Name: 程控电刺激小鼠 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: 学习程控电刺激技术在小鼠心脏电生理研究中的应用，通过颈静脉插入导管记录心内电图，评估心脏传导特性并诱导心律失常，为研究心律失常机制提供可靠的临床前研究方法。

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X.H.T.W. 是 W.M. Keck 基金会医学研究杰出青年学者，获得美国国立卫生研究院/国家心肺血液研究所（NIH/NHLBI）R01-HL089598 和 R01HL091947 项目资助，以及肌营养不良协会（Muscular Dystrophy Association）#69238 号资助。本研究还部分得到了 Leducq 基金会 CaMKII 心脏信号传导联盟（Fondation Leducq Alliance for CaMKII Signalling in Heart）的支持。N.L. 获得了心律学会（Heart Rhythm Society）2009-2010 年度 Michel Mirowski 心脏起搏与电生理国际奖学金以及 2009-2012 年美国心脏协会博士后奖学金。

第1部分：手术准备
<ol>
	<li>如果在小鼠中进行程序性电刺激实验作为可存活手术，则需要无菌条件。然而，最常见的实验类型为终点性实验，此类实验采用常规清晰的外科技术即可。</li>
	<li>使用2%异氟烷与0.5 L/min的100% O2对小鼠进行麻醉。</li>
	<li>使用毛发剪将小鼠颈部至胸部中段的毛发剪除。</li>
	<li>将麻醉后的小鼠仰卧固定，四肢用胶带固定在加热板（Indus Instruments, Houston, TX）集成的ECG电极上。手术区域使用10%聚维酮碘进行消毒。推荐使用直肠温度探头连接温控加热垫，并由热分析系统调控，以维持小鼠体温在37.0 °C ± 1.0 °C。</li>
</ol>
第2部分. 右心房和右心室的插管及电生理导管置入
<ol>
	<li>通过夹捏脚趾确认小鼠已完全麻醉后，在正中线右侧做一长约1/2英寸的切口，切口尾端位于锁骨水平。</li>
 <li>通过钝性分离皮下组织、唾液腺和淋巴组织，以暴露右侧颈静脉。</li>
 <li>用6-0缝线结扎静脉近端。轻拉此缝线可在插入导管时保持颈内静脉平直。在可视段静脉远端下方另置一根缝线，待导管在心脏内达到理想位置后，将此缝线绑扎于导管周围，以确保止血并固定导管于所需位置（图1）。</li>
 <li>启动基于计算机的数据采集系统，同步记录体表心电图和4通道心内电图（例如IOX-2采集软件，Emka Technologies，VA，美国）。进行心内电图记录时，将导管上的电极连接至体外刺激器的“记录”模式（例如型号STG3008，MultiChannel Systems，Reutlingen，德国）。</li>
 <li>使用显微剪刀沿静脉纵轴做一小切口，将1.1F八极导管（EPR-800，Millar Instruments，Houston，TX）经静脉送入右心房。轻拉近端缝线有助于保持颈内静脉平直，便于导管顺利进入右心房和右心室。通过观察右心室心尖部、右心室基底部、房室结及右心房处的4通道心内电图波形，确认导管位置正确（图2）。</li>
 <li>结扎远端缝线，以固定导管位置并防止可能的出血。</li>
</ol>
第3部分. 程控电刺激
<ol>
	<li>在选择性心房起搏的情况下，位于心房内的电极对由“记录”模式切换至“刺激”模式，而其余电极对则保持在“记录”模式。 </li>
 <li>为确定小鼠是否对心房心律失常具有更高的易感性，需进行右心房程序性电刺激。首先，通过在不同基础起搏周长（BCL）下施加持续2毫秒的电流脉冲（至少50次），检测刺激捕获的一致性，以确定心房起搏阈值。初始脉冲序列的BCL略低于固有BCL，并以10毫秒为步长递减（例如，100毫秒、90毫秒、80毫秒和70毫秒）。通常实现刺激捕获所需的电流幅度为100–200 μA。</li>
 <li>在以100 ms基础起搏周期（BCL）进行15秒心房起搏后，测量窦房结恢复时间（SNRT）。SNRT定义为起搏脉冲序列中最后一个刺激与其后首次自发性窦性心搏起始之间的时间间隔。 </li>
