利用聚合物复合的嗜生态慢病毒转导人细胞以增强生物安全性

以下实验的总体目标是利用嗜心病毒属慢病毒将癌基因或其他潜在有害基因导入人细胞。该目标通过产生泛嗜性慢病毒来实现，该病毒编码小鼠逆转录病毒受体，同时使用编码目的基因的嗜心病毒属慢病毒感染细胞，使细胞表达小鼠逆转录病毒受体，从而使其易于被嗜心病毒属病毒感染。随后，利用嗜心病毒属慢病毒对细胞进行转导，以引入癌基因，并通过多聚赖氨酸与硫酸软骨素的聚合物复合来增强转导效率。最终获得的结果通过荧光显微镜和流式细胞术分析显示，基于嗜心病毒属慢病毒实现了对人细胞的选择性转导。

与现有的逆转录病毒转导等方法相比，该技术的主要优势在于，慢病毒颗粒能够更有效地转导多种细胞类型，包括干细胞等非分裂细胞。该方法有助于回答癌症和干细胞研究领域中的关键问题，例如理解潜在癌基因的功能。在开始本实验操作之前，请咨询您所在机构的安全负责人，并遵循其建议的安全操作规范。

在超净台中取处于快速增殖期的健康 293T 细胞进行培养。在无菌条件下，将 5 × 10⁶ 个 293T 细胞重悬于 10 毫升不含抗生素的 293T 培养基中。将细胞悬液用移液器转移至 10 厘米组织培养皿中，并在 37°C、5% CO₂ 的细胞培养孵箱中孵育过夜。

第二天下午稍晚开始转染。首先，取一份 Optum 以及转移包装和包膜质粒，置于室温下回温。用移液器将 375 µL 的 Optum 加入一个微量离心管中，然后加入 25 µL 的 FU gene HD 转染试剂。确保将 FU gene 试剂直接加入培养基中，不要接触管壁。

接下来，在另一个微量离心管中，加入5微克转移质粒、3.75微克包装质粒和1.25微克包膜质粒，并用适量的Opti-MEM将体积补足至100微升。然后将Opti-FuGENE转染试剂加入含有质粒混合物的离心管中，混匀后于室温孵育20至30分钟。在孵育的最后几分钟内，轻柔地吸去含有293T细胞的培养板中的培养基，并更换为10毫升新鲜的不含抗生素的293T培养基。

最后，将FU基因质粒混合物逐滴加入10厘米培养皿的培养基中。将培养皿置于设定为37摄氏度和5%二氧化碳的组织培养箱中，过夜培养。次日，非常轻柔地吸出培养皿中的培养基，并更换为新鲜的不含抗生素的293T培养基。

然后将培养板放回组织培养孵育箱中，继续孵育两天。转染后第三天，从培养板中吸出含有病毒的培养基，并使用0.45微米低蛋白结合滤膜过滤。过滤后收集病毒，用含6微克/毫升polybrene的新鲜无抗生素培养基对荧光对照病毒进行系列稀释，并用这些稀释液转导相应细胞系的细胞。在24孔板中，次日更换为新鲜无抗生素培养基，再继续孵育两天，以使细胞表达荧光蛋白。

根据每个病毒稀释度下转导细胞的比例，利用实验数据确定转导细胞的分数。然后基于转导率低于15%的稀释样本，计算每毫升中的转化单位数（TU/mL），以尽量减少多重转导事件的发生。平行条件下产生的其他非荧光慢病毒的滴度被认为与荧光病毒相似。

为了转导靶细胞，首先选择大于2的感染复数，以确保大多数细胞能够被转导。首先，用新鲜的完全培养基将病毒上清液稀释至所需的感染复数，并添加聚凝胺至终浓度为每毫升6微克，总体积为1毫升。

吸出35毫米培养皿中靶细胞的培养基，加入1毫升稀释后的病毒上清液。在组织培养箱中孵育24至48小时，以实现SLC7A1受体的充分表达（如需要）。根据书面实验方案中的说明，使用杀稻瘟菌素（blasticidin）进行抗生素筛选，以获得稳定转导并表达SLC7A1的细胞。

开始毒性测定前，配制 20 毫克/毫升硫酸软骨素的储备液和 20 毫克/毫升聚脑（poly brain）的储备液，溶于水并经无菌过滤。多余的储备液可储存于 -20 °C，待需要时使用。

接下来，确定为准确评估聚合物复合物毒性所需的96孔细胞培养数量。使用MTT法，应至少以三个复孔检测六种不同浓度的硫酸软骨素和聚绿色（poly green）。此外，还需包括未处理细胞以及在无血清培养基中培养的细胞。

应加入培养基，以分别为健康细胞提供基线对照，并控制细胞生长停滞。确定所需孔数后，在96孔板的每个孔中接种5,000个靶细胞，同时在24孔板中平行接种细胞，用于在每种实验条件下通过显微镜或基于事实的方法分析转导效率。让两组细胞均过夜培养。次日，取一份硫酸软骨素储备溶液和一份多聚素储备溶液的等分试样。

