Name: 表达，洗涤剂溶解，和一个膜转运，MexB多药耐药蛋白的纯化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 了解MexB膜蛋白的表达、洗涤剂溶解和纯化方法，使用大肠杆菌重组DNA技术和IMAC层析。该方案为研究多药耐药转运蛋白机制提供了可靠的实验模型。

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本项目得到了美国国家科学基金会和生物分子科学学会向CJJ提供的资助。

1. 第1天：
MexB 来自 铜绿假单胞菌 由 pFB101 编码。MexB 基因从 P. aeruginosa 基因组DNA并插入pET30b+载体的NdeI和XhoI限制性酶切位点中。该构建体包含一个C末端六组氨酸标签。
<ol>
<li>质粒用于转化 E. coli 菌株 C43(DE3) 12，将转化子接种于含 30 ug/mL 卡那霉素的 LB 琼脂平板上。</li>
</ol>
2. 第2天：过夜培养
<ol start="2">
<li>傍晚时，从新鲜的转化子菌落接种4份各3 mL、含30 μg/mL卡那霉素的LB培养物。或者，也可从冻存的甘油菌中接种培养物。 
这些小型培养物在滚瓶机上培养 37°C 过夜。</li>
</ol>
3. 第3天：培养6升培养物：
<ol start="3">
<li>次日早晨，用过夜培养物接种含有 30 µg/mL 卡那霉素的 150 mL LB 培养基。在 37°C 摇床中培养菌液。</li>
<li>下午，用小量培养物接种 6 个含有 30 µg/mL 卡那霉素的 1 L 2XYT 培养基，置于三角烧瓶（Fernbach flask）中（每瓶接种 25 mL，稀释倍数为 1:40）。在 37°C 培养至菌液 OD600 达到 0.4–0.6，约需 1.5 小时。</li>
<li>当菌液达到适当密度时，加入 0.5 mL 1 M IPTG 以诱导蛋白表达。将所有烧瓶重新放入摇床，在 30°C 继续培养过夜。</li>
</ol>
4. 第4天：收集细胞并纯化蛋白：
<ol start="6">
<li>按如下方法向缓冲液中添加蛋白酶抑制剂、DNA酶和溶菌酶：向50 mL细胞重悬缓冲液中加入10 mg DNase I（终浓度0.1 mg/mL）、1片Complete无EDTA蛋白酶抑制剂片剂以及少量溶菌酶；向60 mL膜重悬缓冲液中加入1片蛋白酶抑制剂片剂；向另外50 mL膜重悬缓冲液中加入1片蛋白酶抑制剂片剂。将上述三种溶液均置于冰上保存。</li>
<li>将培养物在大容量离心机中以5,000 rpm离心30分钟，以收集细胞。</li>
<li>用100 mL细胞重悬缓冲液（50 mM NaP，pH 7.0，300 mM NaCl，2 mM MgCl2，1片Complete无EDTA蛋白酶抑制剂片剂，0.1 mg/mL DNAse I，少量溶菌酶）重悬细胞。</li>
<li>将细胞悬液在12,000 psi（762 gauge pressure）压力下通过French高压破碎仪两次。将细胞裂解物收集于预先冰浴冷却的瓶子中。</li>
<li>将细胞裂解物转移至SS34离心管中，在SS-34转子中以10,000 rpm、4°C离心30分钟，以去除细胞碎片。</li>
<li>小心将上清液转移至Ti647.5超速离心管中，在4°C下以40,000 rpm离心50分钟。弃去上清液。</li>
<li>用约25 mL膜重悬缓冲液（50 mM NaP，pH 7.0，300 mM NaCl，5%甘油，1片Complete无EDTA蛋白酶抑制剂片剂）重悬含有细胞膜的沉淀。</li>
<li>将膜悬液转移至洁净的离心管中，在Ti647.5转子中以40,000 rpm、4°C离心50分钟。</li>
<li>弃去上清液，并将洗涤后的膜沉淀用25 mL膜重悬缓冲液（50 mM NaP，pH 7.0，300 mM NaCl，5%甘油，1片Complete无EDTA蛋白酶抑制剂片剂）重悬。</li>
</ol>
5. 跨膜蛋白溶解：
<ol start="15">
