Name: 增强生物安全与聚合物复合物Ecotropic慢病毒的人体细胞的转导 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 3 s
Description: 了解如何利用聚合物复合物增强嗜性慢病毒转导人细胞的效率，从而安全地引入潜在致癌基因。该方法通过表达mSlc7a1受体实现选择性转导，为癌症和干细胞研究提供更安全的技术方案。

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该项目的资金由加州再生医学研究所提供。

1. 慢病毒的制备、收集与冻存
<ol>
	<li>开始本实验方案前，请咨询您所在机构的安全负责人，并遵循其建议的安全指南。</li>
	<li>第1天。使用健康且处于快速生长期的293T细胞进行病毒制备。以每10 cm培养皿5 × 106个细胞的密度接种细胞。病毒生产过程中使用不含抗生素的293T培养基（高糖DMEM，含10% FBS和4 mM L-谷氨酰胺）。</li>
	<li>第2天。在傍晚时分，按以下步骤转染293T细胞（所列用量适用于一个10 cm培养皿）。将所有试剂恢复至室温。取375 μl OptiMEM加入微量离心管中，然后加入25 μl Fugene HD。注意避免未稀释的Fugene直接接触管壁表面。</li>
	<li>在另一微量离心管中混合以下成分：
		<ul>
			<li>5 μg 转移质粒（Slc7a1、目的载体或荧光对照载体）</li>
			<li>3.75 μg 包装质粒（pCMV-dR8.91 或 psPax2）</li>
			<li>1.25 μg 包膜质粒（泛嗜性病毒使用pMD2.G，嗜生态病毒使用pHCMV-EcoEnv）</li>
			<li>无血清OptiMEM补足至100 μl</li>
		</ul>
	</li>
	<li>将上述两个管中的液体混合，室温孵育20–30分钟。</li>
	<li>将293T细胞的培养基更换为10 ml新鲜的不含抗生素的293T培养基。将Fugene/质粒混合物逐滴加入培养皿中，于37°C、5% CO2条件下过夜孵育。</li>
	<li>第3天。将293T细胞的培养基更换为10 ml新鲜的不含抗生素的293T培养基。操作需轻柔，因为293T细胞贴壁较松，若加液时用力过猛可能导致细胞从单层脱落。将细胞置于湿润培养箱中继续孵育两天以生产病毒。</li>
	<li>第5天。收集病毒液，并使用0.45 mm低蛋白结合滤膜过滤。可立即使用，或分装成单次使用量后于-80°C冻存。冻存的泛嗜性病毒和嗜生态病毒分别在储存六个月和一个月后应重新测定滴度。</li>
	<li>按以下方法测定病毒滴度，选用较易转导的细胞进行检测。将荧光对照病毒以系列稀释比例（例如1:10、1:100、1:1000）加入新鲜培养基中，并加入6 μg/ml PB，与靶细胞共孵育过夜。次日更换为新鲜培养基。转导后继续培养细胞两天，使其开始表达荧光蛋白，随后通过FACS分析确定转导细胞的比例。根据产生&lt;15%转导率的稀释度计算每毫升的转化单位（TU）滴度，以减少多重转导事件的影响。 
	<img src="/files/ftp_upload/2822/2822eq1.jpg" alt="滴度计算公式，病毒定量方程，病毒学中的数学分析" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程1">
	</li>
</ol>
2. 使用小鼠逆转录病毒受体 Slc7a1 转导人类靶细胞
<ol>
	<li>选择感染复数（MOI）= 2，以确保大多数细胞能够被转导。对于难以转导的靶细胞（如人包皮成纤维细胞，HDFs），需要更高的MOI；我们通常仅将病毒上清液稀释1:2，以实现大部分细胞的转导。</li>
	<li>将病毒上清液用含6 μg/ml PB的新鲜培养基稀释后，与靶细胞共孵育过夜，PB可通过增强病毒与靶细胞之间的静电相互作用来提高转导效率1。理想情况下应使用最小体积的病毒液，例如35 mm培养皿使用1 ml，因为扩散是影响转导效率的限制因素。</li>
	<li>在去除病毒后，需将细胞继续培养至少48小时，再进行嗜同性病毒的转导，以确保Slc7a1受体得到充分表达。</li>
	<li>（可选）如需要，可使用杀稻瘟菌素（blasticidin）筛选稳定转导并表达Slc7a1的细胞。应预先绘制杀稻瘟菌素的杀灭曲线，以确定最低有效浓度（通常为2–10 μg/ml），该浓度可在7天内杀死所有未转导的靶细胞。在去除Slc7a1病毒约2天后，将转导细胞更换至含杀稻瘟菌素的培养基中。在含杀稻瘟菌素的培养基中继续培养7天，此时存活的所有细胞均能稳定表达逆转录病毒受体，此后可用于嗜同性病毒的转导，或作为稳定表达Slc7a1的细胞系保存以供后续使用。</li>
