Name: 真核硼酸背液转运体的表达、增溶及纯化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-07T15:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 学习利用酵母表达系统纯化真核硼酸转运膜蛋白的完整实验方案，包括镍亲和层析与尺寸排阻层析技术。该方法可获得高纯度均一蛋白样品，适用于下游晶体学与冷冻电镜结构分析。

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本研究得到了戴维森学院启动资金的支持。

1. 培养基和重要缓冲液的制备
<ol>
	<li>通过将200 g半乳糖加入去离子水中，定容至500 mL，配制500 mL的40%半乳糖溶液。使用加热板或微波炉以加快半乳糖溶解速度。使用真空过滤装置（由连接至无菌玻璃瓶的0.2 µm滤膜组成）进行无菌过滤。 
	注意：所有培养基溶液均使用去离子水配制。</li>
	<li>通过将200 g葡萄糖加入水中，定容至500 mL，配制500 mL的40%葡萄糖溶液。经高压灭菌以实现灭菌。</li>
	<li>向四个2 L的锥形瓶中，每个加入0.4 g不含组氨酸的完全补充混合物（CSM-His）、3.35 g含硫酸铵的酵母氮源基础（YNB + 氮）以及475 mL水。高压灭菌后，加入25 mL的40%葡萄糖溶液，使终浓度为2%葡萄糖。</li>
	<li>向一个玻璃瓶中加入50 g蛋白胨、25 g酵母提取物，并加水至375 mL。高压灭菌后，加入125 mL的40%半乳糖溶液，得到含10%半乳糖的5倍浓度酵母蛋白胨（YP）溶液。</li>
	<li>向一个250 mL的锥形瓶中加入0.04 g CSM-His、0.335 g YNB + 氮，并加水至47.5 mL。高压灭菌后，加入2.5 mL的40%葡萄糖溶液，得到50 mL的CSM-His + YNB + 2%葡萄糖溶液。</li>
	<li>通过将121.14 g Tris碱与800 mL水混合，配制1 L的1 M Tris pH 7.0溶液。加入浓盐酸调节pH至7.0，再加水定容至1 L，经0.2 µm滤膜过滤。</li>
	<li>通过将73.06 g EDTA与400 mL水混合，配制500 mL的0.5 M乙二胺四乙酸（EDTA）pH 8.0溶液。加入氢氧化钠颗粒直至EDTA完全溶解且pH达到8.0，再加水定容至500 mL，经0.2 µm滤膜过滤。</li>
	<li>通过将1.74 g苯甲基磺酰氟（PMSF）溶于200 proof乙醇中，配制100 mL的100 mM PMSF溶液。于-20 °C保存。</li>
	<li>配制225 mL的2倍珠洗涤缓冲液，其组成为：50 mM Tris pH 7.0、1.4 M NaCl、20%甘油和1 mM EDTA pH 8.0。</li>
	<li>配制100 mL的凝胶过滤层析缓冲液（S200缓冲液），其组成为：20 mM 4-吗啉乙磺酸一水合物（MES）pH 6.5、100 mM NaCl、2%甘油和0.03%正十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）。</li>
	<li>配制100 mL的膜重悬缓冲液，其组成为：50 mM Tris pH 7.0、500 mM NaCl和10%甘油。</li>
	<li>通过混合3 mL 20%十二烷基硫酸钠（SDS）、3 mL甘油、2.4 mL 1 M Tris pH 6.8、0.03 g溴酚蓝和1.6 mL 2-巯基乙醇，配制10 mL的3倍SDS-PAGE上样染料。</li>
</ol>
2. 在S. cerevisiae中过表达硼酸盐转运蛋白
<ol>
	<li>将三个转化后的酵母菌落接种于50 mL CSM-His + YNB + 2%葡萄糖培养基中，在30 °C、190 rpm条件下振荡培养过夜。</li>
	<li>次日使用分光光度计测定600 nm波长处的光密度（OD600），并据此将菌液接种至OD600为0.01，分别加入四个含有500 mL CSM-His + YNB + 2%葡萄糖培养基的2 L三角瓶中。</li>
	<li>在30 °C、190 rpm条件下振荡培养30小时，使细胞耗尽葡萄糖并生长至高密度。 
	注意：延长培养时间可获得更高的细胞产量、更多的收获膜蛋白量，最终提高纯化蛋白的产量。</li>
	<li>通过加入125 mL添加了10%半乳糖的5x YP培养基进行诱导，使终浓度为2%半乳糖。在30 °C、190 rpm条件下继续振荡培养16小时。</li>
	<li>以4,000 × g 离心15分钟收集细胞，将细胞重悬于100 mL冷水中。 
	注意：此时细胞可于-80 °C长期冷冻保存，也可继续进行细胞裂解和膜蛋白提取。我们通常可收获40–45 g细胞。</li>
</ol>
3. 酵母膜的收获
<ol>
	<li>向细胞重悬液中加入 11.25 mL 的 1 M Tris（pH 7.0）、0.45 mL 的 0.5 M EDTA 和 2.25 mL 的 100 mM PMSF，其中后两者作为蛋白酶抑制剂。加水至终体积为 225 mL，得到含 50 mM Tris（pH 7.0）、1 mM EDTA 和 1 mM PMSF 的细胞重悬缓冲液。 
