Name: 诱导小鼠肠道炎症由效应CD4的过继转移 + CD45RB高 T细胞免疫缺陷小鼠 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 了解通过过继转移CD4+CD45RB高T细胞诱导小鼠肠道炎症的实验方法。该技术利用免疫缺陷小鼠建立结肠炎模型，模拟人类炎症性肠病的临床与病理特征，为研究疾病机制及开发新疗法提供可靠平台。

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本研究得到了美国胃肠病学会（AGA）研究学者奖和克罗恩病与结肠炎基金会（CCFA）职业发展奖（授予 S.Z.S.）、美国国立卫生研究院国家糖尿病、消化与肾脏疾病研究所 F30 DK089692 基金（授予 E.C.S.）以及北卡罗来纳大学胃肠道生物学与疾病研究中心资助 P30 DK34987（组织学核心）的支持。北卡罗来纳大学流式细胞术核心设施部分由美国国家癌症研究所中心核心支持基金（P30CA016086）资助，该基金授予北卡罗来纳大学 Lineberger 综合癌症中心。我们感谢北卡罗来纳州立大学兽医学院的 Luke B. Borst 在组织病理学分析和免疫组织化学方面提供的帮助。

注意：确保所有动物实验方案均已获得机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并符合美国国家研究委员会（National Research Council）的相关规定 实验动物护理和使用的指南供体小鼠可为雄性或雌性，但受体小鼠应为雄性。若使用雌性受体小鼠，则供体小鼠必须为雌性5使用常规非无菌垫料和非酸化水维持品系，因为这些因素可能影响小鼠肠道微生物群，从而影响结肠炎表型5,6.
1. 实验准备
<ol>
	<li>使用预冷的培养基和缓冲液。整个实验过程中将细胞置于冰上。</li>
	<li>在无菌生物安全柜中采用无菌技术进行实验。</li>
</ol>
2. 脾脏T细胞的分离
<ol>
	<li>将供体小鼠置于 CO2 安乐死舱内实施安乐死，随后进行颈椎脱位。用 70% 乙醇喷洒腹部。</li>
	<li>在腹部做一横向切口，剥离皮肤以暴露腹膜。用镊子将腹膜与内脏分离，切开左侧腹膜，暴露并切除脾脏。</li>
	<li>将脾脏放入含 10 ml 完全培养基的培养皿中。去除并弃去脾脏上的多余组织。</li>
	<li>使用两片灭菌玻璃载玻片将脾脏碾碎并分散成单细胞悬液。将细胞悬液通过 70 μm 细胞筛滤入 50 ml 锥形管中，并用 5 ml 完全培养基冲洗细胞筛。每只 50 ml 锥形管中最多可放入 5 只脾脏。</li>
	<li>以 450 × g 离心 7 分钟。倾倒或通过真空抽吸将上清液弃入废液容器中。</li>
	<li>每只脾脏加入 5 ml 裂解缓冲液，轻柔重悬细胞，在室温下裂解红细胞 10 分钟。向管中加入等体积的完全培养基（每只脾脏 5 ml）。</li>
	<li>以 450 × g 离心 7 分钟。倾倒或通过真空抽吸将上清液弃入废液容器中。</li>
	<li>用 10 ml 标记缓冲液轻柔重悬细胞。</li>
	<li>通过台盼蓝排斥法计数细胞。
	<ol>
		<li>取 20 μl 细胞悬液加入含 180 μl 台盼蓝的微量离心管中，充分混匀。5 分钟后，取 10 μl 染色细胞加入血细胞计数板，在显微镜下计数未染成蓝色的细胞。确定活细胞总数。弃去细胞与台盼蓝的混合液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞在 10 ml 标记缓冲液中以 450 × g 离心 7 分钟。倾倒或通过真空抽吸将上清液弃入废液容器中。</li>
</ol>
3. CD4+ T 细胞的富集
注意：本节所用特定产品的操作请遵循制造商的说明。
<ol>
	<li>用预冷的标记缓冲液将细胞轻柔重悬，调整细胞浓度至 20 × 106 个细胞/ml，形成单细胞悬液。</li>
	<li>每 1 × 106 个细胞加入 5 μl 生物素化 CD4 T 细胞富集抗体。冰上孵育 15 分钟。</li>
	<li>加入 10 倍体积的标记缓冲液。以 450 × g 离心 7 分钟。使用真空抽吸装置小心吸除所有上清液至废液容器中。</li>
	<li>充分涡旋振荡链霉亲和素偶联的磁性颗粒。每 1 × 106 个细胞加入 5 μl 磁性颗粒。</li>
	<li>充分但轻柔地混匀。将混合物置于 6–12 °C 条件下孵育 30 分钟。</li>
	<li>用标记缓冲液调整细胞浓度至 20–80 × 106 个细胞/ml。每根 12 × 75 mm 圆底试管（称为“阳性组分管”）最多加入 1.0 ml 标记后的细胞悬液。</li>
	<li>将每根阳性组分管置于磁力架上 6–8 分钟。</li>
	<li>保持阳性组分管仍在磁力架上，用玻璃巴斯德吸管小心将上清液从阳性组分管转移至新的无菌 50 ml 锥形管（称为“富集组分”）。该富集组分含有 CD4+ T 细胞。操作时注意不要扰动被磁力吸附的标记细胞。</li>