</ol>
3. 聚合物复合物滴定法测定毒性
<ol>
	<li>第1天。 将细胞以每孔5000个细胞的密度接种于96孔板中，每个实验组至少设置三个复孔。包括接种于完全培养基中的未转导细胞，以提供健康细胞的基线值；同时设置无血清培养基中的细胞样本作为生长停滞的对照。平行地，将细胞接种于合适的容器（如24孔板）中，用于在各实验条件下通过显微镜或基于FACS的方法分析转导效率。</li>
	<li>第2天。 使用编码GFP的病毒对用于MTT和FACS分析的细胞进行转导，MOI为0.5，以转导约40%的目标细胞。测试不同浓度的CS/PB（例如每种组分分别为50、100、200、400、600和800 mg/ml），以及6 μg/ml的PB，以确定最佳用量。按以下第4部分所述方法制备聚合物复合物。</li>
	<li>第3天。 移除含病毒的培养基，更换为新鲜培养基。将培养板放回湿润培养箱中继续培养。</li>
	<li>第5天。 对FACS用培养板进行分析，测定每种聚合物浓度下的转导效率。</li>
	<li>第6天。 吸去MTT培养板中所有孔的培养基，每孔加入100 μl MTT溶液（含1 mg/ml MTT的完全培养基）。在湿润培养箱中继续培养3小时，使代谢活跃细胞线粒体内的MTT被还原。</li>
	<li>吸去MTT溶液，每孔加入200 μl MTT溶解液（含0.1 N HCl和0.1% Igepal CA-630的异丙醇溶液）。</li>
	<li>室温孵育2小时，或直至紫色的MTT甲臜沉淀完全溶解。使用酶标仪在570 nm波长处读取吸光度，并扣除690 nm处的背景值。</li>
	<li>根据FACS结果选择可最大程度增强转导效率、同时对细胞代谢活性（由MTT法测定）影响最小的最佳聚合物浓度。对于HDF细胞，我们根据下文“代表性结果”中所示数据，选择100 μg/ml的CS/PB。</li>
</ol>
4. 利用聚合物复合物进行嗜生态转导
<ol>
	<li>将PB和硫酸软骨素用无菌水配制成20 mg/ml的储备液，经滤膜除菌。分装后于-20°C保存。</li>
	<li>用移液器将病毒上清液转移至微量离心管中，并用新鲜培养基稀释至所需终浓度（例如MOI为2）。依次加入等体积的PB和硫酸软骨素溶液（浓度根据上述步骤3确定），每次加入后轻轻弹击管壁以混匀。随着沉淀物形成，病毒混合液将立即变浑浊。室温孵育5分钟，以促进复合物形成。</li>
	<li>移除表达受体的靶细胞中的培养基，加入上述病毒混合液，于37°C、5% CO2条件下过夜孵育。移除病毒混合液后，用PBS洗涤细胞表面两次，以帮助去除病毒复合物。无需完全清除；我们观察到残留的聚合物复合物对细胞健康无不良影响。</li>
</ol>
5. 验证嗜生态转导的特异性
<ol>
	<li>首次制备嗜生态病毒时，从安全角度考虑，应验证该病毒无法转导未经修饰的人类细胞。使用较高浓度的嗜生态慢病毒（仅用新鲜培养基对病毒上清液进行1至2倍稀释）与人类细胞共孵育过夜，并加入6 μg/ml PB或优化浓度的CS/PB。</li>
	<li>移除含病毒的培养基，更换为新鲜培养基。细胞继续培养2天后，通过荧光载体进行FACS检测和/或使用目的基因特异性引物进行RT-PCR，以验证外源基因的表达。</li>
</ol>
6. 代表性结果：
图1A展示了慢病毒的生产流程，图1B展示了使用嗜鼠类慢病毒对人类细胞进行转导的过程，包括使用小鼠逆转录病毒受体Slc7a1进行预转导。在病毒滴度测定中，我们采用稳定转导Slc7a1的人类横纹肌肉瘤细胞系（Slc-hRMS）。当使用荧光对照载体监测转导效率时，我们通常可达到 &gt; Slc-hRMS细胞中嗜同性病毒的转导效率为90%，如图2A和2B所示。HDFs细胞的转导率通常较低，因为这些细胞未经过杀稻瘟菌素筛选以富集受体表达（图2C）。在Slc-hRMS细胞上测定，嗜同性慢病毒的滴度通常为VSV假型病毒的10-20%（图2D）。
一次冻融循环会使嗜生态病毒的滴度降低16 - 3%，相当于VSV假型病毒单次冻融循环过程中的滴度损失（p &gt; 0.05）。与以往报道相反2，我们未观察到干冰速冻对病毒滴度产生任何积极影响。相反，仅需将病毒管直接放入-80°C冰箱中，即可获得更高的冻融后滴度（数据未显示）。