	注意：若使用冷冻细胞，请在室温下充分解冻约 1 小时，因为若细胞仍部分冻结，将难以通过珠击破碎法有效裂解。</li>
	<li>将细胞重悬液加入一个 450 mL 的金属罐中用于珠击破碎，剩余体积用冷的 0.5 mm 玻璃珠填满。</li>
	<li>组装珠击破碎室并连接转子，将其浸入冰浴中。进行六次 1 分钟的脉冲处理，每次间隔 2 分钟以冷却，防止裂解物过热。</li>
	<li>使用一个塑料一次性瓶顶滤器旋紧在玻璃瓶上组装真空过滤装置。移除滤膜，因为剩余的塑料装置可截留玻璃珠而允许裂解物流过。在施加真空的同时，将珠击破碎室中的内容物倒入该装置，以分离玻璃珠与裂解物。</li>
	<li>用 225 mL 含 50 mM Tris（pH 7.0）、1 mM EDTA、1 mM PMSF、1.4 M NaCl 和 20% 甘油的 2× 洗涤缓冲液洗涤珠击破碎室。将洗涤液倒入装置中以清洗玻璃珠。 
	注意：此洗涤步骤可使裂解细胞总体积达到约 450 mL，并显著提高膜蛋白的收获量。最终浓度为 50 mM Tris（pH 7.0）、1 mM EDTA、1 mM PMSF、10% 甘油和 700 mM NaCl；提高盐浓度的主要目的是促进外周膜蛋白的解离。</li>
	<li>将细胞裂解物在 15,000 × g 条件下离心 15 分钟。将上清液转移至聚碳酸酯瓶中，在超速离心机中以 135,000 × g 离心 1 小时以收集膜组分。 
	注意：若无超速离心机，可在落地式离心机中以 53,000 × g 离心 3 小时收集膜组分，该离心力可在常规离心机中实现。</li>
	<li>弃去上清液，称量含有膜沉淀的离心瓶。将膜沉淀重悬于约 35 mL 含 50 mM Tris（pH 7.0）、500 mM NaCl 和 10% 甘油的膜重悬缓冲液中，并转移至玻璃匀浆器。称量空离心管以确定所收获膜的质量。 
	注意：在高效的膜收获过程中，膜的质量通常约为用于提取的细胞质量的 20%。本方案通常可获得 40–45 g 细胞，因此预期膜产量为 8–9 g。</li>
	<li>使用玻璃匀浆器对膜进行匀浆处理，并分装至 50 mL 圆锥形管中，可于 -80 °C 长期保存。 
	注意：本实验通常分为两份样品，以便从同一批细胞制备物中进行两次独立的蛋白质纯化。</li>
</ol>
4. 蛋白质的溶解与纯化
<ol>
	<li>向烧杯中加入磁力搅拌子，并按每克膜使用量加入 150 mg 的正十二烷基-β-D-麦芽糖吡喃苷（DDM）。全程将蛋白质置于冰上或 4 °C 环境中。 
	注意：DDM 具有吸湿性，不使用时应储存于含干燥剂的玻璃瓶中，并置于 -20 °C。此外，通常在纯化过程中使用 4–5 g 膜以获得足量的纯化蛋白。</li>
	<li>解冻膜样品，并用补充了 1 mM PMSF 和 20 mM 咪唑（pH 8.0）的膜重悬缓冲液将体积调至每克膜 15 mL。将膜样品加入含 DDM 的烧杯中，在 4 °C 下搅拌 1 小时。 
	注意：DDM 的终浓度为 1% w/v，但在膜蛋白增溶过程中，更关键的是每克膜所添加的去垢剂质量。</li>
	<li>在 4 °C 下以 135,000 × g 离心 25 分钟，沉淀未溶解的物质。将上清液通过 5 µm 注射式滤器过滤。</li>
	<li>使用蠕动泵以 1 mL/min 的流速，将样品加载至已用含 20 mM Tris（pH 7.0）、500 mM NaCl、10% 甘油、20 mM 咪唑（pH 8.0）和 0.05% DDM 的缓冲液平衡好的 1 mL 固定化镍亲和柱上。 
	注意：对于表达量较低的蛋白，使用 1 mL 柱而非 5 mL 柱，并采用镍离子而非钴离子进行亲和层析，可观察到纯度和得率的提升。</li>
	<li>用洗涤缓冲液（含 20 mM Tris（pH 7.0）、500 mM NaCl、10% 甘油、80 mM 咪唑（pH 8.0）和 0.05% DDM）洗涤柱子 10 个柱体积。 
	注意：对于带有 10-His 标签的蛋白，洗涤步骤中可使用的咪唑浓度通常高于普遍认知值，有助于提高纯度。</li>
	<li>用含 20 mM Tris（pH 7.0）、200 mM NaCl、10% 甘油、300 mM 咪唑（pH 8.0）和 0.05% DDM 的缓冲液洗脱蛋白。收集洗脱液为十个 1 mL 的组分，并与增溶后的裂解液及洗涤组分一同在 4–20% Tris-甘氨酸 SDS-PAGE 凝胶上电泳分析。</li>
	<li>合并主峰组分（通常约为 5–6 mL），使用截留分子量为 50 kDa 的浓缩管，在 4 °C 的台式离心机中浓缩至 500 µL 或更少体积。 
	注意：500 µL 是通常可注入尺寸排阻色谱（SEC）柱的最大体积。此时蛋白可在 -80 °C 长期保存，或继续进行 SEC 分离。</li>
	<li>将蛋白溶液通过 0.2 µm 离心滤管过滤后，注入已用 S200 缓冲液（20 mM Mes pH 6.5、100 mM NaCl、2% 甘油和 0.03% DDM）平衡好的尺寸排阻色谱柱（例如 Superdex-200）。 
