通过将效应性CD4⁺CD45RB^high T细胞过继转移至免疫缺陷小鼠诱导小鼠肠道炎症

本实验的总体目标是通过将初始T细胞过继转移至免疫缺陷小鼠体内，诱导肠道炎症。该过程首先从小鼠脾脏中分离细胞，裂解红细胞，然后富集CD4阳性T细胞群体。第二步是使用荧光标记的DI偶联CD4和CD45RB抗体对这些细胞进行标记。

接下来，利用流式细胞术将标记的细胞分选为 CD45、RB 低表达和 CD45 RB 高表达的细胞群。最后一步是通过腹腔注射将 CD45 RB 高表达的细胞转移至免疫缺陷小鼠体内。最终，这些转移的细胞被激活，并在缺乏调节性 T 细胞的情况下引起局部组织损伤，从而导致实验性结肠炎。

该方法有助于解答炎症性肠病研究中的关键问题，例如特定细胞群体和胃肠道微生物群在疾病发病机制中的作用。处死供体小鼠后，用70%乙醇喷洒腹部以消毒该区域。然后在腹部做一横向切口，并用镊子将皮肤掀开，暴露腹膜。

将腹膜与内脏分离，切开左侧腹部腹膜。随后，从小鼠体内切除脾脏，并置于含有10毫升冰上预冷的完全培养基的培养皿中。用两片无菌玻璃片研磨脾脏，制备单细胞悬液。

将细胞通过70微米细胞筛过滤至50毫升锥形管中，然后用5毫升完全培养基冲洗细胞筛，每根锥形管最多可处理五只脾脏。接下来，在4摄氏度条件下以450 × g离心7分钟。将上清液吸出至废液容器中，然后在10毫升冰上预冷的标记缓冲液中轻柔重悬细胞。

取20微升细胞悬液与180微升0.4%台盼蓝溶液混合，在室温下孵育5分钟。然后取10微升细胞悬液加入血细胞计数板，在显微镜下计数未染成蓝色的细胞，以开始富集沉淀，并将细胞轻轻重悬于冰上预冷的标记缓冲液中，浓度为每毫升20×10⁶个细胞。每1×10⁶个细胞加入5微升生物素标记的CD4 T细胞富集抗体，然后将细胞与抗体在冰上孵育15分钟。

向细胞悬液中加入10倍体积的标记缓冲液，然后在450 × g下离心7分钟。小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。接下来，通过涡旋重悬链霉亲和素偶联的磁性颗粒，并按照每1 × 10⁶个细胞加入5 µL颗粒的比例将颗粒加入细胞中。

轻轻弹动试管，将颗粒与细胞混匀，然后在6至12摄氏度下孵育30分钟。用标记缓冲液将细胞重悬至浓度为20至80乘以10的6次方个细胞每毫升。随后，将1毫升标记后的细胞转移至12毫米×75毫米的圆底试管中，并将此阳性组分试管置于磁铁上6至8分钟。

将试管置于磁铁上，用玻璃巴斯德吸管小心吸去上清液，注意不要扰动标记的细胞，并将上清液转移至新的无菌50毫升锥形管中。此组分含有CD4阳性T细胞。将阳性组分试管从磁铁上取下，通过剧烈吹打，用标记缓冲液重悬细胞。

将离心管放回磁架上，再静置六到八分钟。再次小心地将上清液转移至富集组分管中。根据需要重复富集步骤，以提高CD4阳性T细胞的得率，为细胞标记做好准备。首先将富集后的组分在450 × g离心7分钟，弃去上清液。

然后将细胞重悬于标记缓冲液中，调整浓度至每毫升含10的6次方个细胞。取细胞悬液，分别在多个微量离心管中分装，每管含10的5次方个细胞，用于未染色、同位素染色及单染对照细胞。随后，向含有原始细胞悬液的管中加入终浓度为5 µg/mL的CD4-FITC抗体和1 µg/mL的CD45RB-PE抗体。

将同位素对照染料和单染染料以相同浓度加入相应的细胞分样中。轻轻混匀细胞与抗体，然后将试管置于冰上孵育30分钟。用盖子遮盖试管，避免光照。

接着，按照文本方案中的说明，用标记缓冲液将细胞洗涤两次，并将细胞重悬于标记缓冲液中，浓度为每毫升含 10 × 10⁶ 个细胞。然后将细胞悬液通过 70 µm 细胞筛滤入流式管中。将试管置于冰上，并遮盖避光，以防止染料发生光漂白。

使用未染色的单阶段对照细胞校准细胞分选仪的补偿。通过前向散射和侧向散射门控排除非活细胞。然后利用同位素染色对照设置 CD4 阳性和 CD4 RB 阳性细胞的门控。

接下来，对CD4阳性细胞群进行分选，将细胞分为CD45RB高表达和CD45RB低表达两个群体。将细胞收集到含有2毫升完全培养基的离心管中，然后从每一分选组分中取约10×10³个细胞上样至流式分选仪，以评估样品纯度。随后，按照文本方案中所述的适当细胞密度，用PBS洗涤并重悬CD45RB高表达和CD45RB低表达细胞，以备注射。接下来，牢固固定受体小鼠，将100 µL细胞悬液分别注射至小鼠腹部右侧和左侧的腹腔内。

按照文本方案中所述，每周监测受体小鼠的临床指标。注射后疾病进展通常在第五周变得明显。在预定时间点处死小鼠，或在其体重减轻达到初始体重的20%时处死，并取出结肠。

然后测量并记录结肠的长度和重量。将CD4阳性CD45RB高表达的T细胞转移至Rag1敲除和NFIL3-RAG1双敲除的受体小鼠中，注射后五周。双敲除小鼠体重较初始下降了10%，Rag1敲除小鼠和双敲除小鼠的结肠均出现变化。

与对照小鼠相比，受体小鼠的结肠出现增厚和缩短。将CD4阳性CD45RB高表达的T细胞转移至rag1基因敲除小鼠以及rag1基因敲除P110δ突变体受体小鼠后，转移后三周的组织学分析显示，rag1基因敲除δ突变体受体小鼠出现上皮细胞增生、炎性细胞浸润及隐窝脓肿，而rag1基因敲除小鼠则未出现上述病理变化。一旦掌握该技术，若操作得当，可在四到六小时内完成。