Name: HIV - 1衣壳大会通过低温电子显微镜的结构和迭代螺旋实时空间重构 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: 学习利用冷冻电子显微镜获取螺旋组装分子的三维结构。本方案采用快速稀释和背面印迹法制备样品，通过迭代螺旋实空间重构技术对HIV-1衣壳组装体进行高分辨率三维重建，为结构生物学研究提供可靠方法。

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作者感谢赵 Gongpu 博士和柯丹霞提供的技术支持。感谢 Edward Egelman 博士和 Niko Grigorieff 博士分享他们的图像处理软件。同时感谢匹兹堡大学医学院结构生物学冷冻电镜设施以及 Beowulf 集群和网格的支持人员。本工作由基金项目 GM082251 和 GM085043 资助。

1. 冷冻水合电镜样品制备
由于HIV-1衣壳蛋白（CA）的组装结构9 仅在高盐（1 M NaCl）缓冲液中稳定，这会在冷冻电镜成像中产生强烈的背景噪声，因此我们在制备冷冻水合电镜载网时，采用快速稀释和背侧 blotting 的方法，瞬时降低盐浓度。
<ol>
<li>将200目R2/1 Quantifoil铜网的碳膜面在25 mA条件下进行25秒的辉光放电处理。</li>
<li>使用雾化器将环境室（自制的手动重力加样器）内的湿度调节至80%。</li>
<li>在FEI Vitrobot冷冻投掷仪的杜瓦瓶中，用液氮冷却液态乙烷。将冷冻投掷用杜瓦瓶安装到手动重力加样器上。</li>
<li>取2.5 μl预先组装好的CA溶液，滴加到固定在镊子上的铜网碳膜面，然后将镊子装入加样器，使铜网的碳膜面背对操作者。</li>
<li>向网格的背面加入3 μl低盐稀释缓冲液（100 mM NaCl），并立即用一片滤纸吸去背面液体。滤纸应与网格整个背面紧密接触约6秒后再移除滤纸。移除滤纸后立即把网格投入液态乙烷中。</li>
<li>从加样器上取下镊子，并迅速将网格转移至网格储存盒中。</li>
</ol>
2. CA 管状组装体的冷冻电子显微镜观察
<ol>
<li>将冷冻水合网格载入在200 kV下运行、配备Gatan 4Kx4K CCD相机的FEI Polara G2电子显微镜中。</li>
<li>在低剂量搜索模式下，放大倍数约为 200 倍，并施加剂量 &lt;0.001e-/Å2，全面筛查载网，寻找具有合适冰层的区域，并将这些区域的位置信息保存至载台文件中。</li>
<li>调用已保存的位置，并在低剂量搜索模式下以3,900倍放大倍数进一步筛选这些区域。选择冰层均匀且较薄、含有分散良好且跨越孔洞的长管状结构的区域用于数据采集。将这些区域的位置信息保存至第二个阶段文件中。</li>
<li>切换至59,000倍放大倍数的曝光模式，插入 100 μm 物镜光阑，并调节物镜散光和电子束强度，使剂量约为 ˜15 e-/Å2 每次曝光</li>
<li>返回低剂量搜索模式，移动到已保存的位置，使用CCD相机识别并居中一根合适的管状结构。切换至对焦模式，调节对焦，并设置欠焦值，通常在0.5至 2.5 μm. 切换至曝光模式，设置曝光时间为 0.3–0.5 秒，剂量为 15 e-/Å2，然后采集图像。图像使用平板相机采集，胶片在曝光前应静置10秒。 </li>
<li>移动到下一个保存的位置，重复步骤5以采集更多图像。</li>
<li>胶片使用全浓度 D19 显影 12 分钟，并采用尼康 Super Coolscan 9000 ED 扫描仪以像素尺寸 6.35 μm图像文件的格式为TIFF。</li>
</ol>
3. 螺旋索引
螺旋结构可通过两个参数进行标定：贝塞尔阶数 n 和层线编号 l。傅里叶变换中的每条层线由 (n, l) 表征，对应于螺旋结构表面晶格上的一组线条，该组线条用二维晶格符号 (h, k) 表示。对于任意 (h, k)，(nhk, lhk) 层线是两个基本矢量 (n10, l10) 和 (n01, l01) 的线性组合，这两个基本矢量分别对应于两个主层线 (1, 0) 和 (0, 1) 的 n 和 l 值。l 可通过傅里叶变换中沿 Z 轴方向测得的层线高度获得。n 的值可通过以下公式估算10
2πRr ≈ Jn ≈ 1.1|n|+0.9   .....................(1)
其中 Jn 是贝塞尔函数，用于确定强度的分布 nth 层线，r 为螺旋物体的半径，R 为层线最大振幅处的半径。层线编号， l，与……相关 n 由选择定则11
 l = tn + um   ....................(2)
其中 t 和 u 是螺旋的常数。对于任意给定的螺旋，可能存在恰好 u 单位精确（或非常接近） t 完整旋转圈数
<ol>
<li>使用 EMAN 软件包中的程序12 helixboxer 对直径均匀、相对较直且较长的管状结构进行框选，并将图像保存为 MRC 格式。</li>
<li>利用 MRC 软件包13 中基于互相关分析的程序（例如 'imgccf'）确定螺旋重复距离 c。</li>
<li>采用新的盒长（为重复距离 c 的整数倍）计算傅里叶变换。</li>
<li>选择两条主要的层线，它们定义了两个基本的表面晶格矢量 (1,0) 和 (0,1)。</li>
<li>测量管状结构的半径 r，以及傅里叶变换中两条主要层线的高度和半径，分别为 l10、R10、l01、R01（见图 1）。</li>
<li>根据公式 (1) 计算 n10 和 n01。</li>
<li>由于 n 值仅为估算值，因此在后续步骤中（见步骤 4.2）需测试若干组 n10 和 n01 的组合，以使用程序包 IHRSR 确定正确的螺旋对称性。</li>
<li>计算由两个实数描述的螺旋对称参数：即亚基之间的旋转角度（Δφ）和单星螺旋（n=1）的轴向上升距离（Δz）。给定 l10、l01、n10 和 n01 的值后，可通过在一定范围（例如 -50&lt;m&lt;50）内测试 m 值并依据选择规则，求得 u 和 t。最终通过 Δφ =360t/u 和 Δz =c/u 计算 Δφ 和 Δz。</li>