	注意：在后续进行戊二醛交联实验时，缓冲体系中不得含有伯胺。SEC 提供了更换缓冲液的机会，如本例中将 Tris 更换为 Mes。</li>
	<li>将主峰组分在 4–20% Tris-甘氨酸 SDS-PAGE 凝胶上电泳分析。染色后收集纯度高的主峰组分，并在 4 °C 下使用截留分子量为 50 kDa 的浓缩管进行浓缩。</li>
	<li>通过测定 280 nm 波长处的吸光度确定蛋白浓度，并在 -80 °C 长期保存。</li>
</ol>
5. 戊二醛交联实验
<ol>
	<li>在S200缓冲液中配制10 µL反应体系，包含3 µL浓度为0.5 mg/mL的蛋白质、5 µL S200缓冲液、1 µL水或20%十二烷基硫酸钠（SDS），随后加入1 µL 1.5%戊二醛。 
	注意：该体系终浓度为0.15 mg/mL蛋白质和0.15%戊二醛。含SDS预处理的样品作为重要的阴性对照，&#160;应在加入戊二醛前于室温混合并孵育5分钟。</li>
	<li>将反应体系在室温下孵育30分钟。通过加入5 µL 3x SDS-PAGE上样缓冲液终止反应，该缓冲液含有过量Tris缓冲液，可淬灭戊二醛。</li>
	<li>将全部15 µL样品上样至4–20% Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶，每泳道上样1.5 µg蛋白质。以200 V电压电泳30分钟。通过染色检测二聚体交联程度，观察是否存在一条迁移位置为变性单体两倍大小的条带。 
	注意：可先进行戊二醛浓度梯度和时间进程实验，以确定同源寡聚转运蛋白的最佳反应条件。</li>
</ol>

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<li>Hays, F. A., Roe-Zurz, Z., Stroud, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+and+purification+of+integral+membrane+proteins+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Overexpression and purification of integral membrane proteins in yeast.</a> Methods in Enzymology. 470, Issue C (2010).</li>
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<li>Robertson, J. L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design%2C+function+and+structure+of+a+monomeric+ClC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Design, function and structure of a monomeric ClC transporter.</a> Nature. 468 (7325), 844-847 (2010).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文分享了三种不同真核生物硼酸盐转运蛋白均一化纯化的详细方案。所展示的方案基于其他在S. cerevisiae1,14中表达整合膜蛋白的已有方法，并通过我们的优化实现了纯度和产量的双重提升。优化的参数包括细胞培养的体积与时间、珠击破碎裂解程序、细胞裂解及蛋白纯化过程中的缓冲液组成、每克膜所用去垢剂的量、亲和纯化中金属离子的种类、亲和层析柱的体积，以及引入交联实验以通过评估寡聚态转运蛋白的多聚状态来判断同源蛋白和去垢剂的适用性。这些方案在来自植物和真菌物种的多个SLC4同源蛋白中均取得成功。所有整合膜蛋白纯化策略的一个局限性在于，目前尚不存在一种能够保证对所有膜蛋白都有效的通用纯化方法。我们的方案可能更适用于在序列相似性和结构上与SLC4转运蛋白相近的蛋白，因此SLC4、SLC23和SLC26家族成员可能是较有前景的目标15。同样，若某膜转运蛋白在进化上与硼酸盐转运蛋白差异越大，则越可能需要对表达系统、去垢剂或其他关键参数进行调整，以建立不同的纯化方案4。
该实验方案利用了蛋白质纯化中最常用的亲和标签——His标签。尽管初始洗脱组分中存在杂质，但通过镍亲和层析、充分的洗涤以及后续的凝胶过滤层析（SEC）纯化相结合，可获得高纯度的蛋白质。10-His标签允许使用更严格的咪唑梯度洗涤，因此能够比8-His或6-His标签在允许的洗涤条件下去除更多的非特异性结合蛋白。我们在选择纯化组分时倾向于保守地选取纯度最高的凝胶电泳条带，这些条带对应于SEC洗脱曲线的主峰组分。通过合并并浓缩更多洗脱组分，可以提高最终蛋白质的得率，但代价是蛋白质纯度略有下降。本文所述方法成功实现了AtBor1蛋白的大量纯化，从而获得了其晶体结构7；与之前方法的差异在于切除了His标签，并将转运蛋白置换到另一种去垢剂中，以改善晶体衍射质量7。
