增强生物安全与聚合物复合物Ecotropic慢病毒的人体细胞的转导

慢病毒是一个有价值的研究工具，为探索基因功能，然而，研究人员可能希望避免生产pantropic慢病毒，已知的编码或怀疑致癌基因。作为替代方案，我们目前使用ecotropic慢病毒修改的人体细胞表达ecotropic的受体mSlc7a1一个更安全的协议。

以下实验的总体目标是使用嗜回声慢病毒将癌基因或其他潜在危险基因引入人体细胞。这是通过产生编码小鼠逆转录病毒受体的泛热带慢病毒以及编码目标基因的回声热带慢病毒与小鼠逆转录病毒受体一起转导来实现的，这使得它们易与回声热带病毒一起转导。接下来，用嗜回声病毒转导细胞，以便利用聚合物与多脑的络合引入癌基因，硫酸软骨素增强转导结果，显示基于荧光显微镜和事实的热带慢病毒对人类细胞进行选择性转导。

与现有方法（如 γ 逆转录病毒转导）相比，该技术的主要优点是慢病毒颗粒可以更有效地转导多种细胞类型，包括干细胞等非分裂细胞。这种方法可以帮助回答癌症和干细胞研究领域的关键问题，例如了解潜在癌基因的功能。在开始此程序之前，请咨询您的机构安全官员并遵循他们推荐的安全指南。

首先在组织培养罩中培养健康快速生长的 2 9 3 T 细胞。在无菌条件下，复苏将 6 2 9 3 T 细胞的 5 乘以 10 在 10 毫升不含抗生素的 2 9 3 T 培养基中悬浮。将细胞悬液移液到 10 厘米的组织培养板中，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的组织培养箱中孵育过夜。

第二天，在下午晚些时候开始转染。首先，收集等分试样的 Optum 和转移包装和包膜质粒，让它们升温至室温，将 375 μL Optimum 移液管放入微量离心管中，然后加入 25 μL FU 基因 HD 转染试剂。确保 FU 基因试剂直接移液到培养基中，不要接触试管的侧面。

接下来，在第二个微量离心管中，将 5 μg 转移质粒、3.75 μg 包装质粒和 1.25 μg 包膜质粒以所需量的最佳量混合，使体积达到 100 μL。然后将 Optum Fuji 混合物添加到含有质粒混合物的试管中，并在室温下孵育 20 至 30 分钟。在孵育的最后几分钟内，非常轻柔地从含有 2 9 3 T 细胞的板中吸出培养基，并用 10 mL 新鲜的不含抗生素的 2 9 3 T 培养基替换。

最后，将 FU 基因质粒混合物滴加到 10 厘米板的培养基中。将板放入设置为 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的组织培养箱中，孵育过夜。第二天，非常轻柔地从平板中吸出培养基，并更换为新鲜的无抗生素 2 9 3 T 培养基。

然后更换组织培养箱中的板并再孵育两天，转染后三天，从板中吸出含有病毒的培养基，并使用 0.45 微米低蛋白结合过滤器过滤。将病毒过滤得更紧密后，在新鲜的无抗生素培养基中用每毫升 6 微克多脑细胞对荧光对照病毒进行连续稀释，并使用这些稀释液转导适当细胞系的细胞。第二天在 24 孔板中，将培养基更换为新鲜、不含抗生素的培养基，然后继续孵育两天，让细胞表达荧光蛋白。

使用事实来确定每种病毒稀释度的转导细胞分数。然后，根据转导率低于 15% 的稀释度计算每毫升转化单位的滴度，以最大限度地减少多次转导事件。推测平行产生的其他非荧光慢病毒的山雀与荧光病毒的山雀相似。

转导靶细胞：首先选择大于 2 的多重感染，以确保大多数细胞都能被转导。首先，在新鲜完全培养基中将病毒上清液稀释至所需的感染倍数。补充每毫升 6 微克的 Poly Brain，最终体积为 1 毫升。

从 35 毫米的靶细胞培养皿中吸出培养基，并加入 1 毫升稀释的病毒脊髓灰质。如果需要，在组织培养箱中孵育 24 至 48 小时，以允许 SLC 7 A 1 受体充分表达。根据书面程序中的说明，使用抗生素和冲击蛋白选择表达 SLC 7 A one 的稳定转导细胞。

开始毒性测定时，制备 20 毫克/毫升硫酸软骨素储备液和 20 毫克/毫升储备液。Poly brain in water 和无菌过滤器。多余的储备溶液可以储存在零下 20 摄氏度，直到需要。

接下来，确定准确测定聚合物复合物毒性所需的 96 孔细胞培养物的数量。使用 MTT 测定法，应一式三份检测至少 6 种浓度的硫酸软骨素和聚绿。此外，未还原的细胞和在无血清中生长的细胞。