MTT 活性检测法可灵敏地检测靶细胞的生长停滞情况。用病毒联合浓度高达 800 μg/ml 的 CS/PB 进行转导，对人成纤维细胞（HDF）的代谢无影响（图 3A）。在无病毒的情况下暴露于 CS/PB 也对细胞无毒性作用（数据未显示）。对用病毒联合不同浓度 CS/PB 转导的人成纤维细胞进行流式细胞术（FACS）分析，结果显示相较于仅使用 PB，转导效率得到增强（图 3B）。最大增强效应出现在 100 μg/ml CS/PB 时（图 3C），该浓度显著低于此前报道的数值3。因此，针对特定的靶细胞类型优化实验条件至关重要。
与CS/PB的复合使Slc-hRMS中的观察滴度大约提高了3倍（图4A，p &lt; 0.01）。在实际应用中，这种效应在低病毒浓度下的转导效率提升更为显著，而在较高病毒浓度下则较弱（图4B），这很可能是因为在较高病毒浓度下发生了多重转导细胞以及受体饱和现象。
使用嗜鼠病毒进行转导具有特异性，仅针对表达小鼠逆转录病毒受体的细胞。当使用嗜鼠病毒转导未经修饰的人类细胞时，无论采用PB还是CS/PB方法，均未观察到荧光信号高于未转导对照组的背景水平，如图5A所示。在显微镜下，人包皮成纤维细胞（HDFs）在无受体表达时未显示任何转导信号（图5B），而预先导入受体后则可观察到荧光阳性细胞（图5C）。
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig1.jpg" alt="慢病毒生产流程图，展示293T细胞转导及病毒上清液阶段。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 示意图 （A） 病毒的生产过程以及 （B） 转导表达小鼠逆转录病毒受体的人源细胞，随后进行嗜同种慢病毒感染。
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig2.jpg" alt="流式细胞术图谱、GFP阳性细胞百分比分析、荧光显微镜图像、病毒滴度柱状图" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 使用编码GFP的嗜鼠型慢病毒对人细胞进行高效转导。细胞预先转导了小鼠逆转录病毒受体Slc7a1。(A) 人横纹肌肉瘤细胞系经blasticidin筛选获得Slc7a1表达（Slc-hRMS），转导（蓝色）或未转导（粉色）GFP。(B) 嗜鼠型慢病毒转导的Slc-hRMS细胞的荧光显微图像（4倍放大）。(C) 人真皮成纤维细胞（HDFs）经嗜鼠型GFP慢病毒转导（蓝色）与未转导（粉色）；细胞在进行嗜鼠型转导前两天已转导Slc7a1。(D) 在Slc-hRMS细胞上测定的VSV-G假型慢病毒与嗜鼠型慢病毒的滴度。
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig3.jpg" alt="聚合物浓度对GFP表达的影响；吸光度、流式细胞术和GFP%图表。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 优化人真皮成纤维细胞中硫酸软骨素/聚溴化物（CS/PB）的浓度。(A) 仅使用PB或不同浓度的CS/PB存在下，通过MTT法测定HDF的存活率。(B) 通过FACS检测不同浓度CS/PB对HDF转导效率的增强作用。(C) 转导增强效果的定量分析，显示在100 μg/ml CS/PB时转导效率最高。
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig4.jpg" alt="基因转导效率与滴度分析，柱状图和散点图，聚凝胺效应比较。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4. 400 μg/ml CS/PB 对 Slc-hRMS 细胞进行嗜鼠类慢病毒转导的影响。(A) 滴度增强效果，以及 (B) 与单独使用 6 μg/ml 聚凝胺相比，转导率的倍数变化。
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig5.jpg" alt="流式细胞术GFP强度图及荧光显微镜图像，显示GFP+细胞分布情况。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图5"> 
图5. 在缺乏小鼠逆转录病毒受体Slc7a1的情况下，人成纤维细胞（HDFs）无法被嗜生态病毒感染。(A) BJ人成纤维细胞的流式细胞术图谱，未转导（粉色）或转导（蓝色）嗜生态GFP慢病毒，两种情况均在无受体Slc7a1的条件下进行。BJ人成纤维细胞转导嗜生态GFP慢病毒后，在未预先转导受体Slc7a1 (B) 和预先转导受体Slc7a1（4倍量）(C) 的情况下的结果。

