离体活体成像是一种研究活体组织中细胞运动和相互作用动态过程的强大技术。本文介绍了一种利用双光子显微镜对培养的成年小鼠全门齿中的牙上皮细胞进行活体示踪的实验方案。
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方法文章
使用 离体 活体成像技术研究小鼠牙齿更新过程中的细胞分裂与迁移
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
不断生长的小鼠门齿正成为研究成年上皮和间充质干细胞调控机制及牙齿再生的一个高度可操作的模型系统。这些祖细胞群体能够活跃地分裂、迁移并分化，以响应性地维持组织稳态并再生丢失的细胞。然而，传统的基于固定组织切片的分析方法无法捕捉细胞运动与相互作用的动态过程，限制了我们对这些调控机制的研究。本文介绍了一种将完整小鼠门齿维持在离体培养系统中的方案，并利用多光子延时显微成像技术对牙源性上皮细胞进行活体示踪。该技术丰富了牙科研究现有的技术工具箱，使研究人员能够在活体组织中获取有关细胞行为与组织结构的时空信息。我们预期该方法将有助于科研人员进一步探索牙齿更新与再生过程中动态细胞活动的调控机制。
引言
在过去的二十年中，小鼠门齿已成为研究成体干细胞调控和牙齿再生原理的宝贵平台1,2。小鼠门齿能够终生持续生长并自我更新，其机制依赖于维持上皮和间充质干细胞的存在，这些干细胞具有自我更新能力，并可分化为牙齿中的多种细胞类型1,2。牙源性上皮干细胞分化为成釉细胞，分泌釉质基质；而牙源性间充质干细胞则分化为成牙本质细胞、成牙骨质细胞和成纤维细胞，分别形成牙本质、牙骨质和牙周韧带3,4,5,6。这种持续的新细胞供应维持了组织稳态，并可替换因咀嚼磨损或损伤而丢失的老旧细胞7,8。因此，阐明调控牙源性干细胞维持与分化的细胞和分子机制，对于理解日益受到关注的牙齿再生领域至关重要。
从解剖学上看，成年小鼠门齿的大部分被包裹在颌骨内。虽然牙齿的切缘部分暴露在外，但门齿的尖端嵌入牙槽中，并通过牙周....
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方案
所有小鼠均饲养于加利福尼亚大学洛杉矶分校（UCLA）或耶路撒冷希伯来大学（HUJI）的无病原体动物设施中。涉及小鼠的所有实验均依照各机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的规定和方案进行（UCLA：ARC-2019-013；HUJI：MD-23-17184-3）。实验步骤的总体工作流程见图2A。有关本方案中使用的所有仪器、试剂和材料的详细信息，请参见材料表。
1. 溶液与凝胶的制备
- 解剖培养基：使用含0.5%葡萄糖的DMEM/F12新鲜配制，并在37 °C保温，待步骤2.4中使用。
注意：我们使用不含酚红的DMEM/F12，以减少活体成像过程中的自发荧光。 - 1x 培养基：使用50% DMEM/F12、50% 大鼠血清、1x 谷氨酰胺替代物、1x MEM必需氨基酸、1% 葡萄糖、0.1 mg/mL L-抗坏血酸和0.5% 青霉素-链霉素新鲜配制培养基。在37 °C保温，待步骤5.5中使用。该培养基用于活体成像过程中门齿外植体的培养。
注意：大鼠血清应为高质量产品，由研究人员专门制备或购自商业来源，用于全组织培养。特别需要注意的是，血液必须在凝血开始前进行离心（室温下1,200 × g 离心5分钟）。离心后应挤压并弃去形成的纤维蛋白凝块
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结果
成年小鼠门齿的顶端区域被下颌骨包裹（图1），因此无法直接观察和活体追踪位于生长区域内的前体细胞。为此，我们建立了一种方法，可将整个门齿从颌骨中完整取出，并在组织外植体培养系统中进行双光子延时显微成像（图2）。本文描述了代表性实验结果，记录了牙上皮唇侧颈环区域中细胞增殖与迁移的动态过程。
为了展示实验步骤，我们使用了两种不同的小鼠模型，其牙源性上皮表达绿色荧光。第一种小鼠品系为 K14Cre;R26rtTA;tetO-H2B-GFP，其中 K14Cre（MGI:2680713）在角蛋白14（Keratin 14）启动子驱动下表达Cre重组酶35，从而在上皮组织中激活来自 R26rtTA 等位基因36（MGI:3584524）的反向四.......
