Ex vivo Live Imaging을 사용하여 마우스 치아 재생 중 세포 분열 및 움직임 조사
Summary
생체 외 라이브 이미징은 생체 조직에서 세포 움직임과 상호 작용의 동적 과정을 연구하기 위한 강력한 기술입니다. 여기에서는 배양된 전체 성체 마우스 앞니에서 치아 상피 세포를 실시간으로 추적하기 위해 이광자 현미경을 구현하는 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
지속적으로 성장하는 마우스 앞니는 성체 상피 및 중간엽 줄기 세포의 조절과 치아 재생을 조사하기 위한 다루기 쉬운 모델 시스템으로 부상하고 있습니다. 이러한 전구 세포는 활발하게 분열, 이동 및 분화하여 조직 항상성을 유지하고 손실된 세포를 반응하는 방식으로 재생합니다. 그러나 고정 조직 절편을 사용하는 기존 분석은 세포 움직임 및 상호 작용의 동적 과정을 포착할 수 없었기 때문에 해당 규정을 연구하는 능력이 제한되었습니다. 이 논문은 이식 배양 시스템에서 전체 마우스 앞니를 유지하고 다광자 타임랩스 현미경을 사용하여 치아 상피 세포를 실시간으로 추적하는 프로토콜을 설명합니다. 이 기술은 치과 연구를 위한 기존 도구 상자에 추가되며 연구자가 살아있는 조직의 세포 행동 및 조직에 대한 시공간 정보를 얻을 수 있도록 합니다. 우리는 이 방법론이 연구자들이 치아 재생과 재생 중에 발생하는 역동적인 세포 과정을 제어하는 메커니즘을 추가로 탐구하는 데 도움이 될 것으로 기대합니다.
Introduction
지난 20년 동안 마우스 앞니는 성체 줄기 세포 조절 및 치아 재생의 원리를 조사하기 위한 귀중한 플랫폼으로 부상했습니다 1,2. 쥐 앞니는 동물의 일생 동안 지속적으로 성장하고 스스로 재생됩니다. 상피 줄기세포와 중간엽 줄기세포를 모두 유지함으로써 이를 수행하며, 이 줄기세포는 치아의 다른 세포 유형으로 자가 재생되고 분화할 수 있습니다 1,2. 치아 상피 줄기세포는 법랑질 기질을 분비하는 아멜로아세포를 생성하는 반면, 치아 중간엽 줄기세포는 상아질, 시멘트 및 치주 인대를 형성하는 odontoblast, cementoblast 및 fibroblast를 각각생성합니다 3,4,5,6. 이러한 새로운 세포의 지속적인 공급은 조직의 항상성을 유지하고 저작 마모 또는 부상으로 인해 손실된 오래된 세포를 대체할 수 있도록 합니다 7,8. 따라서 치아 줄기 세포의 유지와 분화를 조절하는 세포 및 분자 메커니즘을 밝히는 것은 점점 더 관심이 높아지고 있는 분야인 치아 재생을 이해하는 데 중요합니다.
해부학적으로 성체 쥐 앞니의 상당 부분이 턱뼈에 둘러싸여 있습니다. 치아의 앞니 가장자리가 노출되어 있는 동안 앞니의 치근단 끝은 소켓 내에 맞고 치주 인대와 결합 조직을 통해 주변 뼈에 단단히 부착됩니다(그림 1A, B). 앞니의 정점 끝은 치아의 성장 영역이기도 하며 상피층과 중간엽 치수(9,10,11,12,13) 모두에서 치아 줄기 세포와 전구 세포를 유지합니다. 특히, 치아 상피 줄기 세포는 순 경부 루프라고도 하는 정점 새싹으로 알려진 상피의 구근 끝에서 유지됩니다(그림 1C). 장 상피 및 표피와 유사하게, 앞니의 상피 재생은 주로 자궁 경부 고리의 안쪽 부분에 있는 줄기 세포와 통과 증폭 세포(transit-amplifying cells)라고 불리는 고도로 증식하는 중간 자손(14,15,16,17)에 의해 주로 지원됩니다. 그러나 앞니 상피가 재생 중에 정지된 줄기세포를 포함하고 활용하는지 여부는 아직 결정되지 않았습니다. 대조적으로, 활성 및 정지 치아 중간엽 줄기 세포는 모두 정점 치수에서 확인되었으며, 정지 줄기 세포는 부상 복구 동안 활성화되는 예비 개체군으로 기능합니다13,18.
