Name: 从晚期果蝇蛹的大脑原发性神经文化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 12 s
Description: 了解如何从晚期果蝇蛹的大脑制备原代神经元培养物，包括解剖中央脑区、酶解分离和Fura-2钙成像技术。该方法可用于研究神经元发育和神经活动动态。

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本研究工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）授予 DKOD 的基金项目 NS27501 的资助。此外，霍华德·休斯医学研究所（HHMI）教授项目向加州大学欧文分校（UC Irvine）提供的基金也对本研究工作提供了额外支持，以资助 DKOD。

培养前的准备工作：
<ol>
<li>制备无菌解剖液。</li>
<li>制备无菌DMEM，并以10 ml分装保存于4°C，可存放2周。</li>
<li>制备无菌DDM2添加剂，并以50或100 µl分装后冷冻保存，可存放1个月。</li>
<li>制备ConA/层粘连蛋白溶液。</li>
<li>包被盖玻片。      可选：制备无菌CNBM，冷冻保存，最长可存放4个月。</li>
</ol>
培养当天
一、&nbsp; 在超净工作台中配制酶溶液（ES）
<ol>
<li>在15 ml离心管中加入5 ml解离液（DS）。</li>
<li>在0.6 ml离心管中称取0.8 mg L-半胱氨酸，并加入150 µl解离液（DS），反复吹打直至晶体完全溶解。</li>
<li>将150 µl DS/半胱氨酸溶液加入5 ml DS中，并充分混匀。</li>
<li>加入50 U（单位）木瓜蛋白酶（Papain）。</li>
<li>加入7 ml 0.1 N NaOH，并充分混匀。激活后溶液将在30分钟内变澄清。&nbsp;</li>
<li>使用0.2 mm注射器滤器将酶溶液过滤至无菌的1.5 ml螺口微量离心管中 &nbsp;    木瓜蛋白酶（Papain）：需在5 ml DS中加入50 U。每批酶活性略有差异，因此需计算用量：                                     浓度为37.3 mg/ml，活性为28.3 U/mg                                      37.3 × 28.3 = 1055.59 U/ml   (1000 ml)                                                                  50 U&nbsp; = 47.4 µl </li>
</ol>
II. 配制 DDM2 培养基
培养当天：加入以下补充成分以配制 DDM2
在培养前，向 10 ml DMEM 中加入以下补充物：
<ol>
<li>100µl 转铁蛋白</li>
<li>100µl 腐胺</li>
<li>100µl 硒</li>
<li>100µl 孕酮</li>
<li>50µl&nbsp; 胰岛素</li>
<li>10µl 20-羟基蜕皮酮</li>
</ol>
注意：为所有计划的培养物制备足够的DDM2（每个脑组织置于单独的35 mm培养皿中的单个盖玻片上，每种培养物培养基体积为1.5 ml）
步骤 III 至 VI 可在非无菌实验台进行，且应在 45 分钟或更短时间内完成。
三、蛹的收集
<ol>
<li>在解剖显微镜下，从培养管壁选择10-15只蛹。</li>
<li>将蛹放置在干燥的35 mm培养皿盖中。&nbsp;</li>
</ol>
注意：我们通常使用蛹化后55至78小时（APF）的蛹脑。较年轻的蛹脑较难解剖，因为其头囊容易塌陷；而较老的蛹脑神经突起生长的整体水平则略低。在Canton-S野生型品系中，这些阶段的特征是眼睛呈浅棕色至微红色，其他部位色素较少。
IV. 在解剖显微镜下进行断头
<ol>
<li>在培养皿盖内靠近蛹的位置滴加两滴无菌解剖液。</li>
<li>用左手持精细镊子轻轻夹住一只蛹，右手持连接1毫升注射器的27号针头，去除蛹体前端的角质层。</li>
<li>用镊子轻轻挤压蛹体，当头部露出时，用27号针头切断颈部。</li>
<li>用针头尖端或镊子将头部转移至解剖液滴中。</li>
<li>重复上述操作，直至单滴解剖液中收集10–15个头部。</li>
</ol>
V. 在解剖显微镜下从头部取出脑组织
<ol>
<li>每只手中各持一个带有27号针头的1 cc注射器。</li>
<li>用注射器将果蝇头部置于解剖液滴中，使吻部朝向操作者，头部背侧朝北。</li>
<li>将左侧针头插入吻部以固定头部，用右侧针头在右眼处做一个切口，切口方向从腹侧延伸至背侧。</li>
<li>将右侧针头插入靠近左侧吻部区域，然后用左侧针头轻轻下压左眼上方的角质层，将脑组织推向右侧的切口。脑组织应相对完整地从右侧切口挤出，通常两侧视叶仍附着，有时还带有色素化的眼组织。</li>
<li>用针头背部将脑组织推入一个新的无菌35 mm培养皿中的无菌解剖生理盐水液滴内。</li>
<li>每种基因型收集10–15个脑组织。 </li>
</ol>
六、视叶的切除与酶处理
<ol>
<li>每只手中持有一个带27号针头的1 cc注射器，用它们将所有脑组织聚集到一滴解剖液中的小范围内</li>
<li>将注射器用作切割工具，从每个脑组织上切除视叶，使剩余用于培养的组织为中央脑区</li>
<li>使用20 µl移液器（设定体积为5 µl），将同一基因型的所有脑组织转移至含有1 ml无菌木瓜蛋白酶溶液的离心管中</li>
<li>将脑组织在60 rpm转速的摇床上用木瓜蛋白酶溶液孵育10–15分钟</li>
<li>以3000 rpm离心3分钟 </li>
</ol>
在无菌超净工作台内——所有组织暴露于空气中的步骤，后续均应在超净工作台内进行。
七、洗涤
<ol>
<li>移除酶溶液，并替换为无菌解剖液。</li>
<li>以 3000 rpm 离心 3 分钟。</li>
<li>用无菌解剖液总共洗涤 3 次。</li>
<li>移除解剖盐溶液，并替换为 DDM2。</li>
<li>用 DDM2 总共离心并洗涤 2 次。</li>
<li>将脑组织和培养基转移至无菌的 35 mm 培养皿中。 </li>
</ol>
八、在解剖显微镜下进行吹打和接种
<ol>
<li>将5 μl DDM2置于盖玻片中央。</li>
<li>用黄色枪头将1个脑组织转移至该滴DDM2中。</li>
<li>在显微镜下，使用27号针头将脑组织切碎成小块（应耗时 &lt;1 分钟。</li>
<li>在视觉引导下，折断一根吸头的尖端&nbsp; 已拉制成细尖的玻璃移液管，以便将较大的组织块轻轻吸入移液管尖端，并重新排回培养基中。我们使用配有标准100 µl血细胞比容毛细玻璃管的口吸移液装置。 注意：注意避免在培养基中产生气泡，且需通过实验确定最适合的移液器规格。理想的消化效果是能在约30秒/脑组织内将脑组织解离成部分单细胞和部分较大的细胞团块。在高倍镜下观察时，约有10–20%的神经元应仍保留部分突起，同时仍可见一些较大的细胞团块。若解离过度，则所有细胞将变为圆形，且因损伤严重而无法存活。该步骤需要练习，并且必须快速完成，由于组织表面积与体积比较大，DDM2液滴的渗透压和pH值会迅速变化。组织需立即置于CO₂培养箱中2 尽快将孵育器放回。 </li>
