מזין ללא עיבוד, התרבות Passaging של תאים שב"ס האדם באמצעות נוקאאוט השלם החלפת סרום מזין ללא בינוני

המטרה הכוללת של הליך זה היא להתאים ולתחזק תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם לתרבית ללא הזנה באמצעות החלפת סרום נוקאאוט מלאה, מדיום ללא מזין. זה מושג על ידי הכנה ראשונה של צלחות מצופות ג'לט, TRX או התחלת תאים. השלב השני של ההליך הוא להעביר את ה-IPS שלך מ-MEFs למדיום נטול מזין באמצעות שטח דיסק.

השלב האחרון של ההליך הוא שמירה מתמדת על מזין תאי ה-IPS שלך חופשי. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות צמיחת תאים וגזע דומים שנמצאו בתרביות מת' באמצעות צביעה חיסונית עם סמנים פלוריפוטנטיים. היי, אני קייט וגנר באתר המשותף של GIB ב-Life Technologies.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות הוא שאתה יכול לחסוך זמן ולהגביר את העקביות בתרבית התאים שלך כאשר אתה משתמש בהחלפת סרום נוקאאוט לאורך כל זרימת העבודה שלך. כיום משפחת מוצרי הנוקאאוט כוללת רשימה מלאה של מדיה וריאגנטים לתנאים מבוססי מזין, ללא מזין וללא קסנו עבור תאי גזע עובריים אנושיים, תאי גזע עובריים של עכברים ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים. ניתן להשתמש ב-KSR לצמיחת נגזרות, הרחבה, שימור בהקפאה ושלבי הבידול הראשוניים.

הסרטון הבא יראה לך התאמה ואריזה של התאים שלך באמצעות KSR בתנאים ללא מזין. כלי תרבית מצופים ג'ל TRX נדרשים להתאמה ואריזה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם בתנאים נטולי מזין יום אחד לפני הכנת הכלים המצופים הללו, יש להפשיר שפופרת אחת של ג'ל TRX לאט על ידי השארתו במקרר למשך הלילה למחרת, לדלל את השפופרת של ג'ל TRX אחד ל-100 במדיום בסיסי על ידי העברת מיליליטר אחד של ג'ל רקס לבקבוק המכיל 99 מיליליטר בזאלי בינוני. מערבבים את התמיסה בעדינות.

אנו ממליצים להשתמש בנוקאאוט D-M-E-M-F 12 כמדיום בסיסי, אך אנא עיין בטקסט הפרוטוקול לאפשרויות אחרות. מכסים את כל פני השטח של כל צלחת תרבות בתמיסת ג'ל רקס. לכל מנה של 60 מילימטר מוסיפים 1.5 מיליליטר תמיסת טרק ג'ל.

דגרו את הכלים למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס. ניתן לעטוף צלחות נוספות בבושם ולאחסן במקרר עד ארבעה שבועות. ניתן להקצות ולאחסן ג'ל TRX מדולל נוסף במינוס 20 עד מינוס 80 מעלות צלזיוס, אך יש להימנע ממחזורי הפשרה מרובים בהקפאה לפני השימוש.

העבירו את הכלים המצופים ג'ל TRX ללימון או קולט אדים והניחו להם להתייצב לטמפרטורת החדר. בנוסף, הכינו את כל הריאגנטים הנדרשים האחרים וודאו שכל המדיה מאוזנת ל-37 מעלות צלזיוס וגז כראוי. להתאים IPCs אנושיים למדיום ללא הזנה תרבית ראשונה.

ה-IPSC נמצא על תאי הזנה של מת' עד שהם מתכנסים ל-70 עד 80%. שואבים את המדיום מכל צלחת תרבית של 60 מילימטר ומוסיפים כמות מתאימה של תמיסת דיספה, שהיא מיליליטר אחד. במקרה זה, דגרו את הכלים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש עד חמש דקות.

שאפו את תמיסת הדיספה מכל צלחת תרבית ושטפו את תאי הזנת המת' בעדינות עם DPBS פעמיים עד שלוש. לאחר מכן, הוסף כמות מתאימה של מדיום תחליף סרום מלא לכל מנת תרבית. בעזרת מגרד תאים מגרדים בעדינות את התאים מעל פני המנה.

