使用胚体冰冻切片分析的多能干细胞

第一部分，引言。嗨，我是 Rafael。我是巴西里约热内卢联邦大学 Stevens Hans 教授实验室的博士后。

嗨，我是 Ismail。我是一名研究助理，也是教授。在本视频中，我们将展示如何准备 Android 正文的清晰部分。

那么让我们开始吧。第二部分，材料和设备。对于此程序，我们需要用于冷冻标本的包埋介质。

4% 多聚甲醛溶液用于固定细胞，蔗糖溶液用于冷冻保护。尖端略微弯曲的针头、用于更好地观察 EBS 的体视显微镜和摇床。第三部分。

在这里，人类胚胎体在非贴壁培养板中培养。使用移液器，我们将所有胚胎体尽可能靠近地分组，以便将它们转移到 15 毫升锥形管中。EBS 被小心地收集并转移到试管中。

收集所有 EBS 很重要，因为没有大量的材料 EBS 倾析后，培养基被小心丢弃。您应该能够在试管底部看到沉淀。现在我们可以进行固定程序。

EBS 将固定在 PBS 或磷酸盐缓冲盐水中的 4% 多聚甲醛溶液中。用 PFA 溶液重悬沉淀物很重要。然后将 EBS 固定在固定液中 30 分钟。

固定后，小心地去除 PFA 溶液。注意避免 Resus 悬浮 EBS 并替换为 PBS 中的 10% 蔗糖溶液以启动对 EBS 的冷冻保护，将材料在该溶液中保存 30 分钟。接下来，我们小心地去除 10% 蔗糖溶液，并将 EBS 重悬于 20% 蔗糖溶液中。

同样，EBS 在此解决方案中保留 30 分钟。最后，去除 20% 蔗糖溶液，用 PBS 溶液中的 30% 蔗糖溶液代替，再放置 30 分钟。现在我们可以继续进行 ebs 的定向和阻塞。

在我们的实验室中，我们使用空的胶囊壳作为模具。对于阻塞 ebs，重要的是在收集 ebs 之前用蔗糖溶液涂覆尖端的内壁。现在我们可以小心地收集 EBS 并等待它们倒出到吸头底部。

接下来，将 EBS 放置在块的中心。这应该是 EBS 在区块内的最终位置。在立体显微镜和细头的帮助下，我们收集并排出尽可能多的蔗糖溶液。

始终注意不要收集 ebs。使用尖端略微弯曲的针头，所有 EBS 都位于模块的中心。最后，用滤纸片收集剩余的蔗糖溶液。

EBS 在数据块中的具体位置对于获得高质量的切片非常重要。以下是 shell 内 EB 定位不佳的示例。定位 EBS 并去除蔗糖溶液后，从边缘开始用 OCT 填充外壳，同时始终注意避免 Resus 悬浮 EBS。

使用移液管去除剩余的气泡，并将外壳搅拌 15 分钟。激越后。OCT 区块被冻结在干冰中。

此时，您可以将包裹在铝箔中的块存放在零下 80 摄氏度进行进一步分析，或者继续进行低温恒温器第四部分，切割。要制作冷冻切片，您需要一次性或永久性刀片、OCT 和聚 L 赖氨酸预处理的载玻片。将 OCT 块从冰箱中取出并保存在低温恒温器内，直到达到零下 20 摄氏度。

然后将块放置在支架上，并与 Blade 的边缘平行对齐。EB 样品比大多数其他组织样品小得多，因此确保块的整个表面同时接触刀片非常重要，从而最大限度地减少材料损失。定位后，将块状物切成 10 微米的切片，然后直接收集到载玻片上。

玻片可以储存，最好在零下 70 摄氏度，也可以在同一天使用。该材料可进行免疫组化或免疫荧光染色。结论。本文描述的方法提供了一种相当便宜且易于遵循的方案，以获得从人 H 9 或小鼠 US P one 干细胞谱系发育的胚胎体的薄低温恒温器切片。

所得冷冻切片可用于多种程序，以分析蛋白质表达或 EB 形态。