifique-se de que todos os meios são aquecidos à temperatura ambiente (22 °C) antes de serem adicionados às células. Cada etapa de centrifugação deve ser realizada à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário.
1. Isolamento de células de amostras de urina
CUIDADO: Garantir que os doadores humanos estejam livres do vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus da hepatite B (HBV) e vírus da hepatite C (HCV). Para NHPs, certifique-se de que os possíveis doadores/células estejam livres de patógenos específicos - Vírus B (BV), Vírus da Imunodeficiência Símia (SIV), Betaretrovírus Símio (SRV) e Vírus Linfotrópico de Células T Simianas (STLV).
- Prepare uma placa de 12 poços revestida com gelatina adicionando 500 μL de gelatina a 0,2% por poço e distribua o líquido movendo a placa. Colocar a 37 °C durante, pelo menos, 30 minutos antes do necessário.
- Coletar amostras de urina humana em tubos cônicos de 50 mL. Para primatas, colete urina do chão do biotério com uma seringa.
NOTA: Um volume de 5 mL de urina mostrou-se suficiente para isolar pelo menos uma colônia em 42% das tentativas. No entanto, o uso de um volume maior de ~50 mL de urina é recomendado para aumentar a chance de isolar colônias. A urina do NHP deve ser colhida o mais fresco possível, de preferência imediatamente após a micção. O armazenamento de amostras de urina a 4 °C por 4 h não teve efeito negativo sobre a taxa de sucesso do protocolo, mas tempos de armazenamento mais longos não foram testados. - Centrifugar o tubo contendo urina a 400 × g por 10 min e aspirar cuidadosamente o sobrenadante, deixando aproximadamente 1 mL no tubo.
- Ressuspender o pellet no 1 mL residual de líquido. Agrupar as suspensões em um tubo se vários tubos de urina foram coletados.
- Lavar as células adicionando 10 ml de tampão de lavagem da urina (ver Tabela Suplementar S1) contendo 2,5 μg/ml de anfotericina ao tubo e misturar cuidadosamente a suspensão utilizando uma pipeta serológica.
- Centrifugar o tubo a 200 × g por 10 min e aspirar cuidadosamente o sobrenadante, deixando aproximadamente <0,2 mL no tubo.
- Ressuspender o pellet de células em 1 mL de meio de urina primária (ver Tabela Suplementar S1) contendo 0,5 μg/mL de anfotericina por 50 mL de urina inicialmente processada (ressuspender em 1 mL, mesmo que menos de 50 mL de urina tenha sido processada).
- Aspirar a gelatina dos poços (preparada na etapa 1.1) e a placa 1 mL da suspensão da etapa 1.7 em um poço de uma placa de 12 poços. Repita para quantos poços desejar, ou para quantos mililitros de suspensão disponíveis.
Opcional: Para evitar contaminação proveniente da coleta insalubre de amostras, adicionar 100 μg/mL de reagente antimicrobiano às células a partir de então, até a primeira passagem. - Coloque a placa numa incubadora a 37 °C, 5% CO2 .
- Adicionar 1 mL de meio urinário primário por poço diariamente até o dia 5, sem remover o meio existente.
- No dia 5, aspirar 4 mL de meio da placa, deixando aproximadamente 1 mL de meio. Adicionar 1 ml de meio REMC (ver Tabela Suplementar S1) por poço para obter uma mistura 1:1 com o novo meio de cultura.
- Substitua metade do meio por meio REMC todos os dias até que as primeiras colônias apareçam (Figura 1A, B). Portanto, remova 1 mL de meio velho e adicione 1 mL de meio REMC fresco por poço.
2. Expansão das células urinárias
NOTA: A passagem celular urinária deve ser realizada antes que a cultura atinja 90% de confluência.
- Preparar a quantidade desejada de placas de 12 poços revestidas com gelatina, conforme indicado na etapa 1.1.
- Aspirar o meio velho e lavar as células adicionando 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (DPBS) de Dulbecco.
- Aspirar a DPBS e adicionar 300 μL de enzima de dissociação 0,5x diluída com DPBS. Incubar a placa a 37 °C durante 5 min.
- Adicionar 700 μL de meio REMC para interromper a reação enzimática. Pipetar suavemente a suspensão usando uma pipeta P1000 até que as células sejam dissociadas em células únicas.
- Transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mL e centrifugar o tubo a 200 × g por 5 min.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 mL de meio REMC.
- Conte as células usando um contador de células (um hemocitômetro ou um contador de células automatizado).
- Para expansão das células urinárias, placa 1,5 × 10 4 a 3 × 104 células em 1 mL de meio REMC em uma placa de 12 poços revestida com gelatina a 0,2%.
- Realizar trocas de meio subsequentes a cada dois dias até que a cultura atinja 80%-90% de confluência. Portanto, aspirar o meio velho e adicionar 1 mL de meio REMC fresco.
3. Geração de iPSCs pela infecção vetorial do vírus Sendai
NOTA: Para obter o fluxo de trabalho do procedimento de reprogramação, consulte a Figura 2A. As células urinárias usadas para reprogramação devem ser tão jovens quanto possível, mas uma perda notável da eficiência da reprogramação não é observada antes da passagem 4. O Kit de Reprogramação de Vírus de Sendai deve ser usado em uma instalação BL-2. Manusear vírus sob uma cabine de segurança biológica com fluxo laminar e usar sempre equipamentos de segurança apropriados para evitar a exposição da mucosa.