אוספים את תרחיף התאים מכל מנה לצינורות חרוטיים נפרדים של 15 מיליליטר. שטפו כל צלחת תרבית בכמות מתאימה של מדיום תחליף סרום מלא והוסיפו את מדיום השטיפה לצינורות החרוטיים של 15 מיליליטר המכילים את צנטריפוגת תרחיף התאים. הצינורות החרוטיים של 15 מיליליטר ב-200 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לגלול את התאים.

לאחר הצנטריפוגה, שאפו בזהירות והשליכו את הסופרנט מבלי להפריע לכדור התא. החלק בעדינות את הצינור כדי לעקור לחלוטין את כדור התא מתחתית הצינור. הוסף כמות מתאימה של תחליף סרום מלא, מדיום ללא מזין בהתאם ליחס הפיצול הרצוי.

ולהשעות בעדינות את הגלולה. אל תשבור את גושי התאים לגודל קטן יותר מכיוון שהגושים הקטנים יותר אינם מתחברים היטב למשטח. שאפו כל שאריות תמיסת ג'ל TRE מכלי התרבית המצופים בג'ל רקס שהוכנו קודם לכן והוסיפו לאט כמות מתאימה של תרחיף תאים לכל צלחת תרבית.

הזיזו את צלחת התרבית קדימה ואחורה ומצד לצד מספר פעמים כדי לפזר את התאים על פני המנה. הניחו בעדינות את כלי התרבות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם אווירה לחה של ארבעה עד 6% CO2 בשגיאת אוויר. החלף את המדיום המושקע מדי יום לאחר מכן עד שהתאים הופכים לכ-70 עד 80% מתלכדים.

כאשר תאי הגזע הפלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם מגדלים תחליף סרום מלא, מדיום נטול מזין הם 70 עד 80% מתלכדים, הם מוכנים להיות תת-תרבית. אם יש תאים מובחנים, הסר אותם לפני האריזה. שאפו את המדיום המושקע מכלי התרבות של 60 מילימטר בעזרת פיפטה ושטפו את התאים פעמיים.

עם DPBS הוסף בעדינות מיליליטר אחד של תמיסה מבוססת דיסק חם מראש לצלחת התרבות. סובבו את צלחת התרבות לציפוי כל שטח התא. דגרו את התרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש עד חמש דקות.

לאחר מכן, שאפו את תמיסת החלל ושטפו בעדינות את התאים פעמיים עם DPBS, הוסיפו תחליף סרום מלא, מדיום ללא מזין וגרדו בעדינות את התאים מעל פני צלחת התרבית. בעזרת מגרד תאים מעבירים את התאים לצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מיליליטר. יש לשטוף את צלחת התרבות פעמיים עם תחליף סרום מלא.

מדיום ללא מזין מרסס בעדינות את כל התאים שלא התנתקו. משוך את המדיום משתי השטיפות עם התאים בצינור של 15 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינור ב-200 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לגלול את התאים מבלי להפריע לכדור התא.

שאפו בזהירות והשליכו את הסופרנטנט. החלק בעדינות את הצינור כדי לעקור לחלוטין את כדור התא מתחתית הצינור. יש להשעות בעדינות את התאים בהחלפת סרום מלאה.

מדיום ללא מזין באמצעות פיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר. אל תשלש. מעבירים את התאים לתבנית טרייה בציפוי ג'ל TRX בגודל 60 מילימטר ביחס הפיצול הרצוי.

הזיזו את צלחת התרבית קדימה ואחורה ומצד לצד מספר פעמים כדי לפזר את התאים על פני השטח שלה. הניחו את צלחת התרבות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם אווירה לחה של ארבעה עד 6% פחמן דו חמצני באוויר למחרת. החלף בעדינות את המדיום המושקע בהחלפת סרום מלאה.

הזנה של מדיום חופשי להסרת פסולת תאים. החלף את המדיום שהוצא כל יום לאחר מכן. תמונת ניגודיות פאזה זו מציגה תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם הגדלים על צלחות תרבית מצופות ג'ל TRX תוך שימוש בתחליף סרום מלא, מדיום ללא מזין.

ה-IPC מציג מורפולוגיה הדומה לתאי גזע עובריים אנושיים המאופיינים בגרעינים גדולים וצביעה דלה של אימונוס ציטופלזמה מראה כי IPC מתורבת עם מדיום החלפת סרום נוקאאוט בתוספת קוקטייל גורם הגדילה, ביטא את הסמנים הפלוריפוטנטיים, OCT 4 ו-SSEA 4. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להתאים ולתחזק את ה-IPCs שלך והחלפת סרום נוק-אאוט, תנאים ללא מזין. אז זהו.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.