比较在体内 GP96佐剂研究中的青蛙非洲爪蟾

该程序的总体目标是研究热休克蛋白 G 96 促进青蛙非洲爪蟾袖中抗原特异性 CD 8 T 细胞反应的进化保守能力。这是通过首先通过腹膜灌洗收集腹膜白细胞来实现的。该程序的第二步是用肿瘤来源的 GP 96 脉冲腹膜白细胞，该 GP 96 在孵育和洗涤后陪伴未成年人和肿瘤抗原。

腹膜白细胞通过腹膜内注射过继转移到幼稚的青蛙体内，以引发这些青蛙对抗肿瘤或轻微的组织相容性抗原。该程序的第三步是皮肤移植或肿瘤攻击引发的青蛙，并监测皮肤移植、排斥反应或肿瘤外观的发生。该程序的最后一步是获取外周血，用于表征参与皮肤排斥反应和抗肿瘤反应的 T 细胞。

最终，可以获得结果，分别通过皮肤移植和肿瘤攻击试验，显示 GP 96 引物青蛙的皮肤移植排斥反应显着加速，以及肿瘤外观的延迟。大家好，我是罗切斯特大学医学中心微生物学和免疫学系 Jacque Robert 博士实验室的 Christina Koska。我是 Tanya Cruz，也来自 Dr.River 的实验室。

今天，我们将向您展示一种通过腹膜白细胞过继转移来引发克隆青蛙的程序，然后进行皮肤移植和肿瘤移植测定。此外，我们还将向您展示如何从这些动物身上获取外周血。我们在我们的诊所中使用该程序来研究加热蛋白质 GP 96 促进 Salla 中抗原特异性 CDAT 细胞的能力，以及研究所涉及的细胞类型。

好了，让我们开始吧。我们实验中使用的青蛙是来自我们在罗切斯特大学繁殖地的 ISO 基因克隆。为了引出腹膜白细胞或 pls 进行收获，使用 25 号 5 8 针头将麻醉的青蛙腹膜内注射热灭活的大肠杆菌制剂注射后 3 天，通过腹膜内灌洗收获 pls。

要开始此程序，请用少量 70% 乙醇对麻醉青蛙的腹部进行消毒。然后使用 18 号 1.5 针头将 5 毫升无菌两栖动物磷酸盐缓冲盐水或战前 PBS 在室温下注射到腹膜腔中。取下针头并轻轻按摩青蛙一分钟，以确保注入的缓冲液与体腔中的液体相等。

接下来，将一个新的 18 号 1.5 针头插入青蛙的腹部，无需注射器。在避开血管的同时，将从针头后部滴落的腹膜液收集到干净的 50 毫升锥形管中。确保在收获 pls 后尽可能多地检索初始注入体积。

将青蛙放入浅水容器中，直到它醒来，此时可以将其放回笼子中。收获 pls 后，在 4 摄氏度下以 1000 RPM 离心 10 分钟，取出 sup、natant 和 resus。将 pls 悬浮在冷 A PBS 中。

将 RESUSPENDED pls 转移到 1.5 毫升微型垃圾管中。用 GP 96 脉冲 PLS。将适量的 GP 96 加入 pls 中，移液混合，一小时后在冰上孵育 1 小时。

以 14， 000 RPM 的转速离心细胞 1 分钟。要去除任何未结合的 GP 96，请去除上清液。加入冷 A PBS 和 resus。

再次暂停 PLS 离心机。用冷 A-P-B-S-A 总共洗涤 S 三次，以确保最后一次洗涤后没有残留的 G 96。Resus 以每 300 微升 PBS 的 5 倍 10 至 5 pls 的浓度悬浮脉冲 pls，以将 pls 过继转移到幼稚的 LG 六受体中。

腹膜内注射每只动物 300 微升脉冲 pls。青蛙需要在皮肤移植或肿瘤攻击实验前至少三天进行灌注，这将在下文中展示。用于移植的皮肤是从麻醉的 LG 15 供体青蛙获得的。