- Prepare uma placa de 12 poços revestida com matriz de membrana basal adicionando 500 μL de matriz de membrana basal por poço e distribua o líquido movendo a placa. Incubar a placa a 37 °C por pelo menos 1 h e substituir a matriz da membrana basal por 900 μL de meio REMC. Conservar o prato a 37 °C até à utilização.
- Descongele rapidamente os componentes do Kit de Reprogramação de Sendai em banho-maria a 37 °C. Misture os vírus de Sendai (policistrônicos KLF4-OCT3/4-SOX2, cMYC e KLF4) com um MOI de 5 e adicione o meio REMC até 100 μL. Use a equação (1):
NOTA: Como os títulos de vírus diferem entre os lotes, sempre verifique o título no certificado de análise fornecido pelo fabricante.
Opcional: Use a proteína fluorescente verde (GFP) vírus de Sendai como um controle positivo para a eficiência da transdução. Para isso, prepare mais 3,5 × 104 células num tubo separado durante o passo 3.3. - Para dissociação das células urinárias, siga os passos 2.2-2.4. Conte as células usando o contador de células e transfira 7 × 104 células urinárias para um tubo de 1,5 mL.
- Centrifugar o tubo a 200 × g durante 5 minutos e remover cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular. Ressuspender o pellet em 100 μL da mistura de SeV preparada na etapa 3.2. Incubar o tubo durante 1 h a 37 °C para infecção da suspensão.
- Colocar a suspensão sobre as placas de 12 poços revestidas com matriz de membrana basal que foram preparadas na etapa 3.1. Rotineiramente, as placas 1 × 10 4 e 2,5 × 104 células por poço em duplicatas.
- Incubar as células a 37 °C e 5% de CO2. Substitua o meio por 1 mL de meio REMC fresco 24 h após a transdução e no dia 3.
- No dia 5 após a transdução, troque o meio para o meio gerador de PSC (ver Tabela Suplementar S1), com trocas subsequentes de meio a cada dois dias. Portanto, remova o meio antigo e adicione 1 mL de meio de geração de PSC por poço.
NOTA: Pode levar até 15 dias até que as primeiras colônias apareçam. - Escolha colônias iPSC individuais quando o tamanho da colônia exceder 1 mm. Para fazer isso, raspe e colete cuidadosamente uma única colônia com uma pipeta p10 sob um microscópio. Transferir a colônia para um novo poço de uma placa de 12 poços revestida com uma matriz de membrana basal contendo 750 μL de meio de cultura PSC.
Opcional: Enxaguar a placa com DPBS e tratar por 1 min com EDTA 0,5 mM antes da colheita pode apoiar a cultura robusta de etapas posteriores. Se as células forem cultivadas por mais tempo para esperar por colônias emergentes posteriores, não execute esta etapa de tratamento com EDTA. - Cultivar as células a 37 °C e 5% de CO2 com subsequentes trocas de meio em dias alternados, conforme indicado na secção 4 do protocolo. Quando a colônia colhida atingir um diâmetro de 2 mm, continuar com a passagem rotineira da iPSC, conforme explicado na seção 5 do protocolo.
4. Mudança média
NOTA: O meio de cultura deve ser trocado a cada dois dias até que as colônias cresçam suficientemente grandes para a passagem.
- Aspirar o meio velho e adicionar 750 μL do meio fresco por placa de 12 poços. Para mudar para um tipo diferente de meio, substitua o meio pelo menos 1 dia após a passagem.
5. Passagem
NOTA: As células devem ser passadas quando as colônias iPSC crescem o suficiente (diâmetro > 2 mm), ou as colônias estão prestes a tocar umas às outras. Rotineiramente, as iPSCs podem ser divididas aproximadamente a cada 5 dias. Use clump-passaging (etapa 5.1) para manutenção de rotina e passaging de célula única (etapa 5.2) para experimentos em que um número definido de células é necessário. Caso as iPSCs se diferenciem muito, a colheita de colônias (etapa 5.3) pode ajudar a melhorar a pureza das culturas.
- Passagem de aglomeração
- Prepare uma placa de 12 poços revestida com matriz de membrana basal adicionando 500 μL de matriz de membrana basal por poço e distribua o líquido movendo a placa. Incubar a placa a 37 °C durante, pelo menos, 1 h. Substitua a matriz da membrana basal por 500 μL de meio de cultura PSC e armazene a placa a 37 °C até o uso.
- Aspirar o meio das células cultivadas e lavar as células adicionando cuidadosamente 500 μL de DPBS. Remova o DPBS e adicione 500 μL de EDTA 0,5 mM ao poço.
- Incubar a placa em TR por 2-5 min, até que as colônias comecem a se desprender. Observe cuidadosamente as células sob o microscópio.
- Quando as bordas das colônias começarem a descascar e as lacunas entre as células se tornarem visíveis (Figura 3A), remova o EDTA e adicione cuidadosamente 500 μL de DPBS.