</ol>
4. 三维重建
<ol>
<li>颗粒分割<ol>
<li>使用 EMAN 软件包中的图形程序 Boxer 打开包含螺旋颗粒的显微照片。</li>
<li>将螺旋颗粒切割为具有重叠部分的片段。在 Boxer 的控制面板中选择“螺旋模式”（Helix mode），并设置选框参数：框的尺寸应大于颗粒的直径，“Olap”值应设为框尺寸的约 90%。</li>
<li>在螺旋颗粒任一端左键点击后，Boxer 将自动沿螺旋长度生成一系列颗粒框。</li>
<li>保存选框后的片段及其坐标。</li></ol></li>
<li>使用 IHRSR 程序进行初始三维重构<ol>
<li>在使用迭代螺旋实空间重构方法（IHRSR）处理前，对冷冻电镜图像进行反差反转，并可选地进行低通滤波14。</li>
<li>通过输入“Generator”打开 IHRSR 程序的图形界面。向该界面提供所有关于颗粒框堆栈的信息，包括堆栈的名称和路径、堆栈中的图像数量、对称性参数的数值等。点击“Finish”按钮以生成重构脚本 b25.spi。</li>
<li>使用实心或空心圆柱体作为初始参考模型，并让程序循环运行，直到定义的螺旋对称性不再发生变化，这通常在几次循环后即可实现。正确的螺旋对称性应能产生稳定收敛的重构结果。最后一次循环生成的重构结果将作为进一步精修的初始参考。IHRSR 使用 SPIDER 程序进行三维重构。</li></ol></li>
<li>通过迭代精修进行重构15
由 IHRSR 生成的三维重构结果现作为额外精修的初始参考。在精修过程中，螺旋对称性固定为 Δφ 和 Δz，这两个参数由 IHRSR 步骤确定。<ol>
<li>使用程序 CTFFIND3 和 CTFTILT16 确定显微照片中存在的离焦值和像散。</li>
<li>使用 SPIDER 程序将颗粒片段乘以 CTF17。在 SPIDER 套件中，使用称为 FT 的操作计算二维图像的傅里叶变换（FFT）。随后，使用 SPIDER 套件中的 MU 操作，将 FFT 与前一步确定的 CTF 值相乘。所得结果再通过 SPIDER 的 FT 操作进行逆变换，以在实空间中生成新的图像（即 CTF 校正后的图像）。</li>
<li>通过多参考比对，将参考体积的投影与 CTF 校正后的图像进行投影匹配。平面外倾斜角的变化范围限制在 ±10°，以 1° 为步长进行采样。对每个片段的比对参数引入约束条件，例如高相关系数、平面内角度接近 0° 或 180°，以及有限的 x 方向偏移。仅将满足这些约束条件的片段纳入重构。</li>
<li>每次迭代精修循环后，使用反投影生成三维重构，并除以 CTF² 的总和。</li>
<li>施加螺旋对称性以生成对称化的体积。当新的三维重构分辨率不再进一步提高时，终止迭代精修。</li>
<li>图像处理软件包 SPIDER 用于大多数精修步骤。一系列操作由 SPIDER 脚本控制，这些脚本是用户创建的批处理控制文件，包含操作序列和参数值。最终的重构使用 SPIDER 套件中的程序计算得出。</li></ol></li>
</ol>
5. 代表性结果：
选取一根单独的 HIV-1 CA A92E 管状结构（图 1a），对其截取区域进行傅里叶变换（图 1b），用于螺旋参数标定。对于层线 (1, 0) 和 (0, 1)，l10=28，l01=37，R10=55，R01=44。给定管状结构半径为 211.57Å，我们估算出 n10=-12，n01=11（此处手性已预先确定）。根据重复距离 5195.48Å，确定该管状结构的螺旋对称参数为 Δz=6.8093Å，Δφ=328.88°。利用 IHRSR 方法对 Δz 和 Δφ 进一步优化，得到 7.1321Å 和 328.86°（图 2a），初始重构结果如图 2b 所示。经过迭代优化后的最终重构结果（图 3），其密度图质量相较于基于 IHRSR 计算得到的初始模型（图 2b）有显著提升。
<img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig1.jpg" alt="X射线衍射图谱，电子显微镜；分子排列的结构分析；示意图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. HIV-1 CA螺旋管的指数标定。（A）单个HIV-1 CA A92E管状结构图像。比例尺，30 nm。（B）A图所示管状结构的傅里叶变换图。标示出螺旋指数（n10=-12，n01=11）。箭头指向分辨率为23Å的层线。
<img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig2.jpg" alt="晶体学分析；角度、距离变化与循环次数的关系图；原子结构图像。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. 使用 IHRSR 进行的初始重构。（A）每次迭代循环的螺旋对称性确定。Δφ 和 Δz 从初始值开始，在经过 10 次迭代优化循环后收敛至稳定值。（B）经过 10 次迭代循环后的初始三维密度图。
<img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig3.jpg" alt="显示蛋白质丝状结构及其排列分析的冷冻电子显微镜图像" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 图 3．经过迭代优化后的三维密度图。（A-C）CA 管的密度图以三个正交切面显示：平行于管轴且靠近表面（A），垂直于管轴（B），以及平行并通过管轴（C）。比例尺，10 nm。（D）三维密度图的表面渲染图，等高线设定为 1.8s，包含 100% 体积。