本方案在同源蛋白的选择以及用于溶解和纯化的去垢剂方面提出了重要考虑因素。DDM 是去垢剂的常用首选，因其相对温和，通常能有效实现蛋白溶解，并已被广泛应用于多种膜蛋白的结构与功能研究中。判断一种去垢剂是否适用于特定膜蛋白的常见评估方法是：目标蛋白在尺寸排阻色谱（SEC）图谱中是否呈现单一且单分散的峰，而不是在空体积处出现大峰或出现一系列多分散峰，后者通常提示蛋白发生错误折叠或不稳定。我们在纯化 ScBor1 的过程中提出了一个更为细致的问题。该蛋白能够大量纯化，并在 SEC 图谱中呈现良好且单分散的峰形，表明其可能是结构研究的理想候选目标。然而，我们的交联实验显示，纯化后的 ScBor1 为单体形式。尽管 ScBor1 在细胞内天然存在形式可能为单体&#160;，但已有研究表明 SLC4 转运蛋白及其同源蛋白通常以二聚体形式存在7,8,9,10。我们在完成 AtBor1 的结晶并解析其结构之后才建立了该交联实验。然而，若我们早先能够利用交联实验将 ScBor1 与 AtBor1 进行比较，则可能将宝贵的时间和研究资源重新导向 AtBor1 而非 ScBor1，因为后者最终未能成功获得可用于衍射实验的晶体。因此，该实验方法可帮助研究人员在开展结构研究时，区分不同同源蛋白或去垢剂的适用性，从而优先选择能够维持蛋白预期天然构象的实验条件。此外，该方法还可用于探究哪些氨基酸对多聚化至关重要，进而寻找破坏多聚化界面、导致蛋白形成强制性单体的氨基酸替换。此类策略已被用于研究膜转运蛋白同源多聚组装的功能意义16,17,18。
本方法的一个普遍优势在于，酵母已被证明能够表达多种功能各异且具有挑战性的膜蛋白1。此外，其低成本和较短的培养周期使其更易于被广泛的研究工作所采用，尤其适用于那些难以使用需要组织培养或昂贵培养基的表达策略的研究。本文所介绍的实验流程成本相对较低，可在一周内完成，突显了该方法的可行性。这些方案的实施有助于推动对其他难表达膜蛋白的结构与功能研究。

获得足量纯化膜蛋白的困难仍是开展受体、离子通道和转运蛋白结构与功能研究的关键瓶颈。目前已有多种方案用于&#160;中等高通量筛选流程用于筛选并鉴定表达水平足够高、可支持后续研究的候选膜蛋白 体外 研究1,2,3,4通常，蛋白质会与绿色荧光蛋白（GFP）在N端或C端进行融合标记，其表达水平可通过凝胶内荧光检测或荧光检测尺寸排阻色谱法（FSEC）进行监测。5此类方法可将膜蛋白候选对象分类为高表达蛋白、中等或低表达蛋白，以及表达极差或完全不表达的蛋白。当实验设计旨在筛选大量候选基因并选择表达效果最佳的蛋白时，该方法效果良好。然而，在某些情况下，实验需针对特定膜蛋白进行研究，若该蛋白表达水平处于中等或较低范围，则可能带来挑战。此外，在这些情况下，有时即使通过截短构建体、引入热稳定突变或密码子优化等方式对构建体进行改造，表达水平也仅能实现轻微提升。因此，针对表达水平仅为中等的膜蛋白，有时有必要对其表达与纯化方案进行优化。
SLC4 转运蛋白家族包括碳酸氢盐转运蛋白阴离子交换蛋白 1（又称 Band 3），这是红细胞中含量最丰富的膜蛋白6，也是细胞呼吸的关键驱动因子。SLC4 家族与植物中至关重要的硼酸盐转运蛋白具有同源性，且已有研究表明，硼酸盐转运蛋白在结构上与阴离子交换蛋白 1 以及钠离子偶联的 SLC4 转运蛋白相似7,8,9,10。本文报道了利用 S. cerevisiae 表达并纯化酵母和植物中三种不同硼酸盐转运蛋白的优化蛋白表达与纯化方案。我们详细阐述了为提高纯化产率和均一性所采取的关键优化步骤。此外，我们还报道了一种使用戊二醛的化学交联实验，用于在纯化的蛋白-去垢剂-脂质复合物体系中监测这些转运蛋白的多聚体组装状态。该交联实验可通过评估寡聚转运蛋白在纯化后的多聚体状态，帮助判断同源蛋白和去垢剂的适用性。
本方案假设目的转运蛋白已克隆至含有GAL1启动子诱导表达系统的2 µ质粒中，用于在S. cerevisiae中表达。在这些实验中，所使用的DNA编码了全长野生型硼酸盐转运蛋白：Saccharomyces cerevisiae Bor1（ScBor1）11、Arabidopsis thaliana Bor1（AtBor1）12和Oryza sativa Bor3（OsBor3）13。每个构建体的C末端均连接了一个10-His标签，并在转运蛋白与10-His标签之间插入了凝血酶切割位点，以便在需要时将其切除。本方案还假设该质粒已转化至缺乏组氨酸的完全补充选择性培养基（CSM）上的S. cerevisiae DSY-5表达菌株中。

