Ex Vivo Live Imagingを用いたマウス歯の再生中の細胞分裂と動きの調査
Summary
Ex vivo ライブイメージングは、生体組織における細胞の動きや相互作用のダイナミックなプロセスを研究するための強力な技術です。ここでは、培養された成体マウス切歯全体の歯上皮細胞をライブトラッキングするために2光子顕微鏡法を実装するプロトコルを紹介します。
Abstract
成長を続けるマウス切歯は、成体上皮幹細胞や間葉系幹細胞の調節や歯の再生を研究するための扱いやすいモデル系として注目されています。これらの前駆細胞集団は、組織の恒常性を維持し、失われた細胞を応答的に再生するために、活発に分裂、移動、分化します。しかし、固定された組織切片を用いた従来の解析では、細胞の動きや相互作用のダイナミックなプロセスを捉えることができず、その制御を研究する能力が制限されていました。この論文では、外植片培養システムでマウス切歯全体を維持し、多光子タイムラプス顕微鏡を使用して歯上皮細胞をライブトラックするプロトコルについて説明します。この技術は、歯科研究のための既存のツールボックスに追加され、研究者が生体組織内の細胞の挙動と組織に関する時空間情報を取得することを可能にします。この方法論は、研究者が歯の再生と再生の両方で起こる動的な細胞プロセスを制御するメカニズムをさらに探求するのに役立つと期待しています。
Introduction
過去20年間で、マウス切歯は成体幹細胞の調節と歯の再生の原理を研究するための非常に貴重なプラットフォームとして浮上してきました1,2。マウス切歯は継続的に成長し、動物の生涯を通じて再生します。これは、上皮幹細胞と間葉系幹細胞の両方を維持することによって行われ、自己複製して歯のさまざまな細胞型に分化することができます1,2。歯の上皮幹細胞はエナメル質マトリックスを分泌する髄芽細胞を生じさせるのに対し、歯の間葉系幹細胞は歯芽細胞、セメント芽細胞、線維芽細胞を生じさせ、それぞれ象牙質、セメント質、歯根膜を形成します3,4,5,6。この新しい細胞の絶え間ない供給は、組織の恒常性を維持し、咀嚼の摩耗や損傷のために失われた古い細胞の交換を可能にします7,8。したがって、歯科幹細胞の維持と分化を調節する細胞および分子メカニズムの解明は、関心が高まっている分野である歯の再生を理解する上で中心的な役割を果たします。
解剖学的には、成体マウス切歯の大部分は顎骨に包まれています。歯の切歯縁が露出している間、切歯の頂端はソケット内に収まり、歯根膜と結合組織を介して周囲の骨にしっかりと取り付けられています(図1A、B)。切歯の頂端は歯の成長領域でもあり、上皮層と間葉系歯髄の両方で歯の幹細胞と前駆細胞を維持しています9,10,11,12,13。具体的には、歯の上皮幹細胞は、頂端芽として知られる上皮の球状端(唇頸管ループとも呼ばれる)に維持されています(図1C)。腸上皮や表皮と同様に、切歯の上皮再生は、主に活発に循環する幹細胞と、頸管ループの内側に存在する移行増幅細胞14、15、16、17と呼ばれるその高度に増殖する中間子孫によって支えられています。しかし、切歯上皮が再生中に静止幹細胞を含み、利用するかどうかは、まだ決定されていない。対照的に、根尖歯髄では活性型と静止期の歯間葉系幹細胞の両方が同定されており、静止幹細胞は損傷修復中に活性化される予備集団として機能する13,18。
マウス切歯の再生と再生の生物学に関する発見の多くは、組織学的調査の結果であり、サンプルは明確な時間的分岐点で採取され、固定され、処理され、特定の平面に沿ってミクロン単位の薄切りに切断されます。系統追跡や遺伝的摂動を可能にするさまざまなマウスモデルの組織学的切片の詳細な分析を通じて、科学者たちは、さまざまな前駆細胞集団の細胞系統、ならびに切歯の恒常性と損傷の修復を制御する遺伝的およびシグナル伝達経路を特定しました19,20,21.しかし、切片内の非生命細胞の静的な2次元(2D)画像では、細胞の形状変化、動き、細胞動態など、生体組織における細胞の挙動や空間的組織の全範囲を捉えることはできません。組織切片では解決できない時間スケールで発生するこれらの急速な細胞変化を検出および測定するには、別の戦略が必要です。さらに、このような情報を取得することは、歯の細胞がどのように相互作用し、さまざまなシグナル刺激に反応し、組織の構造と機能を維持するために自己組織化するかを理解する上でも重要です。
2光子顕微鏡を用いた4次元(4D)深部組織イメージングの出現22は、3つの空間次元と時間分解能を統合した技術であり、培養組織の外植片、オルガノイド、さらには組織をその場で時空間的に検査することを可能にし、組織学的分析の固有の限界を克服しました23,24,25,26 .例えば、発生中の歯上皮の4Dライブイメージングは、組織の成長、シグナル伝達中心の形成、および歯の上皮形態形成を調整する細胞分裂と移動の時空間パターンを明らかにしました27,28,29,30,31,32.成体マウス切歯では、最近、4Dイメージングが、歯の上皮損傷修復中の細胞挙動を研究するために適応されています。ライブイメージングにより、基底層の層中間細胞が基底層の髄芽細胞に直接変換され、損傷した上皮を再生できることが明らかになり、上皮損傷修復の従来のパラダイムに挑戦します15。
