Name: 使用油脂介孔结构的测定结晶膜蛋白 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-21T17:00:00.000+00:00
Duration: 22 min
Description: 学习使用脂质介晶相法进行膜蛋白结晶实验的完整操作流程。本方法通过精确控制温度与混合条件，帮助研究人员获得高质量膜蛋白晶体，用于结构生物学研究和药物设计。

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许多人为本工作做出了贡献，其中大部分来自Caffrey膜结构与功能生物学研究组的历任及现任成员。我们向所有参与者致以最诚挚的感谢与敬意。本工作部分得到了爱尔兰科学基金会（07/IN.1/B1836）、美国国立卫生研究院（GM75915）以及利默里克大学的资助。

结构生物学与功能生物学领域的一个重要研究对象是生物膜（图1）。生物膜存在于细胞及细胞内细胞器的周围，是一种分子级薄层结构，厚度仅为两个脂质分子，并镶嵌有多种蛋白质。脂质和蛋白质的结构与功能均是研究关注的重点。然而，本文的重点仅限于膜蛋白。
深入了解膜蛋白在分子水平上的功能机制出于两个原因。首先，了解其作用机制本身具有重要的科学意义。其次，通过了解蛋白质的工作原理，一旦其功能失常，就有可能对其进行修复，或针对特定应用对其进行改进甚至改造。这类研究工作的一个直接应用便是药物设计。在分子水平上阐明膜蛋白功能机制的一种方法是测定其结构，即确定构成该蛋白质的所有原子（或至少所有非氢原子）在三维空间中的位置。我们采用的方法是大分子X射线晶体学（MX）。图2展示了一个通过MX方法测定结构的膜蛋白实例。进行MX研究需要获得具有衍射质量的蛋白质晶体。
显然，使用大分子晶体学进行结构测定涉及多个步骤，如图3所示。这些步骤通常包括确定膜蛋白靶标，随后对其进行表达、纯化和结晶。利用实验室X射线源或同步辐射X射线源对晶体进行衍射测量。对衍射数据进行处理，得到电子密度图，并将其与分子模型进行拟合。经过优化的模型可用于研究蛋白质的作用机制以及基于结构的药物设计。
本文的重点是展示如何利用脂质介相（lipidic mesophases）通过所谓的 在中间相中 方法。关于该方法及其应用范围的最新综述见参考文献1（Caffrey, 2009）。本实验所遵循的逐步操作方案详见参考文献2（Caffrey和Cherezov, 2009）。
图4展示了建立膜蛋白in meso结晶实验所需步骤及时间的流程图。本文涵盖由红色虚线框出的步骤。
第1部分：结晶板的制备
<ol>
 <li>将一块硅化显微镜载玻片放置在工作台上。</li>
 <li>从一段带穿孔的双面胶间隔胶带（可商业购得，参见下文“特定试剂与设备表”）的一侧揭去保护纸。</li>
 <li>将胶带粘性面向下，贴附在载玻片表面。</li>
 <li>使用压辊或滚轮对胶带与载玻片进行加压密封。可在胶带与滚轮之间放置铝箔以保护孔底。</li>
 <li>揭去胶带另一侧的第二层保护纸，暴露出上表面的粘性区域。</li>
 <li>将单个硅化盖玻片放置在靠近板位的位置，以便在加样完成后快速高效地完成孔的封合。</li>
</ol>
第2部分：准备脂质注射器
<ol>
 <li>将脂质（通常为单油精）置于45 °C的温控金属块中加热3分钟，使其熔化。</li>
 <li>在脂质熔化的同时，准备两支100-μL耐压气密式Hamilton注射器，用于后续的脂质-蛋白混合步骤。取下将要盛装蛋白溶液的注射器中的聚四氟乙烯（Teflon）垫圈。将用于盛装脂质的注射器并排放置（保留其垫圈）。</li>
 <li>将连接器（参见下方“试剂与设备清单”及参考文献3（Cheng et al., 1998））连接至脂质注射器。用手拧紧连接器与注射器，但切勿过度拧紧。将脂质注射器的推杆从针筒中取出。</li>
 <li>注意：必须在脂质完全熔化后方可继续操作。将移液器调至30 μL，缓慢吸取约30 μL熔融脂质。然后缓慢将尽可能多的熔融脂质注入注射器的开口端，注意避免引入气泡。</li>
 <li>将推杆插入针筒，使其接触熔融脂质，并将注射器垂直持握，如视频所示，缓慢推动推杆沿针筒向上移动。在此过程中，可能意外夹带的气泡应会逐渐上浮并排出。</li>
 <li>通过观察注射器针筒上的刻度，仔细确定注射器中脂质的体积。</li>
 <li>将垫圈套在从连接器伸出的针头上。使用推杆推动熔融脂质沿针筒上升，并缓慢轻柔地压入连接器中心的针头内。</li>
</ol>