<table><tbody><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>4-吗啉乙磺酸水合物（MES）</td><td>Acros</td><td>172591000</td><td></td></tr><tr><td>&amp;Auml;kta Pure 25 L FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>29018224</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 mL，50 kDa 分子量截留浓缩管</td><td>Millipore</td><td>UFC905024</td><td>用于浓缩镍柱洗脱组分</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 4 mL，50 kDa 分子量截留浓缩管</td><td>Millipore</td><td>UFC805024</td><td>用于浓缩 S200 洗脱组分</td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>BD Diagnostics</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>BD Diagnostics</td><td>288620</td><td></td></tr><tr><td>玻璃锥形瓶，2L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS44442L</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Sorvall</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>瓶顶滤器</td><td>Nalgene</td><td>595-4520</td><td>滤膜被移除后用于过滤玻璃珠</td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114391</td><td></td></tr><tr><td>不含组氨酸的完全补充混合物</td><td>Sunrise Science</td><td>1006-100</td><td></td></tr><tr><td>D-半乳糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RDD016</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，200 证明</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>凝胶电泳槽 SDS-PAGE 系统</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>玻璃珠破碎细胞裂解仪</td><td>BioSpec</td><td>1107900</td><td></td></tr><tr><td>玻璃珠，0.5 mm</td><td>BioSpec</td><td>11079105&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16019</td><td>以氮气保护的 8% 溶液形式提供</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap IMAC FF 柱，1 mL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0921-02</td><td>已负载镍离子</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Acros</td><td>12202</td><td></td></tr><tr><td>Instant Blue 蛋白染色液</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>JA-10 转子</td><td>Beckman</td><td>369687</td><td></td></tr><tr><td>JA-14 转子</td><td>Beckman</td><td>339247</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管，1.5 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>3451</td><td></td></tr><tr><td>制冷微量离心机</td><td>Fisher</td><td>13-100-676</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean Tris-甘氨酸凝胶，4-20%</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1096</td><td></td></tr><tr><td>Minipuls 3 蠕动泵</td><td>Gilson</td><td>F155005</td><td>用于将裂解液上样至亲和柱</td></tr><tr><td>n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）</td><td>Inalco</td><td>1758-1350</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镍六水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227676</td><td></td></tr><tr><td>带温度控制的轨道摇床培养箱</td><td>New