真核硼酸背液转运体的表达、增溶及纯化
March 7th, 2019
在这里, 我们提出了一个协议, 以表达, 溶解, 并纯化几个真核硼酸盐转运体与同源的 slc4 转运体家族使用酵母。我们还描述了一种化学交联法, 以评估纯化的同源蛋白的多重组装。这些协议可适用于其他具有挑战性的膜蛋白。
为下游应用获取足够数量的膜蛋白仍然是一个重大的技术挑战。该协议能够纯化几种膜传输蛋白的均匀性。该技术的一个关键优点是，糖精酶是膜蛋白的一个时间和具有成本效益的真核表达系统，允许优化许多关键的实验变量。
首先接种三个转化酵母菌群，在50毫升的完整补充选择性培养基没有组蛋白。辅以酵母氮碱基和2%葡萄糖过夜孵育，每分钟190次旋转，30摄氏度。第二天删除区域性。
使用分光光度计确定 600 纳米或 OD 600 的光学密度。并接种四个两升烧瓶，其中含有500毫升培养培养，以0.01的OD 600。然后以每分钟190次旋转的速度在30摄氏度下摇动培养物，30小时，让细胞消耗所有葡萄糖并生长到高密度。
为了诱导玻酸盐运输者表达，加入125毫升的5个x酵母肽介质，辅以10%的半乳糖在每分钟190旋转在30摄氏度16小时。然后通过离心收获酵母细胞，并在100毫升冷水中重新加入颗粒。在漩涡中旋转以重新暂停酵母颗粒，并串行转移溶液，以做到这一点，所有瓶子含有颗粒。
为了收获酵母膜，首先，向重新暂停的细胞中加入11.25毫升的摩尔三叶草、0.45毫升的0.5摩尔EDTA和2.25毫升的100毫升PMSF。将水加入225毫升的最终体积，并将细胞转移到450毫升金属珠子跳动罐中。用冷 0.5 毫米玻璃珠顶掉剩余体积，用转子组装珠珠腔。
将腔室浸入冰浴中，执行六次一分钟的脉冲，由两分钟的休息时间分开，以防止酸盐过热。最后一次脉冲后，从塑料一次性瓶顶过滤器中取出过滤膜，将其拧入玻璃瓶中，在吸尘时将珠室的内容倒入组件上。然后用两个 x 珠洗缓冲液冲洗，加入腔室旋转，然后添加到珠子中。
用 225 毫升的洗涤缓冲液冲洗珠珠腔，然后用珠子内装物清洗珠子。通过离心收集离酸液，将上经剂转化为聚碳酸酯瓶，用于超离心，用于收集膜。在超离心结束时，丢弃上流水液，用膜颗粒称重瓶子，然后再将膜重新吸收在大约 35 毫升的膜再吸收缓冲液中。
将悬浮液添加到玻璃 Douncer 中，然后 Dounce 将均质异质的膜均匀化到 50 毫升锥形管中，以进行负 80 摄氏度的存储。称重空离心瓶以确定收获膜的质量。对于蛋白质溶解和纯化，每克膜上加入搅拌棒和150毫克DDM，将解冻膜重新暂停至15毫升膜再吸收缓冲液的最终体积，每克膜辅以1毫升PMSF和20毫升。
将膜溶液加入烧杯，在冰浴中搅拌一小时。然后离心，使非溶解材料颗粒。在4摄氏度的冷室中，通过5微米注射器过滤器过滤上清液，并使用每分钟1毫升的流速的吸热泵将样品装载到1毫升固定镍亲和力柱上，然后用10列洗涤缓冲液清洗柱，稀释洗脱缓冲液中的蛋白质。
收集十毫升分之一的埃卢酸盐。在 4 至 20% Tris-Glycine SDS 页面凝胶上运行收集的凝胶分数，以及溶解的解液和在室温下洗涤馏分，在 4 摄氏度的台式离心机中将收集的未收集馏分将浓度拉至 500 微升或更少的体积。通过0.2微米旋转柱过滤器过滤浓缩蛋白质，将滤液注入S-200缓冲液中平衡的尺寸排除柱上。
在秒四至 20%Tris-Glycine SDS 页面凝胶上运行峰值分数后，染色凝胶并收集纯峰值分数，以在 4 摄氏度的 50 公斤道尔顿截止集中器中浓度。然后测量蛋白质样品在280纳米波长的吸光度，以确定浓度，然后无限期地将样品储存在负80摄氏度。要进行谷胱甘肽交叉链接测定，首先，在S-200缓冲液的三微升中加入每毫升0.5毫克解冻蛋白，以5微升S200缓冲液。
加入一升20%硫酸钠和1.5%谷胱甘肽的微升，完成负控制反应。加入一微升水和一微升1.5%谷胱甘肽，完成实验样品。在室温下30分钟后，用5微升的3x SDS页面凝胶加载模具终止反应，含有过量的Tris缓冲液，以淬火谷氨酸，并加载所有15微升溶液到4至20%的Tris-Glycine SDS页面凝胶上。
然后，在染色前以 200 伏特运行凝胶 30 分钟，以确定暗色交叉链接的范围，如以变性单体两倍大小的带来证明。在缓慢的轨道摇床上摇动，将凝胶染色添加到凝胶中，使凝胶染色。这里，镍亲和色谱中未分离分数的典型凝胶显示三种部分纯化蛋白质，其中酸盐分数没有显示与玻酸盐运输器对应的重要带，因为对于表达不过度的蛋白质，其比例不强。
每个凝胶中的ad毫摩尔洗涤道显示，尽管其相对较高的发射体旧浓度较高，但十种组蛋白的损耗最小。虽然与玻酸盐运输机对应的带子在逃避的分数中很容易明显。在S200柱注射之前，蛋白质对于许多下游应用的纯化不足，每个样品中的额外波段所示。
然而，在它们注入大小排除柱后，可以观察到高纯度的未观测分数。交联表明，纯化的同质运输器可以很容易地在溶液中组装，并结合程度取决于彼此附近的莱辛残留物的数量。要么在摄氏四度的房间的冰上，要么在熟食盒里。
按照这个程序，膜蛋白可以进一步定性的生物物理，生化或结构方法，包括X射线晶体学或低温电子显微镜。通过使一定量的均质蛋白得到纯化，这些技术被用来确定阿拉比多普西沙利纳一个运输器的晶体结构。
概述
本文介绍了一种使用酵母表达、溶解和纯化真核硼酸盐转运蛋白的协议。它还包括了一个化学交联分析，用于评估纯化蛋白质的多聚体组装。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 膜蛋白研究
背景
- 膜蛋白在足够的数量上纯化具有挑战性。
- 酵母是一个有效的真核表达系统。
- 实验变量的优化对于成功的蛋白质表达至关重要。
- 交联分析有助于评估蛋白质组装。
研究目的
- 开发一个可靠的硼酸盐转运蛋白纯化协议。
- 促进膜蛋白组装的研究。
- 提供一种适用于其他膜蛋白的方法。
使用的方法
- 将转化的酵母菌落接种在选择性培养基中。
- 使用半乳糖诱导蛋白质表达。
- 使用DDM进行膜收集和蛋白质溶解。
- 通过镍亲和色谱和尺寸排阻色谱进行纯化。
主要结果
- 成功纯化硼酸盐转运蛋白至纯度。
- 通过交联分析证明多聚体组装。
- 建立了一个适用于各种膜蛋白的协议。
结论
- 该协议提供了一种研究真核膜蛋白的稳健方法。
- 交联分析对于评估蛋白质相互作用有效。
- 酵母是膜蛋白研究的宝贵工具。
常见问题
Executive Industry Relevance
Expression and purification of eukaryotic membrane proteins remain a bottleneck in target validation and structural biology efforts. This protocol enables milligram-scale production of homogeneous borate transporters using a cost-effective yeast expression system, supporting downstream biophysical and functional assays. The approach enhances predictive confidence in early discovery by providing reliable access to challenging targets for mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transporter function and oligomerization state for target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides a reproducible yeast-based platform for expressing eukaryotic membrane proteins at scale.