	<li>用与步骤 3.6 相同体积的标记缓冲液，通过反复吹打将阳性组分管中残留的细胞充分重悬。将阳性组分管再次放回磁力架上，静置 6–8 分钟。</li>
	<li>保持阳性组分管仍在磁力架上，用玻璃巴斯德吸管小心将上清液（富集组分，CD4+）从阳性组分管转移至步骤 3.8 中的无菌 50 ml 锥形管，注意不要扰动吸附在管壁上的细胞。</li>
	<li>重复步骤 3.9–3.10 以提高所获得的 CD4+ T 细胞得率。后续实验使用富集组分（CD4+ 细胞）继续进行。</li>
</ol>
4. 细胞标记与分选7
<ol>
	<li>在450 × g下离心富集的细胞7分钟。通过倾倒或真空抽滤将上清液弃入废液容器中。</li>
	<li>在1 ml标记缓冲液中重悬细胞。取部分细胞用于计数，并通过台盼蓝排斥法检测细胞活力，步骤同2.9。</li>
	<li>加入标记缓冲液至 10 x 106 细胞/毫升；如果细胞已经 &lt;10 x 106，450 × g 离心 7 分钟，倾去上清液或用真空抽滤法转移至废液容器，加入标记缓冲液至 10 × 106 cells/ml
	<ol>
		<li>准备若干独立的分装样品，每份约含 5-10 × 105 每个微离心管中分别加入未染色、同型染色和单染对照细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>添加 5 μg/ml CD4-FITC 和 1 μg/ml 将CD45RB-PE加入细胞中。在微量离心管中，向相应的分样中加入相同浓度的同型对照染料和单染染料。充分但轻柔地混匀，置于冰上避光孵育30分钟。</li>
	<li>加入10倍体积的标记缓冲液至细胞及对照样本中，450 × g离心7分钟，用真空抽滤法将上清液弃入废液容器。</li>
	<li>用步骤4.5中的体积的标记缓冲液重悬。450 × g离心7分钟。用真空抽滤将上清液弃入废液容器中。</li>
	<li>用标记缓冲液重悬至 10 x 106 细胞/ml。将细胞通过 70 μm 滤器转入流式管中，置于冰上避光保存，直至准备进行流式细胞术。</li>
	<li>使用未染色细胞和单染对照在细胞分选仪上设置并确定适当的补偿。</li>
	<li>通过前向散射和侧向散射门控排除非活细胞图1A设置CD4的门控+ 和 CD45RB+ 细胞与同型染色对照。在CD4上设门细胞+ 群体</li>
	<li>分选CD4+ 将细胞分选为CD45RB高 和 CD45RB低 使用简单直方图分析将PE染色的细胞分选至含2 ml完全培养基的试管中。CD45RB高 群体代表 CD4 表达水平最高的前 40%+CD45RB+ 细胞（CD45RB高），以及 CD45RB低 群体为 CD4 水平最低的 20%+CD45RB+ 细胞（CD45RB低; 图1B).</li>
</ol>
<img alt="多色流式细胞术分析、散点图和直方图，突出显示细胞数据分布。" src="/files/ftp_upload/52533/52533fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1：FACS 分析过程中 CD4+CD45RB T 细胞群体的代表性流式细胞术图谱。（A-C）来自供体 C57BL/6 小鼠的经 FITC 标记 CD4 和 PE 标记 CD45RB 染色的脾细胞，通过 FACS 分选为 CD4+CD45RBhigh 和 CD4+CD45RBlow T 细胞群体。（A）在前向散射图中排除双联体事件。（B）在前向散射和侧向散射图中圈选淋巴细胞。（C）圈选 CD4+ T 细胞，（D）CD4+CD45RB+ T 细胞在 PE 信号对事件数的直方图上显示。CD4+CD45RBlow 细胞定义为 CD45RB+ 细胞中表达水平最低的 20%。CD4+CD45RBhigh 细胞定义为 CD45RB+ 细胞中表达水平最高的 40%。
<ol start="11">
	<li>使用流式细胞仪检测每种细胞群体的等分试样，以评估细胞群体的纯度。</li>
	<li>将分选后的细胞在450 × g离心7分钟。用1 ml PBS重悬细胞。取部分细胞用于计数，并通过台盼蓝排斥法检测细胞活力，步骤同2.9。</li>
</ol>
5. 将细胞注射至受体
<ol>
	<li>用 PBS 将分选后的细胞重悬至 4 x 106 个细胞/ml（CD45RBhigh）或 2 x 106 个细胞/ml（CD45RBlow）。</li>
	<li>将每只受体所需的 100 μl CD45RBhigh 细胞转移至新的无菌管中。向该管中每只受体加入 100 μl PBS。因此，每只动物的总注射体积为 200 μl，每只受体接受的细胞总量为 4 x 105 个 CD4+CD45RBhigh 初始 T 细胞。</li>