Brunswick</td><td>C24</td><td></td></tr><tr><td>含硼酸转运蛋白插入片段的 p423 GAL1 质粒</td><td></td><td></td><td>可向作者索取</td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟（PMSF）</td><td>Acros</td><td>215740050</td><td></td></tr><tr><td>聚碳酸酯超速离心管</td><td>Beckman</td><td>355618</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯瓶，250 mL</td><td>Beckman</td><td>356011</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯瓶，500 mL</td><td>Beckman</td><td>355607</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Kaleidoscope 标准蛋白</td><td>Bio-Rad</td><td>1610375</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;S. cerevisiae&lt;/em&gt; 表达菌株 DSY-5</td><td></td><td></td><td>可向作者索取</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>带 0.2 &amp;micro;m 滤膜的离心柱，0.5 mL</td><td>Millipore</td><td>UFC30GV0S</td><td>用于蛋白上样 Superdex 200 柱前的过滤</td></tr><tr><td>无菌 Falcon 管，15 mL</td><td>Lab Depot</td><td>TLD431696</td><td></td></tr><tr><td>无菌 Falcon 管，50 mL</td><td>Lab Depot</td><td>TLD431698</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL 柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td>用于尺寸排阻层析（SEC）纯化</td></tr><tr><td>注射器滤器，5&amp;micro;m</td><td>Pall</td><td>4650</td><td>用于亲和柱上样前裂解液的过滤</td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Type 70 Ti 转子</td><td>Beckman</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Beckman</td><td>L8-70M</td><td></td></tr><tr><td>不含氨基酸的 YNB+氮源培养基</td><td>Sunrise Science</td><td>1501-500</td><td></td></tr></tbody></table>

真核生物硼酸盐转运蛋白的表达、增溶与纯化

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

溶质载体4（SLC4）蛋白家族被称为碳酸氢盐转运蛋白，其中包括典型的阴离子交换蛋白1（AE1，也称为Band 3），这是红细胞中含量最丰富的膜蛋白。SLC4家族与已在植物和真菌中鉴定的硼酸盐转运蛋白具有同源性。将膜转运蛋白以足够数量且均一的形式表达和纯化，用于&#160;结构或功能研究，仍是一项重大的技术挑战。本文详细描述了在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中过表达硼酸盐转运蛋白、分离酵母膜、使用去垢剂溶解蛋白，以及从酿酒酵母（S. cerevisiae）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sativa）中纯化硼酸盐转运蛋白同源物的具体步骤。我们还详细介绍了利用戊二醛交联实验检测同源多聚体转运蛋白多聚化的分析方法。本研究所建立的通用方法适用于上述三种蛋白，并已针对效率进行了优化。本文开发的许多策略也可用于其他难处理膜蛋白的研究。