<li>在培养皿盖上标注：“基因型、日期和时间”。</li>
<li>将35 mm培养皿放入100 mm培养皿中（内含湿润的吸水纸），并在CO₂培养箱中静置平衡2 30 分钟孵育。</li>
<li>用 1.5 ml DDM2 充满 35 mm 培养皿。</li>
<li>将培养物置于含5% CO₂的培养箱中培养2 23°C 培养箱 注意：如果你无法使用冷却的CO₂培养箱2 培养箱，使用标准的哺乳动物组织培养箱，可将其置于低温房间并加热至23°C，或放置于实验室中，关闭温度控制，于培养箱底部托盘内放置冰块以将温度调节至接近室温。 </li>
</ol>
IX. 喂养细胞
<ol>
<li>第1天（次日），加入0.5 ml CNBM/B27（条件培养基），配制成3:1 DDM2:CNBM/B27的培养基。</li>
<li>第5天，更换1 ml培养基为3:1 DDM2:CNBM/B27。</li>
<li>每隔4–5天以3:1 DDM2:CNBM/B27继续喂养细胞。 注意：培养物可在无非神经元条件培养基的条件下生长，但神经元会显得较为脆弱，在进行电生理实验时更难操作。</li>
</ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. (1991).</li>
<li>Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+bases+of+behavioral+plasticity%3A+Establishing+and+Modifying+synaptic+circuits+in+the+Drosophila+Genetic+System%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cellular bases of behavioral plasticity: Establishing and Modifying synaptic circuits in the Drosophila Genetic System.</a> J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).</li>
<li>O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-gated+currents+and+firing+properties+of+embryonic+Drosophila+neurons+grown+in+a+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-gated currents and firing properties of embryonic Drosophila neurons grown in a chemically defined medium.</a> J. Neurobiol. 27, 113-126 (1995).</li>
<li>Lee, D., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+excitatory+synaptic+transmission+mediated+by+nAChR+in+cultured+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast excitatory synaptic transmission mediated by nAChR in cultured Drosophila neurons.</a> J. Neurosci. 19, 5311-5321 (1999).</li>
<li>Su, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+synaptic+currents+in+Drosophila+mushroom+body+Kenyon+cells+are+mediated+by+alpha-bungarotoxin-sensitive+nAChRs+and+picrotoxin-sensitive+GABA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast synaptic currents in Drosophila mushroom body Kenyon cells are mediated by alpha-bungarotoxin-sensitive nAChRs and picrotoxin-sensitive GABA receptors.</a> J. Neurosci. 23, 9246-9253 (2003).</li>
<li>Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+mushroom+body+Kenyon+cells+generate+spontaneous+calcium+transients+mediated+by+PLTX-sensitive+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels.</a> J. Neurophysiol. 94, 491-500 (2005).</li>
<li>Campusano, J. M., Su, H., Jiang, S. A., Sicaeros, B., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nAChR-mediated+calcium+responses+and+plasticity+in+Drosophila+Kenyon+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">nAChR-mediated calcium responses and plasticity in Drosophila Kenyon cells.</a> Develop Neurobiol. 67, 1520-1532 (2007).</li>
<li>Oh, H. -W., Campusano, J. M., Hilgenberg, L. G. W., Sun, X., Smith, M. A., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+chemical+synapses+and+gap+junctions+between+Drosophila+brain+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of chemical synapses and gap junctions between Drosophila brain neurons in culture.</a> Develop Neurobiol. , (2007).</li>
</ol>

