HIV - 1衣壳大会通过低温电子显微镜的结构和迭代螺旋实时空间重构
August 9th, 2011
本文介绍了一种方法来获得一个三维（3D）螺旋组装使用低温电子显微镜的分子结构。在这个协议中，我们使用的HIV - 1衣壳集会，说明详细的三维重建过程，实现了由迭代螺旋空间重构方法的密度图。
该程序的总体目标是提供一种使用冷冻电子显微镜获得螺旋组装分子的三维结构的方法。该方案从冷冻 EM 样品制备开始，使用快速稀释和背面印迹方法在制备冷冻水合 EM 网格时瞬时降低盐浓度。该过程可确保蛋白质稳定性，同时降低背景噪音并提高 cryo EM 低剂量数据收集期间的信噪比。
衍射花样的螺旋标定完成。然后进行图像处理，然后进行真实空间 3D 重建，从而获得 HIV 一个衣壳或 ca 管的最终密度图。通常，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为最佳数据收集和分析有几个关键点。
例如，在 HIV 的情况下，仅在一个摩尔源溶液中形成的衣壳管状组件可迅速降低盐浓度而不影响结构。获得高质量的冷冻电镜图像至关重要。给定管状图像，很难学习如何对关键管进行索引，以及可以考虑使用哪种软件进行 3D 重建。
本视频提供了一种详细而直接的方法，可用于获得物理对象的 3D 重建，并可用作实验的参考。我将与 Dr.Puja 一起演示该程序。我们都是 Dr.Laboratory 的博士后 为了准备用于冷冻电镜的 HIV 单衣壳蛋白组装体，首先在辉光下将 200 目铜栅的碳侧在 25 毫安下放电 25 秒。
使用雾化器将环境室中的湿度调到 80%，这是自制的手动重力柱塞。同时，在带有液氮的体外 bott 柱塞压头中冷却液态乙烷，将插入式冷冻压头安装到手动重力柱塞上。接下来，使用镊子夹住闭合在网格边缘上的钳子。
将 2.5 微升预组装的蛋白质溶液涂抹在网格的碳侧。然后将镊子装到柱塞上，网格的碳面朝向。在网格背面加入 3 μL 低盐稀释缓冲液。
立即在同一侧用一张滤纸吸干网格。保持网格的整个背面与滤纸紧密接触约 6 秒钟。去除滤纸后，立即将网格浸入液态乙烷中。
最后，从柱塞上取下镊子，将网格快速转移到网格存储盒中。通过将冷冻的水合网格加载到 FEI 极性 G 双电子显微镜中来开始冷冻电子显微镜。在 200 KB 电压下运行，并配备 gatin 4K x 4K CCD 相机。
在低剂量搜索模式下，添加约 200 倍的放大倍数。筛选整个网格以查找具有合适冰的区域。将这些区域的位置保存在舞台文件中。
调用已保存的位置并进一步筛选这些区域。在低剂量搜索模式下添加 3， 900 x 的放大倍数。选择具有均匀薄层冰的区域进行数据收集，其特征是包含悬挂在孔上的长管。
将所有区域保存在第二个阶段文件中。切换到曝光模式。添加 59， 000 x 的放大倍率并插入 100 微米的物镜孔径。
然后调整客观柱头和光束强度，剂量约为每次曝光每平方埃 15 个电子。返回低剂量搜索模式并移动到保存的位置。确定并居中一根好管子。
使用 CCD 相机切换到对焦模式，调整焦距并设置散焦值，通常介于 0.5 到 2.5 微米之间。然后切换到曝光模式，并将曝光时间设置为 0.3 到 0.5 秒，剂量为每平方埃 15 个电子。在平板相机上收集图像，让胶片在曝光前稳定 10 秒。
在收集图像后，移动到下一个保存的位置，然后重复此过程以收集更多图像。将全强度 D 19 显影 12 分钟。然后使用 Nikon Super cool scan 9， 000 ED 扫描仪以 6.35 微米的像素尺寸对图像进行数字化处理。
螺旋对象可以由两个参数进行索引。螺旋对象表面晶格的 Forer 变换中的贝塞尔阶数 N 和层线号 L。每层线以 N 和 L 为特征，对应于表面晶格上的一组线，由 H 和 K 指数表示。
要开始螺旋标定，请使用 Iman 程序 Helix Boxer 装箱出直径均匀的相对较长且直的管子，并将图像保存为 MRC 格式。然后使用 Iman 的程序 Boxer 测量管子的半径。使用基于互相关的程序（如 MRC 软件包中的 I-M-G-C-C-F）确定 HEL 重复距离。
然后计算门厅。使用新的框长进行变换，该长度是重复距离的整数。接下来，选择两条主层线，它们定义两个基本表面晶格矢量：一零和零一，以 FFT 像素为单位。
确定傅里叶变换中两条主层线的层线号以及最大振幅半径。给定两条主层线的层线编号和贝塞尔阶数值，可以使用书面程序中描述的选择规则获得子单元之间的旋转和单星螺旋线的轴向上升。这两个实数描述了管子的螺钉对称性。
3D 重建从使用 Iman 程序的粒子分割开始。拳击手。打开包含螺旋粒子的显微照片后，在 Boxer 的控制面板中将粒子切成重叠的片段。选择 helix 模式并设置装箱参数。
盒子的大小应大于颗粒的直径，OLA 的值应约为盒子大小的 90%。左后，单击粒子框的任一端将沿螺旋长度自动生成一系列粒子框，保存框段及其坐标。下一步是在使用 I-H-R-S-R 进行处理之前，使用迭代螺旋实空间重建方法 I-H-R-S-R 进行初始 3D 重建。
反转冷冻电镜图像的对比度并应用 LOWPASS 过滤。然后通过键入 generator 打开 I-H-R-S-R 程序的图形界面。为图形界面提供盒装粒子堆栈的所有信息，包括堆栈的名称和路径、堆栈中的图像数以及对称参数的值。
单击 finish 按钮创建重建脚本。B 25 SP.我使用实心或空心圆柱体作为初始参考，并允许程序循环，直到定义的螺钉对称性没有变化，这通常发生在几个循环之后。直螺旋对称性应给出稳定收敛的重建。
上一个周期生成的重建将用作进一步优化的初始参考。最后，使用 I-H-R-S-R 生成的 3D 密度图作为优化过程中额外细化的初始参考，通过迭代细化进行 3D 重建。螺旋对称性固定在亚基之间的旋转和轴向上升处，这是由 I-H-R-S-R 程序确定的。