 <li>心房有效不应期（AERP）通过在固定基础起搏周长（BCL，即100 ms）下施加一系列心房起搏脉冲，并耦合一个较短的S2期前刺激来测定。在每次起搏序列中，S1-S2间期从70 ms逐步递减2 ms，直至20 ms。AERP定义为S2刺激未能引发可传导的心房反应时，最长的S1-S2耦合间期（其中S1为规律起搏脉冲，S2为期前刺激）。每次刺激方案之间设有至少30秒的恢复期。</li>
 <li>房室结有效不应期（AVNERP）通过在基础周长（BCL）为100 ms的条件下施加一系列心房起搏，并叠加一个配对的S2期前刺激来测定。每次起搏序列的S1-S2间期从70 ms开始，以每序列递减2 ms的方式逐步缩短至20 ms。AVNERP定义为：当给予心房期前刺激后，仍可记录到希氏束电位但不再跟随QRS波群时，所对应的最长S1-S2配对间期。每次刺激方案之间设有至少30秒的恢复期。 </li>
 <li>通过Verheule描述的阵发性起搏方案可检测包括心房颤动（AF）在内的房性心律失常的可诱导性 等2 应用一系列持续2秒的刺激脉冲以评估心房心律失常的可诱导性。首次2秒刺激的周长（CL）为40 ms，随后每次刺激的CL较前一次缩短2 ms，直至最终达到20 ms的CL。若无心律失常发生基质，心脏将在起搏程序结束后立即恢复窦性心律。若发生心房扑动，心房电图上将显示快速而规律的A波，而心室电图上所见的心室反应频率通常较慢。若发生心房颤动，体表心电图将表现为P波消失且RR间期不规则。此外，心房电图将显示快速而不规则的A波，而心室电图则显示不规则且较慢的心室波图3心律失常诱导方案通常进行三次重复，若在3次试验中至少有2次可诱发出心律失常，则认为存在心律失常。3,4.</li>
</ol>
第4部分. 导管移除
<ol>
	<li>完成所有起搏程序后，停止数据采集。轻轻剪断导管远端的缝线，以释放导管。</li>
	<li>对于终末期电生理研究，轻轻松开结以释放导管。</li>
	<li>研究结束时，在异氟烷麻醉下对小鼠实施颈椎脱位，以人道方式处死。</li>
</ol>
代表性结果
在整个体内电生理研究过程中，同步记录体表心电图和心内电图，并在所有实验方案完成后进行详细回顾。基础电生理参数包括PR间期、PQ间期、QRS时限、QT间期以及QRS波形态。这些参数可通过手动测量，或使用数据采集软件IOX-2或ECG-AUTO（Emka Technologies, VA, USA）自动测量。
SNRT、AERP和AVNERP分别提供了关于窦房结“起搏”功能、心房以及房室结传导特性的信息。 pacing诱发的心房颤动发作示例可参见Chelu et al.4的论文。
<img src="/files/ftp_upload/1730/1730fig1.jpg" alt="大鼠手术装置；颈静脉插管；心肺示意图；长度测量图表。" data-altupdatedat="1754907495000" data-alt="图1"> 图1. 小鼠电生理研究中经心导管术示意图。 A. 分离并插管右侧颈内静脉。当导管位置正确后，结扎静脉远端。 B. 小鼠在该操作过程中呈仰卧位。 C. 示意图显示导管在心脏内的位置。成对电极分别位于右心室心尖部、右心室基底部、房室结以及右心房水平。 D. 1.1F八极导管的放大图。该图经Circ Arrhythm Electrophys 5许可，改编自Mathur et al。
<img src="/files/ftp_upload/1730/1730fig2.jpg" alt="心电图波形示意图；显示心脏电活动；包含PQRS波群分析。" data-altupdatedat="1754907495000" data-alt="图2"> 图2. 小鼠代表性体表心电图与心内电图。（A） Ⅱ导联体表心电图，显示频率为每分钟540次的规律窦性心律。（B-E） 右心房水平（B）、房室结（C）、右心室基底部（D）以及右心室心尖部（E）的双极心内电图记录。请注意，B图中的心房内A波对应于体表心电图上的P波；心室电图上的V波则对应于体表心电图上的QRS波。
<img src="/files/ftp_upload/1730/1730fig3.jpg" alt="心电图电生理研究；II导联、心房、心室电图；心律分析示意图。" data-altupdatedat="1754907495000" data-alt="图3"> 图3. 在心房爆发性起搏后发生心房颤动的小鼠的代表性体表心电图和心内电图。

