基于蛋白脂质体的外排实验测定 Cl⁻ 通道单分子特性^- 通道蛋白与转运蛋白

本实验的总体目标是定量测定重建的氯离子通道或转运蛋白的转运活性。首先将纯化后的转运蛋白以低密度重组到脂质体中，使每个脂质体在去除外部氯离子后仅包含零个或一个活性复合物，从而形成向外的离子浓度梯度。随后将脂质体加入记录室，利用氯离子敏感电极监测氯离子浓度。接着通过加入钾离子载体缬氨霉素（Valinomycin）启动氯离子从脂质体中的流出，以消除膜电位。

当信号达到稳态后，通过加入去垢剂溶解脂质体以终止实验。最终，通过测量含有纯化通道蛋白或转运蛋白的蛋白脂质体中氯离子外流的速率，可以定量确定该活性蛋白复合物的单分子转运速率及其化学计量比。该技术相较于其他现有方法（如基于荧光的通量测定）的主要优势在于，能够定量测定重组转运蛋白的关键参数，例如单分子转换速率以及复合物的结构构型。

除了提供这些关键参数的定量测量外，该方法还可用于快速、精确地确定突变、小分子对重组转运蛋白亚基的影响，并对其进行监测。记录装置由两个腔室、一个氯离子电极、一台带有模拟或数字电信号输出的pH计、一个数据采集器和一台配备适当采集软件的计算机组成。将氯离子电极连接至pH计，然后将pH计的输出端连接至数据采集器，再将数据采集器连接至计算机。

将参考电极放入一个腔室，记录导线放入另一个腔室。随后将腔室置于搅拌台上，搅拌子置于记录腔室中。确保搅拌子不接触电极。

在实验前一晚，使用琼脂桥连接各个腔室。将1克Cidex G-50珠粒加入15毫升外部缓冲液中，在室温下轻轻摇动溶胀至少3小时，备用。每次实验大约需要3毫升溶胀后的珠粒，同时将脂质体在室温下解冻。将约3毫升溶胀的G-50珠粒倒入每根层析柱中。

让其依靠重力自然干燥。在室温下进行。通常需要一到两分钟。

接下来，使用微型挤出器将蛋白脂质体通过0.4微米聚四氟乙烯滤膜挤出11次，以制备均匀囊泡。然后将层析柱置于塑料圆底离心管中，在临床离心机中以1400 ×g离心20至30秒，以去除多余溶液。随后，在防止流出液损失的前提下，将层析柱转移至一支13 × 100毫米的玻璃试管中，并向柱内加入100 µL挤出后的囊泡。

在500 G条件下，将层析柱离心一分钟。使用临床离心机收集约200微升的穿流液，并将其加入记录室中。为进行外排测量，在参考室中加入2毫升100毫摩尔氯化钾溶液，在记录室中加入1.8毫升外部缓冲液。启动采集程序。

让基线达到平衡，这可能需要几分钟。当信号达到稳定基线后，开始记录。

加入 15 µL 的 1 摩尔氯化钾溶液以校准系统。然后加入脂质体。由于蛋白脂质体外部的氯离子未完全去除，可能会观察到微小的跳跃。

等待基线稳定。随后加入CIN以启动flx。让FLX反应进行至其达到平台期。

此时，向外部缓冲液中加入 40 微升 1.5 摩尔的 β-辛基葡萄糖苷，以溶解所有脂质体。然后等待 10 至 15 秒。结束记录，并按照文本方案中所述进行数据分析。

当含有高浓度内氯化物的脂质体被置于低氯化物环境中，形成300倍的氯离子浓度梯度时，未观察到净离子流。这是因为不含蛋白质的脂质体对离子具有较低的本征通透性。在重组了质子偶联氯离子转运蛋白C-L-C-E-C one的蛋白脂质体中，也未观察到明显的FLX信号。

由于从囊泡中流出的少量氯离子会在脂质体内部积聚净正电荷，加入CIN可允许钾离子跨膜移动，从而消除电势差并启动氯离子的流动。反应终止后，测定囊泡内所含氯离子的总量，以确定单个重组蛋白的性质。首先将流出动力学的原始数据从毫伏转换为氯离子浓度，然后进行归一化处理，再对时间过程曲线进行拟合。

已确定外排的时间常数为41秒，含有零个活性拷贝C-L-C-E-C1的脂质体比例为0.31，表明根据这些数值，约有三分之一的脂质体不含任何活性蛋白。通过测量至少含有一个C-L-C-E-C1拷贝的囊泡中的氯离子含量，可确定C-L-C-E-C1的单通道转运速率为每秒约2,500个氯离子。观看本视频后，您应充分理解如何测定转运蛋白的周转率。若操作仔细，这些实验可在10至15分钟内完成。

必须仔细评估脂质体的质量，因为泄漏会不利地影响周转率估算的准确性。