第3部分：准备蛋白注射器
<ol>
 <li>在设置结晶实验之前，应将蛋白质溶液在 4 °C 条件下以 14,000 g 离心 5 至 10 分钟，以去除大分子聚集体。从冰上取出蛋白质溶液，并使其在室温下平衡。</li>
 <li>计算用于形成立方相的蛋白质溶液体积，使其达到或接近完全水合状态。对于 20 °C 下的单油酸甘油酯，如相图5（图 5）所示，水完全水合时的含水量接近 40 %（质量比）。</li>
 <li>使用 25 或 50 μL Hamilton 注射器吸取所需体积的蛋白质溶液。将溶液转移至蛋白质注射器筒内柱塞的聚四氟乙烯（Teflon）尖端，注意避免产生气泡。</li>
 <li>小心回抽针头，并测量注射器内蛋白质溶液的体积，应与前一步骤中加入的体积一致。</li>
 <li>缓慢推动蛋白质溶液沿筒壁向上移动，使其末端与筒体开口端齐平。</li>
 <li>将蛋白质注射器旋入连接于脂质注射器的接头开口端。此步骤中切勿过度拧紧装置。若在此阶段过度拧紧混合装置，会损坏卡套并导致泄漏；拧紧不足也会引起泄漏。</li>
</ol>
第4部分：混合蛋白质溶液与脂质：制备中间相
<ol>
 <li>为实现混合，用拇指或食指推动组装好的混合装置中蛋白侧的推杆至极限位置，使蛋白溶液从蛋白注射器中排出，经过连接器进入脂质注射器。</li>
 <li>随后使用脂质侧的推杆，将脂质注射器中的内容物通过连接器推回蛋白注射器中。</li>
 <li>此过程需重复多次；有时需要进行一百次以上的往复操作才能形成均匀的中间相。在混合初期，物料通过连接器的往复运动可能不均匀，有时需要施加额外的力以促进混合。初始混合阶段通常伴随样品中出现不均匀的浑浊现象。随着均质化的进行，样品质地逐渐变得均匀，并呈现出黏稠立方相特有的外观特征，即形成典型的立方中间相。</li>
 <li>若条件适宜且形成了立方相，分散体系在注射器筒内应呈现光学透明状态。因此，应能清晰地透过筒内的中间相读取注射器筒壁上的刻度标记。</li>
 <li>在混合过程中，将注射器混合装置短暂置于冰上进行轻微冷却，可加速均质化并促进透明性的获得。但需注意避免过度冷却样品。</li>
 <li>应避免过于剧烈的混合操作，因为这可能导致因摩擦生热而引起样品温度升高3。</li>
</ol>
第5部分：装载分配器
<ol>
 <li>从10-μL Hamilton注射器上取下针头和推杆。保留聚四氟乙烯（Teflon）卡环在原位。</li>
 <li>使用小硬币辅助，从分配器上取下固定螺母。</li>
 <li>将棘轮臂完全缩回，然后将注射器（不带推杆和针头）穿过分配器的固定环。</li>
 <li>将固定螺母重新装上，垫圈面朝向注射器，并将其拧紧在注射器的开口端。 
 应注意确保注射器在固定环中居中，且筒体与棘轮臂平行。这两点可通过目测判断。满足这两个条件对防止泄漏至关重要。</li>
 <li>将推杆穿过夹持环（夹紧螺母先松开几圈），引导推杆进入注射器的开口端。将棘轮臂完全压下。推动推杆进入筒体，检查其在筒体内是否能自由且直线移动。可适当松开导杆上的螺丝以帮助推杆顺畅移动。务必确保推杆移动自如。将推杆压下，直至其聚四氟乙烯（Teflon）尖端与筒体上的0 μL刻度线对齐。如果导杆上的螺丝曾被松开，请重新拧紧并再次检查推杆是否仍能自由移动。</li>
 <li>将组装好的混合单元一侧的推杆移至0 μL刻度线，以将中间相转移至另一支注射器和连接器中。</li>
 <li>将空注射器（保留其卡环）从混合单元上断开，并立即把已装样且连接有连接器的注射器接到10-μL分配注射器的螺纹端。连接时的紧固程度至关重要，如前所述。</li>
 <li>通过按压100-μL注射器的推杆，使中间相经由连接器转移，从而完成分配注射器的装样。</li>
 <li>将一根短的平头针头固定在分配注射器的钢制末端，并小心拧紧。</li>
 <li>通过拧紧夹持环中的螺母，将推杆固定在棘轮臂上。应注意不要过度拧紧螺母，否则可能划伤或变形推杆，导致其无法使用。在夹紧状态下，棘轮臂的行程范围应限制在不超过一英寸，如视频中所示。超过此范围，推杆容易发生弯曲，导致给液失败。</li>
 <li>多次按压棘轮鼓轮，使推杆在筒体内前进，从而填满针头的空体积并完成针头装样。此步骤应重复（最多十次），直至有连续的中间相液丝从针头尖端流出。</li>
 <li>应立即开始结晶试验，因为某些蛋白质在无添加沉淀剂的立方相中不稳定。</li>
</ol>
第6部分：设置结晶板
<ol>