然后将编码GFP的病毒稀释于不含抗生素、并含有6 µg/mL多聚素（polybrene）的培养基中，稀释至感染复数足以使每孔中约10%至50%的目标细胞被转导。确保每种测试条件及每个平板上的对照孔均有足够的稀释病毒。用一组试管分别标记待测的每种硫酸软骨素和多聚绿色聚合物浓度。

然后将病毒悬液按每种条件分装三份，每份取适量加入各离心管中。接着，依次向各管中加入所需体积的硫酸软骨素和聚脑苷脂储备液，以配制相应的测试浓度。在加入硫酸软骨素和聚绿溶液后，立即轻轻弹击离心管以混匀。

将病毒-硫酸软骨素-聚绿色混合物在室温下孵育5分钟。随着病毒沉淀物的形成，混合物可能会变浑浊。孵育结束后，吸去96孔板各孔中的培养基。

然后按计划将病毒-硫酸软骨素-聚绿色混合物加入各孔中。同时将对照和无血清培养基用移液器加入相应的孔中。对24孔板重复上述操作，随后在组织培养孵育箱中过夜孵育。

接下来，吸除培养板中含有病毒的培养基，并更换为新鲜培养基。将培养板放回培养箱中继续培养48小时。48小时后，取出24孔板，利用相关数据评估每种硫酸软骨素和聚脑浓度的转导效率。

第二天。吸去96孔板中所有孔的培养基，每孔加入100 µL MTT溶液，在湿润培养箱中孵育3小时，使代谢活跃细胞的线粒体能够还原MTT。3小时后，吸去MTT溶液，每孔加入200 µL溶剂溶液。

将培养板在室温下孵育两小时，或直至所有紫色 MTT 形成的沉淀完全溶解。使用酶标仪在 570 纳米处读取吸光度，并以 690 纳米处的读数作为空白背景进行校正。最佳聚合物浓度应在 hdfs 实验中通过事实确定，表现出对转导的最大增强作用，同时通过 MTT 法测定对代谢活性的影响最小。

每毫升含100微克硫酸软骨素。通过本方法确定，Poly brain为最佳聚合物浓度。首先，配制足量的每毫升含100微克硫酸软骨素的Poly green病毒上清液混合物，以用于转导所需数量的表达SLC7A1受体的HDF细胞35毫米培养皿。将混合物孵育5分钟，以使聚合物复合物形成。

然后吸去表达靶细胞的受体细胞中的培养基，加入病毒混合液，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜。去除病毒混合液后，用PBS洗涤细胞表面两次，以帮助去除病毒复合物。残留的聚合物复合物对细胞健康无不良影响，因此无需完全去除。

这幅荧光显微镜图像显示，在使用荧光对照载体监测转导效率的情况下，人肉瘤细胞被嗜性病毒高效转导，这些细胞稳定表达 SLC seven A one。通过 Fax 分析对荧光进行定量，表明转导效率高于 90%。HDFS 的转导率通常较低，因为这些细胞未经过有丝分裂活化，也未筛选受体表达；在 S-L-C-H-S-C 上测得的非嗜性慢病毒滴度通常为 VSV 假型病毒的 10% 至 20%。MTT 活性检测法可灵敏地检测靶细胞的生长停滞，如本图所示，在病毒转导的同时加入硫酸软骨素浓度梯度处理后观察到该现象。

浓度高达每毫升800微克的聚脑对人真皮成纤维细胞（HDF）的代谢无影响。对使用病毒转导并添加不同浓度硫酸软骨素的人真皮成纤维细胞（HDFs）进行Fax分析。与单独使用聚绿相比，聚绿显示出转导效率的增强。

最大增强效应出现在每毫升100微克的浓度下。软骨素硫酸盐对多聚脑的促进作用比先前报道的数值低数倍。因此，针对特定细胞类型与软骨素硫酸盐形成复合物的条件优化至关重要。

多聚脑可使观察到的滴度在S-L-C-H-S-C中大约提高三倍。在实际应用中，这在低病毒浓度下对转导效率的影响大于高病毒浓度下的影响，这很可能是因为在高病毒浓度下存在多个转导细胞以及受体饱和现象。嗜神经病毒的转导特异性针对表达神经元逆转录病毒受体的细胞。

在通过嗜性病毒感染未修饰的人类细胞时，显微镜下经传真分析观察，未检测到荧光信号高于未降低的背景水平。HDFS 在无受体存在时不显示转导，而预先加入受体进行转导则可观察到荧光细胞。在进行该操作时，务必确认该病毒不会对经修饰的人类细胞产生转导作用。

观看本视频后，您应能够充分理解如何使用嗜性慢病毒将潜在有害基因递送至人类细胞，包括利用聚合物复合技术增强转导效率的方法。