处理火炬松PtGen2差异表达基因的cDNA微阵列

该视频由佐治亚大学沃内尔林业与自然资源学院的研究人员制作。本培训视频的目的是详细介绍如何处理我们的 LOB 棒棒糖松 pt，第二代 CDNA 微阵列芯片，特别注意杂交前后阵列的洗涤和处理。一般来说，我们的实验步骤遵循基因组研究所 Tiger 和范德比尔特微阵列共享资源设施 （VMSR） 开发的实验步骤，我们的芯片就是在那里打印的。

我们发现，需要对 PT Gen 2 进行更严格的处理，才能在信号质量的均匀性和低背景方面提供最大的一致性。第一步是预洗。我们这样做是因为我们的去样缓冲液含有非常高的盐含量，并且这种预洗对于去除该盐是必要的。

将载玻片置于显微镜载玻片架中，并在已预热至 43 度的 0.2% SDS 溶液中剧烈浸入 15 至 20 次。在 SDS 溶液中洗涤载玻片后，用镊子小心地将其取出到含有预杂交缓冲液的 Copeland 染色缸中。该缓冲液含有 5 个 XSSC 0.1%SDS 和 1% BSA，并在 43 度下加热。

谷轮罐盖上香水，放入 43 度的培养箱中 1 小时。预杂交后，将载玻片移至显微镜载玻片架上，并通过去离子水的 5 次更换连续处理，每次更换 15 至 20 次。最后，将玻片置于异丙醇中并浸渍 5 或 6 次，然后在 chip M mate 离心机中离心至干。

离心后，用通过 0.2 微米过滤器的压缩空气吹扫玻片。然后将载玻片覆盖在升降片上，这些衬片也已用压缩空气清洁，我们使用一个小移液器吸头将升降衬套调整到正确的位置。在幻灯片上。

在定位升降片之后，但在添加杂交缓冲液之前，我们将 20 微升 100 毫摩尔 dihi，3 atol 添加到位于腔室末端的湿度井中。现在我们准备添加目标 CDNA，这些 CDNA 已重悬于杂交缓冲液中。将移液器吸头放置在升降滑片和载玻片的边缘，缓慢移液溶液。

我们发现，利用毛细管效应来加载阵列可提供最大的一致性，并大大减少任何不需要的气泡的掺入。将目标材料添加到阵列中后，组装杂交室并用铝箔覆盖。然后将杂交室置于振荡水浴中过夜孵育，通常为 14 至 16 小时。

水浴设置为 48 度，摇床设置为 50 rpm。还需要注意的是，从添加杂交溶液到所有杂交后洗涤，这些程序都在弱光下进行，以防止光氧化。第二天，将载玻片从杂交室中取出，并置于装有 1 号洗涤液的 Copeland 染色缸中，该清洗液已预热至 53 度。

让载玻片在 Copeland 染色缸中停留约一分钟，直到升降器滑脱，此时用镊子轻轻取出载玻片并放入显微镜载玻片架中以进行洗涤。然后将载玻片在第二个容器中用力浸入约 15 至 20 次，该容器也含有 53 度的 1 号洗涤液。然后将容器涂上香水，并置于设置为 53 度和 100 RPM 的培养箱空气振荡器中。

孵育和洗涤溶液 1 分钟后，将载玻片用力浸入装有 2 号洗涤液的容器中 15 至 20 次，该容器在室温下为容器。用封口膜覆盖，并在室温下再次放在摇床上孵育 10 分钟。最后，将玻片从 2 号洗涤液中取出，并用力浸入装有 3 号洗涤液的容器中 15 至 20 次。

然后将玻片取出到第二个装有 3 号洗涤液的容器中，用 perfil 覆盖，再次放在摇床上 10 分钟。最后一次洗涤后，我们将载玻片离心至完全干燥。为此，我们将 15 mil 的 Falcon 帽放入 50 mil 锥形管中，然后将阵列条形码的一面朝下放入锥形管中。

然后在室温下以 1500 RPM 的转速在摆动桶头中旋转试管。离心后，将载玻片移至第二组 50 mil 锥形管中，该锥形管已用铝箔覆盖。然后用氮气吹扫试管，氮气通过 0.22 微米过滤器和盖子过滤，以便运输或储存，直到扫描。

我们在 PerkinElmer 扫描阵列 5， 000 上收集扫描数据。对阵列图像进行网格化，处理原始扫描数据，并使用 bio discovery 的成像软件套件完成初始数据分析。接下来，使用 BRB 阵列工具进行统计分析时，对斑点信号强度数据进行归一化，BRB 阵列工具是一个强大且免费提供的微阵列统计包，可从美国国家癌症研究所下载。

其他统计分析和基因表达模式搜索使用基因表达模式和分析套件 Jeep PPA 进行。另一个免费提供的基于 Web 的分析包。感谢您观看我们关于如何处理 lob lolly pine PT Gen two 微阵列芯片的视频。

以下人员负责此培训视频的内容和制作。