接下来，使用程序 CTF find three 确定显微照片中存在的散焦和散光，使用称为 FT 的蜘蛛程序确定 CTF 倾斜，并通过对比度传递函数乘以粒子段。缩写 CTF 通过使用多参考对齐将参考体积的投影与 CTF 校正图像进行比较来执行投影匹配。平面倾斜角外的变化限制为正负 10 度，并以 1 度为步长采样，引入了一些限制，例如接近零度或 180 度的平面角中的高相关系数以及有限的 X 偏移。
对于每个线段的对齐参数，在重建中仅包含满足约束条件的线段。在每个迭代优化周期之后，使用反向投影生成 3D 重建，并除以一些 CTF 平方施加螺旋对称性以生成对称体积。当新 3D 重建的分辨率没有进一步提高时，迭代优化将终止。
将单个 HIV 单衣壳组件，一个 92 e 管装箱，并计算其傅里叶变换以对两个半径进行螺旋标定，确定层线数和层线 1 0 和 0 1 的最大振幅半径。然后分别计算 1 0 和 0 1 的负 12 和 11 的结束值，重复距离为 5195.48 埃。确定管的螺杆对称性为 delta Z 等于 6.81 埃，delta 5 等于 328.88 度delta Z 和 delta 5 使用 I-H-R-S-R 细化为 7.13 埃和 328.86 度，并在 10 个迭代周期后生成初始重建。
迭代细化后的最终重建比使用 I-H-R-S-R 计算的初始模型显着改进了密度图。衣壳组装管的密度图显示为三个平行于管轴且靠近表面的正交切片，垂直于管轴，平行于并穿过管轴。显示的结构是 3D 密度图的表面渲染的结果，该图的轮廓为 1.8 Sigma，包含 100% 体积。
看完这个视频，你应该对如何使用乌鸦电子显微镜获得盟体组装分子的 3D 结构有很好的了解。
概述
本文介绍了一种使用冷冻电子显微镜获取螺旋组装分子三维（3D）结构的方法。该协议阐述了使用HIV-1衣壳组装体实现密度图的详细3D重建程序。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 结构生物学
- 冷冻电子显微镜
背景
- 了解螺旋组装体的3D结构对于各种生物学应用至关重要。
- 冷冻电子显微镜可以对生物标本进行高分辨率成像。
- HIV-1衣壳组装体可作为研究螺旋结构的模型。
- 最佳数据收集和分析对于准确的3D重建至关重要。
研究目的
- 提供获取螺旋组装体3D结构的详细协议。
- 阐述螺旋实空间迭代重建方法。
- 增强对HIV-1衣壳组装体结构生物学的理解。
使用的方法
- 使用快速稀释和背面杂交法制备冷冻电子显微镜标本。
- 使用低剂量冷冻电子显微镜进行数据收集。
- 对衍射图案进行螺旋索引以实现准确的3D重建。
- 图像处理和实空间3D重建以生成密度图。
主要结果
- 成功获取了HIV-1衣壳组装体的高质量冷冻电子显微镜图像。
- 通过迭代重建方法生成详细的密度图。
- 确定了最佳数据收集的关键参数。
- 证明了该协议对该领域的新研究者的有效性。
结论
- 该协议提供了一种可靠的螺旋结构3D重建方法。
- 它为研究类似生物组装体的研究者提供了宝贵的参考。
- 进一步优化该方法可以提高成像质量和数据准确性。
常见问题
Executive Industry Relevance
Cryo-electron microscopy combined with iterative helical real-space reconstruction enables high-resolution structural determination of helical protein assemblies under near-native conditions. This approach provides biopharma R&D with a mechanistic foundation for target validation by resolving the architecture of viral capsids and other filamentous complexes. Structural insights support de-risking in early discovery by clarifying oligomerization states, binding interfaces, and assembly dynamics relevant to antiviral strategy.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of HIV-1 capsid architecture to validate mechanistic hypotheses about viral assembly and maturation.
- Operational Value: Provides reproducible 3D density maps that clarify subunit interactions and symmetry parameters for target de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable structural constraints (helical rise, twist) that can inform assay design for compounds targeting capsid assembly.
- Operational Value: Produces standardized density maps enabling cross-lab comparison of structural phenotypes under varying conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports translational continuity by linking in vitro assembly states to infectious virion morphology.