OBS: Sempre pipetar contra a parede lateral do poço e nunca diretamente sobre as células, para não desprender as células da placa. - Aspirar o DPBS e lavar o poço com 500 μL de meio de cultura PSC usando uma pipeta p1000. Pipetar para cima e para baixo 1x-5x para dispersar as colônias em aglomerados de tamanho apropriado (Figura 3A). Não pipetar muito.
NOTA: Se as iPSCs forem acidentalmente pipetadas demais, adicione 10 μM do inibidor de rocha Y-27632 ao meio. Isso pode aumentar a sobrevida, já que as iPSCs não são capazes de sobreviver como células únicas. - Transferir 1/10-1/50 da suspensão de aglomeração celular para os novos poços. A razão depende da confluência do poço antes da divisão, da densidade desejada das células semeadas e da preferência clonal iPSC.
- Distribua as touceiras uniformemente no poço, movendo suavemente a placa para frente e para trás várias vezes. Incubar a placa durante pelo menos 30 minutos a 37 °C para deixar os grumos fixarem.
- Substituir o meio por 750 μL de meio de cultura PSC se forem observadas muitas células mortas flutuantes; caso contrário, adicionar 250 μL de meio de cultura PSC. Colocar a placa a 37 °C e 5% CO2 numa incubadora.
NOTA: A substituição do meio após 30 minutos é crítica, especialmente para linhagens celulares instáveis (por exemplo, NHPs). - Troque o meio a cada 2-3 dias até que as colônias cresçam o suficiente para a passagem. Para mudança média, siga a etapa 4 do protocolo.
- Passagem de célula única
- Preparar a placa de cultura revestida com matriz de membrana basal, conforme indicado na etapa 5.1.1, com a adição de 10 μM Y-27632 ao meio de cultura PSC.
Opcional: Adicionar 10 μM Y-27632 às células 1-3 h antes da passagem para aumentar a sobrevivência de linhagens celulares sensíveis. - Aspirar o meio e lavar as células adicionando 500 μL de DPBS. Remova o DPBS e adicione 300 μL de solução de descolamento aos poços.
- Incubar a placa a 37 °C durante 5-10 min. Quando for observado desprendimento suficiente das células ao microscópio, adicionar 700 μL de meio de cultura PSC ou DPBS.
- Pipetar para cima e para baixo 5-10x usando uma pipeta p1000 até que as células sejam dissociadas em células únicas. Não pipetar muito, a fim de evitar danos celulares.
- Transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mL contendo pelo menos 2 mL de DPBS para diluir a solução de descolamento.
- Centrifugar o tubo a 200 × g durante 5 min e aspirar completamente a solução, sem perturbar o pellet celular.
- Ressuspender o pellet em 500 μL de meio de cultura PSC suplementado com 10 μM Y-27632.
- Contar as células e sementes 5.000-7.000 células por placa de 12 poços revestida com matriz de membrana basal, preparada na etapa 5.2.1.
Observação : se um número de célula diferente for necessário, altere para um poço maior ou menor de acordo. - Incubar a placa durante pelo menos 30 minutos a 37 °C e 5% de CO2 para deixar as células fixadas.
- Substitua o meio por 750 μL de meio de cultura PSC + 10 μM Y-27632 se forem observadas muitas células mortas; caso contrário, adicionar 250 μL + 10 μM Y-27632.
NOTA: Esta etapa é crítica, especialmente para as linhagens celulares instáveis (por exemplo, NHPs). - Colocar a placa a 37 °C e 5% CO2 numa incubadora.
- Trocar o meio para meio de cultura PSC sem Y-27632 1 a 2 dias após a bivisão, para permitir que as células voltem a exibir a morfologia clássica da colônia (Figura 3B).
- Troque o meio a cada 2 dias até que as colônias cresçam o suficiente. Para mudança média, siga a seção 4 do protocolo.
- Preparar a placa de cultura revestida com matriz de membrana basal, conforme indicado na etapa 5.1.1, com a adição de 10 μM Y-27632 ao meio de cultura PSC.
- Passagem de iPSCs por colheita de colônias
- Preparar 12 poços revestidos com matriz de membrana basal, conforme indicado na etapa 5.1.1.
- Aspirar o meio e lavar as células adicionando cuidadosamente 500 μL de DPBS. Remova o DPBS e adicione 500 μL de EDTA 0,5 mM ao poço.
- Incubar a placa em RT por 1-3 min e observar as células ao microscópio, até que o descolamento da colônia seja visível nas bordas.
- Retire o EDTA e adicione cuidadosamente 500 μL de DPBS. Aspirar o líquido antes de adicionar lentamente 500 μL de meio de cultura PSC ao poço, sem desprender as células.
- Use uma pipeta p200 para escolher a colônia desejada ao microscópio, sem coletar as células diferenciadas. Para fazer isso, coce suavemente sobre a colônia enquanto ocupa o meio que contém células.
- Transfira cada colônia colhida para um poço revestido com matriz de membrana basal, conforme preparado na etapa 5.3.1. Dissociar as células em pequenos aglomerados usando uma pipeta p1000, pipetando as células 2-5x.
- Incubar a placa durante 30 min a 37 °C e 5% de CO2, permitindo a fixação dos grumos.
- Substituir o meio por 750 μL de meio de cultura PSC se forem observadas muitas células mortas flutuantes; caso contrário, adicionar 250 μL de meio de cultura PSC.