	<li>若需设置接受调节性 T 细胞的实验组，则将每只受体所需的 100 μl CD45RBhigh 细胞转移至新的无菌管中，并向同一管中加入每只受体所需的 100 μl CD45RBlow 细胞。每只动物的总注射体积为 200 μl；CD45RBhigh 与 CD45RBlow 细胞的比例为 2:1。</li>
	<li>将 100 μl CD45RBhigh 或 CD45RBhigh/CD45RBlow CD4+ 细胞分别注射至每只受体腹部右侧和左侧腹腔内（总量为 200 μl）。</li>
</ol>
6. 受体动物疾病进展的监测
<ol>
	<li>为评估受体动物的临床状态，在注射当天、之后每周以及处死时，对以下参数进行综合临床评分8：
	<ol>
		<li>通过测量体重减轻情况判断消耗状态：0 – 无体重减轻；1 – 初始体重减轻0.1–10%；2 – 初始体重减轻超过10%（图2A）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="免疫反应研究；体重变化图；小鼠受试者；胃肠道对比；T细胞影响。" src="/files/ftp_upload/52533/52533fig2highres.jpg" width="650" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2：将野生型 CD4+CD45RBhigh T 细胞转移至 Rag1-/- 和 NRDKO 受体小鼠后，出现临床及大体病理学炎症表现11。（A）NRDKO 受体小鼠在细胞转移后 5 周平均体重下降 10%，而 Rag1-/- 受体小鼠在此时未表现出疾病的临床症状。每个数据点代表该组小鼠初始体重百分比的平均值 ± 标准误（SEM）。**，p &lt;0.005。（B）部分小鼠出现严重肠道炎症，表现为直肠脱垂。此图为 NRDKO 受体小鼠直肠脱垂的代表性图像。（C）大体观察显示，与未经 T 细胞过继转移的 Rag1-/- 和 NRDKO 小鼠相比，接受转移的 Rag1-/- 和 NRDKO 受体小鼠结肠均增厚且缩短。NRDKO 受体小鼠的结肠表现出严重炎症及结肠重量增加（数据未显示）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52533/52533fig2highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>
	<ol start="2">
		<li>通过将动物置于洁净容器中直至其排便，评估粪便质量：0 – 无粪便；1 – 软便；2 – 水样便和/或带血粪便。</li>
		<li>通过观察以下疾病体征评估动物整体健康状况：0 – 无弓背姿势、毛发竖立或皮肤病变；1 – 出现以下任一体征：弓背姿势、毛发竖立或皮肤病变。</li>
		<li>评估直肠脱垂情况：0 – 无；1 – 有（图 2B）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当动物体重减轻至初始体重的20%，或达到预定时间点（以先到者为准），采用 CO2 吸入法处死动物，随后进行颈椎脱臼确认死亡。临床疾病通常在再感染后第5周开始显现。</li>
	<li>按照先前描述的方法5,7评估疾病严重程度。
	<ol>
		<li>参照步骤 6.18 进行临床评分。</li>
		<li>测量结肠长度和重量（图 2C）。</li>
		<li>进行炎症的组织学分析5。</li>
		<li>检测肠道组织外植体培养物9、肠系膜淋巴结10 和/或血清11 中细胞因子的自发表达。
		<ol>
			<li>简言之，对于外植体培养9，处死动物后取出结肠，沿纵轴切开，并用 PBS 清洗。将结肠置于完全培养基中，在室温下以 250 rpm 的转速于摇床孵育 30 分钟。</li>
			<li>将组织剪成小块，于 37 °C 的完全培养基中孵育 24 小时。收集上清液，通过 ELISA 法测定每 100 mg 组织中细胞因子的含量。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>进行 T 细胞表型和/或功能的离体（ex vivo）分析10。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文介绍了一种通过将CD4+CD45RB+ T细胞过继转移至免疫缺陷小鼠来诱导小鼠结肠炎症的逐步实验方案。我们使用了C57BL/6品系供体的脾脏以及同源的Rag1-/-受体小鼠，尽管其他品系（例如，BALB/c、129S6/SvEv、非肥胖型糖尿病（NOD）小鼠）以及其他的免疫缺陷遗传模型（例如，SCID、Rag2-/-）也可应用4,14-16。已有充分证据表明，背景品系会影响小鼠实验性结肠炎的严重程度1。此外，即使在同一机构内的不同实验设施之间，小鼠群体中的肠道微生物群也存在显著差异6,17。尽管图2和图3未展示Rag1-/-小鼠在细胞转移后4周时结肠炎的发展情况，但根据我们及其他研究者的经验，Rag1-/-受体小鼠在接受CD4+CD45RB<s...

