利用冷冻电子显微镜和迭代螺旋实空间重构解析HIV-1衣壳组装体的结构

本实验的总体目标是提供一种利用冷冻电子显微镜获得螺旋组装分子三维结构的方法。该方案首先采用快速稀释与背面滤纸吸附法进行冷冻电镜样品制备，在制备冷冻水合电镜载网时 transiently 降低盐浓度。该过程可在后续进行低剂量冷冻电镜数据采集时，确保蛋白质稳定性，同时降低背景噪声，提高信噪比。

已完成衍射图样的螺旋索引。随后进行图像处理，接着进行实空间三维重构，最终得到HIV衣壳或ca管的密度图。通常，初次接触该方法的人员会遇到困难，因为最优数据采集与分析过程中存在多个关键步骤。

例如，在 HIV 的情况下，一种衣壳管状组装结构仅在摩尔浓度的原料溶液中形成，需在不破坏结构的前提下迅速降低盐浓度。获得高质量的冷冻电镜图像至关重要。给定一幅管状结构图像，很难确定如何对关键的管状结构进行指标化，以及应选用哪种软件进行三维重构。

本视频提供了一种详细且简便的方法，用于获取物理物体的三维重建图像，可作为您实验的参考。我将与Dr.Puja一起演示该操作流程。我们两人均来自Dr.Laboratory。为准备用于冷冻电镜的HIV-1衣壳蛋白组装体，首先在25毫安电流下对200目铜网的碳膜面进行25秒的辉光放电处理。

使用雾化器将环境室内的湿度调节至80%，该环境室为自制的手动重力驱动冷冻装置。同时，用液氮冷却玻璃瓶中的液态乙烷，并将浸入式冷冻装置安装到手动重力驱动装置上。接着，使用镊子将夹钳夹紧在载网边缘。

将2.5 µL预组装的蛋白溶液加至载网的碳膜面。然后将镊子装载到压杆上，使载网的碳膜面背离方向。向载网背面加入3 µL低盐稀释缓冲液。

立即用一张滤纸在同一侧轻轻吸去网格上的液体。保持网格整个背面与滤纸紧密接触约六秒钟。移去滤纸后，立即将网格浸入液态乙烷中。

最后，将镊子从推杆上取下，并迅速将载网转移至载网储存盒中。通过将冷冻水合载网装入FEI Titan Krios 2电子显微镜，开始冷冻电子显微镜观察。该设备在200千伏电压下运行，并配备Gatan 4K × 4K CCD相机。

在低剂量搜索模式下，增加约 200 倍的放大倍数。对整个载网进行筛查，寻找具有合适冰层的区域。将这些区域的位置保存至载物台文件中。

调用已保存的位置，并进一步筛查这些区域。在低剂量搜索模式下，将放大倍数设为 3,900 倍。选择具有均匀薄层冰的区域用于数据采集，其特征是孔洞上方悬浮有长管状结构。

将所有区域保存到第二阶段文件中。切换至曝光模式。设置59,000倍的放大倍数，并插入直径为100微米的物镜光阑。

然后调节物镜散光和电子束强度，使剂量约为每次曝光每平方埃15个电子。返回低剂量搜索模式，并移动到已保存的位置。识别并居中一个良好的微管。

使用CCD相机切换至对焦模式，调节焦距并设定通常在0.5至2.5微米之间的欠焦值。然后切换至曝光模式，设置曝光时间为0.3至0.5秒，以获得每平方埃15个电子的剂量。在胶片相机上采集图像，曝光前让胶片稳定10秒钟。

采集完图像后，移动到下一个已保存的位置，并重复此过程以采集更多图像。使用全浓度 D 19 显影液显影 12 分钟。然后使用尼康 Super CoolScan 9000 ED 扫描仪以 6.35 微米的像素尺寸对图像进行数字化。

螺旋结构可通过两个参数进行表征：贝塞尔阶数 N 和螺旋表面晶格在傅里叶变换中的层线编号 L。每条层线由 N 和 L 描述，并对应于表面晶格上一组以 H 和 K 指数表示的线条。

