in vivo 条件下比较非洲爪蟾 Xenopus laevis 中 gp96 佐剂活性的研究

本实验的总体目标是研究热休克蛋白G96在非洲爪蟾（Xenopus laevis）中促进抗原特异性CD8+ T细胞反应的进化保守性。首先通过腹腔灌洗法收集腹腔白细胞，以实现这一目标。实验的第二步是在孵育和洗涤后，用肿瘤来源的G96蛋白（该蛋白可作为次要抗原和肿瘤抗原的分子伴侣）对腹腔白细胞进行脉冲处理。

将腹腔白细胞通过腹腔注射过继转移至未经致敏的青蛙体内，以使其对肿瘤抗原或次要组织相容性抗原产生致敏。该实验流程的第三步是对已致敏的青蛙进行皮肤移植或肿瘤攻击，并监测皮肤移植物排斥反应或肿瘤出现的情况。实验的最后一步是采集外周血，以鉴定参与皮肤排斥反应和抗肿瘤免疫应答的T细胞。

最终，通过皮肤移植和肿瘤攻击实验分别发现，经GP96致敏的青蛙不仅皮肤移植物排斥反应显著加快，而且肿瘤出现时间明显延迟。大家好，我是罗切斯特大学医学中心微生物学与免疫学系Jacque Robert博士实验室的Christina Koska。我是Tanya Cruz，同样来自Robert博士的实验室。

今天，我们将向您展示一种通过过继性转移腹腔白细胞来诱导克隆蛙产生免疫应答的方法，随后进行皮肤移植和肿瘤移植检测。此外，我们还将向您演示如何从此类动物中获取外周血。我们在实验室中使用该方法研究热休克蛋白GP96在非洲爪蟾（Salla）中促进抗原特异性CDAT细胞的能力，以及参与该过程的细胞类型。

好的，我们开始吧。实验中使用的青蛙来自罗切斯特大学繁殖种群的同基因型克隆个体。为诱导腹膜白细胞（PLS）以供采集，使用25号5/8英寸针头向麻醉后的青蛙腹腔内注射灭活的大肠杆菌（E. coli）制剂。注射后第三天，通过腹腔灌洗法采集PLS。

开始此操作时，用少量70%乙醇对麻醉青蛙的腹部进行消毒。然后使用18号1.5英寸针头向腹腔内注射5毫升无菌两栖类磷酸盐缓冲盐水（PBS），或室温预热的PBS。拔出针头后，轻轻按摩青蛙腹部一分钟，以确保注入的缓冲液与体腔内的液体充分混匀。

接下来，将一根新的18号1.5针头（不连接注射器）插入青蛙的腹部。在避开血管的同时，收集从针头后端滴出的腹膜液，滴入一个洁净的50毫升锥形管中。在收集完PLS后，应尽可能回收最初注入的全部液体体积。

将青蛙放入装有浅水的容器中，直至其苏醒，之后可将其放回笼中。一旦收获了pls，于4摄氏度下以1000 RPM离心10分钟，弃去上清液并重悬。将pls重悬于冷的A PBS中。

将重悬的PLS转移至一个1.5毫升的微量离心管中。用GP 96对PLS进行脉冲处理：向PLS中加入适量的GP 96，通过移液混匀，冰上孵育1小时，1小时后继续后续操作。

以 14,000 RPM 离心细胞一分钟。去除上清液以除去未结合的 GP 96。加入冷的 A PBS 并重悬。

再次悬浮PLS并进行离心。用预冷的A-P-B-S-A溶液将S洗涤共三次，以确保最终洗涤后无残留的G 96。将脉冲处理后的PLS重新悬浮于300微升PBS中，浓度为每300微升含5 × 10⁵个PLS，用于过继转移至6只未经处理的LG受体小鼠体内。

每只动物腹腔注射 300 微升脉冲处理的 pls。在进行皮肤移植或肿瘤攻击实验（接下来将展示）前，至少需要提前三天对青蛙进行预处理。用于移植的皮肤取自一只麻醉的 LG 15 供体青蛙。