<ol><li>Frank, J., Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+single+particles+negatively+stained+or+in+vitreous+ice%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of single particles negatively stained or in vitreous ice.</a> Ultramicroscopy. 46, 241-262 (1992).</li>
<li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Purple+Membrane+from+Halobacterium-Halobium+-+Analysis+of+X-Ray-Diffraction+Pattern%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure of Purple Membrane from Halobacterium-Halobium - Analysis of X-Ray-Diffraction Pattern.</a> J Mol Biol. 93, 123-128 (1975).</li>
<li>Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iterative+helical+real+space+reconstruction+method%3A+surmounting+the+problems+posed+by+real+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers.</a> J Struct Biol. 157, 83-94 (2007).</li>
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<li>Toyoshima, C., Unwin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+the+acetylcholine+receptor+by+cryoelectron+microscopy+and+helical+image+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of the acetylcholine receptor by cryoelectron microscopy and helical image reconstruction.</a> J Cell Biol. 111, 2623-2635 (1990).</li>
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<li>Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN%3A+semiautomated+software+for+high-resolution+single-particle+reconstructions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions.</a> J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).</li>
<li>Yonekura, K., Toyoshima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+determination+of+tubular+crystals+of+membrane+proteins.+IV.+Distortion+correction+and+its+combined+application+with+real-space+averaging+and+solvent+flattening%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. IV. Distortion correction and its combined application with real-space averaging and solvent flattening.</a> Ultramicroscopy. 107, 1141-1158 (2007).</li>
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<li>Mindell, J. A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+determination+of+local+defocus+and+specimen+tilt+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Accurate determination of local defocus and specimen tilt in electron microscopy.</a> J Struct Biol. 142, 334-347 (2003).</li>
<li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+and+WEB%3A+Processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">SPIDER and WEB: Processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).</li>
<li>Zhang, P. J., Hinshaw, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+dynamin+in+the+constricted+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of dynamin in the constricted state.</a> Nat Cell Biol. 3, 922-926 (2001).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

