使用油脂介孔结构的测定结晶膜蛋白

大家好，欢迎来到膜结构和功能生物学组。我叫 Martin Caffery。我们研究的重点是生物膜，其示意图显示在第一张幻灯片上，围绕细胞和亚细胞器的膜是一个分子薄的结构，只有两个脂质分子横跨并点缀着蛋白质。

我们对应用于脂质和蛋白质的结构和功能感兴趣。但是，出于本 JO 系列的目的，我将重点限制在膜蛋白上。我们试图了解这些膜蛋白如何在分子水平上发挥作用，原因有两个。

首先，了解某物如何运作会产生智力上的满足感。其次，通过了解它的工作原理，就像您的自行车或汽车一样，如果它出现故障，就有可能修复它。药物设计是此类工作的明显结果。

我们采用的弄清楚膜蛋白在分子水平上如何工作的方法是确定其晶体结构。这涉及确定所有原子在三维空间中的位置，或者至少是构成蛋白质的所有非氢原子。我们为此目的使用的方法简称为大分子 X 射线晶体学 MX。

在这里，我们看到一个膜蛋白的例子，其结构是使用 MX 确定的，蛋白质的馏分质量晶体需要进行 mx。可以想象，如图所示，使用大分子晶体学进行结构化测定涉及许多步骤。这里。通常，这些包括识别膜蛋白靶标，然后产生、纯化和结晶。

使用家用或同步加速器 X 射线源对晶体进行衍射测量。对衍射数据进行处理，产生电子密度图，然后用分子模型拟合。该模型经过改进后可用于探索蛋白质的作用机制和基于结构的药物设计。

本文的重点是向您展示我们如何通过所谓的 in meso 方法使用脂质中观相生产组分质量的膜蛋白晶体。参考文献 1 中提供了对该方法及其范围的最新回顾。我们在此处将遵循的分步方案参考流程图进行了描述，该流程图总结了设置终中膜蛋白结晶试验所涉及的步骤和所需的时间。

此视频介绍了由红色虚线括起来的步骤。在手动模式下进行细观结晶时需要做的项目如下所示。它们包括纯化的膜蛋白脂质的浓缩溶液，用于产生宿主酶，通常是单醇以使脂质更明显。

在本视频中，它掺杂了红色染料沉淀剂溶液、纯化水管抚摸装置和一次性吸头以及各种气密性汉密尔顿注射器，其中一些带有可拆卸针头，一个用于将蛋白质溶液与脂质混合以产生酶的窄孔耦合器。Hamilton 玻璃显微镜载玻片和盖玻片的重复分液器。理想的硅化穿孔双棒垫片胶带，用于开孔镊子、碎冰纸、计算器，以及最重要的实验室笔记本。

以下程序用于制备玻璃夹心结晶板。加载时，将孤立的显微镜载玻片放在工作台上。从一条穿孔的双贴纸垫片胶带的一个表面上取下保护纸盖。

将胶带粘性面朝下，与载玻片压力表面接触。将胶带密封到载玻片上。使用 brayer 或滚筒，可以在胶带和滚筒之间放置铝箔以保护孔的底部。

从胶带上取下第二个纸盖，露出其上部粘性表面。此过程会生成一块玻璃板，一旦加载完成，就可以进行装载和随后的吊顶。单独的筒仓式盖板可靠近板滑动，以实现快速高效的孔顶。

将脂质放入 45 摄氏度的温控块中 3 分钟以使其熔化。请注意，使用的脂质通常是单晶细胞。在本视频中，脂质添加了红色染料，以便在脂质熔化时可见。

准备两个 100 微升气密 Hamilton 注射器以供使用 在脂质蛋白质混合步骤中，从包含蛋白质溶液的注射器中取出特氟龙毛油。将装有脂质的注射器放在旁边。在这种情况下，fal 被保留在原位。

将窄口径耦合器放在两个注射器之间，然后将耦合器连接到脂质注射器手指。将耦合器拧紧到注射器上，但不要拧得过紧。从脂质注射器的针筒中取出柱塞。

确保脂质已熔化。将移液管设置为 30 微升，然后缓慢吸收 30 微升熔融脂质帽。脂质瓶。

脂质应储存在零下 80 摄氏度的氮气或氩气下。慢慢地将尽可能多的熔融脂质输送到注射器的开口端。注意不要引入气隙。

将柱塞放入与熔融豹接触的桶中，然后垂直握住注射器，将柱塞缓慢地向上推进到桶中。如图所示，被困的气泡在此过程中无意中上升并被释放。现在，我们在桶中有一个熔融脂质塞，您必须准确测定其体积。