<ol><li>Nattel, S., Shiroshita-Takeshita, A., Brundel, B. J., Rivard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+atrial+fibrillation%3A+lessons+from+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Cardiovasc+Dis%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of atrial fibrillation: lessons from animal models.</a> Prog Cardiovasc Dis. 48, 9-9 (2005).</li>
<li>Verheule, S., Sato, T., Everett, T. t, Engle, S. K., Otten, D., Rubart-von der Lohe, M., Nakajima, H. O., Nakajima, H., Field, L. J., Olgin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+vulnerability+to+atrial+fibrillation+in+transgenic+mice+with+selective+atrial+fibrosis+caused+by+overexpression+of+TGF-beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Increased vulnerability to atrial fibrillation in transgenic mice with selective atrial fibrosis caused by overexpression of TGF-beta1.</a> Circ Res. 94, 1458-1458 (2004).</li>
<li>Sood, S., Chelu, M. G., Oort, R. J. van, Skapura, D., Santonastasi, M., Dobrev, D., Wehrens, X. H., H, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+leak+due+to+FKBP12.6+deficiency+in+mice+facilitates+the+inducibility+of+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium leak due to FKBP12.6 deficiency in mice facilitates the inducibility of atrial fibrillation.</a> Heart Rhythm. 5, 1047-1047 (2008).</li>
<li>Chelu, M. G., Sarma, S., Sood, S., Wang, S., van Oort, R. J., Skapura, D. G., Li, N., Santonastasi, M., Muller, F. U., Schmitz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+kinase+II-mediated+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+leak+promotes+atrial+fibrillation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Calmodulin kinase II-mediated sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak promotes atrial fibrillation in mice.</a> J Clin Invest. 119, 1940-1940 (2009).</li>
<li>Mathur, N., Subeena, S., Wang, S., van Oort, R. J., Sarma, S., Li, N., Skapura, D., Bayle, J. H., Valderrabano, M., Wehrens, X. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sudden+Infant+Death+Syndrome+in+Mice+With+an+Inherited+Mutation+in+RyR%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Arrhythmia+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Sudden Infant Death Syndrome in Mice With an Inherited Mutation in RyR.</a> Circ Arrhythmia Electrophysiol. , Forthcoming (2009).</li>
</ol>

在心脏导管术过程中，导管插入期间大量出血可能因低血容量导致心率增加。此时，腹腔注射无菌生理盐水（0.3–1.0 mL）可恢复正常充盈压，减轻小鼠的血流动力学应激。
暴露于异氟烷的时间超过2小时，或使用较高浓度的异氟烷（&gt;2%），可能会抑制小鼠的心脏和呼吸功能。因此，建议所有实验均在2小时以内完成。此外，必须始终将体温维持在正常范围37.0 ± 1.0°C内。低体温和高体温均会影响心律以及潜在致心律失常基质的存在。
每次实验都应从测定心房起搏阈值开始。在进行心房起搏时，应测定心房阈值、窦房结恢复时间（SNRT）、心房有效不应期（AERP）和房室结有效不应期（AVNERP），以评估窦房结、房室结及心房组织的传导特性是否正常。

小鼠程序性电刺激

Programmed Electrical Stimulation in Mice

转基因小鼠已成为研究传导异常、心房和心室心律失常以及心脏性猝死分子机制的优选动物模型。1通过将一根1.1F八极导管插入小鼠颈静脉并推进至右心房和右心室，可对其进行心内起搏研究。本文展示了在小鼠中进行程序性电刺激的步骤。同时记录体表心电图以及心房、房室交界区和心室心肌的腔内电图，同时使用外部刺激器对心房进行心内起搏。因此，小鼠的程序性电刺激为探索传导障碍和心律失常的分子机制提供了独特的机会。

程序性电刺激可用于评估心脏的传导特性，并通过不同的起搏方案诱导和终止心律失常。利用经静脉导管，在小鼠中实施程序性电刺激方案后，可获取心内电图记录，以识别致心律失常的基质。