我们提供了一套方案，可简便地获得螺旋状物体的三维结构。利用所述方法，我们从单根管状图像（176个片段）中解析出了HIV-1衣壳组装体的三维结构。通过增加更多图像数据，可以获得更高分辨率的结构。
要获得最佳的数据采集和分析结果，有几个关键点需要注意：首先，在制备冷冻电镜样品时，应将样品溶液进行滤纸吸除，留下一层均匀且略厚于样品本身的薄层溶液。样品的吸除方法有多种。对于细菌细胞和管状样品（如HIV-1 CA组装体），从单侧特别是背侧进行吸除最为合适。
其次，需要确定螺旋的手性，因为仅通过螺旋索引或重构无法确定手性。常用的方法是采用冷冻蚀刻结合旋转喷镀技术18来判断手性。当密度图的分辨率足够高时，也可在重构完成后确定手性：假设正确的手性时，各个组分的三维原子模型应能很好地拟合到密度图中；否则，应假设为相反的手性。
第三，在图像处理过程中应使用维纳滤波器对相位和振幅进行校正，以减少噪声放大。由于单幅图像的对比度传递函数（CTF）始终存在零点交叉，导致倒易空间中的部分信息丢失。因此，必须包含多个投影数据集用于三维重构，每个数据集需在不同的离焦值下成像。

<table><tbody><tr><td>辉光放电装置 100X</td><td>辉光放电装置 100X</td><td></td><td></td></tr><tr><td>配备场发射枪的 Tecnai Polara F30 透射电子显微镜</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gatan 4K x 4K CCD 相机</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷冻固定装置</td><td></td><td></td><td>自制手动重力冷冻仪</td></tr><tr><td>Quantifoil R2/1 200 目带孔碳膜铜网</td><td>Quantifoil Micro Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电镜软件 EMAN</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://blake.bcm.edu/EMAN/">http://blake.bcm.edu/EMAN/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>电镜软件 IHRSR</td><td></td><td></td><td>程序可从 Edward H. Egelman 获取&lt;a href=&quot;http://people.virginia.edu/%7Eehe2n/">http://people.virginia.edu/~ehe2n/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>电镜软件 Spider</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>基于 MRC 的螺旋结构处理软件</td><td></td><td></td><td>程序可从 Koji Yonekura 获取&lt;a href=&quot;http://www.riken.jp/biostrmech/index.html">http://www.riken.jp/biostrmech/index.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CTFFIND3/CTFTILT 及实空间螺旋结构精修软件</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://emlab.rose2.brandeis.edu/software">http://emlab.rose2.brandeis.edu/software&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

