纯净小鼠的B细胞的诱导和评估类开关重组
August 13th, 2010
抗原暴露后，激活的B细胞亚群接受类开关重组（CSR）的一个过程，产生不同的效应功能的抗体亚型。在本报告所述的协议解释CSR如何可诱发和分析在体外为研究B细胞功能的目的。
在体液免疫反应期间，随着反应的进展，被抗原激活的 B 细胞增殖并分泌抗体。默认的 I GM 抗体同种型被更多样化的 IgG iga 或 IgE 同种型取代，以评估增殖和类别转换。使用磁性细胞分离从实验小鼠中分离体外脾 B 细胞。
用荧光染料 CFSE 对细胞进行染色以监测增殖，其增殖通过细菌 L-P-S-L-P-S 处理刺激，刺激也诱导类转换为同种型 IgG 3，其与增殖一起，可以通过流式细胞术进行监测。今天，我将向您展示一种分离和激活纯脾 B 细胞的技术。该技术可用于观察体外的类别开关重组和增殖，也可用于回答 B 细胞免疫领域的关键问题，包括脱氨酶中激活诱导的引用的功能和调节。
首先用 70% 乙醇浸泡安乐死的小鼠。小鼠应该是 8 到 12 周大 为确保免疫系统完全成熟，请使用无菌剪刀在腹部左疑病症的皮肤和肌肉上切开。使用剪刀或镊子从邻近组织去除脾脏。
接下来，在 PBS 中将其切成三大块。然后使用 1 毫升注射器柱塞的橡胶端，通过 70 微米细胞过滤器将脾脏轻轻捣碎到 PBS 中。请务必使用推动动作而不是研磨动作。
因为研磨可能导致较大的增殖细胞破裂。以不超过 350 G 的浓度离心细胞 5 分钟。然后将沉淀重悬于 PBS 中。
使用血液细胞仪在无菌 5 ml 聚苯乙烯管中对重悬的细胞进行计数。在含 5% 正常大鼠血清的 PBS 中制备每毫升 1 倍 10 至第八个细胞的悬浮液。每管最多可添加 2 毫升。
接下来是 50 微升 EP 阴性选择。每毫升细胞的小鼠 B 细胞富集混合物。然后盖上试管并放入冰箱冷藏 15 分钟。
为每毫升细胞添加 100 μL EP 生物素选择混合物。与生物素选择混合物、EP 磁性纳米颗粒一起孵育后，盖上试管并放入冰箱冷藏 15 分钟，每毫升细胞添加 100 μL。移液混合液，盖上试管，放入冰箱冷藏 5 分钟。
在 PBS 溶液中加入 2.5 mL，然后放入磁力架中 5 分钟，将磁力架倒置在试管中，然后快速倒入新的聚苯乙烯试管中。不要摇晃试管，因为阴性选择的细胞会磁性结合到试管壁上。为了进一步提高细胞悬液的纯度，将新的细胞管放入磁力架中 5 分钟，然后再次倒入新管中。
此步骤可能会降低整体细胞回收率。B 细胞纯度可以通过 B 细胞表面标志物的流式细胞术分析来评估。富集后，大于 95% 的细胞应为 B 2 20 阳性。
Re 将分离的细胞悬浮在补充有 0.1% BSA 的温 PBS 中，终浓度为 100 万个细胞/毫升，来自用无菌二甲基亚砜稀释的 5 毫摩尔 CFSE 染料储备液。管中每毫升细胞添加 2 μL。CFSE 用于监测受刺激细胞的细胞分裂。
这是同种型转换的关键过程。10 μmol 的终浓度最适合原代 B 细胞染色。在 37 摄氏度下避光孵育 10 分钟。
请注意，CFSE 对光敏感，应尽可能避光。孵育后，向细胞中加入等体积的牛犊血清并在冰上孵育，以淬灭染色剂。洗涤细胞 5 分钟，用至少五倍体积当量培养基填充试管，以抵消牛犊血清的粘度，并使细胞产生沉淀，然后以 350 G 离心。 细胞现在已经准备好进行刺激了。
