从晚期果蝇蛹的大脑原发性神经文化

我叫 Diana Dowd，是加州大学欧文分校解剖学和神经生物学系以及发育和细胞生物学系的教授。今天，我将向您介绍从 Drosophila Papi 制备神经元培养物的过程。这涉及从晚期 Pupi 中取出大脑，我们通常只培养中央大脑区域。

在这个阶段，成人大脑中存在的主要解剖结构已经形成。这包括触角叶，其中有投射神经元将其轴突一直向上发送到蘑菇体区域，以及蘑菇体神经元，肯尼亚细胞，它们通过 Alpha、β 和 γ 叶将其轴突向下发送到目标神经元。在培养当天，我们做的第一件事是进入层流罩，准备无菌酶溶液，我们将用它来解离组织。

我们还配制了用于培养细胞的培养基。这是由我们提前准备好的茎制成的。下一步是收集我们将用于此解离或解剖的 pupi。

这是在引擎盖外完成的，因为这些是在含有酵母和各种其他物质的小瓶中生长的。因此，我们实际上是在引擎盖外进行解剖的初始阶段。这些是我刚刚从小瓶侧面取下的窥视物，在左边的这一排，我们有红眼睛的动物，它们是培养的好舞台。

这些人稍微年轻一些。他们有橙色或黄色的眼睛，这是一条还可以的 1 0 7 线。它们的眼睛比普通的野生类型略亮，在这些阶段的颜色会更棕色。

所有这些阶段都适合培养，适合让人们进行大脑培养。好的，第一步是将几滴解剖液滴在我拔出并排成培养皿中的幼犬旁边。我们使用 35 毫米培养皿的顶部。

然后，我用左手拿一对 5 号镊子和一个末端带有 27 号针头的 CC 结核菌素注射器。这是我的两个剖析工具。要从瞳孔或幼崽中取出头部，基本上我必须使用 i，我用左手用镊子握住幼崽，然后用右手的针头取出瞳孔的前部。

然后我将拉力向后拉，角质层覆盖物，头部从前面弹出。然后我用针头切断颈部区域的 I，然后拿起头部并将其放入解剖盐水滴中。我将重复此过程 10 到 15 次，因为为了实现良好的培养，我喜欢每种基因型 10 到 15 只动物。

好了，我要从动物的头部取出大脑。为此，我使用两个结核菌素注射器，每个注射器都装有 27 号针头。我将左针直接穿过动物的 psis 将头部固定到培养皿底部。

然后我用右针在右侧打开一个缝隙，这就是我要将大脑推出的地方。好的，我现在，下一步是将我的左针放在左眼上。现在我实际上只是向前推，大脑应该通过缝隙从右侧出来。

来了。您可以在右侧看到它，现在我只需用右针即可将其与头部囊和眼睛的其余部分分开。好。现在，在进行最后的解剖之前，即去除视叶，我将大脑转移到一滴干净的生理盐水中。

我可以使用管式 eman 来做到这一点，我在 20 微升管式 eman 的尖端拾取它，并将其设置为 5 微升，或者我实际上也可以将其转移到针头上。这是解剖程序的最后一个阶段。它是在一滴新鲜的盐水中完成的，通常我这里大约有 10 到 15 个大脑。

然后，我使用 27 号针作为切割工具，从每个大脑上去除视叶，然后切断每个大脑的左视叶和右视叶。此时，所有以这种方式加工的大脑都将被转移到一个装有酶溶液的试管中，该试管将用于酶解离。来自单个基因型的所有大脑都放入一个 epi 螺旋盖 einor 管中，该管包含一研磨的酶溶液。

然后我们只需将它们插入试管支架中，然后将它们放在旋转器上，在室温下放置 10 到 15 分钟。这就是 Dissociation 的实际时间。为了完成酶解离步骤，我们实际上必须去除酶。

因此，我们将试管带到 EOR 离心机中，将试管放入离心机中，然后以 3000 RPM 的速度将它们旋转 3 分钟。在我们旋转大脑后，我们现在将它们带到我们的层流罩中。这是程序的无菌部分开始的地方。