ここでは、口唇頸管ループの上皮細胞に着目して、成体マウス切歯の解剖、培養、イメージングについて述べる(図1)。この技術により、歯細胞の活力を12時間以上維持し、蛍光標識された細胞を単一細胞の分解能でライブトラッキングすることができます。このアプローチにより、通常の培養条件下、または遺伝的、物理的、化学的摂動に対する応答における細胞の動きと移動、および細胞の形状と分裂配向の動的な変化を調べることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
生組織イメージングは、細胞がニッチな環境で維持されるときの細胞の動的なプロセスと挙動を研究することを可能にする重要な技術です41。理想的には、ライブイメージングは、高い時空間分解能で in vivo で行われます。しかし、哺乳類器官の in vivo イメージングは、組織へのアクセス不能、光学的不透明性、および動物または器官を長期間固定することの?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
カリフォルニア大学ロサンゼルス校(UCLA)の先端光学顕微鏡/分光法研究所とカリフォルニアナノシステム研究所(RRID:SCR_022789)のライカマイクロシステムセンターオブエクセレンスが、2光子顕微鏡を提供してくれたことに感謝します。ASは、イスラエル科学財団のISF 604-21の支援を受けました。JHは、NIH/NIDCRのR03DE030205とR01DE030471の支援を受けました。ASとJHは、米国・イスラエル二国間科学財団(BSF)からの助成金2021007の支援も受けています。
Materials
| 24 well, flat bottom tissue culture plate | Olympus plastics | 25-107 | |
| 25x HC IRAPO motCORR water dipping objective | Leica | 11507704 | |
| Ascorbic acid (Vitamin C) | Acros Organics | 352685000 | |
| D-(+)-Glucose bioxtra | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Delta T system | Bioptechs | 0420-4 | Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup |
| Dissection microscope- LEICA S9E | Leica | LED300 SLI | |
| DMEM/F12 | Thermo Scientific | 11039047 | Basal media without phenol red |
| Feather surgical blade (#15) | Feather | 72044-15 | |
| Fine forceps | F.S.T | 11252-23 | |
| Glutamax | Thermo Scientific | 35050-061 | Glutamine substitute |
| Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective | Leica | n/a | |
| low-melting agarose | NuSieve | 50080 | |
| non-essential amino acids (100x) | Thermo Scientific | 11140-050 | |
| penicillin–streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Petri dish | Gen Clone | 32-107G | 90 mm |
| Rat serum | Valley Biomedical | AS3061SC | Processed for live imaging |
| Razor blade #9 | VWR | 55411-050 | |
| Scalpel handle | F.S.T | 10003-12 | |
| Scissors | F.S.T | 37133 | |
| serrated forceps | F.S.T | 11000-13 | |
| spring scissors | F.S.T | 91500-09 |
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