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</ol>

未声明任何利益冲突。

基于莫洛尼鼠白血病病毒（MLV）及其受体 mSlc7a1 的重组嗜鼠性γ逆转录病毒已被广泛研究并易于获取，过去二十多年中一直用于向小鼠细胞递送转基因。近年来，嗜鼠性γ逆转录病毒也被用于向人类细胞递送癌基因；在细胞重编程的背景下，使用 mSlc7a1 以避免产生携带人类癌基因的兼嗜性病毒已有充分依据4,5。然而，在转导难处理的细胞群体（包括常作为重编程理想靶标的原代细胞）方面，慢病毒相较于γ逆转录病毒具有显著优势6，这是因为慢病毒的前整合复合物能够介导非分裂细胞的转导7。
为改变病毒的嗜性、毒性及其他特性，已成功制备出包含MLV在内的数十种不同假型的慢病毒8。MLV假型的嗜鼠性慢病毒已被用于转导小鼠细胞9，但极少应用于人类细胞10。因此，我们提出将MLV假型的嗜鼠性慢病毒作为一种安全、经济高效且高度有效的载体，用于向人类细胞递送已知或疑似癌基因，包括细胞重编程因子。
需要特别注意的是，本方案并未完全消除生产和使用泛嗜性慢病毒的必要性；相反，该方案将癌基因与泛嗜性病毒分离，使研究人员避免可能因接触与癌症相关的病毒而导致的自我接种风险。蛋白mSlc7a1及其人类同源物hSlc7a1是普遍表达的氨基酸转运蛋白，目前尚无证据表明其具有致瘤性或能够赋予受体细胞生长优势11，因此将mSlc7a1引入异嗜性病毒的风险相对较低。这一额外步骤对于缺乏符合相应生物安全等级的专用病毒或组织培养设施的实验室可能尤为有用。
在某些情况下，可通过将 Slc7a1 质粒直接转染入靶细胞，从而完全避免使用泛嗜性病毒；然而，该技术所适用的许多靶细胞同样难以转染。作为替代方案，利用杀稻瘟菌素筛选分离 Slc7a1 转导细胞的能力意味着可先使用 VSV-G 假型慢病毒一次性建立表达受体的细胞库，此后便可常规使用嗜生态病毒对这些细胞进行转导，以开展大量实验。研究人员应始终遵循所在机构关于使用任何慢病毒（无论其嗜性如何）的安全指南。
采用本方案获得的嗜生态病毒滴度通常略低于VSV假型病毒，一般为泛嗜性病毒滴度的10%至20%，与以往研究结果一致9。这些滴度是在稳定转导了Slc7a1的人细胞中测定的，因此嗜生态病毒观察到的较低滴度可能部分归因于靶细胞中受体基因表达水平的差异。尽管如此，本方案获得的病毒滴度已完全足以满足大多数应用需求，并可实现大部分细胞的转导，在某些情况下转导率超过&gt; 90%的细胞。
基于离心的技术常用于浓缩病毒颗粒。然而，离心过程需要数小时，可能产生具有传染性的气溶胶，并可能导致病毒颗粒显著损失。12 作为替代方法，使用壳聚糖/聚苯乙烯磺酸盐（CS/PB）复合物可在不改变病毒趋向性的前提下增强转导效率。3 该方法快速（5分钟）且成本低廉（每10 ml病毒仅需0.03美元），同时可使观察到的滴度提高约三倍。该方法无需特殊设备或专有试剂，我们在人真皮成纤维细胞（HDFs）暴露于CS/PB后观察到极低的急性毒性，这与先前在其他细胞系中的研究结果一致。13 该方案的一个潜在缺点是，部分在显微镜下可见的聚合物复合物会在培养过程中附着于细胞表面并持续数天。我们不能排除这些复合物虽然对细胞无明显毒性，但仍可能对细胞过程产生更细微影响的可能性。
本文介绍了一种安全高效地利用致癌因子转导人类细胞的方法。该方法对于研究癌基因和干细胞生物学（包括诱导多能干细胞）的研究人员具有重要应用价值。