- Operational Value: Enables structure-guided interpretation of preclinical efficacy data for capsid-targeting inhibitors.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, where structural data informs hit-to-lead progression for antiviral programs.
- Discovery Biology: Clarifies HIV-1 capsid assembly mechanics to support hypothesis testing and pathway validation.
- Screening: Delivers reproducible structural outputs that enable quantitative assessment of compound-induced assembly perturbations.
- Analytics: Yields precise helical parameters (rise, twist) and density maps for objective comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects recombinant capsid tube structures to native viral cores for predictive modeling of inhibitor effects.
- Enterprise Reuse: Establishes a transferable workflow for studying other helical assemblies (e.g., microtubules, amyloid filaments) across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in viral target validation through direct visualization of assembly intermediates.
- Operational Value: Ensures data reproducibility via standardized specimen preparation, low-dose imaging, and iterative refinement protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in antiviral programs by providing structural confidence in target engagement mechanisms.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of capsid-targeting candidates based on structural and functional alignment.
Implementation Considerations
- Expertise in cryo-EM specimen handling, helical diffraction indexing, and 3D reconstruction software.
- Access to cryo-transmission electron microscopes with CCD cameras and liquid ethane plunge-freezing capability.
- Cross-team standardization of helical symmetry parameters and box-sizing protocols for segment extraction.
- Adaptation considerations for varying helical repeat lengths and subunit flexibility in non-viral assemblies.
- Practical limitations include dependency on sample homogeneity and the need for manual helical indexing prior to automated refinement.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:04
Frozen-hydrated Electron Microscopy (EM) Specimen Preparation
3:22
Cryo-EM of HIV-1 Capsid Protein Tubular Assemblies
5:26
Helical Indexing
7:13
Three-dimensional Reconstruction
10:42
Representative Results: HIV-1 Capsid Assemblies Structure Determination
12:16
Conclusion