 <li>将多孔结晶板和盖玻片放置在高于工作台几英寸的平面上，以便于加样。当表面略呈深色时，可获得最佳对比度和增强的可见性。</li>
 <li>混匀沉淀剂溶液并打开瓶盖。将分配移液器设定为 1 μL。</li>
 <li>一手垂直持握分配用注射器，另一手将针尖置于第1号孔底部正上方中央位置。按下重复分配器上的按钮，将一段200 nL的中间相（mesophase）释放到玻璃表面（使用标准重复分配器配合10 μL注射器时）。针尖距孔底不得超过数百微米，以确保准确递送。</li>
 <li>在相邻的4个孔中完成中间相加样后，使用2 μL移液器和标准一次性吸头，在每个中间相液滴上方加入1 μL沉淀剂溶液。</li>
 <li>尽快将盖玻片准确地覆盖在已加样孔上，确保均匀密封。为实现防水密封，使用刮刀对盖玻片与间隔胶带暴露粘性表面接触的区域施加压力。</li>
 <li>可重复进行中间相和沉淀剂的分配过程，直至板上所有孔均完成加样并密封。</li>
 <li>清晰标记板以用于追踪。对光敏感的蛋白质通常在放入孵育室前用铝箔包裹板体。</li>
 <li>将板置于温度可控的孵育室中，通常设为 20 °C。</li>
 <li>按照固定时间表，使用配备10倍或20倍物镜的偏光显微镜定期检查孔内晶体生长情况。作者实验室采用的时间表如下：设置后的第0、1、2、3、5、7、14、21、30和60天。仔细检查中间相液滴，在0.14 mm厚的样品内调节焦深。观察应在普通光和交叉偏振光下分别进行。</li>
</ol>
第7部分：代表性结果
所得晶体的外观会因膜蛋白本身的颜色、观察时光源的偏振状态（或无偏振）以及照明方式和照明质量的不同而有所差异。图6展示了多种可能的晶体外观。in meso 条件下生长的天然有色膜蛋白在普通光下观察时，可能呈现如图6（b和d面板）所示的形态。在立方相中生长且在普通光下观察的无色膜蛋白晶体，可能呈现如图6（e面板）所示的形态。最后，在in meso 条件下生长且在偏振光下观察的无色膜蛋白晶体，可能呈现如图6（a和c面板）所示的形态。
结构解析整体流程的后续步骤包括收集晶体并进行低温冷冻，以及记录和分析晶体的X射线衍射数据。这些主题将在其他 JoVE 文章中分别介绍。
<img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig1.jpg" alt="显示细胞膜组成的脂质双分子层结构示意图，包含蛋白质和碳水化合物。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
 图 1. 生物膜的示意图，显示嵌入其中并分布于其上的脂质双分子层及多种蛋白质。
<img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig2.jpg" alt="蛋白质-配体相互作用，分子模型，可视化，结构分析，生物化学研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
 图 2. 本 JoVE 文章中所介绍的采用 in meso 方法生长晶体并利用 MX 解析出的维生素 B12 转运蛋白 BtuB 的结构6。
<img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig3.jpg" alt="结构-功能循环图；蛋白质纯化、结晶、药物作用机制。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
 图 3. 结构-功能循环展示了获取和利用蛋白质完整结构信息所涉及的多个步骤。
<img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig4.jpg" alt="结晶流程图；蛋白质-脂质中间相制备；实验设置。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
 图4. 该流程图总结了通过in meso方法生产膜蛋白晶体所涉及的步骤。本JoVE文章仅涵盖由红色虚线框出的步骤。引自参考文献2。
<img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig5.jpg" alt="单油酸甘油酯-水相图、脂质-蛋白质溶液、温度-组成关系图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
 图 5. 脂质（单油酸甘油酯）/水体系的简化温度-组成相图。结晶实验在 20 °C 下进行，此时脂质在 40% 水合度下达到水饱和。详细相图见参考文献 5。