NOTA: A substituição do meio após 30 minutos é crítica, especialmente para as linhagens celulares instáveis (por exemplo, NHPs). - Colocar a placa a 37 °C e 5% CO2 numa incubadora.
- Troque o meio a cada 2-3 dias até que as colônias cresçam o suficiente para a passagem. Para fazer isso, siga a seção 4 do protocolo.
6. Congelamento de células urinárias e iPSCs para armazenamento a longo prazo
NOTA: Rotineiramente, as iPSCs são congeladas como aglomerados em meio de congelamento celular sem contagem. A pipetagem deve ser mínima, para evitar a dissociação em células únicas. Para células urinárias, rotineiramente, 1,5 × 10 4 a 3 × 104 células são congeladas por tubo, permitindo que o usuário descongele um tubo diretamente em um poço de uma placa de 12 poços sem a necessidade de outra etapa de contagem.
- Preparar 5 mL de DPBS em um tubo de 15 mL.
- Para o congelamento das células urinárias, siga os passos 2.2-2.4 do protocolo. Para o congelamento de iPSCs, siga as etapas 5.1.2-5.1.5 do protocolo de passagem de aglomeração.
- Transferir a suspensão para o tubo de 15 ml preparado no passo 6.1. Para o congelamento das células urinárias, conte 10 μL da suspensão celular usando um hemocitômetro. Centrifugar as células por 5 min a 200 × g e aspirar completamente o sobrenadante.
- Ressuspender o pellet celular em 400 μL de meio de congelamento celular por tubo e distribuir as células até a quantidade desejada de criotubos.
- Transfira os criotubos imediatamente para -80 °C. Transfira os tubos congelados para um congelador de -150 °C ou nitrogênio líquido 1 dia após o congelamento a -80 °C para armazenamento a longo prazo.
7. Descongelamento de células urinárias e iPSCs
- Para o descongelamento das células urinárias, preparar a quantidade desejada de 12 poços revestidos com gelatina, conforme indicado na etapa 1.1 do protocolo. Para iPSCs, preparar as placas de 12 poços revestidas com matriz de membrana basal, conforme indicado na etapa 5.1.1. Em ambos os casos, não troque a matriz por meio.
- Preparar um tubo de 15 ml contendo 4 ml de DPBS e armazená-lo a 37 °C.
- Coloque rapidamente um frasco congelado de células num banho-maria a 37 °C para descongelar, até que um pedaço de gelo flutuante se torne visível.
OBS: Limpe o criotubo com etanol antes e depois da incubação em banho-maria para evitar contaminações. - Adicionar 500 μL de meio REMC para células urinárias ou 500 μL de meio de cultura PSC para iPSCs à suspensão contendo gelo e transferir imediatamente a suspensão para o tubo de 15 mL pré-aquecido preparado na etapa 7.2.
- Centrifugar o tubo a 200 × g durante 5 minutos e eliminar completamente o sobrenadante.
- Para as células urinárias, ressuspender o pellet em 1 mL de meio REMC. Para iPSCs, ressuspender cuidadosamente o pellet em 750 μL de meio de cultura PSC. Evite pipetar demais, a fim de manter as touceiras intactas.
Opcional: A suplementação do meio com 10 μM Y-27632 pode apoiar a sobrevivência de iPSCs após o descongelamento. - Aspirar a matriz das placas de 12 poços preparadas na etapa 7.1 e transferir cuidadosamente a suspensão da célula para o poço.
- Coloque a placa durante a noite a 37 °C e 5% CO2 em uma incubadora.
- No dia seguinte, substituir o meio por meio de cultura PSC, sem Y-27632 para iPSCs e com REMC para células urinárias.
- Cultivar as células a 37 °C e 5% CO2 em incubadora.
- Troque o meio a cada 2-3 dias até que as células cresçam o suficiente para a passagem. Para mudança média, siga a seção 4 do protocolo.
8. Imunocitoquímica
NOTA: A imunomarcação com anticorpos visando marcadores relacionados à pluripotência, como NANOG, OCT3/4, SOX2, TRA-1-60 e EpCAM é uma das validações mais amplamente utilizadas de iPSCs recém-geradas. Mais informações sobre os anticorpos e diluições podem ser encontradas na Tabela de Materiais.
- Placas iPSCs 1-3 dias antes do uso em um número apropriado de placas de 12 poços. Aspirar o meio, lavar as células adicionando 500 μL de DPBS e remover o DPBS. Adicionar 400 μL de paraformaldeído (PFA) a 4% por poço e fixar as células por 15 min na RT.
- Retire o PFA a 4% e lave as células 3x com DPBS. Adicionar 400 μL de tampão de bloqueio por poço e incubar a placa por 30 min no TR.
- Aspirar o tampão de bloqueio e adicionar os anticorpos diluídos em 400 μL de tampão de diluição de anticorpos (ADB) a cada poço. Incubar a placa a 4 °C durante a noite.
- Remova o ADB que contém os anticorpos primários e lave as células 3x com DPBS.
- Aspirar a DPBS e adicionar 400 μL de anticorpos secundários diluídos em ADB por poço. Incubar a placa por 1 h no TR no escuro.
- Remova o ADB e lave as células 3x com DPBS. Adicionar 1 μg/mL de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) diluído em DPBS por poço e incubar por 3 min no TR.
