评估电子晶体结构生物学研究的小膜蛋白的二维结晶试验
2010年10月29日
形成有序的膜蛋白质阵列的二维（2D）的结晶试验评价是一个非常关键的电子晶体而艰巨的任务。在这里，我们描述了我们的方法，筛选，并确定在15范围内的主要是小膜蛋白的二维晶体 - 90kDa。
该程序的总体目标是确定通过电子晶体学结构化测定膜蛋白的最佳 2D 结晶条件。这是通过在纯化过程中首先使用相容的去污剂来溶解天然脂质双层中的蛋白质来实现的。该程序的第二步是添加外源脂质并通过透析蛋白质脂质洗涤剂混合物去除洗涤剂，在仔细控制的条件下产生 2D 晶体。
该程序的第三步是闪蒸，将样品冷冻成玻璃体状态。该程序的最后一步是通过冷冻电镜收集数据。最终，通过对数据进行计算图像处理，可以获得产生蛋白质最终结构的结果。
嗨，我来自实验室。我在佐治亚理工学院的生物学院。嗨，我很害怕 Tina。
我来自佐治亚理工学院化学与生物化学学院的 Berry 实验室和生物学院的 Schmidt Kray 实验室。我是来自佐治亚理工学院生物学院 Ingleborg Schmidt Cry 实验室的 Matt Johnson。今天，我们将向您展示一个评估 em 的 2D 合唱试验的程序。
我们在实验室中使用此协议来识别和优化 2D 结晶条件。那么让我们开始吧 要开始这个程序，在碳涂层的 400 目铜透射电子显微镜或 TEM 网格上准备负染色的样品。在碳覆盖的 TEM 网格下吸取 2 微升 protea 脂质体样品，并孵育 60 秒。
如果样品分布不均匀，请用移液器吸头的侧面轻轻滑动。从边缘开始的下一个块，用一张撕裂的 watman 4 号滤纸。这确保了液体的最佳去除，而不会过度去除 protea 脂质体，并有助于保留脆弱的碳膜。
印迹后立即。30 秒后涂抹两微升 1% 尿瓶醋酸盐染色剂，从网格边缘吸干。同样，如果样品中含有高浓度的粘性甘油或蔗糖，通常在 10% 到 20% 的范围内，在阴性染色之前用不含甘油或蔗糖的缓冲液清洗网格的几个循环有助于允许使用小便池 tate 溶液进行适当染色。
准备好网格后，使用电子显微镜以低倍率观察样品，以评估膜的出现分布和形态以及整体网格质量。然后使用高放大倍率获取图像并对图像进行 RIA 变换以识别 2D 晶体。要在电子显微镜样品架中开始低网格，以获得平均膜分布的第一印象，请使用 2000 至 10， 000 x 的中间放大倍率。
在实验室笔记本中记下膜的分布范围、形态和大小。使用 CCD 相机记录代表性视图。接下来，如有必要，在大约 400 到 800 x 的范围内以低放大倍率观察样品，以获得网格的概览。
这可以通过揭示样品浓度、蛋白酶不均匀、脂质体分布和碳膜部分破损等问题来提供有价值的信息来评估网格制备。以低倍或中倍率识别感兴趣的网格区域。然后使用高放大倍率来评估不同膜中可能的阶次。
这在 2D 结晶试验的早期阶段至关重要。为了识别具有有序区域的有前途的 protea 脂质体，并在以后的实验中验证可重复性，以确定筛选 2D 晶体的最佳高放大倍率设置，从 50， 000 和 60， 000 x 之间的放大倍率开始。根据 2D 晶体尺寸和晶胞尺寸，高放大倍率设置可能会降低到低至 30， 000 或提高到 80， 000。
在相邻位置 对于感兴趣的图像区域，如果不确定感兴趣区域是否确实是膜，我们会散焦大约负 400 纳米或更高。检查样品中是否有碳膜 MICA 或其他可能被误认为是 protea 脂质体的伪影。还要观察边缘以辨别典型的膜折叠和形态。
接下来，使用 CCD 相机检查感兴趣区域。通过在最佳高放大倍率设置下收集 CCD 图像，较小和/或大部分疏水膜蛋白的晶格可能无法通过对 CCD 图像本身的目视评估来观察到。在这种情况下，整个图像用于在线 foer 转换或 ft。
但是，如果有序数组很小，则此 FT 将包含大量噪声，以提高信噪比，减小方框图像大小，将缩小的方框移动到图像上，并执行实时 FT，调整实时 FT 的伽马函数以实现有序阵列的最佳识别。过高的 Gamma 值可能会因噪声贡献而遮挡点，而过低的 Gamma 值会阻止识别较弱的点。预计在负 400 纳米的 DFO 下，负染色 2D 晶体的分辨率约为 15 埃。
预计会识别 1 到 3 个地点顺序。注意斑点和任何马赛克的清晰度。18 道尔顿小膜蛋白的 2D 晶体大小可达几微米。
FTS 上尖锐且易于识别的现场 FT 盒运动表明晶格是连续的，没有马赛克。可以在 T-E-M-C-C-D 图像集合的小屏幕上识别具有更广泛可溶性结构域的较大蛋白质的晶格，并且 FT 对于更好地评估晶格质量是必要的，包括无序 protea 的 FT 中的马赛克噪声等特征。脂质体可能会被误认为弱点，以确定这些斑点是由于小蛋白质 2D 晶体还是噪音引起的。
移动 live ft.如果斑点立即消失，它们就是噪声，但如果即使在很小的区域保持不变，也可能存在晶体，因为脂质晶体显示出明显的形态和 ft。这些脂质晶体也可以通过目视检查图像和一致的晶胞大小来识别。
在初始试验中可能会发生沉淀。高倍率检查用于区分蛋白质沉淀和脂质聚集体。在脂质聚集体的情况下，重构可能实际上可能已经发生，接下来的实验只需要调整必要的参数以增加膜大小和产生顺序，而不是在 30， 000 至 50， 000 x 下诱导重构。
这些深色结构的边缘表明它们由没有蛋白质的膜组成。在最佳条件下，沉淀样品将包含很大比例的 2D 晶体。没有必要以膜的均匀外观为目标，因为会目视选择最大和最有序的 2D 晶体进行数据收集。
当结晶此类样品用于冷冻电镜数据收集时，这些类型的样品将很容易被识别，从而产生最大数量的高分辨率图像。我们只向您展示在进行此过程时如何通过 TEM 筛选小记忆蛋白的 2D 晶体。重要的是要记住要彻底，不要忽视有前途的结晶条件，因为到目前为止您已经投入了大量的时间和精力。
就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概述
本研究侧重于优化膜蛋白的二维（2D）结晶条件，这对电子晶体学至关重要。该方法包括溶解蛋白质，形成2D晶体，并利用冷冻电子显微镜来确定其结构。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 结构生物学
- 电子晶体学
背景
- 膜蛋白对于各种生物功能至关重要。
- 由于其复杂的性质，确定其结构具有挑战性。
- 2D结晶是研究这些蛋白质的一种方法。
- 电子晶体学提供了高分辨率的结构数据。
研究目的
- 确定膜蛋白2D结晶的最佳条件。
- 增进对膜蛋白结构的理解。
- 促进冷冻电子显微镜在结构确定中的应用。
所用方法
- 使用兼容的洗涤剂纯化蛋白质。
- 添加外源脂质并通过透析去除洗涤剂。
- 在受控条件下形成2D晶体。
- 将样品快速冷冻至玻璃状状态以进行分析。
主要结果
- 成功形成了小型膜蛋白的2D晶体。
- 使用冷冻电子显微镜进行数据收集。
- 计算机图像处理得出结构信息。
- 结果有助于理解膜蛋白的结构。
结论
- 所描述的方法对研究膜蛋白是有效的。
- 优化的结晶条件增强了结构确定。