这可以通过读取点胶针筒上的标记来完成。在这种情况下，体积为 23 微升，记录在实验室笔记本中。将毛皮滑到从耦合器伸出的针上。

使用柱塞将熔融脂质推入桶中，然后缓慢而轻柔地进入耦合器核心的针头。如果针头略微溢出，则会看到脂质在其开口处跳动。通过稍微向后推柱塞，多余的脂质可以被吸入耦合器中，直到它与耦合器针的尖端齐平。

在这种情况下，注射器耦合器单元已满载，可以与蛋白质注射器结合使用。溶液应在 14， 000 G 下旋转 10 分钟，在 4 摄氏度下旋转 5 至 10 分钟，以去除大聚集体。在设置结晶试验之前，从冰桶中取出蛋白质溶液并在室温下平衡。

计算蛋白质的体积，因此使用溶液在或接近 20 摄氏度的完全水合时形成立方相。如相图所示，在接近 40% 重量的水时，水会发生完全水合。回想一下，我们在脂质注射器中装入了 23 个密度为 0.94 毫克/微升的单

这相当于 21.6 毫克脂质，因此需要 21.6 乘以 4 除以 6 或 14.4 毫克或 14.4 微升蛋白质溶液，25 或 50 微升汉密尔顿注射器吸收所需体积的蛋白质溶液，将溶液转移到蛋白质溶液桶中柱塞的特氟龙尖端。注意避免气泡，小心地拔出针头并测量注射器中蛋白质溶液的体积。它应与上一步中提供的值匹配。

准备与载有脂质的注射器结合。小心地将蛋白质溶液沿桶向上移动，使其与开口端齐平。这可以通过从压线筒端接端向下看来观察。

脂质蛋白溶液，加载的注射器现在可以组合，为 Mex 做准备，将蛋白质注射器拧入连接到脂质注射器的偶联器的开口端。通过耦合器将两个注射器组合在一起。从一个注射器中的脂质通过偶联器到另一个注射器中的蛋白质溶液，应存在连续体积的液体。

在准备混合时，将组装好的装置合二为一，右手拿着一个注射器，左手拿着另一个注射器。使用双手的手指和拇指将扭矩施加到两个桶到耦合器，以确保耦合器中沟槽的密封在拧紧过程中保持完整。这个阶段组装好的混合装置会损坏 ALS 并导致泄漏，拧紧下也会导致泄漏。

这是一个经验问题，不可避免地会反复试验和偶尔的样本损失。因此，在使用有价值的蛋白质溶液影响混合之前，值得使用脂质和水或缓冲溶液进行练习以感受系统，用拇指或食指将蛋白质溶液从蛋白质注射器中推出并进入脂质注射器。如果装置已被有效密封，则此作将导致柱塞在脂质侧发生相等且相反的运动。

脂质侧的柱塞现在用于将脂质注射器的内容物通过 coler 送回蛋白质注射器。此过程重复多次。有时需要 100 次或更多次才能产生均匀的 misa 相。

在混合开始时，材料在耦合器中的来回移动可能不均匀，有时需要额外的力来实现混合。这是意料之中的。初始混合通常伴随着样品中不均匀混浊的发展，并且再次是意料之中的。

随着均质化的进行。通过来回移动柱塞所需的力感应到的质地变得更加均匀和具有内脏立方相的特征，新出现的立方相的视觉外观也是如此。如果条件合适并且形成立方相，分散体在点胶针筒中应呈光学透明。

因此，针筒上的标记应通过针筒中的中相清晰易读。对于有色蛋白质，中胚相将具有蛋白质的颜色，但在光学上是透明的。在混合过程中，将注射器混合器放在冰上短时间，使样品略微冷却，可以加速均质化和实现透明度。

但是，重要的是不要过度填充样品，应注意避免过度混合，因为这会导致样品温度因摩擦加热而升高。此时，立方 misa 相已经形成，蛋白质被重构到脂质中。misa 固定相现在可以分配到结晶板的各个孔中。