从胚胎期或出生后啮齿类动物脑组织中分离的神经元可在原代细胞培养体系中生长，其可延伸出神经突并形成具有功能的突触连接。此类培养方法已较为成熟，且啮齿类神经元培养研究在鉴定参与突触形成与功能调控的基因及环境因素方面发挥了关键作用（Banker 和 Goslin，1991）。尽管多种昆虫的神经元也可在体外培养，但迄今仅发现果蝇（Drosophila）神经元可在培养中形成具有功能的突触连接（Rohrbough 等，2003）。在确定培养基中培养的原肠中期果蝇胚胎来源的神经母细胞可分化为具有电兴奋性的神经元，并形成功能性神经元间突触连接（O'Dowd，1995；Lee 和 O'Dowd，1999）。为了鉴定那些已知参与介导成年个体行为的神经元中调控突触形态与功能的因素，我们开发了本视频所展示的技术，用于从晚期果蝇脑组织中分离并培养神经元（Su 和 O'Dowd，2003）。该方法的一个关键特征是使用木瓜蛋白酶（papain），而非传统昆虫神经元培养中常用的胶原酶或其他强效酶。木瓜蛋白酶处理后获得的离散神经元可保留较短的轴突结构，这些神经元能够存活、再生神经突，并形成功能性神经元间突触连接。对特定细胞群（包括蘑菇体Kenyon细胞）进行全细胞记录显...