基因改造小鼠已成为研究传导异常、心房和...潜在分子机制的优选动物模型

将麻醉后的小鼠仰卧位固定于加热板上。分离右侧颈静脉，结扎静脉近端。将1.1 French OC Apolar导管插入静脉，随后推进导管至右心房和右心室。最后，结扎静脉的远端以固定导管位置并防止出血。大家好，我是来自贝勒医学院分子生理学与生物物理学系Zver博士实验室的Naali。今天我们将向您展示在小鼠中设置电刺激程序的操作流程。我们在实验室中采用此方法研究小鼠的可诱导性心律失常。现在开始操作。在进行插管和导管插入手术之前，使用毛发剪将麻醉小鼠从颈部至胸部中段区域的毛发剪除。用10%聚维酮碘消毒手术区域。将小鼠置于仰卧位，并将其四肢固定在集成的心电图电极上。在加热板系统中，建议使用包含直肠温度探针的装置，该探针连接至由热分析系统控制的加热垫，以维持小鼠体温在37±1°C。通过夹捏测试确认小鼠已完全麻醉后，在正中线右侧、锁骨水平处做一长约半英寸的切口。通过钝性分离皮下组织、唾液腺和淋巴组织。为暴露右侧颈静脉，用6-0缝线结扎静脉近端。在可视血管节段的远端下方放置另一根缝线。现在启动基于计算机的数据采集系统，以记录体表心电图。将导管连接至外部刺激器，并置于记录模式。接下来，用显微剪刀在静脉的纵向上做一小切口，同时轻轻牵拉近端缝线。为帮助保持静脉平直，将1.1 French Octo拉出导管经静脉送入右心房和右心室。通过观察右心室心尖部、右心室基底部、房室结以及右心房水平的四种心内电图波形，确认导管位置正确，最后结扎远端缝线以固定导管位置，并防止心房起搏时可能发生的出血。位于心房内的电极对从记录模式切换至刺激模式，而其他电极对保持在记录模式。为了确定小鼠是否具有更高的心房心律失常易感性，需进行右心房程序性电刺激。首先，通过在不同基础起搏周长（BCL）下施加至少52毫秒的电流脉冲，以检测刺激捕获的一致性，从而确定心房起搏阈值。初始脉冲序列的基本周期长度（BCL）略低于固有BCL，并缩短10毫秒。刺激捕获所需的典型电流幅度为100至200微安。在以100毫秒的基本周期（BC）进行15秒的心房起搏后，测量窦房结恢复时间（SNRT），该时间定义为起搏序列中最后一个刺激与其后首次自发性窦性心搏开始之间的间期。为了测定心房有效不应期（A ERP），在固定的BCLS下进行一系列心房起搏，每次起搏包含一个或数个较短的期前刺激S2。S1至S2间期在每次起搏序列中逐步缩短2毫秒，范围从70毫秒递减至20毫秒，每次刺激方案之间至少留有30秒的恢复期。A ERP定义为S1至S2最长的耦合间期，此时心房对S2刺激未能产生可传导的搏动。类似的心房起搏刺激序列和期前刺激方法可用于测定房室结的有效不应期（AV NERP）。AV NERP 定义为：在心房给予期前刺激后，仍能跟随希氏束电位但不再跟随QRS波群的最长S1-S2耦联间期。可采用短阵快速起搏方案检测心房心律失常（包括心房颤动）的可诱发性，该方案通过施加一系列持续2秒的短阵刺激实现。前两次持续两秒的脉冲刺激的周期长度（CL）为40毫秒，随后每次持续两秒的脉冲刺激的CL比前一次缩短2毫秒，直至最终CL达到20毫秒。所有起搏方案完成后，停止数据采集。在终末期电生理研究的情况下，可轻轻松开结以取出导管。此处展示小鼠的一些代表性体表心电图和心内电图。该体表心电图显示规律的窦性心律，频率约为每分钟540次。接下来的四个电图显示右心房水平的双极心内电图记录。房室结、右心室底部以及右心室心尖。在右心房水平记录的心内电图中的a波，对应体表心电图上的P波。心室电图中的V波对应体表心电图上的QRS波。接下来，我们展示一例在体表CCG上经心房爆发性起搏后发生心房颤动的小鼠的代表性体表CCG及心内电图。在体表CCG中，RR间期不规则，且无明显P波。而心房电图则显示出快速且不规则的心房信号，符合心房颤动的特征。心室内电图的频率较慢，与体表导联的RR间期相似。我们刚刚向您展示了如何在小鼠中进行程序性电刺激。在执行此操作时，重要的是要注意避免大量出血，并将体温维持在36至37摄氏度的正常范围内。此外，应尽量减少对异氟烷的暴露，因为长时间（超过两小时）暴露于较高浓度的异氟烷可能会抑制小鼠的心脏和呼吸功能。因此，我们建议所有操作均应在两小时内开始。就到这里。感谢观看，祝您的实验顺利。

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