使用脂单层法进行电子晶体学研究的样品制备

多年来，脂质单层膜一直被用作支持层，以促进外周膜蛋白以及可溶性蛋白的二维结晶。该方法也可应用于某些内在膜蛋白的二维结晶，但需要更广泛的实验探索，以确定促进蛋白分配至脂质单层膜所需的去垢剂和透析条件。

在空气-水界面处形成单层脂质膜，其中脂质的极性头部基团保持在水相中并维持水合状态，而脂质的非极性酰基链则分布于空气-水界面，破坏表面张力并使水面展平。脂质头部基团所带电荷及其特有的化学基团决定了其对溶液中蛋白质的亲和力。

促进结合，并原则上实现二维阵列的形成。在脂单层上形成的任何二维晶体均可被直接转移至透射电子显微镜的载网上，该载网表面覆有碳膜，可用于捞取并支撑脂层上的晶体阵列。本文中，我们描述了一种用于低温电子显微镜成像的脂单层技术方法。

脂质单层制备。脂质储备液的配制：将脂质混合物溶于氯仿与甲醇的混合溶剂（体积比9:1），配制成浓度为0.01 mg/ml的溶液。具体操作为：取8.91 ml氯仿、0.99 ml甲醇，加入0.1 ml浓度为10 mg/ml的脂质溶液。

聚四氟乙烯板的制备：将聚四氟乙烯板置于甲醇溶液中，超声处理5分钟。用热水清洗15分钟，然后用蒸馏水冲洗。

将聚四氟乙烯板在干燥器中干燥30分钟，并在使用前保持在真空条件下。在缓冲液储液池上形成脂质单层。预计操作时间为一个半小时。

将一张1号滤纸放入培养皿中，并将聚四氟乙烯块放置在滤纸上。向聚四氟乙烯板的孔中加入60微升缓冲液。小心地将液体混合物逐滴加在缓冲液表面。

理想情况下，使用 Hamilton 注射器，每滴一微升。用蒸馏水润湿滤纸，并保持培养皿内的湿度。室温孵育 60 分钟，氯仿应完全挥发，在缓冲液表面形成一层脂质单分子层。

将电镜载网应用于脂单层。预计操作时间一个半小时。将碳膜电镜载网（无需辉光放电处理）碳面朝下轻轻放置于每个缓冲液储液槽的表面。

小心地将蛋白质注入侧面的加样孔，使孔中蛋白质的终浓度约为1微摩尔。在室温下孵育60分钟。轻轻向加样孔注入约20至30微升缓冲液，使载网升至聚四氟乙烯块表面之上。

这使得您可以用镊子夹起载网，并将其从液滴上垂直提起。代表性结果：沉积在电镜载网上的脂质单层无需染色增强对比度，即可在透射电子显微镜下观察。

单层膜的存在可以通过其与光束路径中无样品区域之间的对比度差异来识别。有脂质单层膜覆盖的区域比无覆盖区域的对比度更低。由于电子束穿过空孔时未发生散射，因此呈现更亮的照明。

综上所述，由于其简便性，脂质单层法为研究蛋白质结构提供了机会。该方法可能为促进二维结晶过程提供一种替代途径。