使用剪刀剪下并移除一小块呈银色的腹侧皮肤，即腹部皮肤。由于存在 ARI 四个色素细胞，因此在操作移植物时需格外小心。在处理组织时，应尽量减少操作，以免造成移植物损伤。

用镊子非常轻柔地夹住皮肤，并将其放入含有冷A PBS的培养皿中。保持培养皿处于低温状态。将皮肤置于干净的载玻片上，使用剃刀将单个移植物切成5 mm × 5 mm的组织块。

将组织碎片置于冰上的 PBS 中，以准备移植到六只受体青蛙的背侧。首先，在麻醉后的受体青蛙背部皮肤上做一个小切口。然后将 5 毫米 × 5 毫米的移植物植入皮下，银色面朝上。

务必注意移植物上剪刀和镊子造成的标记，因为这些不计入移植物排斥反应。一旦开始评分（24小时后），需要去除覆盖在移植物上的一部分宿主皮肤。使用剪刀在移植物周围剪出一个窗口，以便能够清晰观察移植物。

注意不要触碰供体皮肤或引起出血。立即开始通过绘制草图来标记移植物。皮肤移植。

排斥反应通过移植物皮肤上刺青染料被破坏的百分比来判断。应每隔两到三天在体视显微镜下检查移植物。通过重悬将肿瘤细胞制备用于移植，以每300微升肿瘤培养基中含有5×10⁵个细胞的密度悬浮于肿瘤培养基中。

通过皮下注射将细胞移植到动物背部的一侧。每只青蛙注射 5 × 10⁵ 个细胞，体积为 300 µL。在肿瘤接种后两到三周内，肿瘤生长将开始。

记录肿瘤的初始外观。使用游标卡尺测量肿瘤的尺寸，并在采集蛙类血液白细胞前每两到三天记录一次肿瘤体积。通过在火焰上拉制意面移液管来制备玻璃针。

在体视显微镜下将移液管的精细末端修整锋利后，将移液管连接至一根吸液用的塑料管。开始采血时，剪开麻醉青蛙后肢足部上方的皮肤，暴露背侧跖部静脉。用一到两毫升预冷的含肝素 PBS 溶液填充玻璃针头。

然后将玻璃针插入静脉，通过口吸缓慢开始采集血液。一只中等大小的青蛙可采集1至2毫升血液。青蛙腿部的小切口无需缝合。

伤口将在一周内愈合。此处展示了移植后第12天皮肤移植物排斥反应的体视显微镜分析结果。一只接受来自MHC相同的LG六系供体皮肤移植物的LG六系克隆蛙未出现排斥反应。

星号表示标记的镊子并非由于排斥所致。相比之下，一只接受来自MHC不同的远交系供体皮肤移植的LG六克隆青蛙显示出80%的排斥反应。在两张图像中，箭头指示的是银色的虹彩四色素细胞，标记着健康且未被排斥的移植组织。

在接下来的实验中，将LG 15个脾细胞分别用PBS（作为阴性对照）、从大肠杆菌培养物中纯化的重组GP 96，或从LG 15肿瘤组织细胞中纯化的GP 96进行脉冲处理，然后过继转移至LG 15成年受体中。三天后，通过皮下注射方式移植活的LG 15肿瘤细胞。自攻击后若干天起监测肿瘤的出现情况，并定期测量肿瘤大小。在这些图中，每条曲线代表一只青蛙体内肿瘤生长的动力学过程。结果显示，与对照组相比，预先用0.5或1微克GP 96处理的动物肿瘤出现时间显著延迟。因此，GP 96促进了非洲爪蟾中肿瘤抗原的交叉提呈。

我们刚刚向您展示了如何通过皮肤移植和肿瘤移植实验，研究GP96在非洲爪蟾（xap lavis）中呈递次要抗原和肿瘤抗原的能力。进行该操作时，需注意若血管受损，则应避免采集腹腔灌洗液，因为此时灌洗液中大多数细胞为红细胞而非巨噬细胞。此外，在操作皮肤移植物时，应避免使用镊子挤压组织，以防造成损伤。

以上就是全部内容。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。