Name: 评估电子晶体结构生物学研究的小膜蛋白的二维结晶试验 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 了解小膜蛋白二维结晶试验的优化方法，通过去污剂纯化、外源脂质添加和透析去除去污剂形成晶体，结合冷冻电镜数据采集与计算图像处理解析蛋白质结构。该方法适用于电子晶体结构生物学研究。

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我们感谢合作者提供了宝贵的蛋白质样品，这些样品有助于我们积累相关方法的经验和观察结果。Günther Schmalzing 慷慨地为 FR 提供了参与本项目的机会。感谢 Barbara Armbruster、Jacob Brink 和 Deryck Mills 在设备方面提供的杰出帮助和建议。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 HL090630 提供经费支持。

1. 二维结晶实验的载网制备
<ol>
<li>	采用负染法准备碳膜覆盖的400目铜质电镜载网。醋酸铀酰常被用作负染剂，其染色液可在使用前存放数月，并且适用于载网的长期保存。相比之下，其他负染剂（如甲酸铀酰）虽然染色效果优异，但需新鲜配制1。为快速制备大量用于二维晶体筛选实验的载网，可采用一种改良的负染法：将2 μL样品溶液滴加至覆有碳膜的电镜载网上，孵育60秒；随后用撕成条状的Whatman #4滤纸从边缘吸去液体（图1；视频），立即滴加2 μL 1%醋酸铀酰溶液，30秒后再次从载网边缘吸去染液。使用滤纸的撕裂边缘轻触载网边缘，可确保在不移除蛋白脂质体的前提下有效去除多余液体。此外，在载网边缘处干燥有助于更好地保持碳膜完整性。在载网的制备与操作过程中需格外小心，因为脆弱的碳膜一旦破裂，将导致样品无法附着，并可能造成对样品形态的错误判断。传统上，载网制备通常使用5 μL的较大样品体积，但通过将体积减少至2 μL或更少，可有效节约珍贵样品2。</li>
<li>	为获得尽可能大的膜结构，部分样品在透析缓冲液中需含有高浓度甘油或蔗糖（10–20%）。然而，这可能对载网制备产生不利影响，因为甘油或蔗糖具有高黏性，会阻碍醋酸铀酰充分渗透缓冲液，从而导致膜结构染色不完全，进而掩盖可能存在的晶格结构。解决方法包括：通过离心更换缓冲液，替换为不含甘油/蔗糖的缓冲液（未展示），或在负染前参照冷冻电镜常用技术3,4，用缓冲液或不含甘油/蔗糖的缓冲液对载网进行一次或多次洗涤。</li>
</ol>
2. 通过电子显微镜评估二维结晶实验
<ol>
<li>根据样品 holder 的类型，可装载单个或多个载网。使用 2-10K 的放大倍数（本文中称为中等放大倍数），可初步观察膜的平均分布情况、分散程度、形态和尺寸，相关信息应记录于实验记录本中5。通过 CCD 相机或（若无 CCD 相机）胶片，对具有代表性的区域进行概览图像采集。</li>
<li>在需要获得整个样品/载网整体视图时，可使用约 400-800x 的低倍率观察。尽管并非对每张载网都进行此项操作，低倍率观察在评估载网制备质量方面仍可提供有价值的信息，包括负染效果、碳膜是否部分破裂、样品在载网上的浓度以及脂蛋白囊泡分布是否均匀等。可使用双目镜或 CCD 相机观察单个载网方格。某些电子显微镜允许保存特定感兴趣区域的位置，以便后续在更高倍率下重新调用检查。</li>
<li>一旦在低倍或中等倍率下确定了感兴趣的区域，应将放大倍数调整至约 50K-60K。根据膜、晶体及晶胞尺寸（如已知），也可使用低至 30K 或高至 80K 的倍率。本研究中将 30-80K 的放大倍数范围称为高倍率，用于二维晶体的筛选。聚焦操作可在低剂量模式的聚焦设置下进行，随后切换至成像/拍照模式，或在感兴趣区域附近完成。
<ol class="lalpha">
<li>当难以判断感兴趣区域是否确为膜结构时，应检查样品中是否存在与脂蛋白囊泡、云母或其它杂质尺寸相当的碳膜碎片。为此，边缘区域通常会显示出典型的折叠形态和特征。</li>