炎症性肠病（IBD），包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，是由宿主免疫反应、遗传易感性、环境因素以及肠道腔内容物之间尚未完全明确且复杂的相互作用所导致的1。近期的全基因组关联研究报道了免疫细胞调控基因与IBD易感性之间的关联2,3。这些研究中均涉及先天性和适应性免疫细胞的内在基因，表明这些细胞群体在IBD发病机制中具有核心作用。
目前已有超过50种人类炎症性肠病（IBD）的动物模型。尽管尚无一种模型能够完全模拟人类IBD的表型，但许多模型在研究人类疾病的不同方面（包括疾病起始与进展以及伤口愈合反应）具有重要价值。本文所述方法通过将同基因型脾脏CD4+CD45RBhigh T细胞过继转移至T细胞和B细胞缺陷型受体小鼠，从而诱导肠道炎症4。CD4+CD45RBhigh T细胞群体主要包含处于初始状态、易于活化的T细胞，这些细胞能够诱导慢性小肠和结肠炎症。该方法允许研究人员调控多个关键实验变量，包括先天性和适应性免疫细胞群体，以回答与疾病发病机制相关的生物学问题。此外，该方法可精确控制疾病起始时间，并具有明确的实验时间进程，从而便于对小鼠疾病进展过程中的临床特征进行动力学研究。该方法诱导的肠道炎症在多个方面与人类IBD相似，包括慢性的大肠和小肠透壁性炎症、由TNF和IL-12等细胞因子驱动的发病机制，以及恶病质等全身性症状5。因此，该模型是研究人类IBD发病机制的理想体系。
本文详细描述了通过将CD4+CD45RBhigh T细胞过继转移至Rag1-/-小鼠以诱导实验性结肠炎的方法。我们讨论了该技术的关键操作步骤、预期结果、优化策略以及常见问题的解决方案，并阐述了为研究目的成功建立这种小鼠肠道炎症模型所需的各项要素。