- Aspirar a solução DAPI e lavar a célula 3x com DPBS. Adicionar 500 μL de DPBS para aquisição de imagens.
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Representative Results
Ao isolar células da urina humana e do NHP, diferentes tipos de células podem ser identificados diretamente após o isolamento. As células escamosas, bem como várias células redondas menores, são excretadas com a urina; a urina feminina contém muito mais células escamosas do que a masculina (Figura 1B - Dia 0; Figura Suplementar S1). Após 5 dias de cultura em meio de urina primária, observam-se as primeiras células aderentes em proliferação (Figura 1A,B - Dia 5). Neste ponto, metade do meio é substituído por meio de proliferação REMC todos os dias, até que as primeiras colônias apareçam. Aproximadamente no 13º dia, as células aderentes crescem em grandes colônias que podem ser passadas (Figura 1B - Dia 13). Essas colônias podem ser formadas a partir de dois tipos celulares morfologicamente distintos, uma com fenótipo mais epitelial, com células crescendo intimamente ligadas, e a outra apresentando morfologia mais mesenquimal, com forma alongada e maior capacidade migratória (Figura 1C). Após a primeira passagem, as células urinárias crescem como monocamada, podendo ser passadas quando a cultura atinge 80% de confluência (Figura 1B - Dia 17).
Figura 1: Isolamento e cultivo de células urinárias. (A) Fluxo de trabalho para estabelecer células urinárias a partir de amostras de primatas humanos e não humanos. (B) Imagens de contraste de fase mostrando o crescimento e a formação de colônias de células urinárias até a primeira passagem (p1). (C) Dois tipos celulares diferentes isolados de amostras de urina podem ser distinguidos após 2 semanas de cultura. Barras de escala = 250 μm (B,C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Para gerar iPSCs a partir de células urinárias, uma transdução com vírus de Sendai introduzindo os fatores de Yamanaka OCT3/4, SOX2, KLF4 e c-MYC é usada. Para aumentar a eficiência da transdução, as células urinárias são incubadas com o vírus por 1 h em suspensão, antes de semearem em poços revestidos com matriz de membrana basal (Figura 2A). Algumas células aderentes podem ser vistas nos poços 1 dia após a transdução (Figura 2B - Dia 1). Após 5-10 dias, essas células começam a formar colônias, e alterações morfológicas precoces podem ser observadas, indicando reprogramação das células (Figura 2B - Dia 14). Muitas dessas colônias apresentam progressivamente uma morfologia semelhante à ESC e podem ser colhidas em meio de cultura LSC quando o diâmetro excede 1 mm. Após a coleta, as células formam colônias exibindo a morfologia típica da ESC dentro de aproximadamente 4 dias (Figura 2B - Dias 21 e 24). Quando as colônias iPSC crescem o suficiente, as células podem ser passadas pela primeira vez usando o protocolo de passagem de aglomeração (etapa de protocolo 5.1).
Essa abordagem de reprogramação tem sido utilizada para gerar iPSCs a partir de humanos, gorila gorila (gorila) e Pongo abelii (orangotango)15. Embora a probabilidade de obter células urinárias seja bastante variável, e pelo menos duas a três vezes menor para chimpanzés do que para humanos15, a reprogramação das células urinárias obtidas foi mais bem sucedida em nossa experiência. Em geral, 0,19% das células urinárias infectadas dão origem a colônias com morfologia ESC-like, resultando em pelo menos uma colônia em 87% das tentativas de reprogramação15. Todas as iPSCs geradas compartilham as mesmas propriedades e mostram a morfologia típica de colônia ESC-like, caracterizada por células bem compactadas com bordas claramente definidas (Figura 2C). Além disso, todas as iPSCs apresentam cariótipo normal, e a ausência de vetores de reprogramação do SeV foi verificada por PCR após um mínimo de cinco passagens, conforme recomendado pelo fabricante do kit de reprogramação do SeV (dados não mostrados)15. A imunocitoquímica é usada para testar a expressão de proteínas associadas à pluripotência no núcleo, como NANOG, OCT3/4 e SOX2. Marcadores de superfície como TRA-1-60, EpCAM e SSEA4 também podem ser utilizados (Figura 2D); entretanto, a SSEA4 também é expressa nas células urinárias15. Além disso, a análise por citometria de fluxo pode ser realizada usando esses marcadores de superfície para fornecer informações quantitativas sobre o estado de pluripotência das iPSCs (método descrito por Ohnuki et al.48). Essa abordagem é utilizada para mostrar que 95,3% das iPSCs de orangotangos analisadas são positivas para TRA-1-60 (Figura 2E). Além disso, a capacidade de diferenciação das iPSCs do NHP pode ser comprovada via diferenciação in vitro do corpo embrióide (BE) (método descrito por Geuder et al.15). Como mostrado na Figura 2F, as iPSCs de gorila são capazes de se diferenciar em linhagens endodérmica (ɑ-fetoproteína), mesoderma (actina de músculo liso ɑ) e ectoderma (tubulina β-III).