<li>现在使用 CCD 相机对感兴趣区域进行检查。根据膜尺寸、蛋白质或晶胞尺寸，或已知的晶体区域，以 30K-80K 的放大倍数采集 CCD 图像。较小的和/或高度疏水性膜蛋白的晶格结构，可能无法通过直接观察 CCD 图像来识别。此时可对整幅图像进行在线傅里叶变换（FT，或快速傅里叶变换 FFT）。然而，若有序阵列较小，所得 FT 图谱将包含大量噪声。因此，采用较小的截取图像区域（box）可提高小晶体的信噪比，并更易于识别。为此，可通过移动 box 覆盖图像不同区域，并实时评估其对应的 FT 图谱。 
在调整电子束强度/亮度时，需兼顾样品的低剂量条件以及 CCD 相机的设置参数。根据所用 CCD 相机的不同，需调节实时 FT 图像的伽马值，以实现对有序阵列的最佳识别。伽马值过高可能因噪声干扰而掩盖衍射斑点，而过低则可能导致较弱的斑点无法被识别。这些较弱的斑点可能来源于尺寸较小的晶体阵列，其在 FT 图谱中的信号仅略高于噪声水平。 
尽管已有少数样品采集到了更高分辨率的数据6，但通常情况下，负染二维晶体的分辨率受限，或不应期望优于约 15Å。当欠焦量约为 -400 nm 时，通常仅能清晰识别 1-3 层衍射环或斑点。一般不对样品进行分辨率评估，因为冷冻电镜数据采集才能准确反映所能达到的最高分辨率。但需记录衍射斑点的锐利程度及可能存在的镶嵌性。</li>
</ol>
</li>
<li>在高倍率下，需对不同类型的膜以及不同膜形态进行有序性评估。这一点在二维结晶实验的初期或中期阶段尤为重要，因为较小的脂蛋白囊泡或膜片可能比更大的结构包含更有前景的区域。当二维晶体所占比例极低时，需采集大量图像并进行图像傅里叶变换或光学衍射分析，以识别初始的有序阵列，这通常会迅速促进晶体尺寸和质量的提升2,4,7。</li>
</ol>
3. 典型结果
理想排列的蛋白脂质体呈现出清晰可辨的锐利斑点。大而有序的晶体可通过CCD图像的在线傅里叶变换或显微照片的光学衍射轻易识别。
该示例展示了一种分子量为18 kDa的小型膜蛋白的二维晶体，其尺寸可达数微米。傅里叶变换（FT）图上的衍射点清晰可辨且锐利。实时傅里叶变换框的移动表明晶格连续，无嵌合性。对于可溶结构域更大的蛋白质，也可在电镜的小视野中识别其晶格。采集CCD图像并进行傅里叶变换是必要的，以便更准确地评估样品，并获取相关信息，例如可能存在的嵌合性（显示FT）。当对未有序排列的蛋白脂质体进行傅里叶变换计算时，噪声最初可能被误认为是衍射点。然而，在移动实时傅里叶变换框时，这些假象点会消失。相反，对于结晶性存疑的小晶阵列，即使轻微移动实时傅里叶变换框覆盖图像区域，其衍射点仍保持静止。此外，这些小晶体通常具有相同的晶胞尺寸，可通过多种方式测量不同傅里叶变换图中斑点之间的距离，例如使用特定尺寸的圆圈进行比对。脂质晶体则表现出独特的晶格形态和傅里叶变换特征。
在初始试验中遇到沉淀现象并不罕见，但需要将蛋白质在未复性情况下的沉淀与微小脂质聚集体区分开来。在低倍镜下看似沉淀物的样品，通常在高倍镜下观察时被证实为脂质聚集体。在30,000至50,000倍镜下检查时，这些暗色结构的边缘显示出其由膜组成，而并无蛋白质沉淀。这些观察结果非常重要，因为在后续实验中，这些脂质聚集体可能进一步增大形成更大的膜结构。
在评估样品时出现较差结果，有时与膜浓度过低有关，这会阻碍快速且有效的筛选。通过透析法使用较高的蛋白质浓度进行二维结晶，通常可克服这一问题。另一种方法是在储存期间让膜在离心管底部静置数天。在某些情况下，膜会迅速甚至几乎立即沉降，此时从管底吸取液体可使载网上获得更高的膜密度。另一种更为快速的选择是对样品进行离心处理（3000–8000 rpm，离心1–3分钟），随后从管底取样。
在最佳条件下，样品将含有大量二维晶体。无需追求膜外观的均一性，因为将通过肉眼挑选最大且最有序的二维晶体用于数据收集。当重复结晶实验以及利用样品进行冷冻电镜数据采集时，这类样品均易于识别，从而获得最多数目的高分辨率图像。
<img src="/files/ftp_upload/1846/1846fig1.jpg" alt="印迹过程示意图；显示使用滤纸和镊子从载网上去除多余液体。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 该图显示使用撕成条状的Whatman #4滤纸从载网边缘吸去多余液体。