- 这种方法可以应用于各种小型膜蛋白。
常见问题
Executive Industry Relevance
Robust assessment of two-dimensional crystallization trials for small membrane proteins is critical for advancing structural biology in early drug discovery. High-resolution electron crystallography enables precise structural insights, supporting target validation and mechanistic de-risking for membrane protein drug targets. This workflow underpins predictive confidence at key inflection points in biopharma R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of membrane protein structure to inform target validation.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying protein conformation and assembly.
- Facilitates identification of optimal crystallization conditions for downstream studies.
Screening & Assay Development
- Provides standardized protocols for preparing and screening proteoliposome samples.
- Delivers reproducible, quantitative assessment of crystal order and morphology via EM imaging.
- Enables selection of well-ordered 2D crystals for high-resolution data collection and assay readiness.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural data with disease-relevant membrane protein targets when applicable.
- Ensures continuity from discovery-stage structural insights to preclinical model development.
- Reduces risk of late-stage failure by confirming target structure and integrity early.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, providing a foundation for structure-based drug design and preclinical advancement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by revealing membrane protein architecture.
- Screening: Establishes reproducible criteria for crystal quality and order, enabling reliable downstream workflows.
- Analytics: Generates quantitative EM and Fourier Transform outputs for comparative analysis of crystallization conditions.
- Translational Research: Bridges early discovery with preclinical validation by confirming structural fidelity of targets.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for assessing diverse membrane protein targets across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in membrane protein target validation.
- Operational Value: Standardizes sample preparation, imaging, and analysis for scalable implementation.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation by prioritizing structurally validated targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement and triage of membrane protein drug discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electron microscopy and sample preparation for proteoliposomes.
- Demands access to high-resolution TEM, CCD imaging, and online Fourier Transform analysis tools.
- Necessitates cross-team standardization of grid preparation and imaging protocols.
- Adaptable to a range of membrane protein sizes, though smaller proteins require careful identification.
- Potential limitations include distinguishing true crystal order from noise and artifacts in EM images.