对镍亲和层析洗脱组分进行的典型凝胶电泳结果显示，三种蛋白均得到部分纯化（图1A）。在蛋白分子量标准左侧的是裂解液，其中均未出现与硼酸盐转运蛋白相对应的显著条带，这是难以高效过表达蛋白的典型特征。80 mM 洗脱组分显示，即使在较高浓度咪唑条件下，10-His 标签蛋白的损失也极小。洗脱组分中可清晰观察到对应于硼酸盐转运蛋白的条带，将判定含有大部分洗脱蛋白的组分浓缩后，上样至 S200 凝胶过滤柱。在此阶段，蛋白纯度尚不足以满足多数下游应用的需求，如上样至 S200 柱前浓缩样品的凝胶所示，存在额外杂带（图1B）。然而，将样品上样至尺寸排阻柱后，可获得高纯度的洗脱组分（图1B-C）。文中展示了各硼酸盐转运蛋白的层析图谱及其对应的凝胶电泳结果。尽管亲和层析洗脱后的样品纯度中等，但经凝胶过滤柱洗脱后蛋白纯度显著提高。关键的是，层析图谱显示每种蛋白主要以单一单分散峰的形式洗脱，极少蛋白滞留在空体积中。稳定且正确折叠的蛋白通常呈现单一分散且对称的峰形，而不稳定、错误折叠或聚集的蛋白则通常表现为多个不对称峰或在空体积中出现大峰。ScBor1 每升酵母培养物最终可获得约 2 mg 纯化蛋白，AtBor1 和 OsBor3 每升培养物则分别获得约 1 mg 纯化蛋白。这些数值来源于 4–5 g 膜蛋白样品的一份等分试样，该膜蛋白样品来自原始细胞制备物的一半。
交联实验表明，可轻松评估在溶液中纯化的同源寡聚转运蛋白的组装状态（图2）。含有SDS预处理的样品旨在说明交联依赖于溶液中蛋白的折叠构象，因此当强变性剂破坏多聚状态时，交联不会发生。结果显示，在这些条件下用DDM纯化时，三种硼酸盐转运蛋白中的ScBor1并未形成二聚体，而另外两种AtBor1和OsBor3则发生交联并呈现二聚化。可见并非所有蛋白均能完全交联。在此例中，可观察到微量的OsBor3单体，而AtBor1则完全交联。交联程度取决于相邻赖氨酸残基的数量，也可能存在其他交联试剂可有效交联不同的膜蛋白。
<img alt="蛋白质纯化示意图；镍亲和层析、尺寸排阻色谱（SEC）结果、凝胶分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59166/59166fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1。三种硼酸盐转运蛋白的镍亲和层析与尺寸排阻色谱纯化。 每个垂直图组（A）、（B）和（C）分别展示 ScBor1、AtBor1 和 OsBor3 的数据。（A）镍亲和柱。M 为分子量标准蛋白标记物，左侧标注其分子量（kDa）。L 为粗裂解液，W 为 80 mM 咪唑洗涤液。其余编号泳道对应以 300 mM 咪唑洗脱的 1 mL 分段收集液。分段上方的横条表示被选中合并并浓缩后用于上柱的组分。（B）P 表示上 S200 柱前浓缩的蛋白样品。右侧为尺寸排阻色谱（SEC）洗脱组分，括号用于将凝胶泳道与（C）中的层析图谱组分对应。空隙体积出现在约 8 mL 略后位置。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59166/59166fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="SDS-PAGE 电泳结果；蛋白质条带；二聚体、单体鉴定；分子量标记。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59166/59166fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 2"> 
图 2．交联实验评估纯化的转运蛋白是否形成多聚体结构。 左侧显示了具有分子量标记的蛋白 ladder。所有泳道上方标明了所含蛋白质以及样品是否添加了戊二醛，或在添加戊二醛前是否经 SDS 预处理。箭头指示 AtBor1 和 OsBor3 的单体与二聚体位置。ScBor1 是比 AtBor1 和 OsBor3 更小的蛋白质，其迁移位置符合预期。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59166/59166fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

本文介绍了一种利用酵母表达、增溶并纯化多种与SLC4转运蛋白家族具有同源性的真核生物硼酸盐转运蛋白的实验方案。我们还描述了一种化学交联实验，用于检测纯化的同源多聚体蛋白的多聚化组装情况。这些方案可适用于其他难处理的膜蛋白。

溶质载体4（SLC4）蛋白家族被称为碳酸氢盐转运蛋白，包括典型的阴离子交换蛋白1（AE1，也称……）

