表达，洗涤剂溶解，和一个膜转运，MexB多药耐药蛋白的纯化
2010年12月3日
在这个协议中，我们展示的表达，增溶，并纯化了重组表达的膜蛋白，MexB，作为一种可溶性蛋白的洗涤剂复杂。 MexB是机会主义的细菌病原体绿脓杆菌多药耐药膜转运。
为了纯化 Mex B 膜蛋白，首先使用重组 DNA 方法在大肠杆菌中表达 Mex B。然后分离膜，用温和的去污剂溶解膜蛋白。溶解的膜蛋白通过 iMac 纯化，蛋白质通过凝胶过滤色谱进一步纯化。
使用 SDS 聚 ACRYLAMIDE 凝胶电泳确定蛋白质的纯化水平。虽然该程序可以提供对多药耐药性跨膜转运蛋白的见解，但它也可以应用于其他膜蛋白，证明今天的程序将由我实验室的一名研究生形成。对于此程序，来自假单胞菌 Aosa 的 Mex B 将亚克隆到 PET 30 B plus 表达载体中，以便 Mex B 用 C 末端 HEXA 组胺标签表达。从晚上开始，用新鲜转化体接种四个 3 毫升磅的罐头霉素培养物或使用冷冻原液，早上在 37 摄氏度的滚筒上培养培养物过夜。
使用过夜培养物接种 150 毫升 LB，每毫升含 30 微克。Mycin 可以在下午在 37 摄氏度的摇床上培养培养物吗？使用小培养物接种 6 次 1 升，2 次 XYT 培养基，每毫升含 30 微克。
蕨类植物中的霉素可以背瓶吗？每次培养物使用 25 mL，稀释 1 至 40 mL。在 37 摄氏度下培养培养物，直到它们达到光密度。
600 的 0.4 到 0.6，大约 1.5 小时。当培养物达到适当的密度时，通过添加 0.5 毫升的 1 磨牙来诱导蛋白质表达。IPTG 的。将所有培养瓶放回摇床中，继续在 30 摄氏度下生长过夜，直到第二天早上收获细菌。
从摇床中取出培养物并冷却。然后，为了收获细胞，将培养物转移到离心管中，并在 4 摄氏度下以每分钟 5， 000 转的速度在大型离心机中离心 30 分钟，同时离心细胞。用 DNA、蛋白酶抑制剂和溶菌酶补充 100 mL Cell re 悬浮缓冲液。
此外，用蛋白酶抑制剂补充两等分试样的膜 Resus 悬浮缓冲液，如此表所示。离心完成后，将所有三种溶液放在冰上。Resus 将细胞沉淀消耗在 100 毫升 cell resus 悬浮缓冲液中。
接下来，提取细胞。将细胞悬浮液加载到法式压力池中，然后将细胞置于法式压力机上。施加压力直到达到每平方英寸 12， 000 磅。
阀门打开非常少量，以便破裂的细胞流出。重要的是不要过度打开阀门并让细胞喷出，因为它们会在压力太小的情况下释放并且无法有效破裂。将细胞裂解物收集在瓶子中，在冰上冷藏。
以每平方英寸 12， 000 磅的速度再次将单元溶液通过法式压力单元。将细胞裂解物转移到 SS 34 离心管中，并在 SS 34 转头中以每分钟 10， 000 转的速度离心以去除细胞碎片，持续 30 分钟。接下来是澄清的裂解物。
用于制备膜组分。小心地将旋后神经转移到 ti 中。6 4、7 0.5 超速离心管，在 TI 6、4、7、0.5 转子中以每分钟 40， 000 转的速度离心，在 4 摄氏度下离心 50 分钟。
丢弃旋后物。使用移液管轻轻重悬沉淀，其中含有约 25 毫升膜 Resus 悬浮缓冲液中的细胞膜，将膜悬浮液转移到干净的离心管中，并在 TI I 6 4 7 0.5 转子中以每分钟 40， 000 转的速度离心，持续 50 分钟，4 摄氏度，然后将洗涤过的膜调色板重悬于 25 毫升膜 Resus 悬浮缓冲液中。接下来，将膜蛋白溶解到重悬的膜上，浓度约为 25 mL。
加入 6 毫升 10% DDM，使最终洗涤剂浓度为 2%DDM，在 DDM 离心机存在下孵育 2 小时后，在 DDM 离心机存在下孵育 2 小时，混合物以每分钟 40， 000 转的速度在 TI I 6 4 7 0.5 转子中在 4 摄氏度下旋转 40 分钟。为了将可溶性蛋白质去污剂复合物与不溶性蛋白质分离。保存含有 Mex B 蛋白去污剂复合物的仰卧纳脱剂以用于纯化，将含有 Mex B 蛋白去污剂复合物的仰卧纳脱剂与两毫升在 Resus 悬浮缓冲液中平衡的 lon 金属亲和珠混合，在蛋白质与树脂结合后，在 4 摄氏度的滚筒上孵育一小时。
将浆料倒入重力流塔体中，丢弃流过的液体。柱洗涤完成后，用 20 mL 或 10 倍柱体积的 iMac 结合和洗涤缓冲液洗涤柱。用 10 mL iMac 洗脱缓冲液洗脱结合的蛋白质。
取每个洗脱馏分 10 μL 样品。与 10 微升 2 倍 SDS 样品混合，缓冲，并在 10% 聚丙烯酰胺上进行分析。SDS 凝胶。
估计每个馏分中 mex B 的含量和纯度。拉出含有 Mex B 蛋白去污剂复合物的级分，并在 4 摄氏度的离心浓缩器中浓缩。注意不要在此步骤中使蛋白质沉淀出来。
使用几次短时间旋转并观察降水。每次离心后，然后继续使用凝胶过滤柱纯化合并的级分。用 24 mL 电泳缓冲液预平衡 10 根柱上的 Super Rose 12 HL 30，并等待基线平坦。
接下来，使用 Running Buffer 冲洗 actor 系统加载循环。在将蛋白质上样到色谱柱上之前，使用注射器过滤器过滤蛋白质溶液。然后将多达 240 μL 的蛋白质溶液以高达 5 mg/mL 的蛋白质加载到色谱柱上。
运行 1.5 倍柱体积的缓冲液并收集 0.25 mL 馏分。XB 蛋白去污剂复合物在大约 10 至 15 mL 的洗脱体积处洗脱为峰。取 5 微升峰馏分样品。
将每个样品与两倍 SDS 样品缓冲液一一混合。在 10% 聚丙烯酰胺凝胶上分析样品，以估计每个级分中 me Mex B 的量和纯度，拉出含有纯 ME B 的级分。在凝胶过滤柱之后，蛋白质在 kumasi 染色的聚丙烯酰胺凝胶上呈纯净状态。
凝胶过滤柱的迹线显示从色谱柱洗脱的蛋白质去污剂复合物的主峰。MXB 蛋白的平均产量约为每 6 升两种 XYT 培养物 2 毫克一旦掌握，如果作得当，该程序可以在 8 小时内完成。看完这个视频后，您应该对如何表达、溶解和纯化膜蛋白有了很好的了解。
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概述
本协议概述了MexB膜蛋白的表达、溶解和纯化过程，该蛋白是假单胞菌的多药耐药转运蛋白。该过程涉及重组DNA方法和各种纯化技术，以获得可溶性蛋白表面活性剂复合物。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 微生物学
- 蛋白质纯化
背景
- MexB是一种参与多药耐药的膜蛋白。
- 它在大肠杆菌中使用重组DNA技术表达。
- 纯化过程可以提供关于跨膜运输机制的洞见。
- 该方法可以适用于其他膜蛋白。
研究目的
- 纯化MexB膜蛋白以进行进一步研究。
- 展示重组DNA方法在蛋白表达中的应用。
- 探索多药耐药转运蛋白的特性。
所用方法
- 使用PET 30 B plus表达载体在大肠杆菌中表达MexB。
- 分离膜并用温和的表面活性剂溶解。
- 通过固定金属亲和层析（iMac）进行纯化。
- 使用凝胶过滤层析进一步纯化。
主要结果
- 成功表达和纯化MexB作为可溶性蛋白复合物。
- 使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳评估蛋白纯度。
- 获得多药耐药转运蛋白功能的洞见。
- 展示该协议对其他膜蛋白的适用性。
结论
- 该协议有效纯化MexB，为研究膜蛋白提供了模型。
- 重组DNA方法对于研究中的蛋白表达非常有价值。