Figura 2: Geração e caracterização de iPSCs derivadas da urina. (A) Fluxo de trabalho de reprogramação de células derivadas da urina. (B) Imagens de contraste de fase mostrando as alterações morfológicas das células urinárias dos gorilas durante a reprogramação até o estabelecimento das colônias iPSC. Barras de escala = 500 μm. (C) Morfologia de colônias iPSC estabelecidas de culturas de células humanas, gorilas e orangotangos. Barras de escala = 500 μm. (D) Coloração por imunofluorescência de iPSCs de gorila com marcadores associados à pluripotência na passagem 8: NANOG, OCT3/4, SSEA4, SOX2, EpCAM e TRA-1-60. Barras de escala = 100 μm. (E) Análise por citometria de fluxo de iPSCs de orangotango coradas com anti-TRA-1-60-PE. Células não coradas foram utilizadas como controle. (F) Análise por imunofluorescência da endoderme (AFP), mesoderma (ɑ-SMA) e ectoderma (β-III TUB) após diferenciação do corpo embrióide de iPSCs de gorila. Os núcleos foram contracorados com DAPI. Barras de escala = 100 μm. Abreviações: iPSCs = células-tronco pluripotentes induzidas; PE = ficoeritrina; AFP = α-fetoproteína; ɑ-SMA = alfa actina de músculo liso; β-III TUB = beta III Tubulina; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Quando as colônias iPSC atingem um diâmetro de aproximadamente 2 mm, ou estão prestes a se tocar, as células devem ser divididas. Sugerimos o uso do protocolo de passagem de aglomeração para manutenção de rotina. Neste protocolo, EDTA 0,5 mM é usado para destacar as células por 3-5 min, dependendo do tamanho da colônia. Durante a incubação do EDTA, as bordas das colônias começam a descascar, e lacunas visíveis aparecem entre as células (Figura 3A). O EDTA deve ser removido quando um descolamento apropriado é observado sob o microscópio. A incubação prolongada com EDTA leva a uma maior fração de células individuais que não são capazes de sobreviver. Em seguida, as células devem ser dissociadas para aglomerados de tamanho semelhante, como mostra a Figura 3A. As células não devem ser dissociadas em pequenos aglomerados, pois isso reduz a sobrevivência e pode levar a células mais diferenciadoras.
Quando um experimento requer a semeadura de um número definido de células, o protocolo de passagem de célula única deve ser usado. Esse protocolo inclui a suplementação do meio com um inibidor de rocha, que permite que as células individuais sobrevivam. Espera-se que as células isoladas aderidas apresentem uma morfologia diferente, em comparação com as células que crescem em uma colônia após a semeadura do aglomerado (Figura 3B - Dia 0). Após 1-2 dias de cultura, as células isoladas começam a crescer em colônias novamente, preservando sua morfologia, bem como seu contato célula-célula frouxa, se um inibidor de Rock for adicionado ao meio (Figura 3B - Dia 2). Quando essas pequenas colônias são observadas, o inibidor de Rock deve ser removido do meio, permitindo que as células voltem a exibir a morfologia típica de ESC (Figura 3B - Dia 4).
Para julgar se uma colônia iPSC é de alta qualidade, vários aspectos precisam ser levados em consideração. Primeiro, é normal que colônias saudáveis apresentem nenhuma ou pequena quantidade de diferenciação espontânea; no entanto, um número aumentado de células diferenciadas (>10%) é indicativo de má qualidade das iPSC. Características adicionais de baixa qualidade da iPSC são a perda da integridade e uniformidade das bordas (Figura 3C: direita), bem como o empacotamento celular frouxo com lacunas visíveis entre as células (Figura 3D: direita). Em contraste, iPSCs de alta qualidade são caracterizadas por bordas definidas, empacotamento celular apertado e nucléolos proeminentes (Figura 3C, D: imagens à esquerda).
Figura 3: Cultura iPSC de primatas. (A) Imagens de contraste de fase mostrando o descolamento de colônias iPSC durante a incubação com EDTA seguindo o protocolo de passagem de aglomeração e o tamanho ideal do aglomerado após a dissociação. Barras de escala = 250 μm. (B) Linha do tempo de recuperação de iPSC após passagem de célula única. O inibidor de rocha Y-27632 foi removido a partir do dia 2. Barras de escala = 250 μm. (C) Esquerda: exemplo de uma colônia humana iPSC de alta qualidade com bordas definidas. Direita: exemplo de uma colônia de baixa qualidade com menos integridade de borda e células diferenciadas. Barras de escala = 500 μm. (D) Imagens de exemplo para uma colônia humana iPSC de alta qualidade (esquerda) em comparação com uma de baixa qualidade com células frouxamente compactadas (direita). Barras de escala = 100 μm. Abreviação: iPSCs = células-tronco pluripotentes induzidas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar S1: Visão geral dos tipos celulares encontrados na urina humana. (A) Células isoladas da urina feminina. (B) Células isoladas da urina masculina. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela Suplementar S1: Composição de buffer e meios utilizados neste estudo. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
As iPSCs são tipos celulares valiosos, pois permitem a geração de tipos celulares inacessíveis in vitro. Como os materiais de partida para a reprogramação, por exemplo, fibroblastos não estão facilmente disponíveis em todas as espécies de primatas, este trabalho apresenta um protocolo para a geração de iPSCs a partir de células derivadas da urina. Essas células podem ser obtidas de forma não invasiva, mesmo a partir de amostras não estéreis de urina de primatas, suplementando-se o meio de cultura com antibióticos de amplo espectro.