- Predictive Value: Supports assessment of multimeric assembly via crosslinking, informing target druggability and mechanism of action.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified protein suitable for ligand-binding and functional assays.
- Operational Value: Delivers detergent-solubilized, monodisperse protein preparations compatible with biophysical screening.
- Assay Readiness: Enables standardization of purification workflows across borate transporter homologs from plant, yeast, and fungal sources.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Facilitates structural studies that inform inhibitor design and selectivity profiling.
- Mechanistic De-risking: Allows evaluation of protein-protein interactions and conformational states relevant to physiological function.
- Preclinical Model Support: Provides material for characterizing transporter activity in disease-relevant contexts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target expression to lead identification, enabling progression from molecular target validation to mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Supports cloning, expression, and initial characterization of eukaryotic membrane targets.
- Screening: Produces purified protein for assay development and compound screening campaigns.
- Analytics: Yields quantitative outputs via crosslinking and size-exclusion chromatography to assess purity and oligomerization.
- Translational Research: Connects expression data to structural insights for target-based drug design.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, adaptable platform for purifying diverse eukaryotic membrane proteins across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation success rates by enabling structural and functional studies of difficult-to-express proteins.
- Operational Value: Reduces time and cost associated with membrane protein production through optimized yeast expression and purification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable biophysical data on target behavior.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on structural and mechanistic feasibility.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast culture, membrane isolation, and detergent-based solubilization.
- Depends on access to ultracentrifugation, nickel affinity, and size-exclusion chromatography systems.
- Necessitates standardized protocols for crosslinking and SDS-PAGE analysis across teams.
- Involves optimization of expression conditions (e.g., galactose induction) for different transporter homologs.
- Limited by the inherent instability of some membrane proteins post-solubilization, requiring careful handling at 4°C.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:28
Borate Transporter Overexpression in S. cerevisiae
1:55
Yeast Membrane Harvest
3:51
Protein Solubilization and Purification
5:56
Glutaraldehyde Cross-Linking Assay
7:09
Results: Representative Borate Transporter Purification and Analysis
8:18
Conclusion
