Name: 使用胚体冰冻切片分析的多能干细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: 学习制备多能干细胞来源胚体的高质量冰冻切片技术。该方法保留胚体组织结构，适用于细胞与分子水平的胚胎发育研究，为干细胞分化机制分析提供可靠工具。

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本工作由里约热内卢州研究支持基金会（FAPERJ）、国家科学技术发展委员会（CNPq）和国家科学与技术研究所（INCTC）提供资助。我们感谢 Bruna S. Paulsen 和 Aline M. Fernandes 提供的 EB 图像。

1. 固定与冷冻保存
将多能干细胞培养在经丝裂霉素C灭活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）上，并在添加20%敲除血清替代物（KSR）和8 ng/mL成纤维细胞生长因子（FGF-2）的DMEM/F12培养基中维持培养。为了诱导拟胚体（EB）形成，将H9细胞转移至非黏附培养皿中，在添加15% KSR的DMEM/F12培养基中培养7天8。 
注意（!）：该技术可用于来源于任何胚胎干细胞和诱导性多能干细胞的拟胚体。
<ol>
	<li>用移液器从培养皿中收集拟胚体（EBs）。</li>
	<li>将拟胚体转移至15 mL锥形管中，静置直至材料沉降至管底。</li>
	<li>移除培养基，并用含4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液在室温下固定拟胚体30分钟。 注意（!）：对于 原位 为避免因使用PFA而导致与抗体发生交联反应，应进行杂交抗原修复。6,7.</li>
	<li> 去除PFA溶液，用PBS洗涤5分钟。</li>
	<li>EBs 应置于 PBS 缓冲的蔗糖溶液（依次为 10%、20% 和 30%）中进行梯度脱水，温度为 25–28°C，每种浓度溶液每隔 30 分钟更换一次。处理后的样品可保存在 30% 蔗糖溶液中，置于 4°C，直至进行 OCT 包埋。</li>
</ol>
2. 组织包埋、引导与冷冻
<ol start="6">
	<li>小心从离心管中收集胚胎体（EBs），尽可能排出蔗糖溶液。 注意 (!)：在收集胚胎体（EBs）前，务必用蔗糖溶液润湿移液枪头的内壁。此步骤可防止胚胎体粘附在枪头上。</li>
	<li>将胚胎体（EBs）放入模具中，并用滤纸吸除残留的蔗糖溶液。 注意 (!)：放置胚胎体（EBs）时切勿过量填充模具，以免发生重叠。</li>
	<li>缓慢向模具中加入OCT包埋剂，注意避免重新悬浮胚胎体（EBs）。随后，将所有胚胎体（EBs）调整至模具中央，并用移液枪去除气泡。</li>
	<li>轻轻振荡15分钟。</li>
	<li>用粉碎的干冰包围模具，以冻结样品。OCT应完全冻结。此时，样本块可在-70°C下保存，至少一年。</li>
</ol>
3. 冷冻切片技术
<ol start="11">
	<li>从 -70°C 取出冷冻组织块，置于已预冷至 -18 至 -21 °C 的冷冻切片机中。 注意 (!)：超出此温度范围可能导致切片卷曲、融化或开裂等问题。</li>
	<li>将 OCT 包埋块从模具中取出，并通过添加更多 OCT 将其固定于冷冻切片机的样品台上。</li>
	<li>正确放置组织块的方向并使其与刀刃边缘平行至关重要。 注意 (!)：由于胚胎体（EBs）比其他组织样本更小，此步骤对最大限度减少样本损失极为重要。</li>
	<li>应先对 OCT 包埋块进行表层切削，直至获得平整的切面。随后切取组织样本的薄片（10 μm），并转移至预先涂有 200 mg/mL 多聚-L-赖氨酸（每张载玻片 10 μL）的玻璃载片上 9,10。 注意 (!)：为避免切片撕裂，请仔细检查刀片是否有损伤。</li>
	<li>所有切片应在室温下空气干燥 1 小时，之后可立即使用或于 -70°C 保存至使用前。</li>
</ol>

