Трансдукция на этикетку PDX Опухолевые клетки: Введение лентивируса Экспрессия флуоресцентного маркера в опухолевых клеток в пробирке

Лентивирус является ретровирусом, который содержит РНК-генетический материал. Этот вирус обеспечивает эффективный и стабильный метод введения трансгенов в линии раковых клеток. Начните с добавления нейраминидазы в трубку, содержащую лентивирус, который выражает зеленый флуоресцентный белок, или GFP. Держите трубку на уровне 37 градусов по Цельсию в течение одного часа, чтобы повысить эффективность связывания вируса.

Затем центрифуга трубки, содержащей подвеску опухолевых клеток, чтобы сформировать гранулы. Добавьте маммосферные средства, содержащие полибрен, чтобы повторно использовать клетки. Полибрен является катионическим полимером, который повышает эффективность лентивирусной инфекции. Теперь пластины оптимальное количество опухолевых клеток на колодец в шести хорошо ткани культуры пластины. Добавьте необходимое количество лентивируса в каждый колодец культурной пластины.

Закружить пластину, чтобы смешать содержимое, и держать на 37 градусов по Цельсию в течение 96 часов с непрерывным запасом углекислого газа. Лентивирус попадает в клетку и высвобождает РНК. Вирусная обратная транскриптаза преобразует РНК в двойную мель ДНК, которая интегрируется в геном хозяина. Поместите пластину под флуоресцентный микроскоп и контролировать клетки для успешной трансдукции. Транс индуцированные клетки флуоресцируются из-за экспрессии GFP.

В примере протокола мы будем выполнять трансдукцию PDX-диссоциированных опухолевых клеток с лентивирусными переносчиками.

Чтобы вывести опухолевые клетки, центрифуга изолированных клеток для повторного успенения в двух миллилитров маммосферной среды. После подсчета, центрифуга клетки снова и повторно гранулы в двух миллилитров маммосферной среды, дополненный 20 микролитров полибрена. Далее, пластины 2 раза от 10 до пятой жизнеспособной опухолевых клеток на колодец в ультра низкой приверженности шесть хорошо пластины культуры ткани и лентивирусных частиц в клетки при множественности инфекции 10.

Закружить пластину, чтобы смешать вирус с клетками и инкубировать со-культуры при 37 градусов по Цельсию и 5% углекислого газа на срок до 96 часов, добавив 500 микролитров свежей среды маммосферы после первых 24 часов. Когда по крайней мере 10% клеток GFP положительные, передача трансдуцированных клеток, по крайней мере один хорошо в 15 миллилитров конической трубки на льду и мыть хорошо с одним миллилитр mammosphere среды.

Бассейн мыть с клетками и центрифуги опухолевых клеток в 10 миллилитров HBSS плюс HEPES. Наконец, повторное использование клеток в 50 микролитров экстракта матрицы подвала на льду и загрузить встроенные клетки в 0,5 миллилитров инсулина шприц для реимплантации.