<img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig6.jpg" alt="晶体显微镜；多样的晶体形态；显微图像；比例尺；材料分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 
 图6. 膜蛋白在脂质介相中生长的晶体。 
 (a) 维生素B12转运蛋白BtuB6，(b) 光捕获复合物II7，(c) 黏附/侵袭蛋白OpcA8，(d) 细菌视紫红质9，(e) 来自假单胞菌的一种糖转运蛋白。图像采用普通光（b,d,e）和交叉偏振光（a,c）拍摄。

<ol><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination.+Use+of+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins for structure determination. Use of lipidic mesophases.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).</li>
<li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallising+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Crystallising membrane proteins in lipidic mesophases.</a> Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).</li>
<li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lipids%22%5BJournal%5D)">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast%2C+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li>
<li>Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phase+diagram+of+the+monoolein%2Fwater+system%3A+metastability+and+equilibrium+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects.</a> Biomaterials. 21, 223-234 (2000).</li>
<li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+meso+structure+of+the+cobalamin+transporter%2C+BtuB%2C+at+1.95+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In meso structure of the cobalamin transporter, BtuB, at 1.95 A resolution.</a> J. Mol. Biol. 364, 716-734 (2006).</li>
<li>Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M. Z., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room+to+move%3A+crystallizing+membrane+proteins+in+swollen+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases.</a> J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).</li>
