Transductie naar label PDX-tumorcellen: introductie van lentivirus dat fluorescerende marker uitdrukt in de tumorcel in vitro

Lentivirus is een Retrovirus dat RNA genetisch materiaal bevat. Dit virus biedt een efficiënte en stabiele methode om transgenen in kankercellijnen te introduceren. Begin met het toevoegen van neuraminidase aan een buis met Lentivirus die groene fluorescerende eiwitten uitdrukt, of GFP. Houd de buis een uur op 37 graden Celsius om de bindingsefficiëntie van het virus te verhogen.

Centrifugeer vervolgens een buis met tumorcelsuspensie om een pellet te vormen. Voeg mammosfeermedia met polybreen toe om de cellen te resuspenden. Polybreen is een kationisch polymeer dat de efficiëntie van lentivirale infecties verhoogt. Plaat nu het optimale aantal tumorcellen per put in een zes put weefselkweekplaat. Voeg de vereiste hoeveelheid Lentivirus toe aan elke put van de kweekplaat.

Wervel de plaat om de inhoud te mengen en houd 96 uur op 37 graden Celsius met een continue toevoer van kooldioxide. Het Lentivirus komt de cel binnen en geeft RNA vrij. De virale reverse transcriptase zet het RNA om in dubbelstrengs DNA dat integreert in het gastheergenoom. Plaats de plaat onder een fluorescerende microscoop en bewaak cellen voor succesvolle transductie. De transduceerde cellen fluoresceren als gevolg van GFP-expressie.

In het voorbeeldprotocol zullen we transductie uitvoeren van PDX-gedissocieerde tumorcellen met Lentivirale vectoren.

Om de tumorcellen te transduceren, centrifugeer je de geïsoleerde cellen voor resuspensie in twee milliliter mammosfeermedium. Na het tellen, centrifugeer de cellen opnieuw en resuspend de pellet in twee milliliter mammosfeermedium, aangevuld met 20 microliter polybreen. Vervolgens plaat 2 keer 10 tot de vijfde levensvatbare tumorcellen per put in een ultra lage hechting zes goed weefselkweekplaat en Lentivirale deeltjes aan de cellen bij een multipliciteit van infectie van 10.

Wervel de plaat om het virus met de cellen te mengen en incubeer de co-culturen op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende maximaal 96 uur, voeg na de eerste 24 uur 500 microliters vers mammosfeermedium toe. Wanneer ten minste 10% van de cellen GFP-positief zijn, breng de transduceerde cellen van ten minste één put over in een conische buis van 15 milliliter op ijs en was de put met één milliliter mammosfeermedium.

Pool de was met de cellen en centrifugeer de tumorcellen in 10 milliliter HBSS plus HEPES. Tot slot, resuspend de cellen in 50 microliter kelder matrix extract op ijs en laad de ingebedde cellen in een 0,5 milliliter insuline spuit voor herimplantatie.