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讨论
活体组织成像是一种重要技术，可使我们在细胞处于其微环境时研究其动态过程和行为41理想情况下，应进行活体成像 体内 具有高时空分辨率。然而， 体内 由于组织难以接近、光学不透明以及难以长时间固定动物或器官，对哺乳动物器官进行成像可能具有挑战性42组织外植体可规避其中部分挑战，已被成功应用于多项研究中，用于追踪细胞行为，例如在牙齿形态发生及外胚层器官发育过程中。26在此，我们展示了一种相对简单且稳健的方案，用于对培养的成年小鼠完整门齿进行活体深层组织成像。该技术的应用将有助于我们理解牙齿再生过程中细胞运动、命运决定及组织构建的调控机制。
由于细胞分裂是易于观察的事件，且是再生组织的特征性表现，本研究聚焦于追踪分裂中的细胞，以展示该实验方案的一种应用。我们发现门齿上皮前体细胞可进行垂直分裂和水平分裂，因此与其他上皮组织相似43。阐明调控分裂角度的机制，并探究分裂方.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢加州纳米系统研究所的加州大学洛杉矶分校先进光学显微镜/光谱学实验室和徕卡显微系统卓越中心（RRID:SCR_022789）提供双光子显微镜技术支持。AS 由以色列科学基金会（ISF）资助（项目编号 604-21）。JH 由美国国立卫生研究院/国家牙科与颅面研究所（NIH/NIDCR）资助（项目编号 R03DE030205 和 R01DE030471）。AS 和 JH 还获得了美国-以色列双边科学基金会（BSF）资助（项目编号 2021007）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24 孔平底组织培养板 | Olympus plastics | 25-107 | |
| 25倍 HC IRAPO motCORR 水浸物镜 | Leica | 11507704 | |
| 抗坏血酸（维生素 C） | Acros Organics | 352685000 | |
| D-(+)-葡萄糖 bioxtra | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Delta T 系统 | Bioptechs | 0420-4 | 包含温度控制、培养皿和灌流装置 |
| 解剖显微镜 - LEICA S9E | Leica | LED300 SLI | |
| DMEM/F12 | Thermo Scientific | 11039047 | 不含酚红的基础培养基 |
| Feather 外科刀片（#15） | Feather | 72044-15 | |
| 精细镊子 | F.S.T | 11252-23 | |
| GlutaMax | Thermo Scientific | 35050-061 | 谷氨酰胺替代物 |
| 配备 25倍 HC IRAPO motCORR 水浸物镜的 Leica SP8-DIVE 显微镜 | Leica | n/a | |
| 低熔点琼脂糖 | NuSieve | 50080 | |
| 非必需氨基酸（100倍浓缩液） | Thermo Scientific | 11140-050 | |
| 青霉素–链霉素 | Thermo Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL |
| 培养皿 | Gen Clone | 32-107G | 90 mm |
| 大鼠血清 | Valley Biomedical | AS3061SC | 适用于活体成像处理 |
| 剃刀刀片 #9 | VWR | 55411-050 | |
| 手术刀柄 | F.S.T | 10003-12 | |
| 剪刀 | F.S.T | 37133 | |
| 有齿镊 | F.S.T | 11000-13 | |
| 弹簧剪 | F.S.T | 91500-09 |
参考文献
- Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration. Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).
- Jing, J., et al. Ro....
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