<table><tbody><tr><td>试剂/设备名称</td><td>公司</td><td>目录编号</td><td>备注/描述</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm 圆底管</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 锥形离心管</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>26 G x 3/8 针头</td><td>BD Biosciences</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形离心管</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;#956;m 细胞筛</td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>BD IMagnet</td><td>BD Biosciences</td><td>552311</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Thermo Scientific</td><td>35602</td><td></td></tr><tr><td>CD4-FITC IgG2b</td><td>eBioscience</td><td>11-0041</td><td></td></tr><tr><td>CD45RB-PE IgG2a</td><td>BD Pharminogen</td><td>553101</td><td></td></tr><tr><td>完全培养基</td><td></td><td></td><td>RPMI-1640，1% 青霉素-链霉素，10% 胎牛血清，0.0004% &amp;beta;-ME</td></tr><tr><td>FACS 管 + 筛网</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>玻璃显微镜载玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>12550A3</td><td></td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清</td><td>Gemini</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>标记缓冲液</td><td></td><td></td><td>1x PBS，0.5% BSA，2 mM EDTA</td></tr><tr><td>裂解缓冲液</td><td></td><td></td><td>0.08% NH4Cl，0.1% KHCO3，1 mM EDTA</td></tr><tr><td>MoFlo XDP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠 CD4 T 淋巴细胞富集试剂盒 - DM</td><td>BD Biosciences</td><td>558131</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IgG2a-PE</td><td>BD Pharminogen</td><td>553457</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IgG2b-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4732</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液，100X</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisherbrand</td><td>875713</td><td></td></tr><tr><td>纯乙醇，200 证明</td><td>Decon Labs</td><td>2705-HC</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11-875-093</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>洗涤培养基</td><td></td><td></td><td>RPMI-1640，1% 青霉素-链霉素，0.0004% &amp;beta;-ME</td></tr></tbody></table>