<li>向重悬的膜组分（约 25 mL）中加入 6 mL 10% DDM（最终去垢剂浓度 = 2% DDM），在 4 °C 下轻轻摇动混合物 2 小时。</li>
<li>将混合物在 Ti647.5 转子中于 4°C 以 40,000 rpm 离心 40 分钟，以分离可溶性蛋白-去垢剂复合物与不溶性蛋白。保留上清液，其中含有 MexB 蛋白-去垢剂复合物。</li>
</ol>
6. IMAC：
<ol start="17">
<li>将高速离心后获得的上清液与在重悬缓冲液中平衡过的Talon金属亲和层析珠混合，在4°C下于旋转仪中孵育1小时。</li>
<li>将混合液倒入重力流层析柱中，弃去穿流液。</li>
<li>用20 mL（10个柱体积）IMAC结合与洗涤缓冲液（50 mM NaP，pH 7，300 mM NaCl，5%甘油，0.2% DDM）洗涤层析柱。</li>
<li>使用IMAC洗脱缓冲液（50 mM NaP，pH 7.0，300 mM NaCl，5%甘油，250 mM 咪唑，0.2% DDM）洗脱蛋白。</li>
<li>取15 μL洗脱组分样品，分别与15 μL 2X SDS上样缓冲液混合，用于聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。在微量离心机中离心30秒。在10%聚丙烯酰胺SDS凝胶上分析样品，以评估各组分中MexB蛋白的含量和纯度。</li>
<li>合并含有MexB蛋白-去垢剂复合物的组分，并在4°C下使用离心浓缩装置进行浓缩。注意避免在此步骤中蛋白发生沉淀。</li>
</ol>
7. 凝胶过滤柱：
<ol start="23">
<li>用洗脱缓冲液（50 mM NaP，pH 7.0，300 mM NaCl，5% 甘油，0.2% beta-辛基葡萄糖苷）预平衡 Superose 12 HL 30/10 柱，体积为 24 mL，并等待基线平稳。</li>
<li>用运行缓冲液冲洗 Akta 系统的上样环。</li>
<li>在将蛋白溶液上柱前，使用注射器滤膜过滤。</li>
<li>最多上样 240 μL 蛋白溶液，蛋白浓度最高可达 5 mg/mL。</li>
<li>运行 1.5 柱体积（36 mL）缓冲液，收集 0.25 mL 的组分。MexB 蛋白-去垢剂复合物应在洗脱体积约为 10–15 mL 处以峰形洗脱。</li>
<li>取峰组分的 5 μL 样品，按 1:1 体积比与 2× SDS 上样缓冲液混合。使用 10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析各样品，以评估每管组分中 MexB 的含量和纯度。</li>
<li>合并含有纯 MexB 的组分。</li>
</ol>
8. 代表性结果：
图1包含来自IMAC柱的合并组分以及来自凝胶过滤柱的单个组分的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。经过凝胶过滤柱纯化后，考马斯亮蓝染色的聚丙烯酰胺凝胶显示蛋白质已达到纯度。图2为凝胶过滤柱的洗脱曲线，显示了蛋白质-去垢剂复合物从柱中洗脱的主要峰。MexB蛋白的平均产量约为每6升2XYT培养液获得2 mg。
 <img src="/files/ftp_upload/2134/2134fig1.jpg" alt="SDS-PAGE凝胶电泳结果，按分子量分离蛋白质，蛋白质分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. MexB PDCs纯化的SDS-PAGE凝胶电泳图。 第1道：分子量标记物；第2道：合并的IMAC组分；第3–7道：凝胶过滤柱组分。
 <img src="/files/ftp_upload/2134/2134fig2.jpg" alt="层析结果示意图，蛋白质纯化，15 ml 处出现吸收峰，紫外检测单位为 mAU。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. MexB 蛋白去污剂复合物（PDC）凝胶过滤结果示例。