<ol><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-117 (1998).</li>
<li>Itskovitz-Eldor, J., Schuldiner, M., Karsenti, D., Eden, A., Yanuka, O., Amit, M., Soreq, H., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+compromising+the+three+embryonic+germ+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers.</a> Mol Med. 6, 88-95 (2000).</li>
<li>Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+inducing+embryoid+body+formation%3A+in+vitro+differentiation+system+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells.</a> J Biosci Bioeng. 103, 389-398 (2007).</li>
<li>Conley, B. J., Young, J. C., Trounson, A. O., Mollard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+propagation+and+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation propagation and differentiation of human embryonic stem cells.</a> Int J Biochem Cell Biol. 36, 555-567 (2004).</li>
<li>Moon, I. S., Cho, S. J., Jin, I., Walikonis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+combined+fluorescence+in+situ+hybridization+and+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cells%22%5BJournal%5D)">A simple method for combined fluorescence in situ hybridization and immunocytochemistry.</a> Mol Cells. 24, 76-82 (2007).</li>
<li>Daneshtalab, N., Doré, J. J., Smeda, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troubleshooting+tissue+specificity+and+antibody+selection%3A+Procedures+in+immunohistochemical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 61, 127-135 (2009).</li>
<li>Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+antigen+retrieval+for+immunohistochemical+reactions+in+routinely+processed+paraffin+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections.</a> Methods Mol Biol. , 588-5103 (2010).</li>
<li>Nones, J., Spohr, T. C., Furtado, D. R., Sartore, R. C., Paulsen, B. S., Guimarães, M. Z., Rehen, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoids+modulate+cell+survival+in+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">Cannabinoids modulate cell survival in embryoid bodies.</a> Cell Biol Int. 12, 399-408 (2010).</li>
<li>Huang, W. M., Gibson, S. J., Facer, P., Gu, J., Polak, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+section+adhesion+for+immunocytochemistry+using+high+molecular+weight+polymers+of+L-lysine+as+a+slide+coating%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Improved section adhesion for immunocytochemistry using high molecular weight polymers of L-lysine as a slide coating.</a> Histochemistry. 77, 275-279 (1983).</li>
<li>Kuenzi, M. J., Sherwood, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+localization+of+specific+relaxin-binding+cells+in+thecervix%2C+mammary+glands%2C+and+nipples+of+pregnant+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical localization of specific relaxin-binding cells in thecervix, mammary glands, and nipples of pregnant rats.</a> Endocrinology. 136, 1367-1373 (1995).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本文所述方法提供了一种简单易行的方案，用于制备经PFA固定的类胚体薄冰冻切片，适用于免疫荧光和原位杂交检测。所得冰冻切片可在保持类胚体聚集体结构和组织形态的前提下，用于研究人类胚胎干细胞分化的细胞与分子特征。

<table><tbody><tr><td>D (+) 蔗糖</td><td>试剂</td><td>Vetec</td><td>228</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>试剂</td><td>Rieden-de Ha&amp;#235;n</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>PBS 溶液</td><td>试剂</td><td>LGC Biotecnology</td><td>13-30259.05</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸氢溴酸盐</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td>200mg/mL 水溶液</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂</td><td>试剂</td><td>Sakura Finetek</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖溶液</td><td>试剂</td><td></td><td></td><td>10% 蔗糖溶液（PBS 配制，w/v）</td></tr><tr><td>蔗糖溶液</td><td>试剂</td><td></td><td></td><td>20% 蔗糖溶液（PBS 配制，w/v）</td></tr><tr><td>蔗糖溶液</td><td>试剂</td><td></td><td></td><td>30% 蔗糖溶液（PBS 配制，w/v）</td></tr><tr><td>锥形管</td><td>工具</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91015</td><td>15 mL 锥形管</td></tr><tr><td>平板摇床</td><td>工具</td><td>Biomixer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>工具</td><td>Leica Microsystems</td><td>CM 1850</td><td></td></tr><tr><td>OCT 平台模具</td><td>工具</td><td></td><td></td><td>塑料模具平台</td></tr></tbody></table>