<table><tbody><tr><td>pLenti6/UbC/mSlc7a1</td><td>Addgene</td><td>17224</td><td>小鼠 MLV 受体</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td>VSV-G 包膜</td></tr><tr><td>pCMV-dR8.91</td><td>Addgene</td><td></td><td>D. Trono 实验室&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;
&lt;br/&gt;包装质粒（等效质粒 psPax2 可从 Addgene 获取，货号 12260）</td></tr><tr><td>pHCMV-Ec&amp;#8211;nv</td><td>Addgene</td><td>15802</td><td>嗜同种型包膜</td></tr><tr><td>FUGW</td><td>Addgene</td><td>14883</td><td>GFP 对照质粒</td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD</td><td>Roche Group</td><td>04 709 705 001</td><td></td></tr><tr><td>六亚甲基二溴化铵（Polybrene）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>鲨鱼软骨来源的硫酸软骨素钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4384</td><td></td></tr><tr><td>杀稻瘟菌素 S</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 2647100</td><td></td></tr><tr><td>3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴盐（MTT）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2128</td><td></td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3021</td><td></td></tr></tbody></table>

利用聚合物复合的嗜生态慢病毒转导人细胞以增强生物安全性

Transduction of Human Cells with Polymer-complexed Ecotropic Lentivirus for Enhanced Biosafety