获得足量的膜蛋白以用于下游应用仍然是一个重大的技术挑战。本方案可实现多种膜转运蛋白的均一性纯化。该技术的一个关键优势在于，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一种高效且经济的真核表达系统，适用于膜蛋白的表达，并允许对多个关键实验变量进行优化。首先，在50毫升不含组氨酸的完全补充选择性培养基中接种三个转化的酵母菌落，培养基中添加酵母氮碱和2%葡萄糖，于30摄氏度、190转/分钟条件下过夜培养。次日取出培养物。使用分光光度计测定600纳米处的光密度（OD 600）。将四个装有500毫升培养基的2升锥形瓶分别接种，使初始OD 600为0.01。随后在30°C、190转/分钟的摇床中培养30小时，使细胞耗尽葡萄糖并生长至高密度。为诱导硼酸盐转运蛋白表达，加入125毫升5倍浓度的酵母胨培养基，补充10%半乳糖，在30摄氏度、190转/分钟条件下培养16小时。然后通过离心收集酵母细胞，并将沉淀重悬于100毫升冷水中。涡旋振荡以重悬酵母沉淀，并依次转移溶液，对所有含有沉淀的瓶子进行相同操作。为了收获酵母膜，首先向重悬的细胞中加入 11.25 毫升 1 摩尔 Tris、0.45 毫升 0.5 摩尔 EDTA 和 2.25 毫升 100 毫摩尔 PMSF。加水至终体积为 225 毫升，并将细胞转移至一个 450 毫升的金属珠击破碎罐中。用冷的 0.5 毫米玻璃珠补足剩余体积，并将珠击破碎室与转子组装在一起。将样品室浸入冰浴中，进行六次一分钟的脉冲处理，每次脉冲之间间隔两分钟以防止裂解液过热。最后一次脉冲结束后，从拧在玻璃瓶上的塑料一次性瓶顶滤器中取出滤膜，将珠磨室中的内容物倒入滤器组件中，同时施加真空。然后加入两倍体积的珠子洗涤缓冲液，先加入样品室中涡旋混匀，再加入珠子中进行冲洗。用225毫升洗涤缓冲液冲洗珠磨腔，并用腔内液体洗涤珠子。通过离心收集裂解液，将上清液倾入聚碳酸酯瓶中，用于超速离心以收集膜组分。超速离心结束后，弃去上清液，称量含有膜沉淀的瓶子，然后将膜重新悬浮于约35毫升膜重悬缓冲液中。将悬浮液加入玻璃Dounce匀浆器中，然后对膜进行Dounce匀浆，并将匀浆液分装至50毫升锥形管中，于负80摄氏度保存。称量空离心瓶的质量，以确定收获的膜的质量。进行蛋白溶解与纯化时，将一个搅拌子以及每克膜加入150毫克DDM，置于冰上烧杯中，将解冻的膜重悬于终体积为15毫升的膜重悬缓冲液中，缓冲液中需添加每克膜1毫摩尔PMSF和20毫摩尔咪唑。将膜溶液加入烧杯中，在冰浴条件下搅拌一小时。随后进行离心，以沉淀未溶解的物质。在4摄氏度的冷室中，将上清液通过5微米的注射器滤膜过滤，并使用蠕动泵以每分钟1毫升的流速将样品加载到1毫升的固定化镍亲和柱上。然后，用10倍柱体积的洗涤缓冲液洗涤柱子，并用洗脱缓冲液稀释蛋白质。将洗脱液收集为十个一毫升的组分。将收集的制备凝胶组分、溶解的裂解液以及洗涤组分一同在室温下进行4%至20% Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶电泳。将收集到的峰值洗脱组分在台式离心机中，于4°C条件下，使用截留分子量为50 kDa的浓缩器浓缩至500 µL或更小体积。通过0.2 µm离心柱滤膜过滤浓缩后的蛋白质，然后将滤液上样至预先用S-200缓冲液平衡好的尺寸排阻色谱柱中。在第二次运行4%至20% Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶电泳分离峰组分后，对凝胶进行染色，并收集纯化的峰组分，使用50千道尔顿截留分子量的浓缩管在4摄氏度下进行浓缩，操作方法如前所述。随后，在280纳米波长下测定蛋白质样品的吸光度，以确定其浓度，然后将样品长期保存于-80摄氏度。为进行戊二醛交联实验，首先将3微升S-200缓冲液中含0.5毫克/毫升的解冻蛋白加入到5微升S-200缓冲液中。通过加入一微升20%十二烷基硫酸钠和一微升1.5%戊二醛完成阴性对照反应。通过加入一微升水和一微升1.5%戊二醛完成实验样品反应。室温反应30分钟后，加入五微升3x SDS-PAGE上样缓冲液（含有过量Tris缓冲液以淬灭戊二醛），终止反应，并将全部15微升溶液上样至4%–20% Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶中。然后，在染色前以 200 伏电压电泳 30 分钟，以确定二聚体交联的程度，表现为一条迁移位置为变性单体两倍大小的条带。将染色液加入凝胶后，在慢速旋转摇床上振荡染色。此处展示的是镍亲和层析洗脱组分的典型凝胶结果，显示三种部分纯化的蛋白质，而裂解液组分中未出现与硼酸盐转运蛋白相对应的显著条带，这符合那些不易高效过表达的蛋白质的预期结果。每个凝胶中的毫摩尔洗涤泳道显示，尽管十组氨酸标签蛋白的初始浓度相对较高，其损失仍极小。而对应于硼酸盐转运蛋白的条带在洗脱组分中清晰可见。在注入S200柱之前，由于各样品中存在额外的条带，表明蛋白质纯度尚不足以满足许多后续应用的要求。然而，在将其注入尺寸排阻色谱柱后，可观察到高纯度的洗脱组分。交联实验表明，纯化的同源寡聚转运蛋白在溶液中的组装状态可被快速评估，且交联程度取决于相邻赖氨酸残基的数量。需要注意的是，一旦开始收集细胞，蛋白质必须始终在低温条件下操作，可置于冰上并在4°C的房间中进行，或保存在冷藏柜中。通过该方法，可进一步利用生物物理、生物化学或结构学方法（包括X射线晶体学或冷冻电子显微镜技术）对膜蛋白进行表征。这些技术能够纯化出毫克量级的均一蛋白，已被用于解析拟南芥（Arabidopsis thaliana）一种转运蛋白的晶体结构。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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