<li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+meso+crystal+structure+and+docking+simulations+suggest+an+alternative+proteoglycan+binding+site+in+the+OpcA+outer+membrane+adhesin%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">In meso crystal structure and docking simulations suggest an alternative proteoglycan binding site in the OpcA outer membrane adhesin.</a> Proteins. 71, 24-34 (2008).</li>
<li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 1795-1807 (2004).</li>
</ol>

立方相是一种精细且动态的环境，其状态会随着多个变量的改变而发生显著变化。in meso 结晶试验的手动操作设置无法涵盖所有可能遇到的问题。然而，在将该技术应用于昂贵的蛋白质溶液之前，通过练习掌握操作技巧，并在混合过程中适度控制注射器施加的压力，可避免许多困难。若操作得当，in meso 方法能够获得多种蛋白质的晶体，且成功结晶的蛋白质种类正在持续增加。 此处所述的in meso结晶实验设置主要针对手动操作模式。在需要大规模筛选结晶条件的情况下，该过程可以（也常常）进行调整，以实现结晶板的自动化设置。

<table><tbody><tr><td>蛋白质溶液</td><td>试剂</td><td>多种</td><td>多种</td><td></td></tr><tr><td>脂质（单油酸甘油酯）</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>多种</td><td></td></tr><tr><td>沉淀剂溶液</td><td>试剂</td><td>多种</td><td>多种</td><td></td></tr><tr><td>纯化水</td><td>试剂</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液设备</td><td>工具</td><td>Pipetman</td><td>多种</td><td></td></tr><tr><td>一次性移液器吸头</td><td>耗材</td><td>Pipetman</td><td>多种</td><td></td></tr><tr><td>气密式注射器</td><td>工具</td><td>Hamilton Co</td><td>80265 (25-&amp;#181;l)</td><td></td></tr><tr><td>注射器针头</td><td>工具</td><td>Hamilton Co</td><td>7770-020 (规格 22)</td><td></td></tr><tr><td>窄孔连接器*</td><td>工具</td><td>Hamilton Co</td><td>多种/EBS-LCP-2</td><td></td></tr><tr><td>重复分配器</td><td>工具</td><td>Hamilton Co</td><td>83700</td><td></td></tr><tr><td>硅化玻璃显微镜载玻片</td><td>耗材</td><td>Gold Seal</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>耗材</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548C</td><td></td></tr><tr><td>带孔双面胶间隔胶带</td><td>耗材</td><td>Saunders Corporation (已打孔)</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>工具</td><td>多种</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>压片辊（滚轮）</td><td>工具</td><td>Fisher