Várias etapas críticas do protocolo merecem alguma discussão adicional. Primeiro, ao isolar células de urina não estéril, é importante complementar o meio com um reagente antimicrobiano de amplo espectro para reduzir o risco de contaminação. Se o crescimento da contaminação microbiológica se tornar aparente apesar do uso de antibióticos, recomenda-se descartar toda a cultura e desinfetar a área; Além disso, em nossa experiência, o cultivo contínuo não produz células urinárias saudáveis em crescimento. Em segundo lugar, ao iniciar a reprogramação celular, recomenda-se o preparo de várias placas com diferentes números de células transduzidas por SeV, para evitar o risco de descolamento de todas as células por superconfluência e aumentar a probabilidade de aquisição de iPSC. Em geral, espera-se que o revestimento de uma maior densidade de células transduzidas por SeV produza mais colônias iPSC reprogramadas, enquanto a cultura das células de reprogramação por um período de ~20 dias geralmente resulta em superconfluência, seguida de descolamento de todo o poço. Terceiro, em cada etapa que requer dissociação das iPSCs, é fundamental evitar a pipetagem extensa, que leva à morte celular significativa. Especialmente quando a passagem do aglomerado é realizada, é importante manter as touceiras em um tamanho adequado (Figura 3A). Aglomerações muito grandes podem levar a uma diferenciação rápida, enquanto aglomerações muito pequenas podem diminuir a sobrevivência.
Observamos que a probabilidade de obtenção de células urinárias é bastante variável entre amostras e alíquotas, mas não encontramos evidências de que volumes menores tenham menor taxa de sucesso na obtenção de colônias. Em geral, isolamos uma média de 7,6 colônias a partir de 100 mL de urina humana. Assumindo essa taxa média e uma distribuição de Poisson, a obtenção de pelo menos uma colônia tem uma probabilidade de ~98% para 50 mL e ~30% para 5 mL de material de partida. Em nosso caso, foi possível isolar pelo menos uma colônia a partir de 5 mL de urina humana em 42% das tentativas15. Com base nisso, o isolamento das colônias ainda pode valer a pena tentar, mesmo que apenas pequenos volumes de urina estejam disponíveis. Caso a reprogramação das células urinárias falhe, e nenhuma colônia iPSC possa ser observada, o plaqueamento de diferentes números de células transfectadas pode resultar em reprogramação das células derivadas da urina. As colônias emergentes de iPSC também podem ser identificadas como iPSCs por coloração viva usando marcadores de superfície (por exemplo, TRA-1-60 ou fosfatase alcalina [AP]; dados não mostrados). Sabe-se que a atividade da AP é regulada para cima em células-tronco pluripotentes, e pode ser usada para corar transitoriamente células-tronco durante o processo de cultura. Outra possível armadilha do protocolo é a cultura ótima de iPSCs do NHP. Usando este protocolo, confirmamos que iPSCs humanas e NHP mantêm seu estado pluripotente por mais de 50 passagens usando um meio comercialmente disponível. No entanto, em comparação com iPSCs humanas, as iPSCs de NHP são mais propensas a se diferenciar espontaneamente em nossa experiência, potencialmente devido às condições de cultura que foram otimizadas para culturas humanas e não para culturas de NHP. Além disso, há grande variabilidade entre clones iPSC nas taxas de sobrevivência após o plaqueamento, velocidade de crescimento e tendência de diferenciação. Portanto, muitas vezes é necessário determinar a proporção de divisão ideal, o tempo de passagem e o tamanho do aglomerado para cada clone individualmente.
Demonstramos que mesmo um volume de 5 mL pode ser suficiente para isolar as células urinárias dos NHPs15. No entanto, enquanto não encontramos diferenças significativas no número de células urinárias isoladas em humanos, gorilas e orangotangos, os chimpanzés tiveram uma proporção menor, pois não pudemos isolar células urinárias de um total de 87 mL. Assim, para algumas espécies, pode ser necessário coletar muito mais urina do que para outras. Coletar grandes volumes de pequenos primatas pode ser especialmente desafiador, mas como o isolamento de células urinárias é bastante econômico, é prático apenas experimentá-lo para espécies específicas e volumes disponíveis de urina. Infelizmente, as amostras de urina não podem ser congeladas, o que limita o raio sobre o qual as amostras podem ser coletadas. No entanto, mostramos que um tempo de armazenamento de 4 h a 4 °C não influenciou o número de colônias isoladas15, e um maior tempo de armazenamento ou melhores condições de armazenamento podem ser possíveis. Introduzimos vários tipos de testes de controle de qualidade para validação. No entanto, mesmo que uma linhagem de iPSC satisfaça esses critérios, a heterogeneidade clonal ainda é substancial, o que tem sido explicado pelo background genético49 e status epigenético 50,51,52,53,54. Para aplicar iPSCs de primatas em análises comparativas futuras, deve-se considerar a heterogeneidade e utilizar clones suficientes para calcular a média da variação clonal, evitando assim erros de interpretação do resultado.