- 了解MexB可以为抗生素耐药机制的知识做出贡献。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables the production of purified membrane protein complexes essential for mechanistic studies of multidrug resistance transporters. By providing a scalable method to solubilize and purify transmembrane proteins like MexB, it supports target validation and assay development in antimicrobial discovery. The approach reduces biological risk in early-stage programs by enabling structural and functional characterization of clinically relevant efflux pumps.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of MexB function in multidrug resistance pathways.
- Operational Value: Provides purified protein detergent complexes for binding and inhibition assays.
- Strategic Value: Supports target de-risking by confirming druggability of RND transporters.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Yields soluble MexB suitable for high-throughput screening of efflux pump inhibitors.
- Operational Value: Standardized purification ensures batch-to-batch consistency for assay reproducibility.
- Strategic Value: Enables structure-guided inhibitor design through downstream biophysical characterization.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking MexB activity to antibiotic resistance phenotypes.
- Operational Value: Purified complexes allow evaluation of compound effects on transporter function in vitro.
- Strategic Value: Supports preclinical model validation using defined molecular targets.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, enabling progression from target engagement to lead optimization for antimicrobial programs targeting efflux-mediated resistance.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on MexB substrate specificity and inhibition mechanisms.
- Screening: Delivers purified target for assay development and compound profiling.
- Analytics: Enables quantitative assessment of protein purity and yield via SDS-PAGE and gel filtration.
- Translational Research: Connects molecular target validation to phenotypic resistance outcomes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for solubilizing and purifying other multidrug resistance transporters.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into transmembrane transport and inhibition.
- Operational Value: Delivers reproducible, scalable purification of membrane proteins.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing uncertainty in target validation.
- Portfolio Impact: Enables prioritization of efflux pump inhibitors based on validated target engagement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in recombinant protein expression and membrane biochemistry.
- Depends on access to ultracentrifugation, affinity chromatography, and gel filtration systems.
- Necessitates optimization of detergent type and concentration for solubility and stability.
- Involves careful handling to prevent protein precipitation during concentration steps.
- Limited by the need for specialized equipment and time-intensive purification workflows.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:51
Introduction
1:08
Protein Overexpression
2:48
Harvesting and Extracting the Cells
4:58
Preparing the Membrane Fraction and Solubilizing Transmembrane Proteins
6:46
Hexahistidine Tag Affinity Purification by IMAC
8:23
Gel Filtration
9:44
Representative Results from MexB Purification
10:23
Conclusion