Scientific</td><td>50820937</td><td></td></tr><tr><td>碎冰</td><td>温度控制</td><td>N/A</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>纸巾</td><td>耗材</td><td>N/A</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>计算器</td><td>工具</td><td>多种</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>实验记录本</td><td>工具</td><td>多种</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td colspan="5">&lt;p class=&quot;jove_content">* 自行加工窄孔连接器的完整细节见参考文献3。&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

利用脂质介相结晶膜蛋白以进行结构测定

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

本文介绍了一种利用脂质介相结晶膜蛋白的详细实验方案。该方法也被称为脂质立方相法或in meso法。该方法已被证明具有高度的通用性，已成功用于解析原核和真核蛋白、单体蛋白以及同源与异源多聚体蛋白、含发色团与不含发色团蛋白，以及α-螺旋和β-桶状结构蛋白的X射线晶体结构。近年来采用in meso结晶法取得的重要成果包括人源工程化β2-肾上腺素能受体和腺苷A2a G蛋白偶联受体。本文提供了将膜蛋白重组入单油精基介相的方案，以及手动模式下设置结晶实验的操作流程。整个流程中的其他步骤，例如晶体收获，将在后续的视频文章中进行介绍。手动制备载蛋白介相并完成一块结晶板的设置大约需要一小时。

本文描述了Caffrey膜结构与功能生物学研究组采用的手动设置膜蛋白在脂质介相中结晶实验的步骤。

一种利用脂质介相结晶膜蛋白的详细实验方案被描述。该方法曾被称为……

您好，欢迎来到膜结构与功能生物学研究组。我叫 Martin Caffery。我们研究的重点是生物膜，其示意图如第一张幻灯片所示。生物膜包裹着细胞以及（存在的）亚细胞器，是一种分子级纤薄的结构，仅两个脂质分子厚度，并镶嵌有蛋白质。我们关注脂质和蛋白质的结构与功能。然而，针对本系列 JoVE 视频，我将重点局限于膜蛋白。我们希望从分子层面理解这些膜蛋白的功能，原因有二。首先，了解事物的运作机制能带来智力上的满足感。其次，正如对待自行车或汽车一样，了解其工作原理后，一旦出现故障，便有可能对其进行修复。药物设计正是这类研究工作的直接成果。我们研究膜蛋白在分子水平上如何发挥作用的方法是确定其晶体结构。这包括确定构成该蛋白的所有原子，或至少所有非氢原子在三维空间中的位置。我们用于此目的的方法称为大分子X射线晶体学，简称MX。在此我们看到一个膜蛋白的例子，其结构是通过微晶X射线晶体学（MX）测定的。进行MX分析需要获得该蛋白质的高质量微小晶体。正如您所想象的，利用大分子晶体学进行结构解析涉及多个步骤，如图所示。通常包括确定膜蛋白靶标，随后对其进行表达、纯化和结晶。使用实验室X射线源或同步辐射X射线源对晶体进行衍射测量。对衍射数据进行处理，得到电子密度图，然后将其与分子模型进行拟合。经过优化的模型可用于研究蛋白质的作用机制以及基于结构的药物设计。本文的重点是向您展示我们如何利用脂质介相，通过所谓的“介相内法”（in meso method）获得高质量的膜蛋白晶体。关于该方法及其应用范围的最新综述见参考文献一。本文所遵循的逐步操作方案已在参考文献中描述，此处展示了一个流程图，概括了建立一次介相内膜蛋白结晶实验所需的步骤及相应时间。本视频涵盖由红色虚线框出的步骤。此处展示了以手动模式进行meso结晶所需的物品。它们包括高浓度的纯化膜蛋白溶液和用于形成承载mesophase的脂质，通常使用单油酸（mono ole）以使脂质更明显。在本视频中，已使用红色染料沉淀溶液、纯水管道处理装置、一次性吸头，以及一系列气密型哈密尔顿注射器（部分带可拆卸针头）、用于混合蛋白溶液与脂质以制备微晶的窄孔连接器。此外还包括哈密尔顿重复加样器、玻璃显微镜载玻片和盖玻片，理想情况下还应备有硅化处理的带孔双面胶间隔胶带，用于构建反应孔的镊子、碎冰、纸巾、计算器，以及最为重要的实验记录本。以下步骤用于制备玻璃三明治式结晶板。在加样时，将硅化显微镜载玻片放置于实验台面上。移除一段带孔双面胶带其中一面的保护纸盖。将胶带有粘性的一面朝下，与载玻片表面接触，用手指按压使胶带与载玻片贴合密封。