通过胚胎体冰冻切片分析多能干细胞

Analysis of Pluripotent Stem Cells by using Cryosections of Embryoid Bodies

胚胎干细胞（ES细胞）是来源于囊胚期早期哺乳动物胚胎内细胞团的多能细胞1。ES细胞分化过程中的一个关键阶段是类胚体（EBs）聚集体的形成2, 3。当ES细胞在非黏附培养板中培养时，可自发聚集形成EB。三维结构的EB可模拟早期哺乳动物胚胎发生的多个方面，并分化为三个胚层：外胚层、中胚层和内胚层4。
免疫荧光和原位杂交是广泛用于检测组织切片中细胞内目标蛋白和 mRNA 的常用技术5, 6, 7。本文介绍一种简便的方法，用于制备高质量的类胚体（embryoid bodies, EB）冷冻切片。该方法依赖于将 EB 在 OCT 包埋剂中进行空间定向包埋，随后进行冷冻切片。所得切片可适用于多种分析程序，以表征含有特定蛋白、RNA 或 DNA 的细胞群体。在此意义上，制备 EB 冷冻切片（10μm）是组织学染色分析（如苏木精-伊红染色、DAPI）、免疫荧光（如 Oct4、nestin）或原位杂交的关键工具。该技术还有助于理解与类胚体三维球形结构维持相关的胚胎发育过程。

多能干细胞在悬浮培养中可分化形成类胚体（EBs）。本文展示了如何获得高质量的类胚体冷冻切片，这些切片可用于研究胚胎发生过程中的细胞和分子特征，同时保持其作为细胞聚集体的原有结构。

胚胎干细胞（ES 细胞）是从囊胚期早期哺乳动物胚胎的内细胞团中分离得到的多能性细胞1。一个关键阶段是……

第一部分，引言。大家好，我叫Rafael，是巴西里约热内卢联邦大学Stevens Hans教授实验室的一名博士后。大家好，我叫Ismail。我是一名研究助理，同时也是一名教授。在本视频中，我们将展示如何制备清晰的安卓机体切片。那么，让我们开始吧。第二部分，材料与设备。进行此操作时，我们需要一种用于冷冻样本的包埋介质。用于细胞固定的4%多聚甲醛溶液，用于冷冻保护的蔗糖溶液。尖端略微弯曲的针头，用于更好观察EBS的体视显微镜，以及摇床。第三部分。此处将人胚胎体在非黏附性培养板中进行培养。使用移液器，将所有胚胎体尽可能聚集在一起，以便转移至15毫升锥形管中。小心收集胚胎体（EBS）并转移至该管中。收集所有囊泡（EBS）非常重要，因为材料量并不多。将EBS转移后，小心弃去培养基。此时应可见管底有沉淀物。接下来可进行固定步骤。将使用含4%多聚甲醛的PBS（磷酸盐缓冲液）溶液固定EBS。用PFA溶液重悬沉淀物至关重要。随后，EBS在固定液中固定30分钟。固定后，小心移除PFA溶液。注意避免悬浮EBS，将其替换为含10%蔗糖的PBS溶液，以开始对EBS进行冷冻保护，材料在此溶液中保存30分钟。接下来，我们小心移除10%蔗糖溶液，并将EBS重悬于20%蔗糖溶液中。再次将 EBS 在此溶液中保存 30 分钟。最后，移除 20% 蔗糖溶液，并替换为 PBS 中的 30% 蔗糖溶液，继续保存 30 分钟。现在我们可以进行 EBS 的定位和包埋。在我们的实验室中，我们使用空的胶囊壳作为模具。在收集 EBS 时，用蔗糖溶液涂覆移液头内部壁面以阻断 EBS 非常重要。现在我们可以小心地收集 EBS，并等待其沉降到移液头底部。接下来，将EBS置于模块中央，此位置应为EBS在模块内的最终位置。在体视显微镜下，使用细尖工具尽可能收集并去除多余的蔗糖溶液。始终注意不要收集ebs。使用尖端略微弯曲的针将所有EBS置于块的中央。最后，用滤纸碎片收集残留的蔗糖溶液。EBS 在包埋块内的具体位置对于获得高质量切片至关重要。以下是 EBS 在包埋壳内位置不佳的一个示例。在定位 EBS 并去除蔗糖溶液后，从边缘开始向包埋壳内填充 OCT，操作过程中始终注意避免 EBS 悬浮在 Resus 中。使用移液管去除残留的气泡，并将卵壳振荡 15 分钟。振荡结束后，将 OCT 包埋块置于干冰中冷冻。 此时，您可以将用铝箔包裹的组织块在零下80摄氏度保存，以备后续分析；或者继续进行第四部分——冷冻切片。要制作冷冻切片，您需要一次性或永久性刀片、OCT包埋剂以及经多聚-L-赖氨酸预处理的玻璃载片。将OCT包埋的组织块从冷冻室中取出后，置于冷冻切片机内，待其温度升至零下20摄氏度。 然后将组织块放置在支架上，并与刀片边缘平行对齐。胚胎干细胞（EB）样品比大多数其他组织样品小得多，因此必须确保组织块的整个表面同时接触刀片，以最大程度减少样品损失。定位完成后，将组织块切成10 µm厚的切片，并直接收集到载玻片上。切片可储存，最好在零下70摄氏度保存，也可在同一天使用。材料可用于免疫组织化学或免疫荧光染色。结论：本文所述方法提供了一种相对经济且易于操作的方案，用于获取由人H九或小鼠US P一干细胞系发育而来的胚胎体的薄冰冻切片。所得冷冻切片可用于多种实验流程，以分析蛋白质表达或EB形态。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