开始螺旋索引时，使用 Iman 的程序 Helix boxer 框选出一条相对较长、笔直且直径均匀的管状结构，并将图像保存为 MRC 格式。然后使用 Iman 的程序 boxer 测量该管状结构的半径。利用基于互相关分析的程序（例如 MRC 软件包中的 I-M-G-C-C-F）确定 HEL 重复距离。

然后计算前庭。使用等于重复距离整数倍的新盒长进行变换。接下来，选择两条主层线，这两条层线定义了两个基本的表面晶格矢量，分别以FFT像素为单位表示为一零和零一。

确定傅里叶变换中两条主层线的层线编号以及最大振幅对应的半径。根据两条主层线的层线编号及其对应的贝塞尔函数阶数，利用书面实验步骤中所述的选择定则，可计算出亚基之间的旋转角度以及单星螺旋的轴向升距。这两个实数描述了管状结构的螺旋对称性。

3D 重建始于使用 Iman 程序 Boxer 进行颗粒分割。打开包含螺旋颗粒的显微照片后，在 Boxer 的控制面板中将一个颗粒切割成重叠的片段。选择螺旋模式并设置选框参数。

盒子的尺寸应大于颗粒的直径，OLA 的值应约为盒子尺寸的 90%。向左点击颗粒框任一端后，将自动沿螺旋长度生成一系列颗粒框，并保存框选的片段及其坐标。下一步是在使用 I-H-R-S-R 处理之前，采用迭代螺旋实空间重构方法（I-H-R-S-R）进行初步的三维重构。

反转冷冻电镜图像的对比度并应用低通滤波。然后通过输入 generator 命令打开 I-H-R-S-R 程序的图形界面。在图形界面中提供所有关于 boxed 粒子堆栈的信息，包括堆栈的名称和路径、堆栈中的图像数量以及对称性参数的数值。

单击完成按钮以创建重建脚本。B 25 SP。我使用实心或空心圆柱体作为初始参考，并让程序循环运行，直到定义的螺旋对称性不再发生变化，这通常在几次循环后发生。正确的螺旋对称性应能得到稳定收敛的重建结果。

最后一个循环中生成的重构结果将用作进一步优化的初始参考。最后，以I-H-R-S-R生成的三维密度图作为初始参考，进行迭代优化的三维重构，以实现进一步的精细优化。螺旋对称性固定为亚基间的旋转角度和轴向升移，这些参数由I-H-R-S-R流程确定。

接下来，使用 CTF find 3 和 CTF tilt 程序，结合称为 FT 和 mu 的 SPIDER 程序，确定显微照片中存在的离焦和像散。通过将参考体积的投影与经 CTF 校正的图像进行多参考比对，实现投影匹配。非平面倾斜角度的变化范围限制在正负 10 度以内，并以 1 度为步长进行采样，同时引入诸如平面角度接近 0 度或 180 度时具有高相关系数、X 方向位移受限等约束条件。

对于每个片段的比对参数，在重构中仅包含满足约束条件的片段。每次迭代优化循环后，通过反投影生成一个三维重构，并除以CTF的平方，施加螺旋对称性以生成具有对称性的体积。当新的三维重构分辨率不再进一步提高时，迭代优化即终止。

选取一个 HIV 单个衣壳组装结构，即一个 92 e 管状结构，对其进行裁剪，并计算其傅里叶变换，用于螺旋索引分析两个半径：确定了一阶零层线和零阶一层线最大振幅对应的半径值。随后计算得到一阶零层线和零阶一层线的终值分别为 -12 和 11，重复距离为 5195.48 埃。该管状结构的螺旋对称性被确定为 ΔZ = 6.81 埃，Δφ = 328.88 度；通过 I-H-R-S-R 方法将 ΔZ 和 Δφ 精修至 7.13 埃和 328.86 度，并在经过 10 次迭代循环后生成了初步的重构结果。

经过迭代优化后的最终重构结果，相较于使用I-H-R-S-R方法计算得到的初始模型，显著改善了密度图的质量。衣壳组装管的密度图显示为三个正交切片：两个切片平行于管轴并靠近表面，另一个切片垂直于管轴且穿过管轴中心。所展示的结构是基于三维密度图在1.8 Sigma等值面水平（包含100%体积）进行表面渲染所得。

观看本视频后，您应能充分理解如何利用冷冻电子显微镜获得自组装分子的三维结构。