通过在 RPMI 1640 中补充 10% 胎牛血清和 50 微摩尔 Beto me 人头乙醇来制备体外 B 细胞培养基。接下来，通过添加终浓度为 50 μg/mL 的 LPS 来制备刺激培养基。将 125 μL 刺激培养基分装到平底 96 孔组织培养板的每个孔中。
在不含 LPS 的培养基中制备 CFS E 染色的 B 细胞，终浓度为 3.2 倍 10 至 6 个细胞/毫升。将 125 μL 细胞悬液添加到含有刺激培养基的孔中，轻轻移液混合。每个孔现在包含 400， 000 个细胞，最终 LPS 浓度为 25 μg/mL。
这提供了最佳的细胞增殖和类别转换水平。尽管可以根据需要更改这些值，但请将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 72 至 96 小时。48 小时后，在显微镜下将清晰可见大增殖的 B 细胞簇，以观察类别转换。
从培养箱中取出细胞，并在 1 mL 染色缓冲液中洗涤两次，以防止非特异性抗体染色。通过在 350 G 下旋转细胞来沉淀细胞，然后将细胞重悬于 100 μL 染色缓冲液中，其中含有 5% 正常小鼠血清和每 100 万个细胞 1 μg FC 块，并在冰上孵育 15 分钟，不洗涤。以每百万个细胞 1 μg 的浓度添加荧光标记的抗 US IgG 三抗体，在冰上孵育 30 分钟，洗涤细胞两次，然后重悬于 2 至 300 μL 染色缓冲液中。
细胞现在已准备好通过流式细胞术进行评估。CFSE 在 492 纳米处由氩离子激光器最佳激发，发射波长为 517 纳米。IgG 三抗的激发和发射光谱取决于其偶联荧光染料。
磁富集后，细胞悬液应看起来像一个由难以区分的小圆形细胞组成的均质群体。刺激 48 至 72 小时后，将清晰可见孤立的增大增殖细胞簇。大部分未增殖的细胞在凋亡时会显得小而颗粒状。
通常可以在刺激后 72 到 96 小时之间检测到最高水平的 CSR，然后大多数细胞开始死亡。在这个阶段，细胞应该已经经历了多次细胞分裂，转换细胞出现在后来的子细胞群中。遵循这些方案，其他技术如 rna、AI 介导的基因敲低可用于研究任何基因对 ID 功能和类别开关重组过程的影响。
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概述
本文讨论了在抗原暴露后B细胞中类别转换重组（CSR）的过程。它概述了一种在体外诱导和分析CSR的协议，以研究B细胞功能。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- B细胞生物学
- 抗体生产
背景
- B细胞对体液免疫反应至关重要。
- 活化的B细胞经历CSR以产生不同的抗体同种型。
- 理解CSR对于洞察B细胞功能和调控至关重要。
- 本研究利用体外方法来分析B细胞行为。
研究目的
- 展示一种分离和活化脾脏B细胞的技术。
- 研究体外类别转换重组和增殖。
- 探索激活诱导的胞苷去氨酶的功能和调控。
使用的方法
- 使用磁性细胞分离技术从实验小鼠中分离脾脏B细胞。
- 用CFSE染色细胞以监测增殖。
- 用细菌LPS刺激细胞以诱导类别转换。
- 使用流式细胞术监测增殖和类别转换。
主要结果
- 成功分离和活化了纯脾脏B细胞。
- 诱导了IgG3同种型的类别转换重组。
- 有效地监测了B细胞的增殖。
- 通过这项研究获得了对B细胞免疫的洞察。
结论
- 该协议为研究B细胞功能提供了一种可靠的方法。
- 研究结果有助于理解CSR的机制。
- 这项研究可以帮助回答B细胞免疫的关键问题。