<table><tbody><tr><td>Concanavalin A</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-2010</td><td>向2.5 mL DS中加入25 mg刀豆蛋白A（Concanavalin A）瓶装试剂，配制成10 mg/mL浓度。分装为每份90 μL，于-20℃保存。 &amp;deg;C，不超过3个月。</td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-2020</td><td>向1 mg 层粘连蛋白（Laminin）瓶中加入1 mL DS，配制成0.5 mg/mL浓度。分装成10份 &amp;mu;L，并在 -20 保存 &amp;deg;C，不超过3个月。</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td></td><td>贝尔科玻璃</td><td>1943-00012</td><td>12 mm 玻璃盖玻片</td></tr><tr><td>ConA + 层粘连蛋白溶液</td><td></td><td></td><td></td><td>储备液（Con A 储备液与层粘连蛋白储备液），用于盖玻片包被：在 5 mL DS 中加入 83.5 &amp;mu;L of ConA (167 &amp;mu;g/mL）和 8.35 &amp;mu;uL 层粘连蛋白（0.835） &amp;mu;g/mL）。混合。分装成每份100 &amp;mu;L 并在 -20℃ 下保存 &amp;deg;C，不超过一个月。</td></tr><tr><td>解剖液</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td>500 ml 配方：400 ml 超滤水 + 25 ml 储存液 A + 14 ml 储存液 B + 3.0 g (33.3 mM) D-(+)-葡萄糖 (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) 蔗糖 (Sigma S-0389)。用 1 N NaOH（约 2 ml）调节 pH 至 7.4。用超滤水定容至 500 ml。倒入洁净玻璃瓶中，高压灭菌。贴标签 &quot;解剖液&quot; 并在 4°C 下保存。 </td></tr><tr><td>解剖液</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td>500 ml 配方：400 ml 超滤水 + 25 ml 储存液 A + 14 ml 储存液 B + 3.0 g (33.3 mM) D-(+)-葡萄糖 (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) 蔗糖 (Sigma S-0389)。用 1 N NaOH (约 2 ml) 调节 pH 至 7.4。用超滤水定容至 500 ml。转移至洁净玻璃瓶中，高压灭菌。贴标签 &quot;解剖液&quot; 并在 4°C 下保存。 </td></tr><tr><td>溶液B：HEPES</td><td>缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3375</td><td>20.97克（9.9 mM）。加入超滤水至200毫升，搅拌至完全溶解，再定容至250毫升。置于洁净瓶中，高压灭菌。贴标签 &quot;溶液B&quot; 并在 4 °C 下保存。 </td></tr><tr><td>溶液A</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td>500 ml 配方：80.0 g（137 mM）NaCl（Sigma S-9625）、4.0 g（5.4 mM）KCl（Sigma P-4504）、0.24 g（0.17 mM）Na2HPO4（Sigma S-0876）、0.3 g（0.22 mM）KH2PO4（Sigma P-5379）。称取所有组分，加入 400 ml 超滤水搅拌至完全溶解，加水定容至 500 ml。转移至洁净容器中，高压灭菌。贴标签 &quot;溶液A&quot; 并在4℃保存&amp;deg;C. </td></tr><tr><td colspan="5">包被盖玻片：将经高压灭菌的盖玻片放入60 mm培养皿中。用移液器将5 μl的Con A/层粘连蛋白混合液滴加至每张盖玻片中央。置于37°C培养箱中孵育2小时。每次用100 μl高压灭菌水对盖玻片进行冲洗，共冲洗3次，使用连接真空泵的无菌巴斯德吸管进行操作。在最后一次冲洗时，用镊子夹起盖玻片并干燥两面。将盖玻片转移至35 mm培养皿中。室温保存，最长可保存一个月。</td></tr></tbody></table>

晚期果蝇蛹脑中的原代神经元培养

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

在本视频中，我们演示了从晚期果蝇蛹脑中制备原代神经元培养物的方法。该操作始于在蛹壳形成后70-78小时的果蝇中取出脑组织。分离的脑组织经木瓜蛋白酶短暂孵育后，再用无血清生长培养基多次洗涤。视频展示了将单个脑组织置于盖玻片上5 μl培养液液滴中进行机械解离的过程。在解离过程中，有丝分裂后神经元的轴突和树突在胞体附近被剪切，但神经元在接种后数小时内即开始再生突起。图像显示了培养2天后的活细胞状态。神经元在培养的第一周内持续形成复杂的突起结构。利用GAL4品系驱动荧光标记物（如GFP或RFP）在特定组织中的表达，可在培养物中识别特定的神经元群体。全细胞记录表明，这些培养的神经元能够形成具有功能的、自发活跃的胆碱能和GABA能突触。一段短视频展示了使用钙离子指示染料Fura-2监测培养神经元中钙离子动态的过程，包括自发钙瞬变以及尼古丁诱导的钙反应。这些蛹期脑组织培养物是一种有用的研究模型系统，可用于结合遗传学与药理学工具，鉴定影响中枢突触形成与功能的内在与外在因素。

