使用胚体冰冻切片分析的多能干细胞
2010年12月8日
多能干细胞悬浮液中生长分化成胚状体（EBS）。在这里，我们展示了如何获得高品质的EB冰冻切片，用于研究胚胎发育的细胞和分子方面，同时保留其作为集合体的组织。
第一部分，引言。嗨，我是 Rafael。我是巴西里约热内卢联邦大学 Stevens Hans 教授实验室的博士后。
嗨，我是 Ismail。我是一名研究助理，也是教授。在本视频中，我们将展示如何准备 Android 正文的清晰部分。
那么让我们开始吧。第二部分，材料和设备。对于此程序，我们需要用于冷冻标本的包埋介质。
4% 多聚甲醛溶液用于固定细胞，蔗糖溶液用于冷冻保护。尖端略微弯曲的针头、用于更好地观察 EBS 的体视显微镜和摇床。第三部分。
在这里，人类胚胎体在非贴壁培养板中培养。使用移液器，我们将所有胚胎体尽可能靠近地分组，以便将它们转移到 15 毫升锥形管中。EBS 被小心地收集并转移到试管中。
收集所有 EBS 很重要，因为没有大量的材料 EBS 倾析后，培养基被小心丢弃。您应该能够在试管底部看到沉淀。现在我们可以进行固定程序。
EBS 将固定在 PBS 或磷酸盐缓冲盐水中的 4% 多聚甲醛溶液中。用 PFA 溶液重悬沉淀物很重要。然后将 EBS 固定在固定液中 30 分钟。
固定后，小心地去除 PFA 溶液。注意避免 Resus 悬浮 EBS 并替换为 PBS 中的 10% 蔗糖溶液以启动对 EBS 的冷冻保护，将材料在该溶液中保存 30 分钟。接下来，我们小心地去除 10% 蔗糖溶液，并将 EBS 重悬于 20% 蔗糖溶液中。
同样，EBS 在此解决方案中保留 30 分钟。最后，去除 20% 蔗糖溶液，用 PBS 溶液中的 30% 蔗糖溶液代替，再放置 30 分钟。现在我们可以继续进行 ebs 的定向和阻塞。
在我们的实验室中，我们使用空的胶囊壳作为模具。对于阻塞 ebs，重要的是在收集 ebs 之前用蔗糖溶液涂覆尖端的内壁。现在我们可以小心地收集 EBS 并等待它们倒出到吸头底部。
接下来，将 EBS 放置在块的中心。这应该是 EBS 在区块内的最终位置。在立体显微镜和细头的帮助下，我们收集并排出尽可能多的蔗糖溶液。
始终注意不要收集 ebs。使用尖端略微弯曲的针头，所有 EBS 都位于模块的中心。最后，用滤纸片收集剩余的蔗糖溶液。
EBS 在数据块中的具体位置对于获得高质量的切片非常重要。以下是 shell 内 EB 定位不佳的示例。定位 EBS 并去除蔗糖溶液后，从边缘开始用 OCT 填充外壳，同时始终注意避免 Resus 悬浮 EBS。
使用移液管去除剩余的气泡，并将外壳搅拌 15 分钟。激越后。OCT 区块被冻结在干冰中。
此时，您可以将包裹在铝箔中的块存放在零下 80 摄氏度进行进一步分析，或者继续进行低温恒温器第四部分，切割。要制作冷冻切片，您需要一次性或永久性刀片、OCT 和聚 L 赖氨酸预处理的载玻片。将 OCT 块从冰箱中取出并保存在低温恒温器内，直到达到零下 20 摄氏度。
然后将块放置在支架上，并与 Blade 的边缘平行对齐。EB 样品比大多数其他组织样品小得多，因此确保块的整个表面同时接触刀片非常重要，从而最大限度地减少材料损失。定位后，将块状物切成 10 微米的切片，然后直接收集到载玻片上。
玻片可以储存，最好在零下 70 摄氏度，也可以在同一天使用。该材料可进行免疫组化或免疫荧光染色。结论。本文描述的方法提供了一种相当便宜且易于遵循的方案，以获得从人 H 9 或小鼠 US P one 干细胞谱系发育的胚胎体的薄低温恒温器切片。
所得冷冻切片可用于多种程序，以分析蛋白质表达或 EB 形态。
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概述
本文展示了从悬浮培养的多能干细胞获得高质量胚胎体（EBs）冷冻切片的过程。这些冷冻切片对于研究胚胎发生的细胞和分子方面非常重要，同时保持了EBs的组织结构。
关键研究组成部分
科学领域
- 干细胞生物学
- 胚胎发生
- 细胞分化
背景
- 多能干细胞可以分化为多种细胞类型。
- 胚胎体是模仿早期胚胎发育的聚集体。
- 研究EBs有助于理解胚胎发生的机制。
- 高质量的冷冻切片对于详细分析至关重要。
研究目的
- 提供一种准备EBs冷冻切片的方法。
- 促进对分化过程中细胞和分子过程的研究。
- 在分析中保持EBs的结构组织。
使用的方法
- 多能干细胞在悬浮培养中的制备。
- 诱导分化为胚胎体。
- 获得高质量样本的冷冻切片技术。
- 分析EBs的细胞和分子特性。
主要结果
- 成功制备EBs的冷冻切片。
- 冷冻切片中EBs组织结构的保留。
- 在细胞水平上研究胚胎发生的能力得到增强。
- 展示的方法可以应用于各种研究背景。
结论
- 该方法允许对EBs进行详细分析。
- 高质量的冷冻切片对胚胎研究很有价值。
- 这种方法可以推进对干细胞分化的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-quality cryosectioning of embryoid bodies (EBs) derived from pluripotent stem cells enables precise spatial analysis of differentiation markers and tissue organization, supporting early discovery and target validation in regenerative medicine and developmental biology. This capability enhances predictive confidence in stem cell-based models and informs risk-adjusted decisions at key inflection points in the discovery pipeline. Reliable EB cryosections facilitate cross-functional data integration for portfolio advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of pluripotency and lineage-specific marker expression within three-dimensional EB structures.
- Supports biological de-risking by clarifying differentiation pathways and cellular heterogeneity.
- Provides spatial context for functional target validation in stem cell-derived systems.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of standardized EB cryosections for reproducible immunofluorescence and in situ hybridization assays.
- Enables quantitative assessment of protein and RNA distribution across EB sections.
- Supports assay scalability and platform reuse for compound screening in stem cell models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro differentiation with in vivo developmental processes for disease-relevant modeling.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by preserving EB architecture and marker localization.
- Provides mechanistic insights that inform translational biomarker strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This cryosectioning method integrates into the discovery continuum from early stem cell differentiation studies through assay development and preclinical model validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on pluripotency and lineage commitment within EBs.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for marker expression and tissue organization.
- Analytics: Enables spatially resolved measurements for comparative analysis of differentiation conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with in vivo developmental relevance when supported by marker expression patterns.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for EB analysis applicable across multiple stem cell lines and differentiation protocols.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in stem cell differentiation and target validation.
- Operational Value: Standardizes EB sectioning for reproducible downstream analyses.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust spatial and molecular data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of stem cell-based discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryosectioning and handling of delicate three-dimensional cell aggregates.
- Needs access to cryostats, embedding media, and imaging infrastructure for downstream analysis.
- Demands cross-team standardization of EB preparation and sectioning protocols.
- Adaptable to various pluripotent stem cell lines and differentiation models with attention to EB size and morphology.
- Dependent on careful orientation and embedding to ensure high-quality, interpretable sections.