利用冷冻电子显微镜和迭代螺旋实空间重构解析hiv-1衣壳组装体的结构

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

冷冻电子显微镜技术（cryo-EM）结合图像处理，已成为解析大分子蛋白质复合物和组装体结构的日益强大的工具。事实上，单颗粒电子显微镜1和二维（2D）电子晶体学2已发展为相对常规的方法，大量结构已通过这些方法得以解析。与此同时，螺旋状物体的图像处理与三维（3D）重构技术也迅速发展，尤其是迭代螺旋实空间重构（IHRSR）方法3，该方法结合了单颗粒分析工具与螺旋对称性。许多生物实体以丝状或螺旋形式发挥作用，包括肌动蛋白丝4、微管5、淀粉样纤维6、烟草花叶病毒7以及细菌鞭毛8；由于螺旋结构实体的三维密度图可从单张投影图像中获得，而相比之下非螺旋物体的三维重构需要多张图像，因此利用IHRSR方法，如今已能够实现对这类柔性和无序螺旋组装体的结构分析。
在本视频文章中，我们提供了获取螺旋状蛋白质组装体（以HIV-1衣壳9为例）三维密度图的详细实验方案，包括冷冻电镜样品制备、低剂量冷冻电镜数据采集、螺旋衍射图样的标定，以及使用IHRSR方法进行图像处理和三维重构。与其他技术相比，冷冻电镜能够在接近天然状态的条件下实现最优的样品保存。样品通过快速冷冻被包埋于一层薄薄的玻璃态冰中，并在液氮温度下、以低剂量条件在电子显微镜中成像，以最大限度减少辐射损伤。所获得的样品图像虽在接近天然状态下成像，但记录的显微照片中信号弱、对比度低。幸运的是，螺旋重构过程已基本实现自动化，仅螺旋衍射图样的标定仍需人工干预。本文中，我们描述了一种从数字化显微照片中对标定螺旋结构并确定其螺旋对称性（螺旋参数）的方法，这是实现三维螺旋重构的关键步骤。简而言之，我们首先应用IHRSR方法获得一个初始的三维密度图；随后通过引入对每个片段取向参数的约束条件，迭代优化该初始图，从而控制其自由度。进一步的改进则通过校正电子显微镜的对比度传递函数（CTF，包括振幅和相位校正）以及优化组装体的螺旋对称性来实现。

本文介绍了一种利用冷冻电子显微镜获取螺旋组装分子三维（3D）结构的方法。在本实验方案中，我们以HIV-1衣壳组装体为例，详细说明通过迭代螺旋实空间重构方法获得密度图的三维重建流程。