<ol><li>Johansen, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+field+electron+microscopy+of+biological+specimens+V.+A+low+dose+pre-irradiation+procedure+reducing+beam+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage.</a> Micron. 7, 145-156 (1976).</li>
<li>Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+crystallography+of+membrane+proteins%3A+Two-dimensional+crystallization+and+screening+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Electron crystallography of membrane proteins: Two-dimensional crystallization and screening by electron microscopy.</a> Methods. 41, 417-426 (2007).</li>
<li>Wang, D. N., Kühlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+electron+crystallography+of+light-harvesting+chlorophyll+a%2Fb-protein+complex+in+three+different+media%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution electron crystallography of light-harvesting chlorophyll a/b-protein complex in three different media.</a> J Mol Biol. 217, 691-699 (1991).</li>
<li>Schmidt-Krey, I., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryomicroscopy+of+membrane+proteins%3A+specimen+preparation+for+two-dimensional+crystals+and+single+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Electron cryomicroscopy of membrane proteins: specimen preparation for two-dimensional crystals and single particles.</a> Micron. , (2010).</li>
<li>Schmidt-Krey, I., Mutucumarana, V., Haase, W., Stafford, D. W., Kühlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+crystallization+of+human+vitamin+K-dependent+%26gamma%3B-glutamyl+carboxylase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional crystallization of human vitamin K-dependent &gamma;-glutamyl carboxylase.</a> J Struct Biol. 157, 437-442 (2007).</li>
<li>Trachtenberg, S., DeRosier, D. J., Zemlin, F., Beckmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-helical+perturbations+of+the+flagellar+filament%3A+Salmonella+typhimurium+SJW117+at+9.6+%26Aring%3B+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Non-helical perturbations of the flagellar filament: Salmonella typhimurium SJW117 at 9.6 &Aring; resolution.</a> J Mol Biol. 276, 759-773 (1998).</li>
<li>Zhao, G., Johnson, M. C., Schnell, J. R., Kanaoka, Y., Irikura, D., Lam, B. K., Austen, K. F., Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+crystallization+conditions+of+human+leukotriene+C4+synthase+requiring+a+particularly+large+combination+of+specific+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring a particularly large combination of specific parameters.</a> J Struct Biol. 169, 450-454 (2010).</li>
<li>Cheng, A., Leung, A., Fellmann, D., Quispe, J., Suloway, C., Pulokas, J., Abeyrathne, P. D., Lam, J. S., Carragher, B., Potter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+automated+screening+of+two-dimensional+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards automated screening of two-dimensional crystals.</a> J Struct Biol. 160, 324-331 (2007).</li>
<li>Vink, M., Derr, K. D., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+strategy+to+screen+2D+crystallization+trials+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins.</a> J Struct Biol. 160, 295-304 (2007).</li>
</ol>

对样品的准确评估需要仔细分析足够数量的膜。例如，在超过180个成像的蛋白脂质体中，结晶阵列比例低至2%的样品仍提供了关键信息，可用于快速优化二维结晶条件7。
当蛋白质发生沉淀时，可在低倍镜下观察后放弃对该网格的进一步筛选，尽管偶尔会出现蛋白质的部分沉淀。然而，即使小于100 nm的微小膜结构也能提供有关有序性的有用信息，因此可在后续透析实验中采取相应参数以增大二维晶体的尺寸。
各类实验室正在逐步引入不同程度的自动化技术，以用于筛选过程8,9。然而，样品仍需经过本文所述的二维晶体尺寸、形貌和有序性的评估步骤。未来，或许将能够以更高分辨率分析越来越小的二维晶体数据，这使得这些筛选步骤以及对更小晶区进行评估的难度进一步增加，其重要性也愈发突出。