<ol><li>Eda, S., Maseda, H., Nakae, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+elegant+means+of+self-protection+in+gram-negative+bacteria+by+recognizing+and+extruding+xenobiotics+from+the+periplasmic+space%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An elegant means of self-protection in gram-negative bacteria by recognizing and extruding xenobiotics from the periplasmic space.</a> J. Biol. Chem. 278, 2085-2088 (2003).</li>
<li>Li, X. Z., Ma, D., Livermore, D. M., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+efflux+pump%28s%29+in+intrinsic+resistance+of+Pseudomonas+aeruginosa%3A+active+efflux+as+a+contributing+factor+to+beta-lactam+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Role of efflux pump(s) in intrinsic resistance of Pseudomonas aeruginosa: active efflux as a contributing factor to beta-lactam resistance.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 38, 1742-1752 (1994).</li>
<li>Li, X. Z., Nikaido, H., Poole, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+MexA-MexB-OprM+in+antibiotic+efflux+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 39, 1948-1953 (1995).</li>
<li>Masuda, N., Sakagawa, E., Ohya, S., Gotoh, N., Tsujimoto, H., Nishino, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificities+of+MexAB-OprM%2C+MexCD-OprJ%2C+and+MexXY-oprM+efflux+pumps+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Substrate specificities of MexAB-OprM, MexCD-OprJ, and MexXY-oprM efflux pumps in Pseudomonas aeruginosa.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 44, 3322-3327 (2000).</li>
<li>Okusu, H., Ma, D., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AcrAB+efflux+pump+plays+a+major+role+in+the+antibiotic+resistance+phenotype+of+Escherichia+coli+multiple-antibiotic-resistance+%28Mar%29+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">AcrAB efflux pump plays a major role in the antibiotic resistance phenotype of Escherichia coli multiple-antibiotic-resistance (Mar) mutants.</a> J. Bacteriol. 178, 306-308 (1996).</li>
<li>Srikumar, R., Kon, T., Gotoh, N., Poole, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Pseudomonas+aeruginosa+multidrug+efflux+pumps+MexA-MexB-OprM+and+MexC-MexD-OprJ+in+a+multidrug-sensitive+Escherichia+coli+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Expression of Pseudomonas aeruginosa multidrug efflux pumps MexA-MexB-OprM and MexC-MexD-OprJ in a multidrug-sensitive Escherichia coli strain.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 42, 65-71 (1998).</li>
<li>Tikhonova, E. B., Zgurskaya, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AcrA%2C+AcrB%2C+and+TolC+of+Escherichia+coli+Form+a+Stable+Intermembrane+Multidrug+Efflux%5BTitle%5D)+AND+%22Complex.+J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">AcrA, AcrB, and TolC of Escherichia coli Form a Stable Intermembrane Multidrug Efflux.</a> Complex. J. Biol. Chem. 279, 32116-3224 (2004).</li>
<li>Yoneyama, H., Ocakatan, A., Tsuda, M., Nakae, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mex-gene+products+in+antibiotic+extrusion+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">The role of mex-gene products in antibiotic extrusion in Pseudomonas aeruginosa.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 611-618 (1997).</li>
<li>Berger, B. W., Gendron, C. M., Robinson, C. R., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+protein+and+surfactant+interactions+in+membrane-protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">The role of protein and surfactant interactions in membrane-protein crystallization.</a> Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 61, 724-730 (2005).</li>
<li>Jones, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactants+in+membrane+solubilisation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Surfactants in membrane solubilisation.</a> Int. J. Pharm. 177, 137-159 (1999).</li>
<li>Maire, M. le, Champeil, P., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+membrane+proteins+and+lipids+with+solubilizing+detergents%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1508, 86-111 (2000).</li>
<li>Miroux, B., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-production+of+proteins+in+Escherichia+coli%3A+mutant+hosts+that+allow+synthesis+of+some+membrane+proteins+and+globular+proteins+at+high+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels.</a> J. Mol. Biol. 260, 289-298 (1996).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