利用冷冻电子显微镜和迭代螺旋实空间重构解析HIV-1衣壳组装体的结构

冷冻电子显微镜技术（cryo-EM）结合图像处理，已成为大分子蛋白质结构解析日益强大的工具……

本实验的总体目标是提供一种利用冷冻电子显微镜获取螺旋组装分子三维结构的方法。该方案首先采用快速稀释与背面 blotting 方法进行冷冻电镜样品制备，在制备冷冻水合电镜载网时 transiently 降低盐浓度。该过程可在保证蛋白质稳定性的同时降低背景噪声，并在随后的冷冻电镜低剂量数据采集过程中提高信噪比。衍射图样的螺旋索引已完成。随后进行图像处理，接着进行实空间三维重构，最终得到HIV衣壳或ca管的密度图。通常，初次接触该方法的人员会遇到困难，因为在最佳数据采集与分析过程中存在多个关键步骤。例如，在 HIV 的情况下，一种衣壳管状组装结构仅在摩尔浓度的源溶液中形成，通过快速降低盐浓度而不影响其结构。获得高质量的冷冻电镜图像至关重要。给定一幅管状结构图像，很难了解应如何对关键的管状结构进行指标标定，以及可以考虑使用哪种软件进行三维重构。本视频提供了一种详细且简便的方法，用于获取物理物体的三维重建图像，可作为您实验的参考。我将与 Dr.Puja 一起演示该操作流程。我们两人均来自 Dr.Laboratory。为准备用于冷冻电镜的 HIV-1 衣壳蛋白组装体，首先在 25 毫安电流下对 200 目铜网的碳膜面进行 25 秒的辉光放电处理。使用雾化器将环境室内的湿度调节至80%，该环境室为自制的手动重力驱动冷冻装置。同时，用液氮冷却玻璃瓶中的液态乙烷，并将浸入式冷冻装置安装到手动重力驱动装置上。接着，使用镊子将夹钳夹紧在载网边缘。将2.5 µL预组装的蛋白溶液滴加到载网的碳膜面。然后将镊子装载到打孔器的推杆上，使载网的碳膜面背离方向。向载网背面加入3 µL低盐稀释缓冲液。立即用一张滤纸在同一侧吸去载网上的液体。保持载网整个背面与滤纸紧密接触约六秒钟。移去滤纸后，立即将载网浸入液态乙烷中。最后，从柱塞上取下镊子，并迅速将载网转移至载网储存盒中。通过将冷冻水合载网装入FEI Polar G2电子显微镜，开始冷冻电子显微镜观察。该显微镜工作电压为200千伏，配备Gatan 4K × 4K CCD相机。在低剂量搜索模式下，增加约 200 倍的放大倍数。对整个载网进行筛查，寻找具有合适冰层的区域。将这些区域的位置保存到载台文件中。调用已保存的位置，并进一步筛选这些区域。在低剂量搜索模式下，使用 3,900 倍的放大倍数。选择具有均匀薄层冰的区域用于数据采集，这些区域的特征是孔洞上方悬浮有长管状结构。将所有区域保存至第二阶段文件中。切换至曝光模式。设置59,000倍的放大倍数，并插入直径为100微米的物镜光阑。然后调节物镜散光和电子束强度，使剂量约为每次曝光每平方埃15个电子。返回低剂量搜索模式，并移动到已保存的位置。识别并居中一根良好的微管。使用CCD相机切换至对焦模式，调节焦距并设置通常在0.5至2.5微米之间的欠焦值。然后切换至曝光模式，设置曝光时间为0.3至0.5秒，以获得每平方埃15个电子的剂量。在胶片相机上采集图像，曝光前让胶片稳定10秒钟。采集完图像后，移动到下一个已保存的位置，并重复此过程以采集更多图像。使用全浓度的 D 19 显影液显影胶片，持续 12 分钟。然后使用尼康 Super cool scan 9,000 ED 扫描仪以 6.35 微米的像素尺寸对图像进行数字化。螺旋结构可通过两个参数进行表征：贝塞尔阶数 N 和螺旋表面晶格在傅里叶变换中的层线编号 L。每条层线由 N 和 L 描述，并对应于表面晶格上一组以 H 和 K 指数标记的线条。开始螺旋索引时，使用 Iman 的程序 Helix boxer 选取一段相对较长且笔直、直径均匀的管状结构，并将图像以 MRC 格式保存。随后使用 Iman 的程序 boxer 测量该管状结构的半径。