除非我们在层流罩中，否则我们现在不会打开试管，我们现在将去除酶溶液。我们将用解剖液代替它，然后我们将用解剖液旋转和洗涤多次，最后得到成分确定的培养基，这就是我们培养细胞的培养基。好吧。

我需要做的第一件事是，我需要在这些培养皿中的每个盖玻片上滴一滴 5 微升盐水。每个培养皿只有一个盖玻片，并且涂有 con a 层粘连蛋白，所以我在盖玻片的中间滴了一滴 5 微升。那是我那滴层粘连蛋白的地方。

这非常重要，因为您希望将细胞集中在田间，因为我们每个大脑大约有 10， 000 个细胞，这就是我们进行单一培养物时所用的。好的，现在看看显微镜，这里有 9 个已经经历了酶解离程序的大脑。你可以看到它们仍然几乎完好无损。

他们没有视叶。这些都被去除了，但我们只有中枢大脑区域，现在我要吸取一个大脑，并将其移到盖玻片上的 5 微升滴剂中。我这样做了四次。

我拿了两个 1 个 CC 注射器，放在 27 号针头上。同样，重要的是要注意这些是非常便宜的一次性解剖工具，因此本科生可以这样做而不必担心您的预算。好了，现在我有了两根针，我将进行初始的机械解离，即将这个大脑切成几块，这样我就可以在一分钟内将这些碎片吸到玻璃移液器中，以完成最后的解离。

当我这样做时，我不会把它们弄成小块，我只想增加或减少总尺寸，这样我就可以得到一点点，这样当我进行解离时，移液器会得到比整个大脑略小的碎片。我还想相对较快地完成，因为您会看到介质的滴数很小。这意味着我们的表面体积比很高，如果我将溶液放置任意时间，溶液的 pH 值和渗透压都会发生变化。

当我第一次做这件事时，我实际上一次只做两个大脑，一次做两种培养物。现在我通常做四个，现在我要打破移液器，但我不能谈论它或其他任何事情，对吧？这个我刚刚完成。

解离，移液管的大小相当不错。我能够上下吸吮组织几次，你可以看到单个细胞，我们仍然有团块，但这没关系。他们会冲走的。

现在，培养物一旦铺板，就被放入第二个培养皿中，并在几分钟内被放入 CO2 培养箱中，因为我们希望确保将 pH 值和渗透压维持在支持其生存的水平。所以我们把它们放在这里 30 分钟，然后把盘子淹没。这些培养物是从晚期 Pupi 的大脑制备的。

培养物已在 CO2 培养箱中生长两天，您可以看到具有扩展过程的单个细胞。过程阐述的程度小于您在 5 天内看到的程度，也大于您在 1 天内看到的程度。我叫豪尔赫·阿诺。

我在 Doubts 实验室工作。我现在要向大家展示我们如何进行实验，即我们刚刚准备的人类培养物中的钙成像实验。这是一段钙成像实验的视频，您看到蓝色单元格显示低，表示钙水平低，红色单元格表示钙水平高。

我们会看到有一些细胞变成红色，这表明细胞内钙水平增加。这些是自发的，也是短暂的。随着时间的推移，它们会回到 Baal 钙水平，一段时间后，我们将使用一种药物，在本例中为尼古丁，您会看到细胞内钙水平增加。

我们涂抹尼古丁 100 秒，然后我们注意尼古丁，然后细胞恢复到基础钙水平。因此，这种培养系统的真正优势在于，我们能够从转基因和突变的果蝇系中制备培养物，不同的果蝇系用 GFP 标记不同的神经元亚群。这是我们使用的其中一条细胞系的大脑，其中 GFP 在蘑菇体、肯尼亚细胞、参与介导复杂行为（包括学习和记忆）的神经元中表达。

细胞体位于大脑背侧红色箭头所在的区域周围。而这些 GFP 阳性的 L 形结构实际上是这些蘑菇体肯尼亚细胞的轴突投射。这个脑组织解离后。

神经元在培养物中再生它们的过程，在这种情况下，您可以轻松识别 GFP 阳性肯尼亚细胞。这些可用于标准的电生理记录和钙成像研究。因此，这些培养物是探索遗传和环境因素的真正有用的工具，这些因素对调节神经元的功能很重要，我们知道这些因素在介导成年动物的复杂行为方面很重要。