除了多药耐药性外，许多重要的细胞活动，包括离子转运、细胞间通讯、囊泡运输、细胞结构的维持以及宿主与病原体之间的相互作用，都涉及嵌入细胞膜中的蛋白质。跨膜蛋白占已知蛋白质总数的30%以上，也是目前大多数药物的作用靶点。跨膜蛋白的错误折叠或功能异常会导致重要的遗传性疾病，包括囊性纤维化和糖尿病。尽管跨膜蛋白具有极其重要的生物学意义，但相较于可溶性蛋白，人们对它们的结构和分子机制了解甚少。由于含有疏水序列，这类蛋白在表达和大量分离方面存在困难，也难以适用于许多生物化学和结构研究方法。
本方案展示了多药耐药（MDR）膜蛋白的表达、去垢剂增溶及纯化，以获得可溶性的蛋白-去垢剂复合物。这些方法经适当修改后，也可用于多种重组表达的跨膜蛋白。所获得的纯化蛋白-去垢剂复合物具有可溶性，可用于X射线晶体学结构解析的结晶试验，以及其他生物物理或生物化学表征，包括重建入脂质体或交联研究。
在纯化过程中，需特别注意避免蛋白质-去垢剂复合物在离心浓缩步骤中发生沉淀。在凝胶过滤步骤之前或之后，也可采用其他方法来浓缩PDC，例如使用极小的柱子和少量洗脱体...

<table><tbody><tr><td>SDS 样品缓冲液</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>C43(DE3) 大肠杆菌菌株</td><td>Lucigen</td><td>60345-1</td><td></td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4378</td><td></td></tr><tr><td>2XYT 培养基</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2466-2</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC61189-5000</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3226-1</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7651</td><td></td></tr><tr><td>完全不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂片剂</td><td>Roche Group</td><td>11 873 580 001</td><td></td></tr><tr><td>NaP 单碱性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6566</td><td></td></tr><tr><td>NaP 双碱性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;n&lt;/em&gt;-十二烷基-&amp;#946;-D-麦芽糖吡喃糖苷</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>往复式摇床</td><td>Fisher Scientific</td><td>SSL 4</td><td></td></tr><tr><td>Talon 金属亲和树脂</td><td>Clontech Laboratories</td><td>635503</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>10% 聚丙烯酰胺 SDS-PAGE 凝胶</td><td>Bio-Rad</td><td>161-1454</td><td></td></tr><tr><td>Tris/甘氨酸/SDS-PAGE 电泳缓冲液</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0732</td><td></td></tr><tr><td>Kaleidascope 预染蛋白质分子量标准品</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0324</td><td></td></tr><tr><td>Superose 12 30/10 层析柱</td><td>GE Healthcare</td><td>12 10/300 GL</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 离心浓缩器</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLFG R04 NL</td><td></td></tr><tr><td>Fernbach 三角烧瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-552-39</td><td></td></tr><tr><td>用于放置 Fernbach 三角烧瓶的摇床</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Akta 系统</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>J6 大容量离心机，配备 JLA-8.1000 转子</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 L 离心瓶</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>969329</td><td></td></tr><tr><td>RC-5 离心机</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SS34 固定角转子及配套离心管</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall 地面型超速离心机</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T647.5 转子及带盖离心管</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>08322</td><td></td></tr><tr><td>French 压力裂解细胞仪</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>FA-032</td><td></td></tr></tbody></table>

