利用脂质介相结晶膜蛋白以进行结构测定

您好，欢迎来到膜结构与功能生物学研究组。我叫 Martin Caffery。我们研究的重点是生物膜，其示意图如第一张幻灯片所示。生物膜包裹着细胞以及（存在的）亚细胞器，是一种分子级纤薄的结构，仅两个脂质分子厚度，并镶嵌有蛋白质。

我们关注脂质和蛋白质的结构与功能。然而，针对本系列 JoVE 视频，我将重点局限于膜蛋白。我们希望从分子层面理解这些膜蛋白的功能，原因有二。

首先，了解事物的运作机制能带来智力上的满足感。其次，正如对待自行车或汽车一样，了解其工作原理后，一旦出现故障，便有可能对其进行修复。药物设计正是这类研究工作的直接成果。

我们研究膜蛋白在分子水平上如何发挥作用的方法是确定其晶体结构。这包括确定构成该蛋白的所有原子，或至少所有非氢原子在三维空间中的位置。我们用于此目的的方法称为大分子X射线晶体学，简称MX。

在此我们看到一个膜蛋白的例子，其结构是通过微晶X射线晶体学（MX）测定的。进行MX分析需要获得该蛋白质的高质量微小晶体。正如您所想象的，利用大分子晶体学进行结构解析涉及多个步骤，如图所示。通常包括确定膜蛋白靶标，随后对其进行表达、纯化和结晶。

使用实验室X射线源或同步辐射X射线源对晶体进行衍射测量。对衍射数据进行处理，得到电子密度图，然后将其与分子模型进行拟合。经过优化的模型可用于研究蛋白质的作用机制以及基于结构的药物设计。

本文的重点是向您展示我们如何利用脂质介相，通过所谓的“介相内法”（in meso method）获得高质量的膜蛋白晶体。关于该方法及其应用范围的最新综述见参考文献一。本文所遵循的逐步操作方案已在参考文献中描述，此处展示了一个流程图，概括了建立一次介相内膜蛋白结晶实验所需的步骤及相应时间。

本视频涵盖由红色虚线框出的步骤。此处展示了以手动模式进行meso结晶所需的物品。它们包括高浓度的纯化膜蛋白溶液和用于形成承载mesophase的脂质，通常使用单油酸（mono ole）以使脂质更明显。

在本视频中，已使用红色染料沉淀溶液、纯水管道处理装置、一次性吸头，以及一系列气密型哈密尔顿注射器（部分带可拆卸针头）、用于混合蛋白溶液与脂质以制备微晶的窄孔连接器。此外还包括哈密尔顿重复加样器、玻璃显微镜载玻片和盖玻片，理想情况下还应备有硅化处理的带孔双面胶间隔胶带，用于构建反应孔的镊子、碎冰、纸巾、计算器，以及最为重要的实验记录本。

以下步骤用于制备玻璃三明治式结晶板。在加样时，将硅化显微镜载玻片放置于实验台面上。移除一段带孔双面胶带其中一面的保护纸盖。

将胶带有粘性的一面朝下，与载玻片表面接触，用手指按压使胶带与载玻片贴合密封。使用压延机或滚轮时，可在胶带与滚轮之间放置铝箔以保护孔板底部。

移除胶带上的第二层纸覆盖物，以暴露其上表面的粘性区域。该步骤可制备出可用于加样并立即进行后续封片的玻片。将单个硅化盖玻片紧密放置于玻片附近，以便快速高效地完成各孔的封片。

将脂质置于45摄氏度的温控金属块中加热三分钟，使其熔化。注意，所用脂质通常为单油酸甘油酯（mono land）。在本视频中，脂质中添加了红色染料，以便在熔化过程中更易观察。

准备两支100微升气密型Hamilton注射器，用于脂质与蛋白质混合步骤；将用于盛装蛋白质溶液的注射器中的聚四氟乙烯衬垫油去除。将用于盛装脂质的注射器放置在其旁边。本步骤中，脂质注射器的聚四氟乙烯衬垫保持原位。

将窄孔连接器置于两个注射器之间，然后将连接器连接到脂质注射器的指环上。拧紧连接器与注射器，但不要过度拧紧。从脂质注射器筒中取出活塞。

确保脂质处于熔融状态。将移液器调至 30 微升，缓慢吸取 30 微升熔融的脂质帽。脂质小瓶。

脂质应在氮气或氩气环境中，于负80摄氏度条件下保存。将熔融的脂质缓慢注入注射器的开口端，注意避免产生气泡。

将活塞插入筒内，使其接触熔融的豹脂，并在注射器保持垂直的情况下缓慢向上推动活塞。如图所示，过程中不慎截留的气泡随之上浮并被排出。此时筒内已形成一段熔融脂质栓塞，您必须准确测定其体积。