<table><tbody><tr><td>镀有碳膜的400目铜制透射电镜载网</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子：普通镊子和防毛细管镊子</td><td></td><td></td><td>Dumont #5 和 Dumont N5AC 或类似产品</td></tr><tr><td>微量移液器及移液器吸头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman #4 滤纸</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% 醋酸铀酰</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>待检测二维晶体的透析样品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>不含甘油/蔗糖的透析缓冲液</td><td></td><td></td><td>可选</td></tr><tr><td>JEOL-1400 透射电子显微镜（TEM）</td><td></td><td></td><td>类似的 80 &amp;#8211; 120 kV TEM，配备 Lab6 或钨灯丝，以及胶片和/或 CCD 相机（Gatan Orius SC1000 和/或 UltraScan1000 CCD 相机与 Gatan Digital Micrograph 软件包，或 Tietz 相机（TVIPS））</td></tr></tbody></table>

通过电子晶体学评估小膜蛋白的二维结晶实验以用于结构生物学研究

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

电子晶体学已发展成为一种可用于研究膜蛋白以及可溶性蛋白结构与功能问题的方法，既可作为三维结晶和X射线晶体学的替代手段，也可与之结合使用。通过透射电子显微镜（EM）对二维（2D）晶体进行筛选，是寻找、优化和选择可用于冷冻电镜高分辨率数据收集样品的关键步骤。本文介绍了识别大尺寸有序以及小尺寸二维晶格阵列的基本步骤，这些阵列有可能为结晶条件的优化提供关键信息。
通过在电子显微镜下使用不同的放大倍数，可获得一系列关键参数的数据。低倍放大提供有关形态和膜尺寸的有价值信息。在高倍放大下，可确定可能存在的有序结构及二维晶体的尺寸。在此背景下，本文描述了如何在高倍放大下利用CCD相机和在线傅里叶变换来评估蛋白脂质体的有序性和尺寸。
尽管膜蛋白的二维晶体通常通过透析重构成法进行培养，但该筛选技术同样适用于利用单分子层、天然二维晶体以及可溶性蛋白有序阵列所获得的晶体。此外，本文所述方法也适用于更小或更大尺寸的膜蛋白二维晶体的筛选，其中较小的蛋白质在鉴定时需要与本文示例相同的谨慎程度，而较大蛋白质的晶格在筛选早期阶段可能更容易被识别。

评估二维（2D）结晶实验以形成有序的膜蛋白阵列，是电子晶体学中一项极为关键且困难的任务。本文介绍了我们用于筛选和鉴定主要分子量在15–90 kDa范围内的小型膜蛋白二维晶体的方法。