膜转运蛋白mexb多药耐药蛋白的表达、去垢剂增溶及纯化

Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein

多药耐药性（MDR）是指癌细胞或病原体对结构和功能上互不相关的多种抗癌药物或抗生素产生耐药性的能力，是当前公共卫生领域的一个严重问题。这种多药耐药性在很大程度上归因于依赖能量的药物外排泵。这些外排泵将抗癌药物或抗生素排出细胞外，使其胞内浓度降至毒性阈值以下。我们正在研究多药耐药性在 铜绿假单胞菌一种机会性细菌病原体，可导致多种创伤或疾病患者发生感染，例如烧伤或囊性纤维化患者，以及免疫功能受损的癌症、透析和移植患者。主要的多重耐药外排泵在 P. aeruginosa 由内膜质子-药物反向转运蛋白（RND）、外膜通道（OMF）和周质连接蛋白（MFP）组成的三联复合物 1-8RND 和 OMF 蛋白均为跨膜蛋白。跨膜蛋白占所有蛋白质的 30% 以上，并且是目前 65% 药物靶点的来源。由于其疏水性跨膜结构域的存在，这类蛋白在水相缓冲液中不溶。在纯化跨膜蛋白之前，必须筛选出含有温和去垢剂的缓冲条件，以使蛋白能够形成蛋白-去垢剂复合物（PDC）并实现增溶。 9-11在本示例中，我们使用一种RND蛋白，即 P. aeruginosa MexB 跨膜转运蛋白，用于演示如何表达跨膜蛋白的重组形式，使用去垢剂对其进行增溶，并纯化蛋白-去垢剂复合物。该通用方法可适用于多种其他重组表达膜蛋白的表达、纯化和增溶。所得蛋白-去垢剂复合物可用于后续生化或生物物理表征，包括X射线晶体结构测定或交联研究。

在本实验方案中，我们展示了重组表达的膜蛋白 MexB 作为可溶性蛋白-去垢剂复合物的表达、增溶及纯化过程。MexB 是来自机会性细菌病原体铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的一种多重耐药膜转运蛋白。

