慢性成像小鼠的视觉皮层使用减薄，颅骨的制备

树突棘是神经元树突的膜突起，接收突触输入。脊柱的延长、缩小外观或消失是响应特定神经活动模式导致的神经网络功能变化而发生的。这种现象被称为皮质可塑性，用于观察树突棘的形态变化。

在活体动物中，成像板贴在老鼠的头骨上。颅骨的一个区域通过手术变薄，需要低倍和高倍率的图像。然后在以后的时间点重新对区域进行成像。

获得的结果表明，在多个时间点使用薄颅骨制备可以清楚地可视化树突状脊柱形态。而且脊柱形态具有高度可塑性，显示结构变化以及树突棘的出现和消失。大家好，我是罗切斯特大学神经生物学和解剖学系 Anaya Maka 实验室的 Emily Kelly。

今天，我们将向您展示在称为准备的鳍之后对小鼠小瓶皮层进行慢性成像的程序。我们在实验室使用该程序来研究树突状脊柱翻转。那么让我们开始吧。

通过对无菌手术工具进行消毒来开始手术。然后使用 70% 乙醇对工作区进行消毒，并用干净的敷料覆盖作表面。通过测试芬太尼鸡尾酒麻醉小鼠对脚趾捏的反应来监测其麻醉深度，此处显示的小鼠是表达 GFP 的 AG-F-P-M 转基因小鼠。

在第 5 层中，将树枝状过程投射到浅层中的系金属单元。为了保持 37.5 摄氏度的体温，请将动物放在加热毯上，并用附带的直肠温度计进行监测。然后用剪刀在眼睛上涂抹眼药膏，以防止它们干燥。

从耳朵后面到眼睛去除鼠标后脑勺的毛发。然后用 70% 乙醇清洁动物的头顶，然后用 Betadine 磨砂膏和 Betadine 溶液清洁。在耳后做一个 LCU 切口，并沿着中线的右侧或左侧向上，具体取决于眼睛将成像的半球，将皮肤折叠起来，远离手术部位。

不要去除皮肤，因为稍后会用细镊子缝合。轻轻地将皮肤向上拉，使其远离感兴趣的区域。使用干净的镊子，轻轻地从颅骨的暴露区域刮掉骨膜。

在颅骨上涂抹少量 10% 公平氯化物，使骨膜完全干燥，并确保其已完全去除。颅骨完全干燥很重要。为确保胶水正确粘附，请用显微手术刀片轻轻刮掉干燥的骨膜。

接下来，在不锈钢头板的成像窗口周围涂上一层薄薄的 Sano 丙烯酸胶，并将板贴在头骨上。用棉签棒的木端，将胶水涂在成像窗口的内接缝上，确保填满成像板和颅骨曲率之间的所有间隙。将一滴 glue 加速器放入窗口中。

然后快速擦去多余的部分。胶水完全干燥后，让胶水干燥。使用贴有 0.7 毫米不锈钢毛刺的牙钻，开始在成像窗口中减薄头骨。

交替钻孔，偶尔使用 0.9% 无菌盐水。避免在颅骨上产生过多的热量。在头骨表面用小笔触在头骨上薄一个 4 x 4 毫米的窗口。

用牙钻。用钝端镊子测试颅骨的厚度。颅骨表面会在轻微的压力下略微凹陷。

成像的最佳颅骨厚度在 10 到 30 微米之间。颅骨变薄后，清洁窗户上的所有碎屑并将盐水涂抹在颅骨上。使用安装在解剖镜上的数码相机拍摄成像窗口。

这张照片中的脑脉管系统将有助于定位放置成像板的位置，以便进行后续的成像。将动物运输到双光子装置。动物应留在加热毯上，并在整个成像过程中持续监测体温。

带有 mi tai 激光器的双光子显微镜。使用10 W固态泵以获得最大功率和改进的Olympus flow view 共聚焦装置。该系统针对深层组织成像进行了优化，外部检测器安装在尽可能靠近物镜的位置，以便最大限度地检测来自大脑的荧光，使用低数字变焦向成像窗口添加一滴盐水。

使用固定在显微镜上的数码相机识别包含明亮标记的神经元的区域。Ips，拍摄成像区域的照片。这对于在后续时间点返回相同的成像位置是必要的。

通过大脑的整个可见范围获得低放大率堆栈，显示树突状分支的程度。这将用于在随后的时间点将成像区域定位为血管和树突。使用成像软件在年轻和成年动物中维持其结构。

将数字放大倍数增加八倍，必要时调整 XY 坐标，并收集高放大倍率堆栈，这将显示详细的树突形态，包括树突棘的位置和结构。详细记录每个堆栈集合，包括平移坐标、集合范围、Z 步长和堆栈中的步数。在随后的时间点返回这个树突或轴突时，将使用这些注释。

成像后，轻轻地将头板与颅骨表面分开，将其取出。使用镊子。去除所有残留的胶水，然后用 0.9% 无菌盐水擦拭颅骨。

使用 6 号缝合线将颅骨上的皮肤缝合在一起。成像程序后，用 70% 乙醇擦拭该区域。将动物放在加热灯下的干净笼子里，直到它醒来并可以移动。

然后将动物放回原来的笼子里，在两天到几个月后的某个时间点再次对动物进行成像，取下缝线并重新打开头部的皮肤。使用无菌方法，使用第一次手术期间拍摄的脑血管系统的数字图像来定位原始成像位置。然后像以前一样重新固定头板。

如有必要，使用显微外科刀片轻轻减薄可能在成像时间点之间重新生长的任何骨骼。用牙钻稀释，清除成像窗口上的碎屑，并滴入 0.9% 无菌盐水。将动物带到双光子显微镜前，并使用上一次会议期间拍摄的数字荧光图像定位原始成像区域。

启动 flow view 程序。打开原始的低放大率图像，将透明片贴在计算机屏幕上，并使用透明笔勾勒出主要血管图案。接下来，打开实时图像并将血管系统与透明胶片上的草图图案重新对齐。

移除透明度以重新映像 8 倍放大的结构。打开从上一个映像会话中收集的所需堆栈。将结构绘制到贴在计算机屏幕上的透明胶片上。

将实时图像放大 8 倍，并将图像与透明度对齐。根据对准低倍率位置的精度，可能还需要稍微调整图像的角度，将平移坐标设置为第一天的成像参数，包括步长和收集的图像数量，可以进行两次 Zack 重新成像。应限制头皮打开的次数，以避免破坏颅骨的完整性，这将导致表达 GFPM 的小鼠的成像分辨率差。

使用体内双光子激光扫描显微镜观察第五层系金属细胞的子集和相应的树枝状过程，此处显示了 GFP 标记的视觉皮层树突。该图像是从 PIA 每 5 微米获得一个图像的投影，最终深度为 175 微米。箱状区域在第 0 天以更高的放大倍率显示，第 4 天再次在此处显示，比较了第 0 天和第 4 天的树突分支图像的更高放大倍率。

这些图像显示了由白色箭头指示的稳定棘，丢失的缩回棘（由红色箭头标记）和由绿色箭头指示的新棘。我们刚刚向您展示了如何使用薄颅骨制剂在小鼠视觉皮层中进行慢性双光子成像。进行此程序时，请务必记住在变薄过程中要特别小心，以免损坏颅骨和下面的硬脑膜，因为这会导致成像分辨率不佳并做详细的记录。

就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。