使用压延机或滚轮时，可在胶带与滚轮之间放置铝箔以保护孔板底部。移除胶带上的第二层纸覆盖物，以暴露其上表面的粘性区域。该步骤可制备出可用于加样并立即进行后续封片的玻片。将单个硅化盖玻片紧密放置于玻片附近，以便快速高效地完成各孔的封片。将脂质置于45摄氏度的温控金属块中加热三分钟，使其熔化。注意，所用脂质通常为单油酸甘油酯（mono land）。在本视频中，脂质中添加了红色染料，以便在熔化过程中更易观察。准备两支100微升气密型Hamilton注射器，用于脂质与蛋白质混合步骤；将用于盛装蛋白质溶液的注射器中的聚四氟乙烯衬垫油去除。将用于盛装脂质的注射器放置在其旁边。本步骤中，脂质注射器的聚四氟乙烯衬垫保持原位。将窄孔连接器置于两个注射器之间，然后将连接器连接到脂质注射器的指环上。拧紧连接器与注射器，但不要过度拧紧。从脂质注射器筒中取出活塞。确保脂质处于熔融状态。将移液器调至 30 微升，缓慢吸取 30 微升熔融的脂质帽。脂质小瓶。脂质应在氮气或氩气环境中，于负80摄氏度条件下保存。将熔融的脂质缓慢注入注射器的开口端，注意避免产生气泡。将活塞插入筒内，使其接触熔融的豹脂，并在注射器保持垂直的情况下缓慢向上推动活塞。如图所示，过程中不慎截留的气泡随之上浮并被排出。此时筒内已形成一段熔融脂质栓塞，您必须准确测定其体积。可通过读取注射器筒身上的刻度来完成。本例中，体积为 23 µL，在实验记录本中记录该数值。将毛皮滑至从耦合器伸出的针头上。使用活塞将熔融的脂质向上推入筒内，并缓慢轻柔地注入连接器核心处的针头中。若针头略微过满，可在其开口端观察到脂质向外搏动。通过稍微回撤活塞，可将多余的脂质抽回连接器内，直至脂质液面恰好与连接器针头尖端齐平。此时，注射器连接装置已完全装填，可与蛋白质注射器组合使用。溶液应在 4 摄氏度条件下，于 14,000 G 离心 10 分钟，离心时间为 5 至 10 分钟，以去除大分子聚集体。在设置结晶试验前，将蛋白质溶液从冰桶中取出，并在室温下平衡。计算用于在约20摄氏度下形成立方相且达到或接近完全水合状态所需的蛋白质溶液体积。根据相图，完全水合时水的质量百分比接近40%。请记住，我们已在脂质注射器中装入密度为0.94毫克每微升的23毫克单油酸甘油酯。这相当于21.6毫克脂质，因此需要21.6乘以4再除以6，即14.4毫克或14.4微升的蛋白溶液。使用25或50微升的Hamilton注射器吸取所需体积的蛋白溶液，将溶液转移至蛋白溶液筒内活塞的聚四氟乙烯（Teflon）尖端上。注意避免产生气泡，小心地抽出针头，并测量注射器中蛋白溶液的体积，该体积应与前一步骤中计算出的数值一致。在准备与含脂质的注射器合并之前，小心地将蛋白质溶液缓慢推至注射器筒末端，使其与开口端齐平。可通过从注射器筒末端向下观察来确认该位置。脂蛋白溶液装入注射器后，现在可将注射器连接起来，为制备脂质体做准备。为此，请将装有蛋白的注射器拧入连接器的开口端，该连接器已连接至装有脂质的注射器。通过连接器将两个注射器结合后，应形成一个连续的液体通路，从一个注射器中的脂质，经连接器，到达另一个注射器中的蛋白溶液。在准备混合时，用一只手握住组装好的装置，右手持一支注射器，左手持另一支。通过双手的指头和拇指对两个筒体施加扭矩，传递至耦合器，确保密封部位与耦合器内的凹槽紧密贴合，避免因过度拧紧而导致密封失效。在此阶段，若组装的混合装置未正确操作，会损坏ALS结构，而拧紧不足同样会导致泄漏。这是一个需要通过反复尝试、不断摸索并可能偶尔损失样品才能掌握的过程。因此，在使用宝贵的蛋白质溶液进行混合操作之前，建议先用脂质和水或缓冲溶液进行练习，以熟悉系统的操作。开始时，用拇指或食指推动组装好的混合装置中蛋白质一侧的推杆至极限位置，使蛋白质溶液从蛋白质注射器经由连接器进入脂质注射器。如果装置已有效密封，此操作将导致脂质侧推杆产生相等且相反方向的运动。现在使用脂质侧的推杆将脂质注射器中的内容物重新推过混合器并进入蛋白质注射器。此过程需重复多次，有时需要进行一百次以上的循环，才能形成均匀的混浊相。在开始混合时，物料通过连接器来回移动可能不均匀，有时需要额外施力才能实现混合。这是正常现象。初始混合过程中通常会伴随样品出现不均匀的浑浊，这也属于正常情况。随着均质化的进行，推动活塞来回所需的力所感知到的质地逐渐变得更为均匀，并呈现出黏稠立方相的特征，同时析出的立方相在外观上也表现出相应特性。若条件适宜且形成了立方相，分散液在注射器筒内应呈现光学透明状态。因此，注射器筒身上的刻度应能通过筒内的中间相清晰可见。对于有色蛋白质，中间相会呈现蛋白质的颜色，但仍具有光学透明性。