可通过读取注射器筒身上的刻度来完成。本例中，体积为 23 µL，在实验记录本中记录该数值。将毛皮滑至从耦合器伸出的针头上。

使用活塞将熔融的脂质向上推入筒内，并缓慢轻柔地注入连接器核心处的针头中。若针头略微过满，可在其开口端观察到脂质向外搏动。通过稍微回撤活塞，可将多余的脂质抽回连接器内，直至脂质液面恰好与连接器针头尖端齐平。

此时，注射器连接装置已完全装填，可与蛋白质注射器组合使用。溶液应在 4 摄氏度条件下，于 14,000 G 离心 10 分钟，离心时间为 5 至 10 分钟，以去除大分子聚集体。在设置结晶试验前，将蛋白质溶液从冰桶中取出，并在室温下平衡。

计算用于在约20摄氏度下形成立方相且达到或接近完全水合状态所需的蛋白质溶液体积。根据相图，完全水合时水的质量百分比接近40%。请记住，我们已在脂质注射器中装入密度为0.94毫克每微升的23毫克单油酸甘油酯。

这相当于21.6毫克脂质，因此需要21.6乘以4再除以6，即14.4毫克或14.4微升的蛋白溶液。使用25或50微升的Hamilton注射器吸取所需体积的蛋白溶液，将溶液转移至蛋白溶液筒内活塞的聚四氟乙烯（Teflon）尖端上。注意避免产生气泡，小心地抽出针头，并测量注射器中蛋白溶液的体积，该体积应与前一步骤中计算出的数值一致。

在准备与含脂质的注射器合并之前，小心地将蛋白质溶液缓慢推至注射器筒末端，使其与开口端齐平。可通过从注射器筒末端向下观察来确认该位置。

脂蛋白溶液装入注射器后，现在可将注射器连接起来，为制备脂质体做准备。为此，请将装有蛋白的注射器拧入连接器的开口端，该连接器已连接至装有脂质的注射器。通过连接器将两个注射器结合后，应形成一个连续的液体通路，从一个注射器中的脂质，经连接器，到达另一个注射器中的蛋白溶液。

在准备混合时，用一只手握住组装好的装置，右手持一支注射器，左手持另一支。通过双手的指头和拇指对两个筒体施加扭矩，传递至耦合器，确保密封部位与耦合器内的凹槽紧密贴合，避免因过度拧紧而导致密封失效。在此阶段，若组装的混合装置未正确操作，会损坏ALS结构，而拧紧不足同样会导致泄漏。

这是一个需要通过反复尝试、不断摸索并可能偶尔损失样品才能掌握的过程。因此，在使用宝贵的蛋白质溶液进行混合操作之前，建议先用脂质和水或缓冲溶液进行练习，以熟悉系统的操作。开始时，用拇指或食指推动组装好的混合装置中蛋白质一侧的推杆至极限位置，使蛋白质溶液从蛋白质注射器经由连接器进入脂质注射器。如果装置已有效密封，此操作将导致脂质侧推杆产生相等且相反方向的运动。

现在使用脂质侧的推杆将脂质注射器中的内容物重新推过混合器并进入蛋白质注射器。此过程需重复多次，有时需要进行一百次以上的循环，才能形成均匀的混浊相。

在开始混合时，物料通过连接器来回移动可能不均匀，有时需要额外施力才能实现混合。这是正常现象。初始混合过程中通常会伴随样品出现不均匀的浑浊，这也属于正常情况。

随着均质化的进行，推动活塞来回所需的力所感知到的质地逐渐变得更为均匀，并呈现出黏稠立方相的特征，同时析出的立方相在外观上也表现出相应特性。若条件适宜且形成了立方相，分散液在注射器筒内应呈现光学透明状态。

因此，注射器筒身上的刻度应能通过筒内的中间相清晰可见。对于有色蛋白质，中间相会呈现蛋白质的颜色，但仍具有光学透明性。在混合过程中，将注射器混合器短暂置于冰上进行轻微冷却，可加速均质化并促进透明状态的形成。

然而，需要注意的是，不要过度涡旋样品，应避免剧烈混合，因为这可能导致样品因摩擦生热而温度升高。此时，立方相已经形成，蛋白质已重组进入脂质双分子层中。该立方相现已准备好可分装至结晶板的各个孔中。