通过将效应性cd4+cd45rbhigh t细胞过继转移至免疫缺陷小鼠诱导小鼠肠道炎症

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

目前有多种不同的动物模型可用于研究人类炎症性肠病（IBD）的发病机制，每种模型均有其优缺点。本文描述了一种实验性结肠炎模型，该模型通过同基因型脾脏CD4+CD45RB高 将T细胞转入T细胞和B细胞缺陷型受体小鼠。CD4+CD45RB高 主要由初始效应T细胞组成的T细胞群体能够诱导慢性肠道炎症，该炎症在很大程度上类似于人类炎症性肠病（IBD）的关键特征。该方法可用于研究疾病发生与进展的各个方面，此外还可用于研究先天性免疫细胞、适应性免疫细胞及调节性免疫细胞群体的功能，以及环境暴露的作用。 即， 肠道菌群在肠道炎症中的作用。本文详细阐述了诱导结肠炎的实验方法，并提供分步操作流程。内容包括关键实验技术的视频演示，以帮助研究人员成功建立用于科研目的的小鼠实验性结肠炎模型。

从10只成年C57BL/6供体小鼠的脾脏中可稳定分离出约10 × 106个CD4+CD45RBhigh T细胞。该数量会因供体小鼠的年龄、品系以及研究人员的操作熟练程度而有所差异。当将4 × 105个C57BL/6来源的CD4+CD45RBhigh T细胞转移至C57BL/6 Rag1-/-受体小鼠后，受体小鼠通常在移植后第5周左右出现疾病临床症状，若小鼠在遗传上更易发展为严重疾病，则症状出现时间可能更早（图2、图3）11,12。在Rag1-/-受体小鼠的结肠中，最早可在移植后3周观察到CD3+ T细胞的聚集（图3A）12。
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本文介绍了一种通过将同基因型CD4+CD45RBhigh T细胞过继转移至T细胞和B细胞缺陷型受体小鼠体内，以诱导小鼠结肠炎症的实验方案。该模型的临床表现和组织病理学特征与人类炎症性肠病相似，可用于研究结肠炎症的起始及疾病进展过程。