干细胞与肿瘤细胞生物学研究通常需要将已知或疑似癌基因通过病毒转导至人类细胞，这为实验室人员带来了重大的安全问题。泛嗜性慢病毒（如常用的VSV-G假型病毒）是研究基因功能的有力工具，因为它们能够转导多种细胞类型，包括非分裂细胞。然而，由于编码癌基因的泛嗜性病毒在操作时需要更高的生物安全等级并存在安全隐患，研究人员可能希望避免其制备和离心过程。一些强效的癌基因，如c-Myc和SV40大T抗原，已被证实可促进诱导性多能干细胞（iPSC）的生成。其他所有已知的诱导iPSC的遗传改变（OCT4、SOX2、KLF4、NANOG、LIN28以及p53功能缺失）也均与癌症相关，因此同样具有较高的安全风险。
尽管这些与癌症相关的病毒在细胞重编程和多能性研究中具有重要价值，但其使用必须确保安全。为解决这些生物安全问题，我们展示了一种利用嗜生态型慢病毒转导人细胞的方法，同时特别强调降低实验成本和操作的便捷性。我们所制备的嗜生态型慢病毒滴度足够高，可实现对超过90%表达相应受体的人细胞进行有效转导，从而验证了该方法的高效性。
慢病毒通常通过超速离心进行浓缩；然而，该过程需要数小时，且可能产生对人类生物医学研究人员具有感染性的气溶胶。作为替代方法，可通过与硫酸软骨素和聚凝胺（CS/PB）形成复合物，更安全地将病毒颗粒沉降至细胞上。该技术可使稳定表达鼠类逆转录病毒受体的细胞中的功能性病毒滴度最高提升至原来的3倍，且额外的时间和成本消耗可忽略不计。在人真皮成纤维细胞（HDFs）的转导中，使用约比先前报道的肿瘤细胞系最适浓度低4倍的CS/PB浓度即可达到最大增强效果，提示应针对目标细胞类型对聚合物浓度进行滴定优化。因此，我们描述了使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）在新细胞类型中检测聚合物毒性的方法。我们观察到，使用聚合物复合物或标准剂量的聚凝胺（PB，6 μg/ml）进行病毒转导后，HDFs的细胞活力相当，表明急性毒性极低。
在本实验方案中，我们描述了使用嗜鼠型慢病毒在人源细胞中过表达癌基因的方法，该方法可降低生物安全风险并提高转导效率。我们还展示了利用聚合物复合物增强转导效果的技术，该技术无需通过离心浓缩病毒颗粒，从而避免产生气溶胶。

慢病毒是研究基因功能的重要研究工具；然而，研究人员可能希望避免产生编码已知或疑似癌基因的泛嗜性慢病毒。作为替代方案，我们提出了一种更安全的策略，即在经过改造以表达嗜鼠性病毒受体 mSlc7a1 的人源细胞上使用嗜鼠性慢病毒。