用剪刀剪掉一小块腹侧皮肤，即呈银色的腹部皮肤。由于在处理移植物时存在 ARI 四个色素细胞。尽可能少地作组织至关重要，因为这会导致移植物损伤。

用镊子非常轻柔地握住皮肤，并将其放入含有冷 A PBS 的培养皿中。保持培养皿打开。将皮肤放在新鲜的载玻片上，用剃须刀将单个移植物切成 5 毫米 x 5 毫米的小块。

将碎片保存在冰上的 PBS 中，以将皮肤移植到 LG six 受体青蛙上。首先，在麻醉接受者的背侧皮肤上做一个小切口。然后将 5 毫米 x 5 毫米的移植物插入皮肤下，银色的一面朝上。

请务必注意移植物上的剪刀和镊子标记，因为这些不算作移植物排斥。一旦 24 小时后开始评分，则需要从移植物中取出覆盖宿主的一部分皮肤。用剪刀在嫁接物周围剪出一个窗口，以便可以自由地观察嫁接物。

小心不要触摸供体皮肤或诱导出血。通过画草图立即开始对嫁接物进行评分。皮肤移植。

排斥反应由移植皮肤上 aridol 的破坏百分比决定。应在立体显微镜下每两到三天检查一次移植物。通过复苏准备用于移植的肿瘤细胞，将它们以 5 倍 10 至 5 个细胞/300 微升的密度悬浮在肿瘤培养基中。

通过在动物背侧的一侧皮下注射将细胞移植。每只青蛙以 300 微升体积注射 5 乘以 10 到 5 个细胞。肿瘤生长将在肿瘤攻击后 2 至 3 周内开始。

注意最初的肿瘤外观。使用卡尺测量肿瘤的尺寸，并在从青蛙收集血白细胞之前每两到三天记录一次其体积。将意大利面拉到火焰上，准备玻璃针。

在立体显微镜下磨锐移液器的细肢后，将移液器连接到吸液塑料管。要开始采血，切开麻醉青蛙后足上方的皮肤，露出跗骨背静脉。在玻璃针头中加入 1 至 2 毫升冰冷的 A PBS 加肝素溶液。

然后将玻璃针插入静脉，用嘴慢慢吸气开始收集血液。一只中等大小的青蛙可以获得 1 到 2 毫升的血液。青蛙腿上的小切口不需要缝合。

伤口会在一周内愈合。移植后 12 天皮肤移植物排斥反应的立体显微镜分析结果如下所示。一只 LG 六克隆青蛙接受了来自 MHC 相同的 LG 六供体的皮肤移植物，没有显示排斥反应。

星号表示标记镊子不是由于排斥引起的。相比之下，接受 MHC 不同远交供体皮肤移植的 LG 六克隆青蛙显示出 80% 的排斥反应。在两张图像中，箭头表示银色虹膜四个色素沉着细胞，标记健康的非排斥移植组织。

在下一个实验中，用 PBS 作为从大肠杆菌培养物中纯化的阴性对照重组 GP 96 或从 15 个零肿瘤组织细胞中纯化的 GP 96 脉冲 LG 15 pls，然后将 LG 15 个活细胞过继转移到 LG 15 成年受者中，三天后通过皮下注射移植活的 15 个零肿瘤细胞，监测攻击后几天首次出现的肿瘤，并定期测量肿瘤大小这些图表，每条曲线代表一只青蛙体内肿瘤生长的动力学。结果表明，与对照组相比，用 0.5 或 1 μg GP 96 引发的动物显着延迟了肿瘤出现。因此，GP 96 促进非洲爪蟾中肿瘤抗原的交叉呈递。

因此，我们刚刚向您展示了如何通过皮肤移植和肿瘤移植测定来探索 GP 96 在青蛙 xap lavis 中代表次要抗原和肿瘤抗原的能力。进行此程序时，重要的是要记住，如果血管受损，请避免收集腹膜灌洗液，因为红细胞内的大多数细胞而不是巨噬细胞。在作皮肤移植物时避免用镊子挤压组织也很重要，以避免损坏。

就是这样。感谢您的洗涤，祝您的实验好运。