膜转运蛋白MexB多药耐药蛋白的表达、去垢剂增溶及纯化

多药耐药性（MDR），指癌细胞或病原体对结构和功能上互不相关的多种药物产生耐受的能力……

为了纯化 Mex B 膜蛋白，首先利用重组 DNA 技术在大肠杆菌（e coli）中表达 Mex B。然后分离膜组分，并使用温和型去垢剂溶解膜蛋白。溶解后的膜蛋白通过 iMac 进行纯化，随后再通过凝胶过滤色谱法进一步纯化该蛋白。通过 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳来确定蛋白质的纯化程度。尽管该方法可用于研究多药耐药性跨膜转运蛋白，但也适用于其他膜蛋白。今天演示的实验流程将由我实验室的一名研究生完成。在本实验中，将铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的 MexB 基因亚克隆至 PET-30b(+) 表达载体中，使 MexB 以带有 C 末端六聚组氨酸标签的形式表达。实验从傍晚开始：接种四管含卡那霉素的 3 毫升 LB 培养基，使用新鲜转化子或冻存菌种，在 37°C 条件下置于摇床中过夜培养。使用过夜培养物接种含有 30 微克/毫升的 150 毫升 LB 培养基。下午能否在 37 摄氏度摇床条件下培养含有 30 微克/毫升的 Mycin 培养物？用小量培养物接种六份各一升的 XYT 培养基，每份均含有 30 微克/毫升。蕨类植物的三角瓶中能否使用制霉菌素？每种培养物使用25毫升，进行1:40稀释。在37°C下培养，直至达到光密度。当菌液密度达到 0.4 到 0.6 时，约需 1.5 小时。当培养物达到合适密度后，加入 0.5 毫升 1 摩尔的 IPTG 以诱导蛋白表达。将所有锥形瓶放回摇床，继续在 30 摄氏度下培养过夜，直至次日早晨收获细菌。从摇床中取出培养物并进行冷却。然后，为收获细胞，将培养物转移至离心管中，在大型离心机中于 4 摄氏度、5,000 转/分钟的条件下离心 30 分钟，同时对细胞进行离心处理。向 100 毫升细胞重悬缓冲液中添加 DNA 酶、蛋白酶抑制剂和溶菌酶。同时，根据本表所示，向两份膜重悬缓冲液中添加蛋白酶抑制剂。离心完成后，将所有三种溶液置于冰上。用100毫升细胞重悬缓冲液重悬细胞沉淀。接下来，进行细胞提取。将细胞悬液装入法国压榨细胞装置中，并将该装置置于法国压榨机上。施加压力直至达到每平方英寸12,000磅。将阀门打开极小的幅度，使破碎的细胞缓慢滴出。切勿将阀门开得过大而导致细胞喷出，否则细胞释放时压力不足，无法有效破碎。用瓶子收集细胞裂解液，并将瓶子置于冰上保持低温。将细胞溶液再次通过法国压力细胞，压力为12,000磅/平方英寸。将细胞裂解液转移至SS 34离心管中，在4°C下使用SS 34转子以10,000转/分钟离心30分钟，以去除细胞碎片。接下来为澄清的裂解液。用于制备膜组分。小心将上清液转移至 TI-647 0.5 超速离心管中，在 4 °C 条件下，使用 TI-647 0.5 转子以 40,000 转/分钟离心 50 分钟。弃去上清液。用移液器将含有细胞膜的沉淀物轻轻重悬于约25毫升膜重悬缓冲液中，将膜悬液转移至洁净的离心管中，在TI I 6 4 7 0.5转子中于4°C、40,000转/分钟条件下离心50分钟，然后将洗涤后的膜沉淀物重新悬浮于25毫升膜重悬缓冲液中。接下来，向约25毫升重悬的膜中加入试剂以溶解膜蛋白。加入6 mL的10% DDM，使最终去垢剂浓度为2% DDM，在4°C下轻轻摇动混合物2小时。在DDM存在下孵育2小时后，将混合物于TI I 6 4 7 0.5转子中，在4°C下以40,000转/分钟离心40分钟，以分离可溶性蛋白-去垢剂复合物与不溶性蛋白。收集含有Mex B蛋白-去垢剂复合物的上清液，用于后续纯化。将含有Mex B蛋白-去垢剂复合物的上清液与2 mL已用Resus悬浮缓冲液平衡的金属螯合亲和树脂珠混合，在4°C下于旋转仪上孵育1小时，使蛋白与树脂结合。将悬浊液倒入重力流层析柱中，弃去流出液。当柱子洗涤完成后，用20毫升或10个柱体积的iMac结合与洗涤缓冲液洗涤柱子。用10毫升iMac洗脱缓冲液洗脱结合的蛋白质。取每份洗脱组分10 µL样品，与10 µL两倍浓度的SDS上样缓冲液混合，然后在10%聚丙烯酰胺SDS凝胶上进行分析。估算每种组分中 Mex B 的含量和纯度。收集含有 Mex B 蛋白-去垢剂复合物的组分，并在 4 摄氏度下使用离心浓缩器进行浓缩。注意在此步骤中防止蛋白质发生沉淀。进行数次短时离心，并观察沉淀情况。每次离心后，继续使用凝胶过滤柱纯化合并的组分。用24毫升洗脱缓冲液预先平衡Super Rose 12 HL 30/10柱，等待基线平稳。接下来，用流动缓冲液冲洗自动进样系统加载回路。在将蛋白质上样到色谱柱之前，使用注射器滤器过滤蛋白质溶液。然后，将最多 240 微升、浓度不超过每毫升 5 毫克的蛋白质溶液上样至色谱柱中。用1.5倍柱体积的缓冲液进行洗脱，并收集0.25毫升的组分。XB蛋白-去垢剂复合物在洗脱体积约为10至15毫升时以峰的形式流出。取峰组分的5微升样品。将每个样品与两倍SDS上样缓冲液按1:1比例混合。使用10%聚丙烯酰胺凝胶分析各组分中的ME Mex B蛋白含量及纯度，并收集含有纯ME B的组分。该聚丙烯酰胺凝胶中加样了iMac柱收集的组分以及凝胶过滤柱的各个组分。经过凝胶过滤柱纯化后，蛋白质在考马斯亮蓝染色的聚丙烯酰胺凝胶上显示为单一纯蛋白条带。凝胶过滤柱的图谱显示了蛋白质-去垢剂复合物从柱中洗脱的主要峰。每六升二倍XYT培养液中，mxb蛋白的平均产量约为两毫克。一旦掌握，若操作得当，该实验流程可在八小时内完成。观看本视频后，您应能够充分理解如何表达、溶解并纯化膜蛋白。

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