생쥐 앞니 재생 및 재생의 생물학에 대한 많은 발견은 뚜렷한 시간적 접합점에서 샘플을 획득하고 고정, 처리 한 다음 특정 평면을 따라 미크론 두께의 조각으로 절단하는 조직 학적 조사의 결과입니다. 계통 추적 또는 유전적 교란을 가능하게 하는 다양한 마우스 모델의 조직학적 단면에 대한 상세한 분석을 통해 과학자들은 서로 다른 전구 세포 집단의 세포 계통뿐만 아니라 앞니 항상성 및 손상 복구를 제어하는 유전 및 신호 전달 경로를 확인했습니다 19,20,21. 그러나 단면에서 중요하지 않은 세포의 정적 2차원(2D) 이미지는 세포 형태 변화, 움직임 및 세포 동역학과 같은 생체 조직의 세포 행동 및 공간 조직의 전체 스펙트럼을 캡처할 수 없습니다. 조직 절편을 통해 해결할 수 없는 시간 척도에서 발생하는 이러한 급격한 세포 변화를 검출하고 측정하려면 다른 전략이 필요합니다. 또한 이러한 정보를 획득하는 것은 치과 세포가 서로 상호 작용하고, 다양한 신호 자극에 반응하고, 조직 구조와 기능을 유지하기 위해 스스로 조직화하는 방법을 이해하는 데에도 중요합니다.
3차원과 시간적 해상도를 통합하는 기술인 이광자 현미경22를 사용한 4차원(4D) 심부 조직 이미징의 출현은 배양된 조직 외식, 오가노이드 또는 심지어 제자리 조직의 시공간 검사를 가능하게 함으로써 조직학적 분석의 본질적인 한계를 극복합니다 23,24,25,26 . 예를 들어, 발달하는 치아 상피의 4D 라이브 이미징은 조직 성장, 신호 중추 형성 및 치아 상피 형태 형성을 조정하는 세포 분열 및 이동의 시공간 패턴을 밝혔습니다 27,28,29,30,31,32. 성체 쥐 앞니에서 4D 이미징은 최근 치아 상피 손상 복구 중 세포 거동을 연구하는 데 적용되었습니다. 실시간 이미징을 통해 기저층의 중간층 세포가 기저층에서 아멜로아세포로 직접 전환되어 손상된 상피를 재생할 수 있으며, 이는 상피 손상 복구의 전통적인 패러다임에 도전하는 것으로 나타났다15.
여기에서는 순 경추 루프의 상피 세포에 초점을 맞춘 성체 쥐 앞니의 해부, 배양 및 이미징에 대해 설명합니다(그림 1). 이 기술은 12시간 이상 치아 세포의 활력을 보존하고 단일 세포 분해능에서 형광 표지된 세포를 실시간으로 추적할 수 있습니다. 이 접근법을 통해 정상적인 배양 조건 또는 유전적, 물리적, 화학적 섭동에 대한 반응에서 세포 형태 및 분열 방향의 동적 변화뿐만 아니라 세포 운동 및 이동을 조사할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
살아있는 조직 이미징은 세포가 틈새 환경에서 유지될 때 세포의 역동적인 과정과 행동을 연구할 수 있게 해주는 중요한 기술이다41. 이상적으로, 라이브 이미징은 높은 시공간 해상도로 생체 내에서 수행됩니다. 그러나, 포유류 장기에 대한 생체내 이미징은 조직 접근의 불가능성, 광학적 불투명도, 그리고 장기간 동안 동물 또는 장기를 고정시키는 것의 어려움으?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 이광자 현미경을 제공한 캘리포니아 나노시스템 연구소(RRID:SCR_022789)의 UCLA Advanced Light Microscopy/Spectroscopy Laboratory 및 Leica Microsystems Center of Excellence를 인정합니다. AS는 이스라엘 과학 재단(Israel Science Foundation)의 ISF 604-21의 지원을 받았습니다. JH는 NIH/NIDCR의 R03DE030205 및 R01DE030471의 지원을 받았습니다. AS와 JH는 또한 미국-이스라엘 양국 과학 재단(BSF)의 보조금 2021007 지원을 받았습니다.
Materials
| 24 well, flat bottom tissue culture plate | Olympus plastics | 25-107 | |
| 25x HC IRAPO motCORR water dipping objective | Leica | 11507704 | |
| Ascorbic acid (Vitamin C) | Acros Organics | 352685000 | |
| D-(+)-Glucose bioxtra | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Delta T system | Bioptechs | 0420-4 | Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup |
| Dissection microscope- LEICA S9E | Leica | LED300 SLI | |
| DMEM/F12 | Thermo Scientific | 11039047 | Basal media without phenol red |
| Feather surgical blade (#15) | Feather | 72044-15 | |
| Fine forceps | F.S.T | 11252-23 | |
| Glutamax | Thermo Scientific | 35050-061 | Glutamine substitute |
| Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective | Leica | n/a | |
| low-melting agarose | NuSieve | 50080 | |
| non-essential amino acids (100x) | Thermo Scientific | 11140-050 | |
| penicillin–streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Petri dish | Gen Clone | 32-107G | 90 mm |
| Rat serum | Valley Biomedical | AS3061SC | Processed for live imaging |
| Razor blade #9 | VWR | 55411-050 | |
| Scalpel handle | F.S.T | 10003-12 | |
| Scissors | F.S.T | 37133 | |
| serrated forceps | F.S.T | 11000-13 | |
| spring scissors | F.S.T | 91500-09 |
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