通过将效应性CD4+CD45RBhigh T细胞过继转移至免疫缺陷小鼠诱导小鼠肠道炎症

有多种不同的动物模型可用于研究人类炎症性肠病（IBD）的发病机制，每种模型都有其各自的优势……

本实验的总体目标是通过将初始T细胞过继转移至免疫缺陷小鼠体内，诱导其发生肠道炎症。该过程首先从小鼠脾脏中分离细胞，裂解红细胞，然后富集CD4阳性T细胞群体；第二步是使用荧光标记的DI偶联抗CD4和抗CD45RB抗体对这些细胞进行标记。接下来，使用FACS将标记的细胞分选为CD45、RB低表达和CD45 RB高表达的细胞群。最后一步是通过腹腔注射将CD45 RB高表达细胞转移至免疫缺陷小鼠体内。最终，这些转移的细胞被激活，并在缺乏调节性T细胞的情况下引起局部组织损伤，从而导致实验性结肠炎。该方法有助于解答炎症性肠病研究中的关键问题，例如特定细胞群体和胃肠道微生物群在疾病发病机制中的作用。处死供体小鼠后，用70%乙醇喷洒腹部以消毒该区域。然后在腹部做一横向切口，并用镊子向后剥离皮肤以暴露腹膜。将腹膜与内脏分离，并在左侧腹部腹膜上做切口。随后，将脾脏从小鼠体内切除，并置于含有10毫升冰上预冷的完全培养基的培养皿中。用两片无菌玻璃片研磨脾脏，以制备单细胞悬液。将细胞通过70微米细胞筛过滤至50毫升锥形管中，然后用5毫升完全培养基冲洗细胞筛，每个锥形管最多可处理五只脾脏。接下来，在4摄氏度下以450 × g离心7分钟。将上清液吸除至废液容器中，然后在10毫升冰浴标记缓冲液中轻柔重悬细胞。将20 µL细胞悬液与180 µL 0.4%台盼蓝溶液混合，于室温孵育5分钟。随后取10 µL细胞悬液加入血细胞计数板，在显微镜下计数非蓝色细胞，以开始富集沉淀。将细胞轻轻重悬于冰上预冷的标记缓冲液中，浓度为20 × 10⁶ 个细胞/mL。每1 × 10⁶ 个细胞加入5 µL生物素标记的CD4 T细胞富集抗体，然后将细胞与抗体在冰上孵育15分钟。向细胞悬液中加入10倍体积的标记缓冲液，然后以450 × g离心7分钟。小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。接下来，通过涡旋重悬链霉亲和素偶联的磁性颗粒，并按每1×10⁶个细胞加入5 µL颗粒的比例将颗粒加入细胞中。轻轻弹动试管使颗粒与细胞混匀，然后在 6 至 12 摄氏度下孵育混合物 30 分钟。用标记缓冲液将细胞重悬至浓度为 20 至 80 × 10⁶ 个细胞/毫升。然后将 1 毫升标记后的细胞转移至 12 毫米 × 75 毫米的圆底试管中，并将此阳性组分试管置于磁铁上 6 至 8 分钟。将试管置于磁铁上，用玻璃巴斯德吸管小心吸去上清液，注意不要扰动标记的细胞，并将其转移至新的无菌50毫升锥形管中。此组分含有CD4阳性T细胞。将阳性组分试管从磁铁上取下，通过用力吹打，用标记缓冲液重悬细胞。将离心管放回磁架上，再静置六到八分钟。再次小心地将上清液转移至富集组分管中。根据需要重复富集步骤，以提高CD4阳性T细胞的得率，为细胞标记做好准备。首先将富集后的组分在450 × g离心7分钟，弃去上清液。然后将细胞重悬于标记缓冲液中，调整浓度至每毫升含10的6次方个细胞。取5个微量离心管，每管加入5×10⁵个细胞，分别用于未染色、同位素染色及单染对照细胞。随后，向含有原始细胞悬液的管中加入终浓度为5 µg/mL的CD4-FITC抗体和1 µg/mL的CD45RB-PE抗体。将同位素对照染料和单染染料以相同浓度加入相应的细胞分样中。轻轻混匀细胞与抗体，然后将试管置于冰上孵育30分钟。用盖子遮盖试管，避免光照。接下来，按照文本方案中的说明，用标记缓冲液将细胞洗涤两次，并将细胞重悬于标记缓冲液中，浓度为每毫升含10 × 10⁶个细胞。然后将细胞悬液通过70微米细胞筛滤入流式管中。将试管置于冰上，并遮盖避光，以防止染料发生光漂白。使用未染色的单阶段对照细胞校准细胞分选仪的补偿。利用前向散射光和侧向散射光设门排除非活细胞。然后，利用同位素染色对照设置CD4阳性及CD4 RB阳性细胞的设门。接下来，对 CD4 阳性细胞群体进行分选，将细胞进一步分为 CD45 RB 高表达和 CD45 RB 低表达两个群体。将细胞收集至含有 2 毫升完全培养基的离心管中，然后从每一分选组分中取约 10 × 10³ 个细胞，上样至流式细胞分选仪，检测样品纯度。为后续注射做准备，用 PBS 洗涤并重悬 CD45 RB 高表达和 CD45 RB 低表达细胞，调整至文本方案中指定的适当细胞密度。接下来，牢固固定受体小鼠，将 100 µL 细胞悬液分别注射至小鼠腹部左右两侧的腹腔内。每周按照文本方案中所述监测受体小鼠的临床参数。注射后疾病进展通常在第五周变得明显。在预定时间点或小鼠体重减轻达到初始体重的20%时，处死小鼠并取出结肠。然后测量并记录结肠的长度和重量。将 CD4 阳性、CD45 RB 高表达的 T 细胞转移至 Rag1 敲除和 NFIL3 RAG1 双重敲除的受体小鼠，注射后五周进行观察。双重敲除小鼠体重较初始体重减轻了 10%，Rag1 敲除小鼠和双重敲除小鼠的结肠均出现相应变化。与对照组小鼠相比，受体小鼠的结肠出现增厚和缩短。将 CD4 阳性、CD45RB 高表达的 T 细胞转移至 rag1 基因敲除小鼠和 rag1 基因敲除 P110δ 突变受体小鼠。转移后三周的组织学分析显示，在 rag1 基因敲除 P110δ 突变受体小鼠中出现上皮细胞增生、炎性细胞浸润和隐窝脓肿，而在 rag1 基因敲除小鼠中则未观察到上述现象。一旦掌握该技术，若操作得当，可在四到六小时内完成。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

诱导小鼠肠道炎症由效应CD4的过继转移<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt;高</sup&gt; T细胞免疫缺陷小鼠

本文详细介绍了一种快速分离小鼠肠道树突状细胞（DCs）和巨噬细胞的方法。通过多色流式细胞术对肠道树突状细胞和巨噬细胞进行表型鉴定，同时采用磁珠富集联合细胞分选技术，获得高纯度的细胞群体用于功能研究。...