然而，首先，必须将介相转移到安装在重复分配器上的 10 微升 Hamilton 注射器中。通过将注射器连接到分配器薄片来开始此过程。将立方体混合物装入注射器。

从注射器中取出针头和柱塞。将 Teflon fal 留在原位。借助一枚小硬币从分配器上取下固定螺母。

棘轮臂完全收回。将不带柱塞和针头的注射器插入分配器的固定环。装回面向注射器的固定结垫圈侧，并将其拧紧在注射器的开口端。

应注意确保注射器在固定环中正确居中，并且枪管与棘轮臂平行对齐。这两个要求很重要，因为如果柱塞不能自由运行，并且在加载过程中源注射器中会积聚压力，并且可能会发生泄漏。将柱塞穿过带有夹持螺母的夹持环，拧下几圈，然后将柱塞引导到注射器的开口端。

完全按下棘轮臂，将柱塞移入枪管中，并检查它是否在枪管中自由移动和穿过。如果螺钉和导杆松动，请重新拧紧并重新检查柱塞是否能自由移动。I 分配注射器现在可以装载了。

将组装好的混合装置一侧的柱塞移动到零微升刻度标记处。将介相转移到另一个注射器和耦合器。断开 UL 就位的空注射器与混合装置的连接，并立即将加载的注射器与连接到 10 微升分配注射器螺纹端头的耦合器连接。

耦合的紧密程度至关重要。如前所述，通过按下 100 μL 注射器的柱塞来加载分配注射器，使介相通过耦合器转移。如果耦合紧密且分配注射器中的柱塞自由运行，则当分配注射器填充时，柱塞应开始沿加载柱塞的运动方向移动。

断开与分配注射器连接的耦合器的加载注射器。将短而平的针头固定到分配注射器的钢制末端，并小心地将其拧紧到位。通过拧紧抓环中的结，将柱塞夹在棘轮臂上。

应注意不要将结拧得过紧。因为这会使柱塞划伤和变形，使其无法使用。重要的是，在夹紧状态下提供给棘轮臂的行程范围应限制在不超过一英寸。

除此之外，柱塞会有弯曲的趋势，并且输送可能会失败。l 压下棘轮鼓数次，使柱塞在枪管中前进，从而填充针的空隙体积并加载针。此步骤应重复最多 10 次，直到从针尖出现连续的台面相串。

针头现在已准备好用于设置结晶试验，应立即开始。在设置结晶试验之前，不建议将载样的蛋白质立方相保持太长时间。由于一些蛋白质在立方相中不稳定，如果不添加沉淀剂，请将多孔结晶板和盖玻片放在表面上，高出工作台几英寸以便于加载。

当表面略微暗时，可以获得最佳对比度和增强的可见性。均质沉淀剂溶液并打开样品瓶的盖子。将沉淀剂分配支架设置为 1 微升，一只手垂直握住分配注射器，用另一只手将针尖定位在孔底部的中心和正上方。

第一。按下重复分配器上分配器上的按钮，将一团 mease 喷到玻璃表面上。推注量为 200 纳升。

当标准重复分配器与 10 微升注射器一起使用时，针头尖端应不超过孔底上方几百微米 为确保正确输送，很容易实现可重复的输送。这只需要一点练习。在四个相邻的孔中加载 mease 后，在每个 mease 推注的顶部放置一微升沉淀剂溶液。

尽快使用每瓶 2 μL 的吸头和标准一次性吸头，将盖玻片正好放在装满的孔上，使其均匀覆盖，从而实现防水密封。使用抹刀对盖玻片施加压力，使其与间隔带的裸露粘性表面接触。可以重复 mease 和 precipant 分配过程，直到板上的所有孔都加载并密封。

板现在已准备好进行检查和孵育。清楚地标记板以进行跟踪。光敏蛋白通常通过在将板放入孵育室之前用铝箔包裹板来处理。

这些可以去除并在显微镜下以柔和或适当颜色的光线进行检查。定期将板放在温度受控的腔室中，通常在 20 摄氏度左右。使用满足 10 或 20 倍的偏振光显微镜检查壁上的晶体生长情况。

目标，作者实验室使用的时间表如下，第 0 天 1 2 3 5 7 14 21 30 后设置。仔细检查脓疱疹。调整 140 微米厚样品的焦深。

检查应在正常光线下和交叉交叉偏振器之间进行，在正常光线下观察时，无色膜蛋白晶体在立方相中生长。看起来像这样。用偏振光观察时，在 meso 中生长的无色膜蛋白晶体看起来像这样或这个，在正常光线下观察时，生长在 meso 中的自然着色的膜蛋白看起来像这样或这个。

结构化测定整个过程的下一步是收获和冷冻冷却晶体，并记录和处理来自它们的 X 射线衍射。这些主题在本系列的单独 JoVE 文章中介绍。