使用胚体冰冻切片分析的多能干细胞

我们已确定胎盘是发育过程中的主要造血器官。研究发现，造血干细胞（HSCs）在胎盘内独特的微环境生态位中生成并扩增。本文描述了从小鼠胎盘中分离和可视化造血干细胞所需的实验技术。...

从胎盘中分离和分析造血干细胞

基于自制的细胞离心装置制备细胞单层，从而实现对人多能干细胞（hPSCs）表面标志物（SSEA-3/SSEA-4）进行悬浮免疫细胞化学染色，以便观察与定量分析。...

使用自制细胞离心涂片装置对人类多能干细胞进行免疫细胞化学分析

本视频演示了一种利用诱导性多能干细胞（iPSCs）生成脑类器官的实验方法。将人iPSCs诱导形成拟胚体（EBs）。在诱导培养基中，将EBs培养于聚合物支架上，促进其分化为神经干细胞、前体细胞以及未成熟神经元。最后，将EBs包埋于基质中，并转移至维持培养基中以形成脑类器官。...

生成诱导多能干细胞来源的脑类器官

单细胞基因表达检测对于理解干细胞异质性至关重要。...

通过定量RT-PCR对单个人类胚胎干细胞进行基因表达谱分析

本方案介绍了一种进行定量、单细胞分析的方法 原位...

小鼠植入前胚胎谱系特化过程中蛋白质表达的定量分析

我们介绍了一种利用小鼠胚胎干细胞生成二维或三维类胚体的技术。随后，我们阐述了如何通过视黄酸诱导类胚体细胞的神经分化，以及如何利用前体细胞标志物的免疫荧光染色和免疫印迹法分析其分化状态。...

二维和三维拟胚体中视黄酸诱导小鼠胚胎干细胞神经分化的分析

本文报道了一种由人诱导性多能干细胞（hiPSCs）建立三维（3-D）培养体系的方案，称为无血清拟胚体（SFEB）。该三维模型可类似于器官型脑片培养，用于模拟人类大脑皮层发育过程，并对发育中的神经环路进行生理学研究。...

开发源自人诱导多能干细胞的无血清拟胚体，用于通过生理相关性检测方法研究三维干细胞培养

原始生殖细胞（PGCs）是精子和卵子的共同前体细胞。人类胚胎中的原始生殖细胞通过细胞因子的相互作用，由多能性上胚层细胞发育而来。本文中，我们描述了一种为期13天的实验方案，可从处于启动态多能性的诱导性多能干细胞出发，在类胚体表面诱导产生在转录组水平上类似于原始生殖细胞的人类细胞。...

从始发多能性诱导多能干细胞衍生的类胚体表面产生人类原始生殖细胞样细胞

我们描述了利用悬滴法将小鼠胚胎干细胞在体外分化为神经元细胞的实验步骤。此外，我们通过RT-qPCR、免疫荧光、RNA测序和流式细胞术进行了全面的表型分析。...

小鼠胚胎干细胞向神经前体细胞及神经元的分化与鉴定

我们提供了生成和表征基于人诱导性多能干细胞（hIPSC）的2D和3D新皮质发育模型的详细方案，以及用于定性和定量分析初级纤毛（PC）发生与功能的互补方法。...

基于人诱导性多能干细胞的二维和三维模型解析初级纤毛在新皮质发育中的作用

本文介绍了一种利用单细胞和单细胞核RNA测序技术生成人脑类器官并进行下游分析的综合性实验方案。...

脑类器官中单细胞与单细胞核转录组的生成及下游分析

学习制备多能干细胞来源胚体的高质量冰冻切片技术。该方法保留胚体组织结构，适用于细胞与分子水平的胚胎发育研究，为干细胞分化机制分析提供可靠工具。

通过胚胎体冰冻切片分析多能干细胞

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