干细胞与肿瘤细胞生物学研究通常需要利用已知或疑似癌基因对人类细胞进行病毒转导，这为实验室安全带来了重大挑战……

以下实验的总体目标是利用嗜心病毒属慢病毒将癌基因或其他潜在有害基因导入人细胞。该目标通过产生泛嗜性慢病毒来实现，该病毒编码小鼠逆转录病毒受体，同时使用编码目的基因的嗜心病毒属慢病毒感染细胞，使细胞表达小鼠逆转录病毒受体，从而使其易于被嗜心病毒属病毒感染。随后，利用嗜心病毒属慢病毒对细胞进行转导，以引入癌基因，并通过多聚赖氨酸与硫酸软骨素的聚合物复合来增强转导效率。最终获得的结果通过荧光显微镜和流式细胞术分析显示，基于嗜心病毒属慢病毒实现了对人细胞的选择性转导。与现有的逆转录病毒转导等方法相比，该技术的主要优势在于，慢病毒颗粒能够更有效地转导多种细胞类型，包括干细胞等非分裂细胞。该方法有助于回答癌症和干细胞研究领域中的关键问题，例如理解潜在癌基因的功能。在开始本实验操作之前，请咨询您所在机构的安全负责人，并遵循其建议的安全操作规范。在超净台中取处于快速增殖期的健康 293T 细胞进行培养。在无菌条件下，将 5 × 10⁶ 个 293T 细胞重悬于 10 毫升不含抗生素的 293T 培养基中。将细胞悬液用移液器转移至 10 厘米组织培养皿中，并在 37°C、5% CO₂ 的细胞培养孵箱中孵育过夜。第二天下午稍晚开始转染。首先，取一份 Optum 以及转移包装和包膜质粒，置于室温下回温。用移液器将 375 µL 的 Optum 加入一个微量离心管中，然后加入 25 µL 的 FU gene HD 转染试剂。确保将 FU gene 试剂直接加入培养基中，不要接触管壁。接下来，在另一个微量离心管中，加入5微克转移质粒、3.75微克包装质粒和1.25微克包膜质粒，并用适量的Opti-MEM将体积补足至100微升。然后将Opti-FuGENE转染试剂加入含有质粒混合物的离心管中，混匀后于室温孵育20至30分钟。在孵育的最后几分钟内，轻柔地吸去含有293T细胞的培养板中的培养基，并更换为10毫升新鲜的不含抗生素的293T培养基。最后，将FU基因质粒混合物逐滴加入10厘米培养皿的培养基中。将培养皿置于设定为37摄氏度和5%二氧化碳的组织培养箱中，过夜培养。次日，非常轻柔地吸出培养皿中的培养基，并更换为新鲜的不含抗生素的293T培养基。然后将培养板放回组织培养孵育箱中，继续孵育两天。转染后第三天，从培养板中吸出含有病毒的培养基，并使用0.45微米低蛋白结合滤膜过滤。过滤后收集病毒，用含6微克/毫升polybrene的新鲜无抗生素培养基对荧光对照病毒进行系列稀释，并用这些稀释液转导相应细胞系的细胞。在24孔板中，次日更换为新鲜无抗生素培养基，再继续孵育两天，以使细胞表达荧光蛋白。根据每个病毒稀释度下转导细胞的比例，利用实验数据确定转导细胞的分数。然后基于转导率低于15%的稀释样本，计算每毫升中的转化单位数（TU/mL），以尽量减少多重转导事件的发生。平行条件下产生的其他非荧光慢病毒的滴度被认为与荧光病毒相似。为了转导靶细胞，首先选择大于2的感染复数，以确保大多数细胞能够被转导。首先，用新鲜的完全培养基将病毒上清液稀释至所需的感染复数，并添加聚凝胺至终浓度为每毫升6微克，总体积为1毫升。吸出35毫米培养皿中靶细胞的培养基，加入1毫升稀释后的病毒上清液。在组织培养箱中孵育24至48小时，以实现SLC7A1受体的充分表达（如需要）。根据书面实验方案中的说明，使用杀稻瘟菌素（blasticidin）进行抗生素筛选，以获得稳定转导并表达SLC7A1的细胞。开始毒性测定前，配制 20 毫克/毫升硫酸软骨素的储备液和 20 毫克/毫升聚脑（poly brain）的储备液，溶于水并经无菌过滤。多余的储备液可储存于 -20 °C，待需要时使用。接下来，确定为准确评估聚合物复合物毒性所需的96孔细胞培养数量。使用MTT法，应至少以三个复孔检测六种不同浓度的硫酸软骨素和聚绿色（poly green）。此外，还需包括未处理细胞以及在无血清培养基中培养的细胞。应加入培养基，以分别为健康细胞提供基线对照，并控制细胞生长停滞。确定所需孔数后，在96孔板的每个孔中接种5,000个靶细胞，同时在24孔板中平行接种细胞，用于在每种实验条件下通过显微镜或基于事实的方法分析转导效率。让两组细胞均过夜培养。次日，取一份硫酸软骨素储备溶液和一份多聚素储备溶液的等分试样。然后将编码GFP的病毒稀释于不含抗生素、并含有6 µg/mL多聚素（polybrene）的培养基中，稀释至感染复数足以使每孔中约10%至50%的目标细胞被转导。