悬滴法:一种生成 3D 黑色素瘤球体的技术

- 球状体是三维体外细胞培养模型，可模拟体内肿瘤结构，有助于研究肿瘤内部相互作用。要建立培养物，首先，在适当的培养基中制备黑色素瘤细胞的单细胞悬液。接下来，将小体积的这种细胞悬液充分分散到无菌、非粘附性培养皿的盖子内表面。小心地倒置盖子并将其放在含有 PBS 的培养皿的底部，以形成一个水合室。在适当的条件下孵育板。

PBS 中的水分可防止介质从悬滴中蒸发。通过更换几微升培养基来刷新液滴。由于表面张力，液滴保持其球形并保持悬浮在板的内表面。引力促进细胞保持悬浮状态而不扩散，而是聚集在液滴内形成三维球体。最后，用 PBS 冲洗液滴以收获球体。将它们收集在非粘附性培养皿中。

在以下协议中，我们将演示通过悬滴法生成 451-LU 黑色素瘤细胞的三维球体。

- 首先，根据一般细胞培养方案，使用含有 10% FCS 的 RPMI 培养基培养黑色素瘤细胞 451-LU。要生成黑色素瘤球状体，请在 PBS 中洗涤培养的黑色素瘤细胞。然后，在 PBS 中加入 5 毫升 1x 胰蛋白酶-EDTA。在室温下孵育 3 至 5 分钟。加入 5 毫升含有 10% FCS 的 RPMI 以中和胰蛋白酶。然后，将细胞悬液转移到离心管中。以 200 x g 离心 5 分钟以收获细胞。将细胞沉淀重悬于含有 10% FCS 的 RPMI 中。

接下来，对细胞进行计数，并将细胞悬液稀释至每毫升 10,000 个细胞的最终浓度。使用电动多移液器在无菌、非粘附性 10 厘米细胞培养皿的盖子内表面制作 40 x 25 微升细胞悬液点。

接下来，快速、平稳地将盖子翻转过来，并将其放在含有 5 毫升 PBS 的细胞培养皿上。将吊滴培养皿在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳中培养 10 至 14 天。

初次滴注点样后 5 天，使用电子分配器向每滴中加入 10 微升含 10% FCS 的 RPMI。10 到 15 天后，用 PBS 轻轻冲洗盖子，收获球体。将球体收集在新鲜的非粘附性细胞培养皿中。