应包括培养基，以分别为健康细胞提供基线并控制生长停滞。一旦确定了所需孔的数量，在 96 孔板的每个孔中将 5， 000 个靶细胞铺在 24 孔板中的平行板细胞中，以便在每个实验条件下对转导效率进行显微镜或基于事实的分析，让两组细胞生长过夜。第二天，等分试样硫酸软骨素原液和等分试样的多脑原液。

然后在含有每毫升 6 μg 多脑的无抗生素培养基中稀释编码 GFP 的病毒，使其感染倍数足以每孔转导约 10% 至 50% 的靶细胞。确保每个测试条件以及每个板上的对照孔都有足够的稀释病毒。用要测试的每种硫酸软骨素和聚绿色聚合物浓度标记一组试管。

然后将针对每种情况的足够病毒悬液一式三份分装到试管中。接下来，移液管所需体积的硫酸软骨素和多脑原液，以将测试浓度连续放入每个试管中。加入硫酸软骨素和聚绿后，立即轻弹试管混合。

让病毒硫酸软骨素聚乙烯绿混合物在室温下孵育 5 分钟。随着病毒沉淀物的形成，混合物可能会变得浑浊。孵育后，从 96 孔板的孔中吸出培养基。

然后按计划将病毒硫酸软骨素聚绿混合物添加到孔中。还将对照和无血清培养基移液到适当的孔中。对 24 孔板重复该过程，在组织培养箱中孵育过夜。

接下来，从板中吸出含有病毒的培养基，并更换为新鲜培养基。48 小时后，将板放回培养箱 48 小时。取出 24 孔板，使用事实分析每种硫酸软骨素的转导效率和多脑浓度。

第二天。从 96 孔板的所有孔中吸出培养基，并在加湿培养箱中用 100 微升 MTT 溶液培养物替换 3 小时，以降低代谢活性细胞线粒体中的 MTT。三小时后，吸出 MTT 溶液并替换为 200 微升溶剂溶液。

在室温下孵育板 2 小时，或直到所有紫色 MTT 形成并溶解沉淀。在酶标仪上读取 570 纳米处的吸光度，减去 690 纳米的背景读数。根据事实确定，最佳聚合物浓度将产生最大的转导增强，而对 HDFS 的 MTT 确定的代谢活性的影响最小。

每毫升 100 微克硫酸软骨素。Poly brain 是由该方法确定的最佳聚合物浓度。首先，准备足够的 100 μg 每毫升硫酸软骨素聚绿病毒营养液混合物，以转导所需数量的 35 毫米 SLC 7 A 单受体表达 HDF 细胞的培养皿 将混合物孵育 5 分钟，以形成聚合物复合物。

然后从表达受体的靶细胞中吸出培养基并替换为病毒混合物，去除病毒混合物后，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育过夜。用 PBS 洗涤细胞表面两次，以帮助去除病毒复合物。完全去除不是必需的，因为未观察到残留的聚合物复合物对细胞健康产生不利影响。

该荧光显微镜图像显示了人肉瘤细胞的充分转导，当使用荧光对照载体监测转导效率时，稳定地表达带有热带病毒的 SLC 7 A one。使用传真分析对荧光进行定量表明，转导效率大于 90%HDFS 的转导率通常较低，因为细胞在选择受体表达时没有被炸开，减退慢病毒的山雀通常为 10% 至 20% 的 VSV 假型病毒在 S-L-C-H-S-C 上测量。MTT 活力测定法可灵敏检测靶细胞中的生长停滞，如图所示，用病毒和硫酸软骨素浓度进行转导。

高达每毫升 800 微克的多脑对 HDF 代谢没有影响。用病毒和不同浓度的硫酸软骨素转导的 HDFS 的传真分析。与单独的 Poly Green 相比，Poly Green 显示出转导的增强。

最大增强发生在 100 μg/mL 时。硫酸软骨素多脑比以前报道的值低几倍。因此，优化任何给定细胞类型与硫酸软骨素复合的条件非常重要。

Poly brain 增强了观察到的滴度，在 S-L-C-H-S-C 中大约是三倍。在实践中，这在低病毒浓度下比在较高浓度下对转导效率产生更大的影响，这很可能是由于多个转导细胞和较高病毒浓度下的受体饱和。热带病毒转导对表达神经元逆转录病毒受体的细胞具有特异性。

当用热带病毒荧光转导未修饰的人细胞时，未观察到大于未还原背景的传真显微镜分析。HDFS 在不存在受体的情况下显示无转导，而使用受体的 pret 转导导致荧光细胞。尝试此程序时，请务必记住验证病毒不会在修饰的人类细胞上转导。

看完这个视频，你应该对如何使用热带慢病毒将潜在危险的基因传递给人体细胞有了很好的了解，包括使用聚合物络合来增强转导。