利用基于互相关的方法（例如 MRC 软件包中的 I-M-G-C-C-F）确定 HEL 重复距离。然后计算前庭。使用等于重复距离整数倍的新盒长进行变换。接下来，选择两条主层线，以定义两个基本的表面晶格矢量，分别为“一零”和“零一”，单位为FFT像素。确定傅里叶变换中两条主层线的层线序号以及最大振幅对应的半径。根据两条主层线的层线序号及其对应的贝塞尔函数阶数，利用书面实验方案中所述的选择定则，可求得亚基之间的旋转角度以及单星螺旋的轴向升距。这两个实数描述了管状结构的螺旋对称性。3D 重建始于使用 Iman 程序 Boxer 进行颗粒分割。打开包含螺旋颗粒的显微照片后，在 Boxer 的控制面板中将一个颗粒切割成重叠的片段。选择螺旋模式并设置选框参数。盒子的尺寸应大于颗粒的直径，OLA 的值应约为盒子尺寸的 90%。向左点击后，点击颗粒框任一端将自动沿螺旋长度生成一系列颗粒框，并保存框选的片段及其坐标。下一步是使用迭代螺旋实空间重构方法（I-H-R-S-R）进行初始三维重构，然后再进行 I-H-R-S-R 处理。反转冷冻电镜图像的对比度并应用低通滤波。然后通过输入 generator 命令打开 I-H-R-S-R 程序的图形界面。在图形界面中提供所有关于 boxed particles 堆栈的信息，包括堆栈的名称和路径、堆栈中的图像数量以及对称性参数的数值。单击完成按钮以创建重建脚本。B 25 SP。我使用实心或空心圆柱体作为初始参考，并让程序循环运行，直到定义的螺旋对称性不再发生变化，这通常在几次循环后发生。正确的螺旋对称性应能获得稳定收敛的重建结果。上一轮循环中生成的重构结果将用作进一步优化的初始参考。最后，以I-H-R-S-R生成的三维密度图作为初始参考，进行迭代优化的三维重构，以实现进一步优化。螺旋对称性固定为由I-H-R-S-R程序确定的亚基间的旋转角度和轴向上升距离。接下来，使用 CTF find 3 和 CTF tilt 程序（采用称为 FT 和 mu 的 spider 程序）确定显微照片中存在的离焦和像散。通过 CTF 将粒子片段乘以对比度传递函数（简称 CTF），并对 CTF 校正后的图像与参考体积的投影进行投影匹配，采用多参考比对方法。非平面倾斜角度的变化范围限制在正负 10 度以内，并以 1 度为步长进行采样，引入诸如平面内角度接近 0 度或 180 度时具有高相关系数、X 方向位移受限等约束条件。对于每个片段的比对参数，仅将满足约束条件的片段纳入重构。每次迭代优化循环结束后，使用反投影生成一个三维重构，并通过除以CTF的平方，施加螺旋对称性，以生成具有对称性的体积。当新的三维重构分辨率不再进一步提升时，迭代优化过程终止。选取一个 HIV 单个衣壳组装结构，即一个 92 e 管状结构，对其进行裁剪，并计算其傅里叶变换，用于螺旋索引分析两个半径：确定第一零层线和零一层线最大振幅对应的半径。随后计算得到第一零层线和零一层线的终值分别为 -12 和 11，重复距离为 5195.48 埃。该管状结构的螺旋对称性确定为 ΔZ = 6.81 埃，Δφ = 328.88 度；通过 I-H-R-S-R 方法将 ΔZ 和 Δφ 精修至 7.13 埃和 328.86 度，并在经过 10 轮迭代循环后生成了初步的重构结构。经过迭代优化后的最终重构结果，相较于使用 I-H-R-S-R 方法计算得到的初始模型，显著改善了密度图的质量。衣壳组装管的密度图以三个正交切片形式展示，分别平行于管轴且靠近表面、垂直于管轴，以及平行并通过管轴。所展示的结构是基于三维密度图在1.8 Sigma等值面（包含100%体积）进行表面渲染所得的结果。观看本视频后，您应能很好地理解如何利用冷冻电子显微镜获得自组装分子的三维结构。

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