关键词：原代神经元培养，果蝇蛹脑，GAL4系统，荧光标记，GFP，RFP，木瓜蛋白酶消化，机械解离，无血清培养基，突触形成，胆碱能突触，GABA能突触，全细胞膜片钳记录，钙成像，Fura-2，钙瞬变，尼古丁反应，中枢神经系统，神经元再生，突起发育

本视频展示了如何从晚期果蝇蛹脑中制备原代神经元培养物。活体培养物的图像显示了神经突的生长，以及使用Fura-2对钙离子水平进行成像。

在本视频中，我们演示了如何从晚期果蝇蛹脑中制备原代神经元培养物。该操作流程始于……

我叫 Diana Dowd，是加州大学欧文分校解剖学与神经生物学系以及发育与细胞生物学系的教授。今天我将为大家介绍如何从黑腹果蝇蛹中制备神经元培养物。该过程包括从晚期蛹中取出脑组织，我们通常仅培养中央脑区域。在此阶段，成年脑中主要的解剖结构已经形成。这包括触角叶，其中的投射神经元会将其轴突一直延伸至蘑菇体区域，以及肯扬细胞（Kenyan cells），这些蘑菇体神经元会通过α、β和γ叶将其轴突延伸至靶神经元。在培养当天，我们首先要进入超净工作台，制备用于组织解离的无菌酶溶液。我们还会配制用于培养细胞的培养基，该培养基由我们预先准备好的茎段制成。下一步是收集将用于解离或解剖的蛹。这一操作在超净台外进行，因为这些样品培养在含有酵母及其他各种成分的小瓶中。因此，解剖的初始步骤实际上是在超净台外完成的。这些是我刚从一个小瓶壁上取下的果蝇，左侧一列是具有红眼的个体，处于适合培养的发育阶段。这些果蝇稍年轻一些，这里的PPP品系果蝇年龄略小。它们具有橙色或黄色的眼睛，属于正常的1 0 7品系。与普通野生型相比，它们的眼睛颜色更明亮一些，因为在这些发育阶段，野生型的眼睛颜色会偏棕色。所有这些阶段都适用于培养人脑类器官。好的，第一步是在我取出并排列在培养皿中的幼虫旁边滴加几滴解剖液。我们使用的是35毫米培养皿的盖子。然后，我用左手持一把5号无齿镊子，右手持一支1 mL结核菌素注射器，末端装有27号针头。这两样是我用于解剖的工具。要将头部从瞳孔囊或蛹体中取出，基本上需要这样做：我用左手的镊子夹住蛹体，再用右手的针头去除瞳孔囊的前部。然后，我将表皮切口向后拉开，使头部从前端露出。接着用针在颈部区域切断，挑起头部并将其放入一滴解剖用生理盐水中。我会重复此操作10到15次，因为为了获得良好的培养样本，我通常需要每种基因型的动物10到15只。好的，我将从动物头部取出脑组织。为此，我使用两个结核菌素注射器，每个注射器均装有一根27号针头。将左侧针头穿过动物的枕骨大孔，以将头部固定在培养皿底部。然后用我的右手持针在右侧切开一个切口，脑组织将从该切口推出。好的，下一步是将左针置于左眼上方。现在我将轻轻向外推挤，脑组织应从右侧的切口中推出。现在开始了。你可以从右侧看到它，现在我可以用我的右手持针将其与头壳其余部分和眼睛分离。好了。在进行最后一步解剖（即去除视叶）之前，我将脑组织转移到一滴干净的生理盐水中。我可以使用移液枪的枪头来完成这一步，用20微升移液枪的尖端吸取，并将移液枪设定在5微升；或者我也可以直接用针头进行转移。这是解剖过程的最后一步。操作在新鲜的一滴生理盐水中进行，通常这里会有大约10到15个脑组织。然后，我使用27号针头作为切割工具，从每个样本中去除视叶，先切断左侧视叶，再切断右侧视叶。完成此步骤后，所有经过该处理的脑组织将被转移至含有酶溶液的离心管中，用于后续的酶解离。同一基因型的所有脑组织均放入同一个含有1 mL酶溶液的eppendorf螺口离心管中。然后将它们插入试管架中，置于旋转仪上，在室温下放置10至15分钟，此即解离的实际时间。为完成酶解离步骤，必须去除酶液。因此，我们将试管转移至EOR离心机，将试管放入离心机中，并以3000 RPM的转速离心3分钟。