电子晶体学已发展成为一种既可以替代又可与三维结晶及X射线衍射...结合使用的方法。

本实验的总体目标是确定膜蛋白通过电子晶体学进行结构解析的最优二维结晶条件。首先，在纯化过程中使用一种相容的去污剂，将蛋白质从天然脂双层中溶解出来。实验的第二步是向体系中添加外源性脂质，并通过透析去除蛋白质-脂质-去污剂混合物中的去污剂，从而在严格控制的条件下形成二维晶体。该实验步骤的第三步是将样品快速冷冻，使其进入玻璃态。该实验步骤的最后一步是通过冷冻电镜收集数据。最终，通过对所获得的数据进行计算图像处理，可得到蛋白质的最终结构。您好，我来自佐治亚理工学院生物学院。您好，我是蒂娜·德雷德。我来自佐治亚理工学院化学与生物化学学院的贝里实验室以及生物学院的施密特·克雷实验室。我是佐治亚理工学院生物学院英格尔博格·施密特·克雷实验室的马特·约翰逊。今天，我们将向您展示一种通过电子显微镜评估二维手性组装试验的方法。我们在实验室中使用该方案来鉴定和优化二维结晶条件。现在让我们开始：首先，制备覆盖有碳膜的400目铜质透射电子显微镜（TEM）载网上的负染样品。用移液器吸取两微升蛋白-脂质体样品，滴加到带有碳膜的TEM载网上，孵育60秒。如果样品分布不均匀，可用移液枪头侧面轻轻拂拭。接着，用撕下的沃特曼四号滤纸碎片从边缘进行封闭。这样可确保在不过度去除蛋白脂质体的前提下有效去除液体，并有助于保护脆弱的碳膜。转印后立即进行。30秒后，在网格边缘加入2微升1%醋酸铀染液，并从网格边缘吸去多余液体。如果样品中含有高浓度的黏性甘油或蔗糖（通常在10%至20%范围内），则在负染色前，使用不含甘油或蔗糖的缓冲液对网格进行数次洗涤，有助于醋酸铀染液实现适当的染色效果。网格制备完成后，首先使用电子显微镜在低倍镜下观察样品，以评估膜的分布情况、形态特征以及整体网格质量。随后在高倍镜下获取图像，并对图像进行RIA变换，以识别二维晶体。开始观察时，将网格放入电子显微镜样品 holder 中，为初步了解膜的平均分布情况，可采用2000至10,000倍的中等放大倍数。在实验记录本中注明膜的分布范围、形态和大小。使用CCD相机记录代表性视野。接下来，如有必要，使用约400至800倍的低倍镜观察样品，以获得载网的整体情况。这可以提供有价值的信息，用于评估载网制备质量，揭示样品浓度、蛋白质分布不均、脂质体分布不均以及碳膜部分破裂等问题。在低倍或中倍放大下确定感兴趣的载网区域，然后使用高倍放大来评估不同膜中可能存在的有序结构。在二维结晶实验的早期阶段，这一点至关重要。为了鉴定出具有规则排列区域且前景良好的蛋白脂质体，并在后续实验中验证其可重复性，需确定用于筛选二维晶体的最佳高倍率条件，起始放大倍数应选择在50,000至60,000倍之间。根据二维晶体的尺寸和晶胞大小，高倍率设置可低至30,000倍，也可高至80,000倍。在此，于目标成像区域附近的区域，我们将焦距调至大约负 400 纳米或更大负值，以确认目标区域是否确实为膜结构。检查样品中是否存在碳膜、云母片或其他可能被误认为蛋白脂质体的人工假象。同时观察边缘特征，以识别典型的膜折叠形态和结构特征。接下来，使用CCD相机检查目标区域。在最佳高倍率设置下采集CCD图像时，较小或主要为疏水性的膜蛋白的晶格可能无法通过直接观察CCD图像本身来识别。在此情况下，需对整幅图像进行在线傅里叶变换（Fourier transform，FT）分析。然而，如果有序阵列较小，该傅里叶变换将包含大量噪声。为提高信噪比，应减小图像框的尺寸，移动缩小后的框覆盖图像区域，并执行实时傅里叶变换。调整实时傅里叶变换的伽马函数，以实现对有序阵列的最佳识别。伽马值过高会因噪声干扰而掩盖衍射斑点，而伽马值过低则会导致较弱的斑点无法被识别。预计在负染2D晶体中，当欠焦量为负400纳米时，其分辨率约为15埃。预期可识别出一至三个衍射点阵。注意观察衍射点的锐利程度以及是否存在镶嵌现象。分子量约为18千道尔顿的膜蛋白二维晶体，其尺寸可达数微米。在倒易空间图（FTS）上，清晰且易于识别的活动FT框移动表明晶格是连续的，无镶嵌性。对于具有更大可溶性结构域的较大蛋白质，可在透射电子显微镜-CCD图像采集系统的小屏幕上识别其晶格，但必须通过傅里叶变换（FT）来更准确地评估晶格质量，包括无序蛋白阵列FT中的镶嵌噪声等特征。脂质体可能被误认为微弱斑点，需据此判断这些斑点是由小蛋白质二维晶体产生，还是源于噪声。移动实时傅里叶变换（ft）的框。如果斑点立即消失，则为噪声；但如果在即使很小的区域内保持不变，则很可能存在晶体，因为脂质晶体具有独特的形态特征和傅里叶变换图像。这些脂质晶体还可以通过图像的目视检查以及一致的晶胞尺寸来识别。在初始试验中可能会出现沉淀。通过高倍镜检查可区分蛋白质沉淀与脂质聚集体。如果是脂质聚集体，则可能已经发生了重组，后续实验仅需调整参数以增大膜尺寸并形成有序结构，而无需在30,000至50,000 × 条件下再次诱导重组。这些暗色结构的边缘表明它们是由不含蛋白质的膜组成的。在最佳条件下沉淀的样品将含有大量二维晶体。无需追求膜外观的均一性，因为最大且最有序的二维晶体将在数据收集中通过肉眼挑选。当使用此类样品进行冷冻电镜数据收集时，可获得最大量的高分辨率图像，因此这类样品很容易被识别。在执行此操作时，我们将向您展示如何通过透射电镜筛选小型记忆蛋白的二维晶体。需要牢记的是，在筛选过程中务必全面细致，不要忽略任何有前景的结晶条件，因为至此您已经投入了大量时间和精力。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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Biology

生物学

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