确保每种测试条件及每个平板上的对照孔均有足够的稀释病毒。用一组试管分别标记待测的每种硫酸软骨素和多聚绿色聚合物浓度。然后将病毒悬液按每种条件分装三份，每份取适量加入各离心管中。接着，依次向各管中加入所需体积的硫酸软骨素和聚脑苷脂储备液，以配制相应的测试浓度。在加入硫酸软骨素和聚绿溶液后，立即轻轻弹击离心管以混匀。将病毒-硫酸软骨素-聚绿色混合物在室温下孵育5分钟。随着病毒沉淀物的形成，混合物可能会变浑浊。孵育结束后，吸去96孔板各孔中的培养基。然后按计划将病毒-硫酸软骨素-聚绿色混合物加入各孔中。同时将对照和无血清培养基用移液器加入相应的孔中。对24孔板重复上述操作，随后在组织培养孵育箱中过夜孵育。接下来，吸除培养板中含有病毒的培养基，并更换为新鲜培养基。将培养板放回培养箱中继续培养48小时。48小时后，取出24孔板，利用相关数据评估每种硫酸软骨素和聚脑浓度的转导效率。第二天。吸去96孔板中所有孔的培养基，每孔加入100 µL MTT溶液，在湿润培养箱中孵育3小时，使代谢活跃细胞的线粒体能够还原MTT。3小时后，吸去MTT溶液，每孔加入200 µL溶剂溶液。将培养板在室温下孵育两小时，或直至所有紫色 MTT 形成的沉淀完全溶解。使用酶标仪在 570 纳米处读取吸光度，并以 690 纳米处的读数作为空白背景进行校正。最佳聚合物浓度应在 hdfs 实验中通过事实确定，表现出对转导的最大增强作用，同时通过 MTT 法测定对代谢活性的影响最小。每毫升含100微克硫酸软骨素。通过本方法确定，Poly brain为最佳聚合物浓度。首先，配制足量的每毫升含100微克硫酸软骨素的Poly green病毒上清液混合物，以用于转导所需数量的表达SLC7A1受体的HDF细胞35毫米培养皿。将混合物孵育5分钟，以使聚合物复合物形成。然后吸去表达靶细胞的受体细胞中的培养基，加入病毒混合液，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜。去除病毒混合液后，用PBS洗涤细胞表面两次，以帮助去除病毒复合物。残留的聚合物复合物对细胞健康无不良影响，因此无需完全去除。这幅荧光显微镜图像显示，在使用荧光对照载体监测转导效率的情况下，人肉瘤细胞被嗜性病毒高效转导，这些细胞稳定表达 SLC seven A one。通过 Fax 分析对荧光进行定量，表明转导效率高于 90%。HDFS 的转导率通常较低，因为这些细胞未经过有丝分裂活化，也未筛选受体表达；在 S-L-C-H-S-C 上测得的非嗜性慢病毒滴度通常为 VSV 假型病毒的 10% 至 20%。MTT 活性检测法可灵敏地检测靶细胞的生长停滞，如本图所示，在病毒转导的同时加入硫酸软骨素浓度梯度处理后观察到该现象。浓度高达每毫升800微克的聚脑对人真皮成纤维细胞（HDF）的代谢无影响。对使用病毒转导并添加不同浓度硫酸软骨素的人真皮成纤维细胞（HDFs）进行Fax分析。与单独使用聚绿相比，聚绿显示出转导效率的增强。最大增强效应出现在每毫升100微克的浓度下。软骨素硫酸盐对多聚脑的促进作用比先前报道的数值低数倍。因此，针对特定细胞类型与软骨素硫酸盐形成复合物的条件优化至关重要。多聚脑可使观察到的滴度在S-L-C-H-S-C中大约提高三倍。在实际应用中，这在低病毒浓度下对转导效率的影响大于高病毒浓度下的影响，这很可能是因为在高病毒浓度下存在多个转导细胞以及受体饱和现象。嗜神经病毒的转导特异性针对表达神经元逆转录病毒受体的细胞。在通过嗜性病毒感染未修饰的人类细胞时，显微镜下经传真分析观察，未检测到荧光信号高于未降低的背景水平。HDFS 在无受体存在时不显示转导，而预先加入受体进行转导则可观察到荧光细胞。在进行该操作时，务必确认该病毒不会对经修饰的人类细胞产生转导作用。观看本视频后，您应能够充分理解如何使用嗜性慢病毒将潜在有害基因递送至人类细胞，包括利用聚合物复合技术增强转导效率的方法。

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科研

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生物学

增强生物安全与聚合物复合物Ecotropic慢病毒的人体细胞的转导

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