从小鼠肠道中分离与鉴定树突状细胞和巨噬细胞

本视频展示了如何利用同种异体造血干细胞和可诱导移植物抗宿主病（GvHD）的脾源性异反应性T淋巴细胞，在经致死剂量照射的受体小鼠中诱导肠道移植物抗宿主病。该实验方案有助于建立严重的急性肠道GvHD模型，以深入理解该疾病的发病机制，并开发创新的治疗策略。...

通过同种异体骨髓与脾细胞移植在小鼠模型中诱导移植物抗宿主病

我们提供了一种可重复的方法，通过过继转移针对胰岛抗原的特异性初级 CD4+ T 细胞，在两周内诱导小鼠产生 1...

通过过继性转移致糖尿病性CD4+ T细胞在小鼠中加速诱导1型糖尿病

在此抗原驱动的结肠炎模型中，表达红色荧光蛋白的OT-II CD4+ T细胞被过继转移至单核吞噬细胞（MPs）表达绿色荧光蛋白的RAG-/-小鼠体内。随后，用表达卵清蛋白（OVA）与青色荧光蛋白（CFP）融合蛋白的大肠杆菌（Escherichia...

开发一种抗原驱动的结肠炎模型以研究抗原呈递细胞向T细胞呈递抗原的过程

本文介绍了一种转基因报告小鼠模型，用于可视化小鼠不同组织中产生IL-22的细胞。该方法可用于追踪小鼠体内其他细胞因子或分泌蛋白的定位。...

利用报告基因小鼠可视化表达 IL-22 的淋巴细胞

本文详细描述了一种从小肠免疫系统的诱导部位（包括肠道相关淋巴组织派伊尔集合淋巴结和引流肠系膜淋巴结）以及效应部位（包括小肠固有层和肠上皮）分离淋巴细胞的实验方案。...

从小鼠小肠免疫系统中分离淋巴细胞

本文介绍了一种异基因造血干细胞移植方案，并可在原位对患有肠道移植物抗宿主病的活体小鼠远端结肠进行重复的微型内窥镜评估，以检测结肠炎症的存在、特征及其严重程度。...

活体小鼠肠道移植物抗宿主病的诱导及其微型内镜评估

本方案描述了一种针对肠道微生物群抗原特异性T细胞的过继转移结肠炎模型。从CBir1 TCR转基因小鼠中分离CD4+...

通过将CBir1 TCR转基因CD4+ T细胞过继转移至免疫缺陷小鼠诱导肠道炎症

炎症性肠病（IBD）的发病机制涉及遗传易感性、黏膜免疫和肠道微生态环境之间的相互作用。在本研究中，我们将粪菌移植应用于IL-10缺陷小鼠，并探讨其对结肠炎症和心脏功能的影响。...

白细胞介素10缺陷小鼠模型中粪菌移植的治疗效果评估

该研究揭示了皮肤在通过表皮（EC）免疫调节小鼠免疫反应中的作用。使用蛋白质抗原进行表皮免疫可抑制接触性超敏反应中的免疫应答，或在与病原体相关分子模式联合使用时逆转皮肤诱导的免疫抑制。表皮免疫作为一种有效的无针免疫治疗策略，展现出良好的应用前景。...

经皮诱导免疫调节的小鼠模型

本文报道了一种通过过继转移SKG小鼠的CD4+...

小鼠类风湿性关节炎的过继转移模型

了解通过过继转移CD4+CD45RB高T细胞诱导小鼠肠道炎症的实验方法。该技术利用免疫缺陷小鼠建立结肠炎模型，模拟人类炎症性肠病的临床与病理特征，为研究疾病机制及开发新疗法提供可靠平台。

通过将效应性CD4⁺CD45RB^high T细胞过继转移至免疫缺陷小鼠诱导小鼠肠道炎症

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