诱导小鼠肠道炎症由效应CD4的过继转移 ⁺ CD45RB^高 T细胞免疫缺陷小鼠

在这里，我们提出了一种通过将同基因 CD4⁺CD45RB^高 T 细胞过继转移到 T 细胞和 B 细胞缺陷受体中来诱导小鼠结肠炎症的方案。临床和组织病理学特征与人类炎症性肠病相似。这种方法允许研究结肠炎症的开始和疾病的进展。

该程序的总体目标是通过将幼稚 T 细胞过继转移到免疫缺陷小鼠中来诱导肠道炎症。这是通过首先从小鼠脾脏中分离细胞，裂解血细胞，然后富集 CD 四个阳性 T 细胞群来实现的。第二步是用荧光 DI 偶联的 CD 4 和 CD 45 RB 抗体标记这些细胞。

接下来，使用事实将标记的细胞分为 CD 45、RB 低和 CD 45 RB 高群体。最后一步是通过腹膜内注射将 CD 45 RB 高细胞转移到免疫缺陷小鼠体内。最终，转移的细胞被激活，并在没有 T 调节细胞的情况下引起局部组织损伤，从而导致实验性结肠炎。

该方法可以帮助回答炎症性肠病研究中的关键问题，例如特定细胞群和胃肠道微生物群在疾病发病机制中的作用。对供体小鼠实施安乐死后，用 70% 乙醇喷洒腹部以对该区域进行消毒。然后在腹部做一个水平切口，用镊子剥开皮肤以露出腹膜。

将腹膜远离内脏器官，并在左腹腹膜上切开。接下来，切除小鼠的脾脏，并将其放入含有 10 毫升冰冷完全培养基的培养皿中。用两张无菌载玻片压碎脾脏，制成单细胞悬液。

通过 70 微米过滤器将细胞过滤到 50 毫升锥形管中，然后用 5 毫升完全培养基菌株冲洗过滤器，在一个锥形管中最多冲洗 5 个脾脏。接下来，将细胞在 4 摄氏度下以 450 倍 G 离心 7 分钟。将上清液吸入废液容器中，然后将细胞轻轻重悬于 10 mL冰冷的标记缓冲液中。

将 20 μL 细胞悬液与 180 μL 0.4% trian blue 溶液混合，在室温下孵育细胞 5 分钟。然后将 10 微升细胞悬液加入血液细胞仪中，在显微镜下计数非蓝色细胞的数量以开始富集沉淀，并轻轻复苏，将细胞悬浮在冰冷的标记缓冲液中，浓度为 20 倍 10 至每毫升 6 个细胞。向 6 个细胞中每 10 倍添加 5 微升生物素化 CD 4 T 细胞富集抗体，然后将细胞与抗体在冰上孵育 15 分钟。

向细胞悬液中加入 10 倍体积的标记缓冲液，然后以 450 倍 G 离心细胞 7 分钟。小心吸出上清液，不要干扰细胞沉淀。接下来，通过涡旋重新悬浮链霉亲和素共轭磁性颗粒，并将每 1 乘 10 的 5 微升颗粒添加到六个细胞中。

轻轻弹动试管，将颗粒与细胞混合，然后在 6 至 12 摄氏度下孵育混合物 30 分钟。用标记缓冲液将细胞重悬至浓度为 20 至 80 倍 10 倍/毫升 6 个细胞。然后将 1 毫升标记的细胞转移到 12 毫米 x 75 毫米的圆底试管中，并将该阳性组分管放在磁铁上 6 到 8 分钟。

将试管放在磁铁上，用玻璃粘贴移液管小心地去除上清液，不要打扰标记的细胞，然后将其转移到新的无菌 50 ml 锥形管中。该组分包含 CD 4 个阳性 T 细胞。从磁铁中取出阳性组分管，并通过剧烈移液将细胞重悬于标记缓冲液中。

将试管放回磁力架上再放置 6 到 8 分钟。再次，小心地将 SUP nain 转移到富集的馏分管中。根据需要重复富集以提高 CD 四个阳性 T 细胞的产量，以制备用于标记的细胞：首先，以 450 倍 G 离心富集的组分 7 分钟，然后弃去上清液。

然后将细胞重悬于标记缓冲液中，浓度为 10 倍 10 至第 6 个细胞/毫升。将第五细胞的 5 倍乘以 10 分装在单个微量离心管中，用于未染色同位素染色和单染色对照细胞。然后向含有原始细胞悬液的试管中加入每毫升 5 μg 的 CD four、FE 和每毫升 1 μg 的 CD 45 RB PE 抗体。

将相同浓度的同位素对照染色剂和单个染色剂添加到适当的细胞等分试样中。将细胞与抗体轻轻混合，然后将试管在冰上孵育 30 分钟。盖上管子以保护它们避光。

接下来，按照文本方案中的指示在标记缓冲液中洗涤细胞两次，并在标记缓冲液中以每毫升 6 个细胞的 10 倍 10 倍重悬细胞。然后将细胞悬液通过 70 微米过滤器进入传真管。将管子放在冰上并盖上 以防止污渍光漂白。

使用未染色的单阶段对照细胞校准细胞分选仪上的补偿。使用前向和侧向分散门控排除无活力细胞。然后用同位素染色对照设置 CD 4 阳性和 CD 4 RB 阳性细胞的门控。

接下来，将 CD 四个阳性群体分选为 CD 45、RB 高和 CD 45 RB 低群体。将细胞收集在含有 2 毫升完全培养基的试管中，然后在细胞分选仪上将每个级分的大约 10 乘以 10 的等分试样运行到第三个细胞中，以评估样品纯度，以制备用于注射清洗的 CD 45 RB 高和 CD 45 RB 低细胞，并将它们重悬于 PBS 中至适当的细胞密度，如文本方案所示。接下来，牢牢抑制受体小鼠，将 100 微升细胞悬液腹膜内注射到腹部左右两侧。

每周监测受体小鼠的临床参数，如文本方案所示。注射后疾病进展通常在第 5 周明显。在预定的时间点或当小鼠失去其起始体重的 20% 时处死小鼠并提取结肠。

然后测量并记录结肠的长度和重量。注射后 5 周，将 CD、4 个阳性 CD 45 RB 高 T 细胞转移到 rag 1 敲除小鼠和 NFIL 3 个 RAG 1 双敲除受体小鼠。双重敲除小鼠减轻了初始体重的 10%，结肠分为 rag one knockout 和 double knockout。

来自对照小鼠 CD 的结肠相比，受体小鼠增厚和缩短 CD 四个阳性 CD 45 RB 高 T 细胞，以转移到 rag one 敲除和 rag one 敲除 P one 10 delta 突变受体小鼠转移后 3 周的组织学分析表明，rag one 敲除 delta 突变受体中出现上皮增生、炎性细胞浸润和隐窝脓肿，但不是 rag one 敲除小鼠一旦掌握。如果执行得当，这种技术可以在 4 到 6 小时内完成。