首先，需将中间相转移至安装在重复分配器上的10微升Hamilton注射器中。开始此操作时，先将注射器与分配器细管连接。用立方相样品装填注射器。

将针头和活塞从注射器上取下，特氟龙阀保持原位。借助一枚小硬币，将固定螺母从分配器上卸下。

将棘轮臂完全缩回。将不带活塞和针头的注射器穿过分配器的固定环。将固定结垫圈侧朝向注射器，重新装回并拧紧于注射器的开口端。

应注意确保注射器正确地位于固定环中央，且筒身与棘轮臂平行。这两个要求可通过目测判断。这两点非常重要，因为如果推杆不能自由移动，加样过程中会在源注射器内产生压力积聚，可能导致泄漏。将推杆穿过夹持环，在夹紧螺母已旋松数圈的情况下，将推杆引导至注射器的开口端。

按下棘轮臂，将柱塞完全推入筒体内，检查其是否能在筒体内自由移动并贯穿全程。如果螺钉和导轨已松动，请重新拧紧，然后再次检查柱塞是否能自由移动。此时，分配式注射器已准备就绪，可以进行装载。

将组装好的混合装置一侧的活塞推至零微升刻度线处。将中间相转移至另一注射器和连接器中。将空注射器连同其UL部件从混合装置上拆下，并立即连接装有样品且已安装连接器的注射器至10微升分配注射器的螺纹末端。

耦合的紧密程度至关重要。如前所述，通过按压100微升注射器的推杆使中间相经由耦合器转移，从而完成分配注射器的装样。如果耦合紧密，并且分配注射器的推杆可自由移动，则随着分配注射器被填充，其推杆应开始沿装样推杆运动方向移动。

取下与连接器相连的上样注射器，将其与分配注射器分离。将一根短的平头针固定到分配注射器的金属末端，并小心拧紧。通过拧紧夹持环中的结，将柱塞夹紧在棘轮臂上。

应注意不要过度拧紧结，因为这可能会划伤并损坏推杆，使其无法使用。在夹紧状态下，棘轮臂的行程范围应限制在不超过一英寸。

如上所述，若不进行此操作，推杆容易发生弯曲，导致给药失败。将棘轮鼓轮反复按压数次，使推杆在筒体内前进，从而填满针头的空隙体积并对针头进行装样。此步骤应重复多达10次，直至针尖持续流出均一相（mesa相）的连续细流。

此时针头已准备好用于建立结晶实验，应立即开始操作。不建议在建立结晶实验前将装载了蛋白质的立方相保存过长时间。由于某些蛋白质在未添加沉淀剂的情况下于立方相中不稳定，可将多孔结晶板和盖玻片放置在略高于实验台几英寸的表面上，以便于加样操作。

当表面略呈深色时，可获得最佳对比度和增强的可见性。将沉淀剂溶液混匀后打开瓶盖。用一只手垂直持握分配注射器，将沉淀剂分配移液器设定为一微升，另一只手将针尖置于井底正上方中央位置。

第一步：按下重复分配器上的按钮，将一滴体积为 200 纳升的试样排到玻璃表面。

当使用标准重复分配器与10微升注射器时，针尖应位于孔底上方不超过几百微米处，以确保准确且可重复的加样。这只需稍加练习即可轻松实现。在四个相邻孔中加入微滴后，将一微升沉淀剂溶液加至每个微滴的上方。

尽快使用每孔2微升以及标准的一次性吸头，将盖玻片平整地覆盖在已加样孔上，确保均匀覆盖，以形成防水密封。使用刮刀对盖玻片施加压力，使其与间隔胶带暴露的粘性表面充分接触。该试剂与沉淀剂的加样过程可重复进行，直至板上所有孔均完成加样并密封。

平板现已准备好进行观察和孵育。为便于追踪，需清晰标记平板。对光敏感的蛋白质通常需要在放入孵育箱前用铝箔纸包裹平板。

可在光线较暗或适当颜色的光线下，将这些样品取下并在显微镜下观察。将培养板置于温度可控的培养箱中，通常温度设置为20摄氏度左右，并定期检查。使用偏振光显微镜，以10倍或20倍物镜观察器壁上的晶体生长情况。

目的，作者实验室采用的时间表如下：接种后第0、1、2、3、5、7、14、21、30天。仔细检查食糜团块。在140微米厚的样品内调节焦深。

检查应在自然光下以及交叉偏振器之间进行。在自然光下观察时，立方相中生长的无色膜蛋白晶体呈现此形态。在偏振光下观察时，介相中生长的无色膜蛋白晶体呈现此种或此类形态；在自然光下观察时，天然有色的膜蛋白在介相中生长则呈现此种或此类形态。

结构测定整体过程的后续步骤包括收集晶体并进行低温冷冻，以及记录和处理晶体的X射线衍射数据。这些主题在本系列的其他JoVE文章中有专门介绍。