离心完成后，将样本转移至超净工作台。自此，实验操作进入无菌阶段。现在，除非在层流罩内，否则我们不再打开离心管，接下来将移除酶解液。我们会用解剖液替代，然后用解剖液反复离心洗涤数次，最后用定义培养基（Defined medium）终止，该培养基即为细胞培养所用的培养基。好的。我在这里首先要做的，是在这些培养皿中的每一片盖玻片上滴加5 µL的生理盐水。每个培养皿中含有一片盖玻片，且已包被了Con A和层粘连蛋白（laminin），因此我将5 µL的液滴直接加在盖玻片中央，也就是层粘连蛋白所在的位置。这一步非常重要，因为需要将细胞集中在视野正中央，我们每个脑组织大约能获得 10,000 个细胞，而这就是我们用于制备单个培养物的细胞量。好的，现在通过显微镜观察，这里已经有九个脑组织完成了酶解离过程，可以看到它们仍然基本保持完整。它们没有视叶，这些结构已被去除，我们只保留中央脑区。现在，我将用移液器吸取一个脑组织，转移到盖玻片上5 µL的液滴中。这个过程重复四次。我取两个1毫升的注射器，装上27号针头。需要再次强调的是，这些工具价格低廉且为一次性解剖器械，因此本科生操作时无需担心预算问题。现在我已准备好两根针头，接下来将进行初步的机械解离，即把脑组织切成若干小块，以便一分钟后能顺利将这些组织块吸入玻璃移液管中，完成最终的解离步骤。进行此操作时，我不需要将组织切碎至极小的片段，只需减小总体积即可，这样在使用移液器进行解离时，能够获得比完整脑组织略小的组织块。我还希望操作尽可能迅速，因为培养基液滴较小，这意味着表面积与体积之比较大，若放置时间稍长，溶液的 pH 值和渗透压均可能发生改变。刚开始进行这项操作时，我实际上一次只处理两个脑组织，即两个培养物。现在我通常一次处理四个，现在我要把移液管折断了，但我不能谈论这件事，对吧？这个我刚刚完成。解离后，移液管的尺寸非常合适。我能够将组织反复吹打几次，可以看到单个细胞，尽管仍存在一些团块，但这没有关系，这些团块后续会通过洗涤去除。现在，培养物一旦接种完成，需立即放入另一个培养皿中，并在几分钟内置于 CO₂ 培养箱内，以确保其 pH 值和渗透压维持在支持细胞存活的水平。因此，我们在加液淹没培养皿前，先将其放置于此处孵育 30 分钟。这些培养物取自晚期蛹期果蝇的脑组织。该细胞培养物已在 CO₂ 培养箱中培养两天，可见单个细胞已伸出突起。突起的延伸程度较培养五天时少，但较培养一天时更明显。我的名字是 Jorge Ano。我在Doubts实验室工作。现在我将向您展示如何在刚刚制备好的人源细胞培养物中进行钙成像实验。这是一段钙成像实验的视频，其中蓝色细胞表示钙水平较低，红色细胞表示钙水平较高。我们将观察到一些细胞变为红色，这表明细胞内钙离子水平升高。这些变化是自发的，且为瞬时性的，随时间推移会恢复至基础钙离子水平。一段时间后，我们将施加一种药物，本实验中为尼古丁，此时您将看到细胞的细胞内钙离子水平升高。我们施加尼古丁持续100秒，然后洗去尼古丁，随后细胞的钙水平恢复至基础状态。因此，这种培养系统真正的优势在于，我们可以利用转基因果蝇和突变果蝇的不同品系来建立培养物，其中不同神经元亚群被标记了GFP。这是我们所使用的一个品系的脑组织，其中GFP在蘑菇体和肯扬细胞中表达，这些神经元参与调控包括学习和记忆在内的复杂行为。细胞体位于大脑背侧区域，即红色箭头所指的位置。这些呈绿色荧光蛋白（GFP）阳性的L形结构，实际上是这些蘑菇体肯扬细胞的轴突投射，是在脑组织解离之后观察到的。神经元在培养过程中会再生其突起，在此情况下可轻松识别出表达GFP的肯尼亚细胞。这些细胞可用于标准的电生理记录和钙成像研究。因此，这类培养物是研究调控成年动物中介导复杂行为的关键神经元功能的重要遗传和环境因素的非常有用的工具。

