真核生物硼酸盐转运蛋白的表达、增溶与纯化

获得足量的膜蛋白以用于下游应用仍然是一个重大的技术挑战。本方案可实现多种膜转运蛋白的均一性纯化。该技术的一个关键优势在于，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一种高效且经济的真核表达系统，适用于膜蛋白的表达，并允许对多个关键实验变量进行优化。

首先，在50毫升不含组氨酸的完全补充选择性培养基中接种三个转化的酵母菌落，培养基中添加酵母氮碱和2%葡萄糖，于30摄氏度、190转/分钟条件下过夜培养。次日取出培养物。

使用分光光度计测定600纳米处的光密度（OD 600）。将四个装有500毫升培养基的2升锥形瓶分别接种，使初始OD 600为0.01。随后在30°C、190转/分钟的摇床中培养30小时，使细胞耗尽葡萄糖并生长至高密度。

为诱导硼酸盐转运蛋白表达，加入125毫升5倍浓度的酵母胨培养基，补充10%半乳糖，在30摄氏度、190转/分钟条件下培养16小时。然后通过离心收集酵母细胞，并将沉淀重悬于100毫升冷水中。涡旋振荡以重悬酵母沉淀，并依次转移溶液，对所有含有沉淀的瓶子进行相同操作。

为了收获酵母膜，首先向重悬的细胞中加入 11.25 毫升 1 摩尔 Tris、0.45 毫升 0.5 摩尔 EDTA 和 2.25 毫升 100 毫摩尔 PMSF。加水至终体积为 225 毫升，并将细胞转移至一个 450 毫升的金属珠击破碎罐中。用冷的 0.5 毫米玻璃珠补足剩余体积，并将珠击破碎室与转子组装在一起。

将样品室浸入冰浴中，进行六次一分钟的脉冲处理，每次脉冲之间间隔两分钟以防止裂解液过热。最后一次脉冲结束后，从拧在玻璃瓶上的塑料一次性瓶顶滤器中取出滤膜，将珠磨室中的内容物倒入滤器组件中，同时施加真空。然后加入两倍体积的珠子洗涤缓冲液，先加入样品室中涡旋混匀，再加入珠子中进行冲洗。

用225毫升洗涤缓冲液冲洗珠磨腔，并用腔内液体洗涤珠子。通过离心收集裂解液，将上清液倾入聚碳酸酯瓶中，用于超速离心以收集膜组分。超速离心结束后，弃去上清液，称量含有膜沉淀的瓶子，然后将膜重新悬浮于约35毫升膜重悬缓冲液中。

将悬浮液加入玻璃Dounce匀浆器中，然后对膜进行Dounce匀浆，并将匀浆液分装至50毫升锥形管中，于负80摄氏度保存。称量空离心瓶的质量，以确定收获的膜的质量。进行蛋白溶解与纯化时，将一个搅拌子以及每克膜加入150毫克DDM，置于冰上烧杯中，将解冻的膜重悬于终体积为15毫升的膜重悬缓冲液中，缓冲液中需添加每克膜1毫摩尔PMSF和20毫摩尔咪唑。

将膜溶液加入烧杯中，在冰浴条件下搅拌一小时。随后进行离心，以沉淀未溶解的物质。在4摄氏度的冷室中，将上清液通过5微米的注射器滤膜过滤，并使用蠕动泵以每分钟1毫升的流速将样品加载到1毫升的固定化镍亲和柱上。然后，用10倍柱体积的洗涤缓冲液洗涤柱子，并用洗脱缓冲液稀释蛋白质。

将洗脱液收集为十个一毫升的组分。将收集的制备凝胶组分、溶解的裂解液以及洗涤组分一同在室温下进行4%至20% Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶电泳。将收集到的峰值洗脱组分在台式离心机中，于4°C条件下，使用截留分子量为50 kDa的浓缩器浓缩至500 µL或更小体积。通过0.2 µm离心柱滤膜过滤浓缩后的蛋白质，然后将滤液上样至预先用S-200缓冲液平衡好的尺寸排阻色谱柱中。

在第二次运行4%至20% Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶电泳分离峰组分后，对凝胶进行染色，并收集纯化的峰组分，使用50千道尔顿截留分子量的浓缩管在4摄氏度下进行浓缩，操作方法如前所述。随后，在280纳米波长下测定蛋白质样品的吸光度，以确定其浓度，然后将样品长期保存于-80摄氏度。为进行戊二醛交联实验，首先将3微升S-200缓冲液中含0.5毫克/毫升的解冻蛋白加入到5微升S-200缓冲液中。

通过加入一微升20%十二烷基硫酸钠和一微升1.5%戊二醛完成阴性对照反应。通过加入一微升水和一微升1.5%戊二醛完成实验样品反应。室温反应30分钟后，加入五微升3x SDS-PAGE上样缓冲液（含有过量Tris缓冲液以淬灭戊二醛），终止反应，并将全部15微升溶液上样至4%–20% Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶中。

然后，在染色前以 200 伏电压电泳 30 分钟，以确定二聚体交联的程度，表现为一条迁移位置为变性单体两倍大小的条带。将染色液加入凝胶后，在慢速旋转摇床上振荡染色。此处展示的是镍亲和层析洗脱组分的典型凝胶结果，显示三种部分纯化的蛋白质，而裂解液组分中未出现与硼酸盐转运蛋白相对应的显著条带，这符合那些不易高效过表达的蛋白质的预期结果。

每个凝胶中的毫摩尔洗涤泳道显示，尽管十组氨酸标签蛋白的初始浓度相对较高，其损失仍极小。而对应于硼酸盐转运蛋白的条带在洗脱组分中清晰可见。在注入S200柱之前，由于各样品中存在额外的条带，表明蛋白质纯度尚不足以满足许多后续应用的要求。

然而，在将其注入尺寸排阻色谱柱后，可观察到高纯度的洗脱组分。交联实验表明，纯化的同源寡聚转运蛋白在溶液中的组装状态可被快速评估，且交联程度取决于相邻赖氨酸残基的数量。需要注意的是，一旦开始收集细胞，蛋白质必须始终在低温条件下操作，可置于冰上并在4°C的房间中进行，或保存在冷藏柜中。

通过该方法，可进一步利用生物物理、生物化学或结构学方法（包括X射线晶体学或冷冻电子显微镜技术）对膜蛋白进行表征。这些技术能够纯化出毫克量级的均一蛋白，已被用于解析拟南芥（Arabidopsis thaliana）一种转运蛋白的晶体结构。