No entanto, o uso da urina como fonte de células primárias tem uma grande vantagem sobre os métodos convencionais que utilizam, por exemplo, fibroblastos para reprogramação, pois podem ser obtidos de forma completamente não invasiva. Além disso, esse protocolo permite a geração de iPSCs a partir de células derivadas da urina com um período mais curto do que a reprogramação convencional. Com este método, as colônias tornam-se visíveis dentro de 5-15 dias, enquanto que descobrimos que colônias de fibroblastos de primatas (rhesus, babuíno) tendem a aparecer mais tarde, após 20-30 dias. Além disso, com o uso desse método de infecção em suspensão, 0,19% das células transduzidas pelo vírus deram origem a colônias com morfologia celular pluripotente. Isso resultou em pelo menos uma colônia em 87% das tentativas15. Em comparação, o método convencional de transdução de SeV com células aderidas e a lipofecção com plasmídeos epissomais mostraram uma eficiência de reprogramação significativamente menor, com 0,09% e 0,009% das células formando uma colônia pluripotente, respectivamente15.
Em resumo, este método permite o isolamento de células urinárias de forma não invasiva e a geração de iPSCs livres de alimentação de quase qualquer doador humano e muitos NHPs. Isso aumenta a acessibilidade a tipos de células preciosas que podem ser diferenciadas dessas iPSCs. Além disso, esse método pode ser usado para produzir iPSCs específicas do paciente que podem ser usadas para modelagem de doenças ou futuras terapias baseadas em células. Finalmente, como as iPSCs podem ser geradas a partir de apenas pequenos volumes de urina, este método pode ser aplicado a muitas outras espécies diferentes de primatas ou mesmo mamíferos. Assim, este método pode ser uma poderosa ferramenta para comparação entre espécies, que pode permitir uma melhor compreensão da evolução de características específicas do homem.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela DFG EN 1093/5-1 (projeto número 458247426). M.O. foi apoiado pela JSPS Overseas Research Fellowship. Todas as figuras foram criadas com BioRender.com. A citometria de fluxo foi realizada com o auxílio da citometria de fluxo do Core Facility no Biomedical Center Munich. Gostaríamos de agradecer a Makoto Shida e Tomoyo Muto da ASHBi, Universidade de Kyoto, pelo apoio à videografia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accumax™ cell detachment solution (Detachment solution) | Sigma-Aldrich | SCR006 | |
| Amphotericin B-Solution | Merck | A2941-100ML | |
| Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody | Stem Cell Technologies | 60064 | Dilution: 1/200 |
| Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody | Miltenyi Biotec | 130-122-965 | Dilution: 1/50 |
| Bambanker™ (Cell freezing medium) | Nippon Genetics | BB01 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
| Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR | Greiner BIO-ONE | 665180 | |
| Countess™ II automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes) | Sued-Laborbedarf | 52 95-0213 | Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information. |
| CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus) | Thermo Fisher Scientific | A16519 | |
| CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit) | Thermo Fisher Scientific | A16518 | |
| DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | 10236276001 | |
| DMEM High Glucose | TH.Geyer | L0102 | |
| DMEM/F12 w L-glutamine | Fisher Scientific | 15373541 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Dilution: 1/500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21207 | Dilution: 1/500 |
| DPBS w/o Calcium w/o Magnesium | TH.Geyer | L0615-500 | |
| EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC) | Thermo Fisher Scientific | 710524 | Dilution: 1/500 |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Carl Roth | CN06.3 | |
| Falcon Tube 15 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 188271-N | |
| Falcon Tube 50 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
| FlowJo V10.8.2 | FlowJo | 663441 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-1KG | |
| Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413301 | |
| GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Heracell™ 240i CO2 incubator | Fisher Scientific | 16416639 | |
| Heraeus HeraSafe safety cabinet | Kendro | 51017905 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-749 | |
| ImageJ | Fiji | Version 2.9.0 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL | Nerbe Plus | 04-212-1000 | |
| Microscope Nikon eclipse TE2000-S | Nikon | TE2000-S | |
| Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody | R&D Systems | MAB1368 | Dilution: 1/100 |
| Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody | R&D Systems | MAB1420 | Dilution: 1/100 |
| Mouse anti-beta-III Tubulin antibody | R&D Systems | MAB1195 | Dilution: 1/100 |
| mTeSR™ 1 | STEMCELL Technolgies | 85850 | |
| Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4903S | Dilution: 1/400 |
| Normocure™ (Antimicrobial Reagent) | Invivogen | ant-noc | |
| Oct-4 Rabbit Antibody | Cell Signaling Technology | 2750S | Dilution: 1/400 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 µg/mL Streptomycin. |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Recombinant Human PDGF-AB | PeproTech | 100-00AB | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SIGMA | 4-16KS | |
| Renal Epithelial Cell Basal Medium | ATCC | PCS-400-030 | |
| Renal Epithelial Cell Growth Kit | ATCC | PCS-400-040 | |
| Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900 | Cell Signaling Technology | 4900S | Dilution: 1/400 |
| SSEA4 (MC813) Mouse mAb | NEB | 4755S | Dilution: 1/500 |
| StemFit® Basic02 | Nippon Genetics | 3821.00 | The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
| TrypLE™ Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12563011 | |
| Waterbath Precision GP 05 | Thermo Fisher Scientific | TSGP05 | |
| Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor) | Biozol | BYT-ORB153635 | |
| Antibody dilution buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Blocking buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
| REMC medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Primary urine medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| PSC culture medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| PSC generation medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Urine wash buffer | For composition see the supplementary table S1 |
References
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