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生物学

从晚期果蝇蛹的大脑原发性神经文化

本视频展示了从中肠胚期果蝇胚胎制备原代神经元培养物的方法。活细胞培养物的图像显示了接种后1小时的细胞状态，以及在碳酸氢盐为基础的限定培养基中生长2天后的分化神经元。这些神经元具有电兴奋性，并能形成突触连接。...

中肠胚期果蝇胚胎神经元培养物的制备

本文介绍了一种可模拟的方法 体内 发育 果蝇 蕈体在其中 离体...

ex vivo 培养完整发育中的Drosophila 大脑

本视频演示了一种鉴定外源因子启动果蝇（Drosophila）脑神经干细胞从静息状态重新活化的实验方案。通过解剖刚孵化的幼虫以分离其大脑组织，随后将脑组织置于含有或不含待测激素的培养基中进行培养，以评估该激素是否具有诱导神经干细胞重新活化和增殖的潜力。...

分析培养的果蝇脑外植体中神经干细胞的再激活

本文描述了一种利用果蝇幼虫腹神经索的损伤模型，用于研究中枢神经系统（CNS）的再生与修复。通过穿刺损伤，结合活体及固定样本的时间序列激光共聚焦显微镜成像，并利用专门开发的软件与遗传学工具进行定量分析，以探究中枢神经系统再生与修复的分子机制。...

一种用于研究中枢神经系统修复的损伤范式 果蝇

黑腹果蝇 S2细胞和培养神经元是成像研究马达驱动的细胞器运输的理想体系...

培养细胞中的细胞器运输 果蝇 细胞：S2细胞系和原代神经元

免疫染色是一种用于可视化组织内特定细胞类型和蛋白质的有效技术。通过利用超声处理，本文所述的方案消除了在对晚期胚胎和幼虫进行免疫染色前解剖黑腹果蝇（Drosophila...

超声处理辅助的晚期胚胎与幼虫免疫荧光染色 黑腹果蝇 组织 原位

本方案详细描述了一种用于完整幼虫大脑中活细胞成像的简化方法。活细胞成像技术对于研究不对称神经干细胞分裂以及其他神经发生和发育过程具有重要价值，能够持续揭示以往被忽视的机制。...

活体成像 黑腹果蝇 幼虫神经母细胞

本方案描述了成年个体的解剖与免疫染色方法 黑腹果蝇 脑组织。具体而言，本方案重点介绍了使用 果蝇...

成年黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）大脑中蘑菇体与光感受器神经元的解剖及免疫荧光染色

本实验方案的目的是建立 离体果蝇...

单细胞分辨率荧光活体成像 果蝇 幼虫脑组织培养中的生物钟

本文提供了对成年果蝇（Drosophila）造成穿透性创伤性脑损伤（PTBI）并检测由此引发的神经发生的详细实验方案。...

刺激与分析成年神经发生 果蝇 中枢脑

已建立一种在培养的黑腹果蝇（Drosophila）脑外植体中重新激活静息态神经干细胞的方法。利用该方法，可在调控神经干细胞静息、进入及退出过程中，将系统性信号与组织内在信号分离开来。...

培养条件下神经干细胞的再激活 果蝇 脑组织外植体

了解如何从晚期果蝇蛹的大脑制备原代神经元培养物，包括解剖中央脑区、酶解分离和Fura-2钙成像技术。该方法可用于研究神经元发育和神经活动动态。

晚期果蝇蛹脑中的原代神经元培养

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