在混合过程中，将注射器混合器短暂置于冰上进行轻微冷却，可加速均质化并促进透明状态的形成。然而，需要注意的是，不要过度涡旋样品，应避免剧烈混合，因为这可能导致样品因摩擦生热而温度升高。此时，立方相已经形成，蛋白质已重组进入脂质双分子层中。该立方相现已准备好可分装至结晶板的各个孔中。首先，需将中间相转移至安装在重复分配器上的10微升Hamilton注射器中。开始此操作时，先将注射器与分配器细管连接。用立方相样品装填注射器。将针头和活塞从注射器上取下，特氟龙阀保持原位。借助一枚小硬币，将固定螺母从分配器上卸下。将棘轮臂完全缩回。将不带活塞和针头的注射器穿过分配器的固定环。将固定结垫圈侧朝向注射器，重新装回并拧紧于注射器的开口端。应注意确保注射器正确地位于固定环中央，且筒身与棘轮臂平行。这两个要求可通过目测判断。这两点非常重要，因为如果推杆不能自由移动，加样过程中会在源注射器内产生压力积聚，可能导致泄漏。将推杆穿过夹持环，在夹紧螺母已旋松数圈的情况下，将推杆引导至注射器的开口端。按下棘轮臂，将柱塞完全推入筒体内，检查其是否能在筒体内自由移动并贯穿全程。如果螺钉和导轨已松动，请重新拧紧，然后再次检查柱塞是否能自由移动。此时，分配式注射器已准备就绪，可以进行装载。将组装好的混合装置一侧的活塞推至零微升刻度线处。将中间相转移至另一注射器和连接器中。将空注射器连同其UL部件从混合装置上拆下，并立即连接装有样品且已安装连接器的注射器至10微升分配注射器的螺纹末端。耦合的紧密程度至关重要。如前所述，通过按压100微升注射器的推杆使中间相经由耦合器转移，从而完成分配注射器的装样。如果耦合紧密，并且分配注射器的推杆可自由移动，则随着分配注射器被填充，其推杆应开始沿装样推杆运动方向移动。取下与连接器相连的上样注射器，将其与分配注射器分离。将一根短的平头针固定到分配注射器的金属末端，并小心拧紧。通过拧紧夹持环中的结，将柱塞夹紧在棘轮臂上。应注意不要过度拧紧结，因为这可能会划伤并损坏推杆，使其无法使用。在夹紧状态下，棘轮臂的行程范围应限制在不超过一英寸。如上所述，若不进行此操作，推杆容易发生弯曲，导致给药失败。将棘轮鼓轮反复按压数次，使推杆在筒体内前进，从而填满针头的空隙体积并对针头进行装样。此步骤应重复多达10次，直至针尖持续流出均一相（mesa相）的连续细流。此时针头已准备好用于建立结晶实验，应立即开始操作。不建议在建立结晶实验前将装载了蛋白质的立方相保存过长时间。由于某些蛋白质在未添加沉淀剂的情况下于立方相中不稳定，可将多孔结晶板和盖玻片放置在略高于实验台几英寸的表面上，以便于加样操作。当表面略呈深色时，可获得最佳对比度和增强的可见性。将沉淀剂溶液混匀后打开瓶盖。用一只手垂直持握分配注射器，将沉淀剂分配移液器设定为一微升，另一只手将针尖置于井底正上方中央位置。第一步：按下重复分配器上的按钮，将一滴体积为 200 纳升的试样排到玻璃表面。当使用标准重复分配器与10微升注射器时，针尖应位于孔底上方不超过几百微米处，以确保准确且可重复的加样。这只需稍加练习即可轻松实现。在四个相邻孔中加入微滴后，将一微升沉淀剂溶液加至每个微滴的上方。尽快使用每孔2微升以及标准的一次性吸头，将盖玻片平整地覆盖在已加样孔上，确保均匀覆盖，以形成防水密封。使用刮刀对盖玻片施加压力，使其与间隔胶带暴露的粘性表面充分接触。该试剂与沉淀剂的加样过程可重复进行，直至板上所有孔均完成加样并密封。平板现已准备好进行观察和孵育。为便于追踪，需清晰标记平板。对光敏感的蛋白质通常需要在放入孵育箱前用铝箔纸包裹平板。可在光线较暗或适当颜色的光线下，将这些样品取下并在显微镜下观察。将培养板置于温度可控的培养箱中，通常温度设置为20摄氏度左右，并定期检查。使用偏振光显微镜，以10倍或20倍物镜观察器壁上的晶体生长情况。目的，作者实验室采用的时间表如下：接种后第0、1、2、3、5、7、14、21、30天。仔细检查食糜团块。在140微米厚的样品内调节焦深。检查应在自然光下以及交叉偏振器之间进行。在自然光下观察时，立方相中生长的无色膜蛋白晶体呈现此形态。在偏振光下观察时，介相中生长的无色膜蛋白晶体呈现此种或此类形态；在自然光下观察时，天然有色的膜蛋白在介相中生长则呈现此种或此类形态。结构测定整体过程的后续步骤包括收集晶体并进行低温冷冻，以及记录和处理晶体的X射线衍射数据。这些主题在本系列的其他JoVE文章中有专门介绍。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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